TEMA 7: INGENIERIA GENETICA
• Objetivo: Conocer medios alternativos para liberar variabilidad genética. • 36. Cultivo de tejidos. Fundamentación y aplicaciones en el Mejoramiento Genético. Variación Somaclonal y Gametoclonal • 37. Transferencia de genes. Fusión de protoplastos. • 38. Haploides. Obtención y Utilización • 39. Plantas transgénicas. Obtención. Técnicas de transformación.

Cultivo de Tejidos

.Definición • Técnica mediante la cual un explante se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y en ambiente controlado.

Aplicaciones
• • • • • • • • Producción Comercial Saneamiento de Cultivares Conservación de Germoplasma Obtención de Variación Somaclonal Rescate de Embriones Obtención de Híbridos Somáticos Obtención de Haploides Transformación de Plantas

Variación Somaclonal

Aspectos
• Cambios fenotípicos en la plantas regeneradas a través del cultivo de tejidos • Algunas de esas variaciones eran persistentes y heredables • El cultivo de tejidos apareció entonces como una fuente alterna de variación genética. A esta variación se la denominó Variación somaclonal (Larkin and Scowcroft, 1981).

: con la aplicación de 2.4 D • Acumulación de mutaciones en tejidos indiferenciados mas las que podrían ocurrir luego en los diferenciados • Cambios en el cariotipo. implica cambios bruscos.Origen de la variación • El ciclo y/o el medio de cultivo producen variación. tales como aneuploidía o polipliodía . ej.

. translocaciones de cromosomas no homólogos • Transposición de elementos (Transposones) • Incremento del crossing over.Origen de la variación • Cambios cripticos. que puede ser particularmente importante si los cambios son asimétricos o entre cromosomas no homólogos. ej. pequeños cambios asociados con reacomodamiento de los cromosomas. debido a la "presión" del medio de cultivo.: ruptura y fusión.

en principio individuos haploides.Variación Gametoclonal • Los gametoclones son. las mutaciones controladas por genes recesivos pueden ser observadas en las plantas regeneradas (diploides homocigotas). . en contraste con los somaclones que deben ser autofecundados y su progenie analizada para detectar mutaciones recesivas.

.Variación Gametoclonal • La plantas derivadas del cultivo de gametas son haploides. el número cromosómico debe ser doblado para restaurar la fertilidad para la formación de semillas.

Haploidía .

Definición • Un haploide es un organismo que se asemeja a un esporofito. 1974). 1970. 1974). . pero que posee una constitución cromosómica igual a la de los gametos normales de la especie (Lacadena. • Estos individuos se llaman monoploides si derivan de una planta diploide y polihaploides si provienen de una planta alo o autopoliploide (Sánchez Monge. Hermsen y Ramanna.

Origen e Inducción de Haploides • Origen in vivo • Origen in vitro .

Origen in vivo • La modalidades tienen en común que se originan después de la autopolinización o de la polinización cruzada • Los individuos haploides deben ser seleccionados a partir de poblaciones mezcladas (Diploides más haploides). .

Origen in vivo • • • • Ginogénesis (seudogamia) Androgénesis Semigamia Eliminación del genoma .

con o sin formación del endosperma. (maíz 0-3%) X X . Tubo polínico 2X CH X Monoploide en Endosperma 3X.Ginogénesis (Seudogamia) Célula haploide (CH) del saco embrionario desarrolla una planta completa.

Androgénesis Núcleo paterno . (maíz 1:80000) Núcleo Femenino Eliminado 2X X X X X Núcleo paterno por mitosis Desarrolla un embrión haploide .embrión haploide – Eliminación del núcleo materno.

No existe fusión de los núcleos materno y paterno (algodón y cacao).Semigamia Embrión quimérico con tejidos materno y paterno haploides. .

.Eliminación del genoma La eliminación natural de un genoma completo de uno de los padres después de la fecundación origina individuos haploides (Hordeum).

Eliminación de cromosomas en Hordeum Hordeum vulgare 2n=2x=14 (Anual) Emasculación X Hordeum bulbosum 2n=2x=14 (perenne) Donor de polen Cigoto F1 Cultivo de embriones Eliminación de cromosomas de H. bulbosum Hordeum monoploide 2n=x=7 .

Obtención de haploides en trigo Triticum aestivum 2n=6x=42 X Hordeum bulbosum 2n=2x=14 (perenne) Donor de polen Eliminación de cromosomas de H. bulbosum Triticum aestivum n=3x=21 Polihaploide .

