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Procedimientos Generales de Laboratorio

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Procedimientos Generales de Laboratorio, Uso de Equipo, y Consideraciones de Seguridad

Arturo Duarte Ortuño I. Procedimientos de Seguridad
A. Químicos Un número no definido de químicos usados en cualquier laboratorio de biología molecular son peligrosos. Todos los fabricantes de materiales peligrosos son requeridos por ley de surtir al usuario con información pertinente de cualquier peligro asociado con sus químicos. Ésta información es surtida en forma de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales o MSDS. Ésta información contiene el nombre químico, CAS#, datos de peligro a la salud, incluyendo tratamientos de primeros auxilios, datos físicos, datos de fuego y peligro de explosión, datos de reactividad, procedimientos para derrame o fuga, y cualquier precaución especial necesaria cuando se manipule este químico. Un archivo conteniendo información de MSDS de las sustancias peligrosos debe mantenerse en el laboratorio. Además, la información de MSDS puede ser consultada en el internet. Es extremadamente necesario de hacer uso de esta información previamente al uso de un nuevo químico y sin duda en el caso de cualquier exposición accidental o derrame. El instructor/encargado de laboratorio debe ser notificado inmediatamente en el caso de un accidente que envuelva cualquier reactivo potencialmente peligroso.

Los siguientes productos químicos son particularmente notables:
• Fenol - puede causar quemaduras graves • La acrilamida - neurotoxina potencial • El bromuro de etidio – Cancerígeno
Estas sustancias no son dañinas si se utilizan adecuadamente: use siempre guantes cuando se utilizan productos químicos potencialmente peligrosos y nunca pipeteé con la boca alguno de ellos. Si accidentalmente derrama cualquiera de estos productos químicos en la piel, inmediatamente enjuague el área completamente con agua e informe al instructor. Desechar los residuos en contenedores adecuados.

B. Luz Ultravioleta
La exposición a la luz ultravioleta puede causar irritación ocular aguda. Dado que la retina no puede detectar la luz ultravioleta, puede tener lesiones oculares graves y no se dan cuenta hasta 30 minutos a 24 horas después de la exposición. Por lo tanto, use siempre protección ocular adecuada cuando se utilizan lámparas de rayos ultravioleta.

C. Electricidad
Las tensiones para la electroforesis son suficientes para causar electrocución. Cubrir los embalses de amortiguación durante la electroforesis. Siempre apague la fuente de alimentación y desenchufe los cables antes de quitar un gel.

D.

Limpieza general

Todas las áreas comunes deben estar libres de desorden y de utensilios sucios, equipo de electroforesis, etc. deben ser tratados adecuadamente. Dado que usted tiene sólo una cantidad limitada de espacio para llamarla propia, es a su ventaja de mantener su propia área limpia. Dado que va a utilizar las instalaciones comunes, todas las soluciones y todo lo almacenado en una incubadora, nevera, etc deben estar etiquetados. A fin de limitar la confusión, cada persona debe utilizar sus iniciales o de la denominación única para el etiquetado de otros platos, etc material sin etiqueta en los refrigeradores, incubadoras, o congeladores que pueden ser destruidos. Siempre se marca la parte posterior de las placas con sus iniciales, la fecha y los datos experimentales relevantes, por ejemplo, los números de cepa.

