TEMA 7: INGENIERIA GENETICA
• Objetivo: Conocer medios alternativos para liberar variabilidad genética. • 36. Cultivo de tejidos. Fundamentación y aplicaciones en el Mejoramiento Genético. Variación Somaclonal y Gametoclonal • 37. Transferencia de genes. Fusión de protoplastos. • 38. Haploides. Obtención y Utilización • 39. Plantas transgénicas. Obtención. Técnicas de transformación.

Cultivo de Tejidos

.Definición • Técnica mediante la cual un explante se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y en ambiente controlado.

Aplicaciones
• • • • • • • • Producción Comercial Saneamiento de Cultivares Conservación de Germoplasma Obtención de Variación Somaclonal Rescate de Embriones Obtención de Híbridos Somáticos Obtención de Haploides Transformación de Plantas

Variación Somaclonal

Aspectos
• Cambios fenotípicos en la plantas regeneradas a través del cultivo de tejidos • Algunas de esas variaciones eran persistentes y heredables • El cultivo de tejidos apareció entonces como una fuente alterna de variación genética. A esta variación se la denominó Variación somaclonal (Larkin and Scowcroft, 1981).

tales como aneuploidía o polipliodía . ej.Origen de la variación • El ciclo y/o el medio de cultivo producen variación.: con la aplicación de 2.4 D • Acumulación de mutaciones en tejidos indiferenciados mas las que podrían ocurrir luego en los diferenciados • Cambios en el cariotipo. implica cambios bruscos.

. que puede ser particularmente importante si los cambios son asimétricos o entre cromosomas no homólogos. translocaciones de cromosomas no homólogos • Transposición de elementos (Transposones) • Incremento del crossing over.Origen de la variación • Cambios cripticos. debido a la "presión" del medio de cultivo. ej. pequeños cambios asociados con reacomodamiento de los cromosomas.: ruptura y fusión.

Variación Gametoclonal • Los gametoclones son. en principio individuos haploides. en contraste con los somaclones que deben ser autofecundados y su progenie analizada para detectar mutaciones recesivas. las mutaciones controladas por genes recesivos pueden ser observadas en las plantas regeneradas (diploides homocigotas). .

el número cromosómico debe ser doblado para restaurar la fertilidad para la formación de semillas. .Variación Gametoclonal • La plantas derivadas del cultivo de gametas son haploides.

Haploidía .

Hermsen y Ramanna. • Estos individuos se llaman monoploides si derivan de una planta diploide y polihaploides si provienen de una planta alo o autopoliploide (Sánchez Monge. . 1974). pero que posee una constitución cromosómica igual a la de los gametos normales de la especie (Lacadena. 1970. 1974).Definición • Un haploide es un organismo que se asemeja a un esporofito.

Origen e Inducción de Haploides • Origen in vivo • Origen in vitro .

.Origen in vivo • La modalidades tienen en común que se originan después de la autopolinización o de la polinización cruzada • Los individuos haploides deben ser seleccionados a partir de poblaciones mezcladas (Diploides más haploides).

Origen in vivo • • • • Ginogénesis (seudogamia) Androgénesis Semigamia Eliminación del genoma .

(maíz 0-3%) X X . Tubo polínico 2X CH X Monoploide en Endosperma 3X. con o sin formación del endosperma.Ginogénesis (Seudogamia) Célula haploide (CH) del saco embrionario desarrolla una planta completa.

Androgénesis Núcleo paterno . (maíz 1:80000) Núcleo Femenino Eliminado 2X X X X X Núcleo paterno por mitosis Desarrolla un embrión haploide .embrión haploide – Eliminación del núcleo materno.

Semigamia Embrión quimérico con tejidos materno y paterno haploides. . No existe fusión de los núcleos materno y paterno (algodón y cacao).

Eliminación del genoma La eliminación natural de un genoma completo de uno de los padres después de la fecundación origina individuos haploides (Hordeum). .

bulbosum Hordeum monoploide 2n=x=7 .Eliminación de cromosomas en Hordeum Hordeum vulgare 2n=2x=14 (Anual) Emasculación X Hordeum bulbosum 2n=2x=14 (perenne) Donor de polen Cigoto F1 Cultivo de embriones Eliminación de cromosomas de H.

bulbosum Triticum aestivum n=3x=21 Polihaploide .Obtención de haploides en trigo Triticum aestivum 2n=6x=42 X Hordeum bulbosum 2n=2x=14 (perenne) Donor de polen Eliminación de cromosomas de H.