Detección de Haploides en Cruzas mm X MM Plántulas marcadas Mm se desechan Plántulas no marcadas mmóm Recuento de cromosomas y selección de haploides Duplicación cromosómica .

Origen in vitro • Los haploides in vitro pueden ser obtenidos por cultivos de anteras y ovarios .

• Se requiere: • Un medio de cultivo de micrósporas estandarizado. • Buena regeneración de plantas a partir de células o callos. • Genotipos que respondan al tratamiento en alta frecuencia. • Que el agente para la duplicación cromosómica no provoque mutaciones .

Duplicación • Duplicación espontánea: esta se produce. la técnica utilizada debe ser: . • Duplicación inducida: para diploidizar un elevado número de haploides rápida y eficientemente. pero en frecuencias muy bajas para las necesidades del experimentador.

simple y rápida • Permitir el manejo de grandes cantidades de individuos • Que no se produzcan daños fisiológicos y que no sea selectivo • Que no produzca daños o cambios genéticos • Que no origine otros niveles de ploidía • De alta eficiencia y repetibilidad .• Segura.

• Obtención de series monosómicas para estudios genéticos. especialmente plantas alógamas y plantas dioicas. ej. por ejemplo en ornamentales por su prolongada floración. • Utilización directa.Utilidad de los haploides • Obtención de plantas diploides homocigotas a partir de individuos heterocigotas.: Pelargonium. .

• Para transferencia génica de sp poliploides a sp diploides.• Los haploides androgenéticos permitirían la incorporación de núcleos en citoplasma de otra célula • Dado que no existe relación de dominancia el genotipo del recesivo se expresa. . siendo de utilidad en la mejora por mutación • En alopoliploides como paso intermedio en la duplicación cromosómica a fin de conseguir homología.

. .Esquema de Obtención de líneas puras Población de Partida Método Clásico (autofecundación) S1 S2 . . . S7 Líneas Puras Método Haploide Haploidía Espontánea Detección de Haploides Diploidización Líneas Puras L P con alta frecuencia de haploides espontáneos Intercruzamiento ACG ACE Cultivo de Anteras Obtención de Haploides ACE Líneas Puras de 2° Ciclo .

Hibridación Interespecífica e Intergenérica .

Utilidad La introducción de genes de especies silvestres en especies cultivadas .

(Harlan and De Wet. . 1971) I Especies que se hibridan libremente. sus cromosomas se aparean regularmente e intercambian sus genes. producen descendencia viable.Concepto de pozo génico.

Existe también. un cierto grado de esterilidad en la primera generación (F1) de los híbridos. . alteraciones cromosómicas ó barreras genéticas a la hibridación.II Los híbridos son difíciles de obtener debido a diferentes niveles de ploidía.

III Mayor dificultad para obtener híbridos y sus individuos a menudo pertenecen a distintos géneros. existen altos niveles de esterilidad en las progenies. Las cruzas se pueden efectuar a altos niveles de ploidía. El porcentaje de cigotos viables es bajo. .

Barreras a La Hibridación –Barreras externas –Barreras internas .

Barreras externas Diferencias en el tiempo y la duración de la floración Susceptibilidad al fotoperíodo y al frío. .

.Barreras internas Autoincompatibilidad Diferencias en cruzas recíprocas Niveles diferentes de ploidía Degeneración del endosperma Muerte de embriones Eliminación de cromosomas.

Cruzas Puente
Obtención de resistencia a Cercosporella
Triticum turgidum x Aegilops ventricosa x=7, 4x x=7; 2x Triticum aestivum x x=7, 6x (Susceptible) Retrocruza F1 F1

Germoplasma con alelos para resistencia

• • • •

Metodología complicada Selección del carácter dificultosa Solo para monogenes dominantes Alta probabilidad de pérdida de genes en el proceso de evaluación

Fusión de Protoplastos
• Combinar genomios de especies distantes genéticamente • Se emplean células desprovistas de su pared celular ó protoplastos • Estos protoplastos son inducidos a fusionarse mediante diversas técnicas • Se obtiene una mezcla de los genomios nuclear y de las organellas

• Esta mezcla puede segregar en diferentes vías • El híbrido somático resultante es cultivado in vitro para producir callos a partir de los cuales se trata de regenerar la planta completa .

1993) .• Es factible obtener híbridos nucleares simétricos y combinaciones de los genomios de las organellas en diferente proporción de cada padre (Jacobsen.

M. luego de la remoción de la pared celular originando cuerpos multinucleados. . actúa como un puente molecular.P. • Impulsos eléctricos. • Centrifugación a bajas r.Técnicas De Fusión • Fusión espontánea. • PEG con la mezcla de protoplasma.