II. Preparación de Soluciones
A. Cálculo de Molar, % y Soluciones "X". 1. Una solución molar es una en la cual 1 litro de solución contiene el número de gramos igual a su peso molecular. Ej. Para preparar 100 ml de una solución 5M NaCl = 58.456 (peso molecular del NaCl) g/mol x 5 moles/litro x 0.1 litros = 29.29 g en 100 ml de solución. 2. Soluciones %. Porcentaje (peso/volumen) = peso (g) en 100 ml de solución; Porcentaje (volumen/volumen) = volumen (ml) en 100 ml de solución. Ej. Para preparar una solución 0.7% de agarosa en buffer TBE, pesar 0.7 de agarosa y llevarla a un volumen de 100 ml con el buffer TBE. 3. Soluciones "X". Muchos buffers de enzimas son preparados como soluciones concentradas, por ejemplo 5X o 10X (cinco o diez veces la concentración de la solución a emplear) y son entonces diluidas de tal manera que la concentración final del buffer en la reacción es 1X. Ej. Para configurar una digestión restrictiva en 25 μ l, uno debería añadir 2.5 μ l de un buffer 10X, los componentes de la reacción, y agua para un volumen final de 25 μ l. B. Preparación de Soluciones de Trabajo de Soluciones Concentradas Existentes . Muchos buffers en biología molecular requieren los mismos componentes pero con frecuencia varían en las concentraciones. Para evitar la necesidad de preparar cada buffer desde cero, es útil preparar varias soluciones concentradas base y diluirlas como sea necesario. Ej. Para preparar 100 ml de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), combine 1 ml de una solución 1 M de Tris y 0.2 ml de EDTA 0.5 M y 98.8 ml de agua estéril. Lo siguiente es útil para calcular cantidades de solución existente necesarias: C i x V i = C f x V f , donde C i = concetración inicial, o concentración de la solución existente; V i = volumen inicial, o cantidad de solución existente necesaria; C f = concentración final, o concentración de la solución deseada; V f = volumen final, o volumen de la solución deseada. C. Pasos para la Preparación de Soluciones: Apoyarse en manual de laboratorio de referencia por cualquier instrucción específica en la preparación de una solución en particular y en la etiqueta del envase por cualquier precaución específica en el manejo del químico. Pesar la cantidad deseada de químico(s). Use una balanza analítica si la cantidad es menor a 0.1 g. Coloque el/los químico(s) en un recipiente de tamaño apropiado con una

varilla de agitación. El material de plastic tales como pipetas y tubos de cultivo son surtidos con frecuencia estériles. Añada menos de la cantidad requerida de agua. autoclavados. El material de vidrio debe enjuagarse con agua destilada y autoclavado o secado a 150| C por 1 hora. Pese el agar o agarosa directamente en el recipiente final. cualquier componente adicional.g. a 121° C por 20 min. Tubos hechos de polipropileno son turbios y resistentes a varios químicos. Prepare todas las soluciones con agua doble destilada. los tubos de policarbonato o poliestireno son claros y no son resistentes a muchos químicos. preferiblemente entre una o dos horas. Autoclave.45 μ m. El medio para cultivos de bacterias debe ser autoclavado el mismo día que sea preparado. por ejemplo antibióticos. Si la solución necesita estar a un pH específico. Material de Vidrio y Plástico. Asegúrese que los tubos que esté usando sean resistentes a los químicos usados en su experimento. Ésas deben ser filtradas a través de un filtro estéril de 0. puede ser añadido y las placas pueden entonces ser colocadas. Cuando los químicos se haya disuelto. Para experimentos con RNA. Métodos para aislamiento de DNA A. can be used to make working stocks by adding autoclaved double-distilled water in a sterile vessel to the appropriate amount of the concentrated solution. SDS. contaminación bacteriana y trazas de detergente pueden inhibir reacciones o degradar ácido nucleico. Concentrated solutions. Guardar a temperatura de almacenamiento y checar si hay contaminación previo al uso tomando el recipient a la altura del ojo y agitandolo suavemente. cheque el pHmetro con soluciones buffer frescas y siga las instrucciones para el uso del pHmetro. el material de vidrio y las soluciones son tratados con dietilpirocabonato para inhibir RNasas las cuales pueden ser resistentes al autoclavavado. transfiera a un cilindro graduado y añada la cantidad de agua destilada requerida para completar el volume final. 5M NaCl. Aislamiento a gran escala de DNA de doble cadena . como el fenol y el cloroformo. D. Los medios sólidos para places bacterianas pueden ser preparados de antemano. Algunas soluciones no pueden ser autoclavadas. por ejemplo. de ser posible. Tubos de ensayo sucios. e. Una excepción ocurre cuando se preparan soluciones que contengan agar o agarosa.0. III.22 μ m o 0. El material de vidrio y plastic usado para biología molecular debe estar escrupulosamente limpio. 1M Tris-HCl pH=8. el agar puede ser derretido en un microondas. Las puntas de micropipetas y tubos de microfuga deben ser autoclavados antes de su uso. y almacenados en un recipiente. Cuando sean necesitados.

