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Biotecnologia UAAAN

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Uaaan
saltillo Coahuila mexico
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BIOTECNOLOGIA

Es la aplicación de procesos analógicos hombre.

organismos vivos para beneficios

en de

La biotecnología es uno de los campos multidisciplinarios que mayor expansión se ha experimentado, considerándose prioritario para el desarrollo tecnológico del país, dadas las posibilidades que ofrece para producir bienes y servicios a través de procesos biológicos intensivos y controlados en lugar de los tradicionales procesos biológicos y/o químicos extensivos.
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Biotecnología:
Campo del conocimiento dirigido a la producción de bienes y servicios mediante sistemas biológicos y sus productos. Aprovecha enzimas, microorganismos, tejidos celulares, estructuras subcelulares, etc.

Cultivo de tejidos
BIOTECNOLOGIA Ingeniería genética
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Es interdisciplinaria
Ingeniería mecánica Ciencia y tecnología de alimentos

Microbiología Bioquímica

Genética

BIOTECNOLOGIA Electrónica

Biología celular

Informática

Ingeniería bioquímica

Química

CONOCIMIENTOS:

BIOQUÍMICA FISIOLOGÍA GENETICA

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CULTIVO DE TEJIDOS Es una herramienta de gran utilidades la biotecnología. Esta técnica se basa en la totipotencialidad celular; obteniendo de esta forma una propagación rápida y masiva de plantas idénticas a la original a partir de cualquier parte aislada de la planta.

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Consiste en extraer bajo condiciones asépticas, órganos, tejidos o células de cualquier parte de la planta y colocarlas en medios nutritivos para luego cultivarlos en condiciones ambientales controlados.

TRES FENOMENOS BASICOS 1) ORGANOGENESIS: Formación de órganos (diferenciación). 2) CAULOGENESIS: Formación de callo (no diferenciado, solamente se acumulan no forman órgano ni nada). 3) EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a partir de células no germinadas.
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TOTIPOTENCIA

Capacidad de cualquier célula somática para dividirse y crear un individuo completo y semejante de aquel que se toma la muestra, bajo ciertas condiciones químicas y físicas dados en el cultivo in vitro. Tipos de cultivos

1. El Desarrollo de estructuras pre-existentes

2. Nueva formación a base de totipotencialidad
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Brote axilar o yema

Desarrollo de ovario

Tuberización

Injerto in vitro

Germinación de semillas
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Promotor de brotes

Embriogenesis

Desarrollo de bulbo

Floración in vitro

Rhizogenesis

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APLICACIONES - INDUSTRIA DE FERMENTACIÓN - INDUSTRIAS AGROALIMENTARIAS - INDUSTRIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS - PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS CON CONCENTRADOS DE PROTEÍNA - TRATAMIENTO Y VALORIZACIÓN DE SUBPRODUCTOS AGRICOLAS Y SUS DERIVADOS. - PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES Y PRODUCCIÓN DE BIOGAS - TRATAMIENTO DE MINERALES
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MECANISMO DE GERMINACIÓN EN SEMILLAS PROCESO DE GERMINACIÓN: TRES ETAPAS CONDICIONES: HUMEDAD, LUZ, OXIGENO, TEMPERATURA

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CULTIVO IN VITRO

Es una técnica que usa para propagar plantas a partir de plantas madres por lo que las plántulas obtenidas son idénticas entre si a la planta madre. El cultivo de vegetales superiores se inicio hace mas de medio siglo y es en esta época que alcanza importancia en la agricultura, en la obtención de nuevas variedades y por la multiplicación vegetativa a escalas industriales.

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Ventajas
1.- Es masiva y más rápida .

2.-

Propagar

especies

difíciles

de multiplicar

en

forma

tradicional; esto es posible al fenómeno de rejuvenecimiento. 3.- El crecimiento de las plantas in vitro es más vigoroso que el

de las clonadas in vivo; esto se debe sobre todo al
rejuvenecimiento y / o al hecho de que las plantas in vitro se encuentran libres de enfermedades.