.Desventajas • Frecuente inestabilidad del Cíbrido • Falta de regeneración • Necesidad de repetidas retrocruzas y selección para fijar los caracteres deseados.

Identificación Y Selección De Células Híbridas • Células parentales • Células heterocarióticas o híbridos .

Las Células Híbridas Pueden Ser Diferenciadas De Las Otras Por Selección Basada En La Complementación .

.Fusión de albinos. con alelos recesivos en distinto locus. y posterior selección para individuos fotosintéticos.

se puede identificar lo híbridos al ponerlos en un medio que no suplemente esos requerimientos. . ej. para obtener híbridos somáticos autótrofos para auxinas en sp del género Nicotiana.Fusionar protoplastos con distintos requerimientos para el desarrollo.

. • Separación de los heterocariotes por diferencias de densidad bajo centrifugación.• Empleo de marcadores morfológicos en combinación con mutantes albinos • Selección visual (microscópica) y aislamiento mecánico.

Protoplasto Donante CMS Protoplasto receptor Núcleo Mitocondrias Eliminación del núcleo Fusión Segregación CMS Fértiles .

Transferencia Génica Mediante Manipulación Directa De DNA • Agrobacterium • Absorción • Microinyección de DNA .

Agrobacterium .

.Introducción Directa De DNA • Es una alternativa para especies que no admiten el empleo de Agrobacterium.

Absorción • Es la absorción por parte de los protoplastos de DNA de un medio de cultivo con la ayuda de ciertos agentes como el PEG o pulsos eléctricos. .

. Se inmoviliza la célula y mediante micropipetas se inyecta DNA sin alterar el organismo. Se ha utilizado en alfalfa y en Brassica napus.Microinyección De DNA • Microinyección de DNA.

raimondii Resistencia a roya . Especie Cultivada Avena sativa Beta vulgaris Gossypium hirsutum Especie Donante A. procumbens Resistencia a nemátodos G.Ejemplos de caracteres transferidos por hibridación interespecífica o intergenérica. sterilis Carácter Incremento en rendimiento B.

al virus X Lycopersicum L. a la roya squarrosa de la hoja . a la roya speltoides del tallo Aegilops Resis. acaule Aegilops ovata Alto contenido de proteína Aegilops Resis.Especie Cultivada Especie Donante Carácter Resis. a nemátodos y virus TMV Resis. peruvianum sculentum Solanum tuberosum Triticum aestivum Triticum aestivum Triticum aestivum S.

a la roya del tallo Resis. a Helmintosphorium .Especie Cultivada Triticum aestivum Triticum aestivum Triticum durum Zea mays Especie Donante Agropyron elongatum Secale cereale T. monococcum Tripsacum dactyloide Carácter Tolerancia a sequía Resis. a la roya amarilla y al f Resis.

Plantas Transgénicas .

Organismos Modificados Genéticamente (OMG) • Caracteres de protección • Caracteres de calidad .

Caracteres de Protección • • • • • • Resistencia a Insectos Tolerancia a Herbicidas Resistencia a Hongos Resistencia a Virus Resistencia a Bacterias Resistencia a Nemátodos .

.Caracteres De Calidad • • • • Demora en maduración Aceites modificados Proteínas modificadas Producción vegetal de anticuerpos. etc. enzimas.

Identificación del organismo que lo exprese. Identificación del carácter que no puede ser modificado por el mejoramiento convencional. . 2.Etapas en la Obtención de Plantas Transgénicas (OMG) 1.

3. . Combinar el gen con elementos regulatorios de planta para que sea funcional en vegetales (promotores y terminadores). Aislar el gen (del organismo) responsable del carácter deseado. 4.

Integrar el gen quimérico en el DNA (genómico) cromosómico de la planta a transformar. . 6.5. Identificar las células transformadas y regenerar plantas completas a partir de ellas.

Extracción Del Gen De Interés • Corte del ADN donante en sitios específicos con enzimas de restricción. . • Para cortar el ADN en segmentos de distinta longitud se utilizan distintas enzimas. • El ADN “cortado” posee extremos cohesivos.

• Los ADN se pueden volver a unir. .• Dos cadenas de ADN cortados con la misma enzima de restricción tendrán los mismos extremos cohesivos.

GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Enzima EcoRI G CTTAA AATTC G Extremos Cohesivos Ligasa GAATTC CTTAAG ADN Recombinante .

Transferencia de genes a plantas • • • • • • Agrobacterium (mas eficiente) Microproyectiles Fusión de Protoplastos P. Absorción de DNA Microinyección de DNA .E.G.