Sin embargo. son visualizados bajo la luz UV de longitud de onda larga y la banda inferior es removida con una jeringa de 5cc. empezando con la inoculación inicial de 3 ml de antibiótico contenido en el medio con el plásmido o cósmido contenido en la colonia bacteriana. lisis. Durante el curso de éste trabajo se realizaron varias modificaciones al protocol anterior. diluido y precipitado con etanol. El DNA recuperado es medido mediante la toma de lecturas de absorbancia a 260 nanómetros. . aunque hay una ligera pérdida de rendimiento acompañado de tiempos reducidos de crecimiento. y la bola final de DNA es resuspendida en buffer y ensayada por digestión restrictiva como detectado en electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo. El el supernadante que contiene el DNA es transferido a un nuevo tubo. El DNA es eluído durante incubación a 65° C y el DNA conteniendo supernadante es recolectado después de centrifugación y separación de las partículas de tierra diatomea. equilibradas por el gradient de densidad del cloruro de cesio después la ultracentrifugación. secado. El A260 conteniendo fracciones es combinado. y el DNA plásmido o cósmido es precipitado por la adición de polietilenglicol y recolectado por centrifugación. Por ejemplo. Después del tratamiento con RNasa. el DNA es resuspendido en buffer RNasa y tratado con RNasa A y T1. se observó que el DNA cósmido recombinante aislado del cultivo celular creció bajo estas condiciones. y clarificado del lisado son pasos son pasos efectuados como se describe arriba. Brevemente. Después de la concentración por precipitación con etanol. incubadas en un buffer de lisozima. El tratamiento de la nucleasa es necesario para remover el RNA por digestion ya que el RNA compite con el DNA para el vínculo con la tierra diatomea. Recientemente. y el incremento del volumen del cultivo de 50 ml. El bromuro de etidio mancha las bandas de DNA plásmido o cósmido.El método usado para el aislamiento a gran escala de DNA cósmido y plásmido es una modificación no publicada (16) de un procedimiento de alcalinólisis (17. y después a 4 l. pero siguiendo la precipitación delDNA por polietilenglicol. y después resuspendido en buffer. El DNA es resuspendido en un buffer conteniendo cloruro de cesio y bromuro de etidio. y el lisado es clarificado primero por filtración del precipitado a través de estopilla y después por centrifugación. El DNA asociado a la tierra diatomea es entonces recolectado por centrifugación. en contraste el DNA plásmido recombinado.18) seguido por una ultracentrifugación en equilibrio de gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio (1). lavado varias veces con buffer de etanol y acetona. inicialmente los tiempos de crecimiento de las células incluyeron tres incubaciones sucesivas por la noche. se contaminó con moléculas de DNA cósmido suprimidas. y tratadas con detergente alcalino. el DNA conteniendo supernadadnte es vinculado a la tierra ditomea en un buffer caotrópico de hidrocloruro de guanidina por incubación a temperatura del cuarto. éstas supresiones son evadidas por la aplicación de cada una de las tres incubaciones sucesivas por ocho horas en lugar de por la noche. un método basado en tierras diatomeas (19-22) fue usado para aislar DNA plásmido o cósmido de un lisado celular. El crecimiento celular. las células que contienen el deseado plásmido o cósmido son cosechadas por centrifugación. Las proteínas solubilizadas en el detergente y las membranas son precipitadas con acetate de sodio. el cual es cargado en tubos de polialómero y sujetos a ultracentrifugación de la noche a la mañana. El bromuro de etidio intercalado es separado del DNA cargando la solución en una columna de intercambio de iones en equilibrio. el DNA es ensayado por digestión restrictiva.

centrifuge a 10. 4. e incube por 5min en un baño de hielo-agua. Las placas de células pueden ser congeladas a -70°C en este punto. 9a. centrifuge como antes. selle con tapones de goma y asegure adecuadamente. y decante el medio. y mezcle cuidadosamente. Transfiera la muestra a tubos de polialómero para centrífuga de 35 ml. 6.. . Transfiera 12. y 37 g de cloruro de cesio (Var Lac Oid Chemical Co. 5. e incube por otras 810 horas. Añada 105 ml de 3M NaOAc. proteinas. Resuspenda las placas de células en un total de 70 ml de solución GET/Lisozima (35 ml por cada frasco) removiendo gentilmente la placa con una espátula e incubando por 10 minutod a temperatura de almacenamiento.) (la concentración final del cloruro de cesio debe ser 1 g/ml). Transfiera el lisado a un frasco de centrifugación de 250 ml. Clarifique el lisado de SDS precipitado. Centrifuge a 60. Tome una colonia bacteriana que albergue el DNA plásmido o cósmido de interés y colóquela en un tubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 2 ml de medio LB suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C por 8-10 horas con agitación a 250 rpm. e incube por unas 8-10 horas adicionales. 5 ml de bromuro de etidio 5 mg/ml. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer flask conteniendo 50 ml de un medio similar.Protocolo 1. Resuspenda las placas de células en medio Viejo y transfiera a dos frascos.5 ml del cultivo a cada uno de los 4 litros de mdio similar. tape bien. pH 4. Inc.8 (52. Para la purificación del gradiente de cloruro de cesio: 7a. mezcle gentilmente invirtiendo el frasco algunas veces. membranas. agite y mezcle. 8a. 11a. añada un cuarto en volumen de NaCl 50% PEG/0. 3. e incube en un baño de hielo-agua por 30-60 minutos. (Nota: No arremoline el lisado en ningún momento porque esto puede cizallar el DNA cromosomal). remueva las burbujas de aire. 2.5 ml por cada frasco). Albergue las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500 ml en el RC5-B usando el rotor GS3. Agregue un total de 140 ml de solución lisis alcalina (70 ml por cada frasco).000 rpm por 30 minutos a 4° C en el RC5-B usando el rotor GSA. e incube en un baño de hielo-agua por 1-2 horas. Colecte el DNA precipitado por el PEG por centrifugación en frascos de 250 ml a 7000 rpm por 20 minutos a 4°C en el RC5-B usando el rotor GSA.000 rpm de 16-20 horas a 15-20°C en el Sorvall OTD-75B ultracentrifuge (DuPont) usando el rotor T-865. Junte los supernadantes clarificados en un recipiente limpio.5 M. Disuelva las placas en un combinado total de 32 ml de buffer TE 100:10. 10a. y DNA cromosomal colando a travez de una doble capa de estopilla.