Detección de Haploides en Cruzas mm X MM Plántulas marcadas Mm se desechan Plántulas no marcadas mmóm Recuento de cromosomas y selección de haploides Duplicación cromosómica .

Origen in vitro • Los haploides in vitro pueden ser obtenidos por cultivos de anteras y ovarios .

• Buena regeneración de plantas a partir de células o callos. • Que el agente para la duplicación cromosómica no provoque mutaciones . • Genotipos que respondan al tratamiento en alta frecuencia.• Se requiere: • Un medio de cultivo de micrósporas estandarizado.

la técnica utilizada debe ser: . • Duplicación inducida: para diploidizar un elevado número de haploides rápida y eficientemente.Duplicación • Duplicación espontánea: esta se produce. pero en frecuencias muy bajas para las necesidades del experimentador.

simple y rápida • Permitir el manejo de grandes cantidades de individuos • Que no se produzcan daños fisiológicos y que no sea selectivo • Que no produzca daños o cambios genéticos • Que no origine otros niveles de ploidía • De alta eficiencia y repetibilidad .• Segura.

. • Utilización directa.Utilidad de los haploides • Obtención de plantas diploides homocigotas a partir de individuos heterocigotas. por ejemplo en ornamentales por su prolongada floración.: Pelargonium. especialmente plantas alógamas y plantas dioicas. • Obtención de series monosómicas para estudios genéticos. ej.

• Los haploides androgenéticos permitirían la incorporación de núcleos en citoplasma de otra célula • Dado que no existe relación de dominancia el genotipo del recesivo se expresa. • Para transferencia génica de sp poliploides a sp diploides. siendo de utilidad en la mejora por mutación • En alopoliploides como paso intermedio en la duplicación cromosómica a fin de conseguir homología. .

Esquema de Obtención de líneas puras Población de Partida Método Clásico (autofecundación) S1 S2 . . . . S7 Líneas Puras Método Haploide Haploidía Espontánea Detección de Haploides Diploidización Líneas Puras L P con alta frecuencia de haploides espontáneos Intercruzamiento ACG ACE Cultivo de Anteras Obtención de Haploides ACE Líneas Puras de 2° Ciclo . .

Hibridación Interespecífica e Intergenérica .

Utilidad La introducción de genes de especies silvestres en especies cultivadas .

. producen descendencia viable.Concepto de pozo génico. sus cromosomas se aparean regularmente e intercambian sus genes. 1971) I Especies que se hibridan libremente. (Harlan and De Wet.

un cierto grado de esterilidad en la primera generación (F1) de los híbridos. .II Los híbridos son difíciles de obtener debido a diferentes niveles de ploidía. Existe también. alteraciones cromosómicas ó barreras genéticas a la hibridación.

. El porcentaje de cigotos viables es bajo. Las cruzas se pueden efectuar a altos niveles de ploidía. existen altos niveles de esterilidad en las progenies.III Mayor dificultad para obtener híbridos y sus individuos a menudo pertenecen a distintos géneros.

Barreras a La Hibridación –Barreras externas –Barreras internas .

Barreras externas Diferencias en el tiempo y la duración de la floración Susceptibilidad al fotoperíodo y al frío. .

Barreras internas Autoincompatibilidad Diferencias en cruzas recíprocas Niveles diferentes de ploidía Degeneración del endosperma Muerte de embriones Eliminación de cromosomas. .

Cruzas Puente
Obtención de resistencia a Cercosporella
Triticum turgidum x Aegilops ventricosa x=7, 4x x=7; 2x Triticum aestivum x x=7, 6x (Susceptible) Retrocruza F1 F1

Germoplasma con alelos para resistencia

• • • •

Metodología complicada Selección del carácter dificultosa Solo para monogenes dominantes Alta probabilidad de pérdida de genes en el proceso de evaluación

Fusión de Protoplastos
• Combinar genomios de especies distantes genéticamente • Se emplean células desprovistas de su pared celular ó protoplastos • Estos protoplastos son inducidos a fusionarse mediante diversas técnicas • Se obtiene una mezcla de los genomios nuclear y de las organellas

• Esta mezcla puede segregar en diferentes vías • El híbrido somático resultante es cultivado in vitro para producir callos a partir de los cuales se trata de regenerar la planta completa .

• Es factible obtener híbridos nucleares simétricos y combinaciones de los genomios de las organellas en diferente proporción de cada padre (Jacobsen. 1993) .

M.P. • Impulsos eléctricos. • PEG con la mezcla de protoplasma. . • Centrifugación a bajas r. actúa como un puente molecular. luego de la remoción de la pared celular originando cuerpos multinucleados.Técnicas De Fusión • Fusión espontánea.