4.- Se consigue una multiplicación libre de enfermedades con
selección rigurosa del material inicial, o bien liberando el material inicial de enfermedades.
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5.- Homogeneidad del material. 6.- Multiplicación todo el año. Porque se trabaja en condiciones ambientales controladas.

7.- Ya que se necesita una cantidad de material
relativamente pequeña para iniciar un cultivo in vitro, se puede realizar una cuidadosa selección del mismo. 8.- Ahorro de espacio con respecto de los sistemas tradicionales. 9.- Conservación del material genético. 10.- Fácil transporte e intercambio de material

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vegetal.

Desventajas 1.- En algunos sistemas de propagación in vitro la estabilidad genética es débil. 2.- Las plantas producidas in vitro pueden mostrar características poco convenientes in vivo: Excesiva

producción de ramas laterales y paso total a la fase juvenil.
3.- La aclimatación de las plántulas es un proceso difícil y puede que muchas veces, los mayores porcentajes de la pérdida se presenten en esa etapa.

4.- Difícil respuesta inicial de algunas especies y genotipos.
5.- Variación de respuesta entre los genotipos. 6.- Alto costo de establecimiento de un laboratorio, lo que incide indirectamente en el precio final de la planta producido de esta manera. 7.- Necesidad de una mano de obra especializada.
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ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO in vitro ESQUEMA DE LA REALIZACIÓN DE CULTIVO “IN VITRO” Material a sembrar

Aislamiento o explante

Esterilización del hipoclorito o Cl2Hg

Preparación del medio nutritivo

Esterilización en autoclave
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EQUIPO NECESARIO PARA EL CULTIVO IN VITRO - Autoclave - Cámara de flujo laminar - Medio de cultivo - Planta - Cámara de cultivo Presión de 1.5 atm y una temperatura hasta 120º.

- Cámara de flujo laminar

Es una mesa con una campana de extracción, para uno o dos operarios en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para 17 esterilizar el aire.

TECNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MANIPULACIONES ASEPTICAS ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE ESTERILIZACIÓN POR MEDIOS QUÍMICOS

ESTERILIZACIÓN POR MEDIO NUTRITIVO ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

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ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL HIPOCLORITO DE CALCIO TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN DE SEMILLAS EN HIPOCLORITO DE CALCIO 3% Ejemplos: Avena sativa - 7 Hrs Zea mays - 8 Hrs Triticum aestivum - 15 Hrs Phaseolus vulgaris - 5 Hrs  CLORURO DE MERCURIO  CLORAMINAT Y IODOSUCCIANAMIDA

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-Medio de cultivo Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.
-Planta El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones. -Cámara de cultivo La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc..

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Medio de cultivo
   Es suma importancia Estado del cultivo - Sólido o líquido Componentes

La diferencia principal entre los medios surge por ser variables los requerimientos nutritivos de las especies.
Debe ser específicos para la parte de la planta que se esté cultivando y para la respuesta que se desea obtener. Una vez preparado el medio de cultivo, se ajusta el pH, ya que su valor final es importante pues puede afectar, entre otros, a los enzimas y a algunos componentes del medio de cultivo. Medio de Iniciación: Rugini (MIR), Olive Medium (OM), Murashige y Skoog (MS), Lloyd y McCown, García-Berenguer, Fiorino y Leva

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COMPONENTES DEL MEDIO NUTRITIVO AGUA SALES MINERALES MACRONUTRIENTES (N, S, P, Ca, K, Mg) MICRONUTRIENTES (Fe, Cu, Mn, Al, B) COMPUESTOS ORGANICOS CARBOHIDRATOS SUSTANCIAS HORMONALES AMINOACIDOS Y AMIDAS COMPUESTOS ORGANICOS BASES ORGANICAS INOSITOL ACIDO MALICO COMPUESTOS NATURALES SUSTANCIAS INERTES
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Reguladores de crecimiento Aquellas substancias que son sintetizadas en un determinado lugar de la planta y se translocan a otro, donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando el crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal. Pueden ser de origen natural como sintetizadas en laboratorio que determinan respuestas a nivel de crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.

Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos:  Auxinas  Citocininas o citokininas  Giberelinas  Etileno  Acido abcísico

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REGULADORES DE CRECIMIENTO

AUXINAS

ACIDO-3- INDOLACETICO (AIA) ACIDO-3-INDOLBUTIRICO (AIB) ACIDO NAFTALENACETICO (ANA) ACIDO-4- CLOROFENOXIACETICO (2, 4-D) ACIDO -4-AMINO- 3, 5, 6 TRICLOROPICOLINICO (TORDAN) 6-ISOPENTENIL AMINOPURINA (IPA) ZEATINA 6-FURBURIL ADENINA (KINETINA) 6-BENCIL AMINOPURINA (BA) GA, GA2, GA3.... GA40 GA3 = ACIDO GIBERELICO

CITOCININAS

GIBERELINAS

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Las funciones de las auxinas: 1. Dominancia apical 2. Aumentar el crecimiento de los tallos 3. Promover la división celular en el cambio vascular y diferenciación del xilema secundario 4. Estimular la formación de raíces adventicias 5. Estimular el desarrollo de frutos (partenocárpicos en ocasiones9 6. Fototropismo 7. Promover la división celular 8. Promover la floración en algunas especies 9. Promover la síntesis de etileno (influye en los procesos de maduración de los frutos) 10. Favorece el cuaje y la maduración de los frutos 11. Inhibe la abscisión ó caída de los frutos

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Funciones de las citocininas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Estimulan la división celular y el crecimiento Inhiben el desarrollo de raíces laterales Rompen la latencia de las yemas axilares Promueven la organogénesis en los callos celulares Retrasan la senescencia ó envejecimiento de los órganos vegetales Promueven la expansión celular en cotiledones y hojas Promueven el desarrollo de los cloroplastos.

Funciones de la giberelinas:

• •
• • •

Incrementan el crecimiento en los tallos Interrumpen el período de latencia de las semillas, haciéndolas germinar y mobilizan las reservas en azúcares Inducen la brotación de yemas Promueven el desarrollo de los frutos Estimulan la síntessis de mRNA (RNA mensajero)

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Funciones Acido abcísico: 1. 2. 3. 4. 5. Promueve la latencia en yemas y semillas Inhibe la división celular Causa el cierre de los estomas Antagónico de las giberelinas Inhibe el crecimiento

Las funciones etileno: 1. 2. 3. 4. Promueve la maduración de los frutos Promueve la senescencia (envejecimiento) Caída de las hojas Geotropismo en las raíces

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Equipo para un laboratorio de cultivo de tejidos:
Cámara de flujo horizontal  Autoclave (20 litros)  Termómetro de máx. y min.  Conductimetro de bolsillo  Equipo de aire acondicionado  Microscopio compuesto  Binocular con sistema de  Estéreo microscopio  Cámara Digital  Agitador magnético con calefacción.  Tanque Eternit de 1100 Litros con Electro bomba Centrífuga  Reloj/ alarma  Estabilizador de Voltaje (1000 Wa)  Estabilizador de Voltaje (1KVa)  Autoclave (30 litros)  Autoclave (40 Litros)  Destilador (2 litros/hora)  Destilador de agua  pH-metro  Balanza analítica  Balanza analítica  Des-ionizador  Incubadora  Agitador  Pastilla magnética  Refrigerador  Cámara de termoterapia  Cocinilla eléctrica