pH 7. 12b. 9b.5 volumenes de 95% de etanol frío/acetona.5 ml. añada 80% de etanol. y añada 40 ml de tierra diatomea definida en HCl-guanidina (100 mg/ml) por cada frasco. centrifugue como antes. 13b. Resuspenda el DNA en buffer TE 10:0. Resuspenda la placa en 20 ml de buffer TE 10:1 TE. decante. Incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos. Reúna fracciones con un A260 de 1.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml. y eluir el DNA envolvente por incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente. y colecte fracciones de 0. y centrifugue como anteriormente. añada un volumen de ddH2O. Centrifugue a 9.6 hasta que la solución Dowex tenga un pH de 7. 15a.000 rpm por 30 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. y remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja calibre 25.12a. Decante el supernadadnte y drene la placa de DNA. Reúna los supernadantes del paso 6 en frascos de 500 ml y agregue RNasa A libre de DNasa y RNasa T1 de tal forma que la concentración final de RNasa A sea 40 ug/ml y de RNase T1 sea 40 U/ml. Decante con cuidado el supernadante. y seque la placa de DNA en un horno a vacío. Repita si es necesario. Combine los supernadantes que contienen DNA y precipite el DNA en tubos de vridrio Corex de 35 ml agragando 2. Decante el supernadante y seque la placa en un horno a vacío. Centrifugue a 9. 10b. 11b. y precipite con etanol por adición de 2.6.000 rpm por 10 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. Decante el supernadante. resuspenda cada placa en 40 ml de acetona.5 volumenes de etanol frío al 95%.000 por 10 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. Equilibre la resina Dowex AG (BioRad) por centrifugación sucesiva. y después HCL-Tris 1M. Visualice el DNA teñido por el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda larga.1. 8b. 13a. y centrifugue como antes. 15b. resuspenda cada placa en 40 ml de buffer de lavado de tierra diatomea. Añada un volumen igual de isopropanol y precipite a temperatura de cuarto por 5 minutos. (Sería conveniente primero remover y descartar la banda superior). resuspensión. 14a. Incube al menos 2 hours a -20°C. cargue la muestra de DNA en una columna equilibrada Dowex 1. Permita que el DNA esté a temperature ambiente por 5 minutos con mezclado ocasional.000 rpm por 45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34.5 ml. y decantando con 1M NaOH. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 9. centrifuge a 10. agua. Decante el supernadante. Resuspenda cada placa de DNA en 20 ml de buffer TE 10:1. 14b. . Para remover el bromuro de etidio. Para purificación basada en tierra diatomea: 7b.