Desventajas • Frecuente inestabilidad del Cíbrido • Falta de regeneración • Necesidad de repetidas retrocruzas y selección para fijar los caracteres deseados. .

Identificación Y Selección De Células Híbridas • Células parentales • Células heterocarióticas o híbridos .

Las Células Híbridas Pueden Ser Diferenciadas De Las Otras Por Selección Basada En La Complementación .

. con alelos recesivos en distinto locus. y posterior selección para individuos fotosintéticos.Fusión de albinos.

.Fusionar protoplastos con distintos requerimientos para el desarrollo. para obtener híbridos somáticos autótrofos para auxinas en sp del género Nicotiana. ej. se puede identificar lo híbridos al ponerlos en un medio que no suplemente esos requerimientos.

• Empleo de marcadores morfológicos en combinación con mutantes albinos • Selección visual (microscópica) y aislamiento mecánico. • Separación de los heterocariotes por diferencias de densidad bajo centrifugación. .

Protoplasto Donante CMS Protoplasto receptor Núcleo Mitocondrias Eliminación del núcleo Fusión Segregación CMS Fértiles .

Transferencia Génica Mediante Manipulación Directa De DNA • Agrobacterium • Absorción • Microinyección de DNA .

Agrobacterium .

.Introducción Directa De DNA • Es una alternativa para especies que no admiten el empleo de Agrobacterium.

.Absorción • Es la absorción por parte de los protoplastos de DNA de un medio de cultivo con la ayuda de ciertos agentes como el PEG o pulsos eléctricos.

. Se ha utilizado en alfalfa y en Brassica napus.Microinyección De DNA • Microinyección de DNA. Se inmoviliza la célula y mediante micropipetas se inyecta DNA sin alterar el organismo.

raimondii Resistencia a roya . procumbens Resistencia a nemátodos G.Ejemplos de caracteres transferidos por hibridación interespecífica o intergenérica. sterilis Carácter Incremento en rendimiento B. Especie Cultivada Avena sativa Beta vulgaris Gossypium hirsutum Especie Donante A.

a nemátodos y virus TMV Resis. peruvianum sculentum Solanum tuberosum Triticum aestivum Triticum aestivum Triticum aestivum S.Especie Cultivada Especie Donante Carácter Resis. acaule Aegilops ovata Alto contenido de proteína Aegilops Resis. al virus X Lycopersicum L. a la roya squarrosa de la hoja . a la roya speltoides del tallo Aegilops Resis.

Especie Cultivada Triticum aestivum Triticum aestivum Triticum durum Zea mays Especie Donante Agropyron elongatum Secale cereale T. a Helmintosphorium . monococcum Tripsacum dactyloide Carácter Tolerancia a sequía Resis. a la roya del tallo Resis. a la roya amarilla y al f Resis.

Plantas Transgénicas .

Organismos Modificados Genéticamente (OMG) • Caracteres de protección • Caracteres de calidad .

Caracteres de Protección • • • • • • Resistencia a Insectos Tolerancia a Herbicidas Resistencia a Hongos Resistencia a Virus Resistencia a Bacterias Resistencia a Nemátodos .

etc. enzimas. .Caracteres De Calidad • • • • Demora en maduración Aceites modificados Proteínas modificadas Producción vegetal de anticuerpos.

2. Identificación del organismo que lo exprese.Etapas en la Obtención de Plantas Transgénicas (OMG) 1. Identificación del carácter que no puede ser modificado por el mejoramiento convencional. .

4. Combinar el gen con elementos regulatorios de planta para que sea funcional en vegetales (promotores y terminadores). .3. Aislar el gen (del organismo) responsable del carácter deseado.

5. 6. . Identificar las células transformadas y regenerar plantas completas a partir de ellas. Integrar el gen quimérico en el DNA (genómico) cromosómico de la planta a transformar.

. • El ADN “cortado” posee extremos cohesivos.Extracción Del Gen De Interés • Corte del ADN donante en sitios específicos con enzimas de restricción. • Para cortar el ADN en segmentos de distinta longitud se utilizan distintas enzimas.

.• Dos cadenas de ADN cortados con la misma enzima de restricción tendrán los mismos extremos cohesivos. • Los ADN se pueden volver a unir.

GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Enzima EcoRI G CTTAA AATTC G Extremos Cohesivos Ligasa GAATTC CTTAAG ADN Recombinante .