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Material de laboratorio:
 Pipetas Pasteur s  Pipetas de 1 ml  Frascos de 15 onzas  Probetas 50, 500, 1000 ml  Erlenmeyer de 1000, 500 , 250, 125 ml  Microtiter plate  Discos de Aluminio  Frascos Autoclavables  Recipientes plásticos para pesado  Pipetas 10, 5, 1 ml  Balón de destilación de 1000 y 15000 ml  Matraz quitazato  Placa petri chica y grande  Tubo de ensayo 15 x 150 y 25 x 150 mm  Tubo de ensayo grande 25 x 150  Refrigerante (incompleto)

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 Pinzas de Acero inoxidable curva  Mangos de Bisturí  Gradillas 25 x 150  Hojas de Bisturí  Pabilo  Papel aluminios 822.8 m x 304 mm)  Mascarillas 23 unidades  Tijeras de Acero inoxidable  Espátula de acero quirúrgico  Espátula de bronce en curva  Espátula de bronce recta  Secador para material de vidrio  Embudo plástico  Guantes quirúrgicos  Cubre bocas  Baldes de 10 litros  Pizetas de plástico  Algodón 06,5 kg.
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CONDICIONES DEL CULTIVO IN VITRO En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso son las contaminaciones. No se pueden esterilizar en el autoclave determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, enzimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta.
Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo. Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.
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El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes añadidos a los medios sólidos. Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede producir su licuación. El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo. El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por parte del explante (p.e. la absorción de iones NO3aumenta con la acidez del medio). El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a la actividad de muchos enzimas

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El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento. El medio de cultivo es específico, y se pueden tardar dos años en prepararlo. En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas) y temperatura. - Existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. - Lo normal son 22-26ºC, y en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.

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Producen la luz por fenómenos de incandescencia del filamento calentado por el paso de la corriente eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la LAMPARAS INCANDESCENTES zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad de calor y mucho consumo de electricidad. Producen la luz por fenómenos de fluorescencia del gas sometido a un arco voltáico. El espectro de la luz producida es rico en la zona del azul, existen fluorescentes especiales con un espectro rico en la zona azul y roja. Consumen menos electricidad. Producen la luz por efecto del paso de la corriente eléctrica a través de gases calientes de mercurio (azul y verde) y sodio (naranja). Son altamente eficientes en el consumo de electricidad.
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LAMPARAS FLUORESCENTES

LAMPARAS DE VAPOR DE MERCURIO Y SODIO

Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de explante, parte más juvenil o más adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. Importante el cerrar o sellar.

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Inicio del cultivo in vitro

El material vegetal: Célula, tejido u órgano de la planta.
Partiendo de: fragmentos de tejidos somáticos, tallo, raíz, hoja, meristemos, embriones; o de células o tejidos no somáticos, anteras, polen, microesporas, óvulos, etc. Según sea el explante utilizado se hablará de cultivo de secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de polen, de embriones, etc.

Explante es un fragmento cortado de un tejido o de un órgano utilizado para iniciar un cultivo. Un explante puede ser utilizado casi cualquier órgano o tejido, pero para la micropropagación es conveniente partir de una yema o ápice meristemático para garantizar la estabilidad genética de sus células.
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Una regeneración de planta completa (morfogénesis o órganogenesis) puede ser mediante la formación de raíces (rizogénesis) y/o de tallos. La morfogénesis parte del explante inicial por la formación de raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal (adventicias/os).

Morfogénesis indirecta: Se produce después de la formación de un callo.
Morfogénesis directa: Se produce directamente del explante sin que este pase por fase de callo.

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Las condiciones de cultivo pueden dar origen a una proliferación desorganizada de las células del explante dando lugar a un callo o incluso a un cultivo de células cuando se separan éstas del callo. Se conoce como Caulogenesis a la formación de callo (no diferenciado, solamente se acumulan no forman órgano ni nada).

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El explante puede producir unas estructuras bipolares que presentan las propiedades morfológicas de los embriones zigóticos. Estas estructuras se denominan embriones somáticos. Estos pueden provenir directamente del explante o de un callo y se le denomina Embriogénesis directa o indirecta. EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a partir de células no germinadas.

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