Nota: Éste procedimiento es el método de selección para aislar platillas basadas en plásmido de doble cadena para Reacciones de Rotulado con Tinte de Secuencia Terminadora Sequenase. proteínas. y DNA cromosomal vertiendo a través de una doble capa de estopilla en un nuevo tubo cónico de 50 ml. añada 04 ml de solución lisis alcalina.16b. 5. . B.8. alrederor de 50 ug de DNA son recuperados. mezcle suavemente por agitación. Centrifugue a 3. mezcle suavemente. Protocolo 1. membranas. 2. Aislamiento Midiprep de DNA de doble cadena Una midi-prep de asilamiento de DNA de doble cadena ha sido creada para generar una cantidad suficiente de DNA platilla para varias reacciones catalizadas de terminador fluorescente Sequenase[TM]. El producto aproximado de DNA de doble cadena usando éste método es 1 ug de DNA por ml de cultivo celular.000 rpm por 20 minutos a 4°C en la centrífuga de mesa Beckman GPR. Resuspenda la placa seca de DNA en 2 ml de buffer TE 10:0. e incube por otras 11-14 horas. similar al discutido anteriormente en el aislamiento de DNa a gran escala.1 y ensaye por concentración para lecturas de absorbancia a 260 nm o por electroforesis de gel de agarosa. Las plascas de células pueden congelarse a -70°C en este punto. 4. e incube en un baño de hielo-agua por 30-60 minutos. 3. una colonia bacteriana la cual alberga el plásmido de interés es tomada en 3 ml de medio líquido conteniendo ampicilina e incubado en un agitador a 37°C por 8-10 horas. Después del albergado de células por centrifugación. Para 50 ml de cultivo celular. Tome una colonia de bacteria que albergue el DNA plásmido de interés y colóquela en un rubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 3 ml de medio 2xTY suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 8-10 horas con agitación a 250 rpm. Añada 4 ml de 3M NaOAc. Clarifique el lisado de SDS precipitado. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer conteniendo 50 ml de un medio similar. y 5 ug son usados comúmente en una reacción de terminación Sequenase[TM]. pH 4. e incube por 5 minutos en un baño de hielo-agua. Resuspenda las placas de células en 2 ml de solución de GET/Lisozima. Junte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en tubos cónicos de 50 ml en la centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. En este tiempo. el cultivo es transferido a 50 ml de medio que contiene ampicilina e incubado por otras 10-12 horas. se efectúa un método de purificación de tierra diatomea basado en lisis alcalina (19-22). El DNA purificado es ensayado crudamente por concentración y pureza mediante electrophoresis de gel de agarosa contra estándares conocidos. Aqui.

Las células son sucesivamente incubadas con un buffer RNasa-lisis. y el DNA plásmido es recuperado del supernadante por precipitación con isopropanol. El DNA es checado crudamente para concentración y pureza usando electrofóresis de del de agarosa contra estándares conocidos. Decante el supernadante. Decante el supernadante y seque en un horno a vacío. Decante el supernadante. la placa cellular es resuspendida en un buffer hipotónico de sucrosa. Después de remover las proteínas precipitadas y las membranas. una modificación de éste método empleando tierra diatomea (19-22) algunas veces es usado para el aislamiento de plantillas de doble cadena para DNA secuencial con cebadores fluorescentes. 10. alícuotas más pequeñas de antibiótico conteniendo medio líquido inoculado con colonias celulares que contienen plásmido son incubadas en un agitador a 37°C por 12-16 horas. añada 20 ul de RNasa libre de DNasa a 20 mg/ml e incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos. y acetate de sodio.000 por 5 minutos en la centrífuga de mesa Beckman GPR. 8.000 rpm por 5 minutos en una microcentrífuga a temperatura del cuarto. Decante el supernadante a un tubo de polipropileno para centrífuga de 50 ml. 9.6 ml de buffer TE 10:1. Centrifugue a 3. 11. detergente alcalino.6. C. Transfiera el supernadante a un Nuevo tubo de microcentrifugación de 1.1 y ensaye para concentración por electroforesis de gel de agarosa. Como el DNA superenrrollado es deseado para el secuenciado de DNA de doble cadena. Sin embargo. Un rendimiento típico para éste método de aislamiento de DNA es 10-15 ug de DNA plásmido de 6 ml de cultivo inicial. Añada 7 ml (igual volumen) de tierra diatomea HCl-guanidina (20 mg/ml) y permita que el DNA esté en contacto con la temperatura ambiente por 5 minutos con mezclado ocasional. y centrifugue como antes. El lisado es clarificado de proteínas precipitadas y membranas por centrifugación. Resuspenda la placa de DNA secada en 40 ul de buffer TE 10:0. 14. 13.5 ml y centrifugue a 12.000 rpm por 5 minutos en la centrífuga de mesa Beckman GPR. Después colectando el plásmido contenido en las células por centrifugación. Aislamiento Miniprep de DNA de doble cadena El método estándar para el aislamiento miniprep de DNA plásmido incluye la misma estrategia general que el aislamiento a gran escala. 7. y centrifugue como anteriormente lo hizo. resuspenda en 7 ml de acetona.5 ml y precipite con etanol. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 3. Transfiera el supernadante a un tubo de microcentrifugación de 1. resuspenda en 7 ml de buffer de lavado de tierra diatomea. el plásmido conteniendo supernadante es incubado con tierra diatomea e hidrocloruro de guanidina y esta mezcla es añadida a uno de los 24 pozos en el BioRad . y eluír DNA aprisionado por incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente. 12. Resuspenda la placa en 0.