Absorción de DNA Microinyección de DNA .G.Transferencia de genes a plantas • • • • • • Agrobacterium (mas eficiente) Microproyectiles Fusión de Protoplastos P.E.

de transmitir DNA a un cromosoma hospedante • Transmite un set de genes de una región denominada T-DNA (Ti-plasmid) dentro de las células de una planta en los sitios de infección. .Agrobacterium • Se explota la habilidad natural de la bacteria de suelo Agrobacterium tumefaciens.

• El patógeno tiene un amplio rango de hospedantes. • El resultado de la transferencia es un crecimiento tumoroso llamado corona en el cual el T-DNA es integrado en forma estable dentro del cromosoma huésped. • El sitio de integración es aleatorio. .

• El tumor resulta de la expresión de los genes del T-DNA que altera el normal balance de fitohormonas en la célula. • La técnica consiste en eliminar los genes que causan el tumor y reemplazarlos por DNA que codifique las características deseadas .

soja y en petunia.. Una gran desventaja es que no es activo en monocotiledóneas. tomate. 1987) • Se ha empleado con éxito en tabaco. .• El período crítico es la recuperación de una planta completa a partir de una célula transformada (Goodman et al.

.• Aplicaciones mas importantes: • Transferencia de genes que anulan el efecto de herbicidas • Transferencia de genes que codifican proteínas obtenidas de Bacillus thuringiensis para prevenir el ataque de insectos.

Ventaja Del Método Agrobacterium • Luego de una selección para obtener plantas regeneradas con las características deseadas. . estas son predecibles. heredables y estables.

Vector de Transformación Gen Quimérico P-Gen de interés-T-P-Gen Marcador-T P: Promotor T: Terminador .

.

.

Maíz Bt Gen Bt Gen marcador Gen Bt + Marcador .

Inserción en células Microproyectiles .

Selección de células Medio de cultivo mas antibiótico .

Selección de células Medio de cultivo mas antibiótico Las células no transformadas mueren .

De célula a planta Cultivo de Tejidos Planta Transgénica .

Logros en Plantas Transgénicas .

Resistencia a Herbicidas • El glifoxato actúa sobre el ácido shikimico • Bacteria que producía una enzima resistente (no inhibida por el glifoxato) • La enzima se incorporó a plantas • El maíz además posee otra enzima que degrada al glifoxato .

.

Plantas de Canola Resistentes a Salinidad .

Resistencia a Virosis • Se utilizan virus atenuados (protección cruzada) • No hay plantas liberadas en Argentina • Se basa en la producción de una proteína viral que impide que el gen del virus se exprese • La planta elimina la secuencia de RNA viral .

. • Maíz con alta digestibilidad y con más nutrientes para alimentación animal. • Soja con alto contenido de isoflavonoides (prevención del cáncer).Nuevas plantas • Alto contenido de oleico en canola y en soja para industria. • Papas con alto contenido de almidón • Mayor duración en bananas. frutillas y tomates.

.

Potenciales riesgos asociados con las plantas transgénicas • Introducción de compuestos alergénicos o proteínas dañinas en alimentos. u otras plantas • Efectos perjudiciales sobre otras eespecies y sobre el ambiente . • Transferencia de genes hacia virus. bacterias.

Adición del gen Terminator a plantas transgénicas Gen 1 Promotor Tardío Gen 2 Bloqueador Gen 3 Toxina Semillas Viables .

Adición del gen Terminator a plantas transgénicas Inductor químico Gen 1 Promotor Tardío Gen 1 Promotor Tardío Gen 2 Bloqueador Gen 3 Toxina Gen 3 Toxina Muerte del Embrión .

Marcadores Moleculares Selección Asistida .

Que Son Los Marcadores Moleculares? • Una secuencia detectable de DNA o una proteína cuya herencia puede ser monitoreada .

Aplicaciones de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético • Análisis de variabilidad genética • Marcadores ligados a genes de interés agronómico • Marcadores ligados a genes de resistencia a enfermedades • Marcadores ligados a caracteres de herencia cuantitativa (QTL) .

.

1991. Wageningen Agricultural University. 84 p.. Jacobsen. 1999.. 1993. E. The Netherlands. Mundiprensa. Dep.Bibliografía Cubero. A. In: Introduction to Plant Breeding II. The Netherlands. Wageningen. Genetic Variation. of Plant Breeding. In: Introduction to Plant Breeding II: Genetic Variation.. Dep. J. M. Part IV: Genetic Modification in Vitro. Madrid. Wageningen. Wageningen Agricultural University. of Plant Breeding. 123 pp. Protoplastfusion. 365 pp. Mutation Breeding. . Van Harten. Introducción al mejoramiento genético vegetal.

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