.Agrobacterium • Se explota la habilidad natural de la bacteria de suelo Agrobacterium tumefaciens. de transmitir DNA a un cromosoma hospedante • Transmite un set de genes de una región denominada T-DNA (Ti-plasmid) dentro de las células de una planta en los sitios de infección.

• El resultado de la transferencia es un crecimiento tumoroso llamado corona en el cual el T-DNA es integrado en forma estable dentro del cromosoma huésped.• El patógeno tiene un amplio rango de hospedantes. . • El sitio de integración es aleatorio.

• La técnica consiste en eliminar los genes que causan el tumor y reemplazarlos por DNA que codifique las características deseadas .• El tumor resulta de la expresión de los genes del T-DNA que altera el normal balance de fitohormonas en la célula.

Una gran desventaja es que no es activo en monocotiledóneas. . 1987) • Se ha empleado con éxito en tabaco.. soja y en petunia. tomate.• El período crítico es la recuperación de una planta completa a partir de una célula transformada (Goodman et al.

.• Aplicaciones mas importantes: • Transferencia de genes que anulan el efecto de herbicidas • Transferencia de genes que codifican proteínas obtenidas de Bacillus thuringiensis para prevenir el ataque de insectos.

heredables y estables.Ventaja Del Método Agrobacterium • Luego de una selección para obtener plantas regeneradas con las características deseadas. estas son predecibles. .

Vector de Transformación Gen Quimérico P-Gen de interés-T-P-Gen Marcador-T P: Promotor T: Terminador .

.

.

Maíz Bt Gen Bt Gen marcador Gen Bt + Marcador .

Inserción en células Microproyectiles .

Selección de células Medio de cultivo mas antibiótico .

Selección de células Medio de cultivo mas antibiótico Las células no transformadas mueren .

De célula a planta Cultivo de Tejidos Planta Transgénica .

Logros en Plantas Transgénicas .

Resistencia a Herbicidas • El glifoxato actúa sobre el ácido shikimico • Bacteria que producía una enzima resistente (no inhibida por el glifoxato) • La enzima se incorporó a plantas • El maíz además posee otra enzima que degrada al glifoxato .

.

Plantas de Canola Resistentes a Salinidad .

Resistencia a Virosis • Se utilizan virus atenuados (protección cruzada) • No hay plantas liberadas en Argentina • Se basa en la producción de una proteína viral que impide que el gen del virus se exprese • La planta elimina la secuencia de RNA viral .

• Papas con alto contenido de almidón • Mayor duración en bananas. . frutillas y tomates. • Soja con alto contenido de isoflavonoides (prevención del cáncer). • Maíz con alta digestibilidad y con más nutrientes para alimentación animal.Nuevas plantas • Alto contenido de oleico en canola y en soja para industria.

.

• Transferencia de genes hacia virus.Potenciales riesgos asociados con las plantas transgénicas • Introducción de compuestos alergénicos o proteínas dañinas en alimentos. u otras plantas • Efectos perjudiciales sobre otras eespecies y sobre el ambiente . bacterias.

Adición del gen Terminator a plantas transgénicas Gen 1 Promotor Tardío Gen 2 Bloqueador Gen 3 Toxina Semillas Viables .

Adición del gen Terminator a plantas transgénicas Inductor químico Gen 1 Promotor Tardío Gen 1 Promotor Tardío Gen 2 Bloqueador Gen 3 Toxina Gen 3 Toxina Muerte del Embrión .

Marcadores Moleculares Selección Asistida .

Que Son Los Marcadores Moleculares? • Una secuencia detectable de DNA o una proteína cuya herencia puede ser monitoreada .

Aplicaciones de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético • Análisis de variabilidad genética • Marcadores ligados a genes de interés agronómico • Marcadores ligados a genes de resistencia a enfermedades • Marcadores ligados a caracteres de herencia cuantitativa (QTL) .

.

The Netherlands. 123 pp. of Plant Breeding. Van Harten. Part IV: Genetic Modification in Vitro. 1991. Madrid.. 1999. Wageningen Agricultural University. 1993. Mutation Breeding.Bibliografía Cubero. 84 p. Wageningen Agricultural University. E. Wageningen. Mundiprensa.. Wageningen. Introducción al mejoramiento genético vegetal. The Netherlands. Genetic Variation. Dep. In: Introduction to Plant Breeding II: Genetic Variation. J.. of Plant Breeding. 365 pp. In: Introduction to Plant Breeding II. A. Protoplastfusion. M. Jacobsen. Dep. .

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