pH 4. 6. 5. Protocolo 1. y resuspenda la placa de DNA seca en 100-200 ul de buffer TE 10:0. El DNA asociado a la tierra diatomea es lavado para remover el hidrocloruro de guanidina con un buffer de etanol. proteínas. Nota: Esta es una típica mini-prep hasta el paso 7. El DNA recolectado es concentrado por precipitación con etanol y ensayado en crudo para concentración y pureza por electroforesis de gel de agarosa contra estándares conocidos. Para reacciones de de secuenciado para Sequenase terminador rotulado use el procedimiento Midi-prep detallado anteriormente. y después secado por filtración.5 ml. centrifugue como antes por otros 15 minutos y transfiera el supernadante a un tubo limpio de 1. o en el paso 7b proceder con la purificación de la tierra diatomea para reacciones de ciclo secuenciado para Taq con terminador rotulado.2 ml de solución TE-RNasa (50:10 buffer TE conteniendo 40 ug/ml de RNasa A.2 ml de 3M NaOAc. e incube en un baño de hielo-agua por 15 minutos. Colecte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en un centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. e incube por 15 minutos a la temperatura del cuarto. Clarifique el lisado de SDS precipitado. y DNA cromosomal por centrifugación a 12. y el DNA conteniendo solución es separado de las partículas de tierra diatomea por filtración en un tubo colector. membranas. El supernadante es removido por filtración a vacío sobre un filtro de nitrocelulosa. Resuspenda las placas celulares en 0. transfiera a tubos de microcentrifugación de 1. Electroforise una alícuota de la muestra de DNA en un gel de agasora al 0. Para purificación de base de tierra diatomea: . Las placas celulares pueden ser congeladas a -70°C en este punto.5 ml. El buffer de elución es añadido a los pozos. mezcle con cuidado.8. Para purificación de lisis alcalina estándar: 7a. Tome una colonia que albergue el DNA plásmido de interés y colóquelo en un tubo Falcon de 17 X 100 mm conteniendo 6 ml de metió TB suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 16-18 horas con agitación a 250 rpm. donde en el paso 7a se debe precipitar la muestra y usarla para el ciclo secuenciado de Taq con los tapaporos rotulados.2 ml de solución lisis alcalina. 4. añada 0. 2.5 ml. Añada 0. Transfiera el supernadante a un tubo de microcentrifugación de 1.Gene Prep Manifold.7% para determinar en crudo la concentración y pureza. Precipite el DNA por adición de 1 ml de etanol 95%.1.000 rpm por 15 minutos en una microcentrífuga a 4° C. también puede añadirse RNasa T1 para una concentración final de 10 U/ul) por agitación suave. incube en un baño de hielo-agua por 15 minutos. 3. El producto aproximado de DNA de doble cadena es 3-5 ug de DNA por 6 ml de cultivo inicial. mezcle suavemente por agitación.

precipitación con acetato de sodio de proteínas solubilizadas en detergente y membranas. Añada 1 ml de tierra diatomea en hidrocloruro de guanidina (20 mg/ml) y permita que el DNA esté en contacto con la temperatura del cuarto por 5 minutos con mezclado ocasional. 11b. D. Protocolo 1. el DNA conteniendo fracciones es detectado por la medición de A260 y colectado. Prepare un cultivo en fase inicial de JM101 inoculando un matraz Ehrlenmeyer conteniendo 50 ml de 2xTY con glicerol provisto de JM101 y pre-incubado por 1 hora en unbaño de agua a 37°C. Lave las muestras cuatro veces con 250 ul de buffer de lavado de tierra diatomea. Después el M13RF conteniendo células bacterianas es colectado por centrifugación. Hg.1. 9b. Sin desmontar las abrazaderas negras. como se describió anteriormente. retire las abrazaderas blancas y coloque el estante de recolección con tubos de rosca de 1.7b. y coloque el colector Prep-A-Gene como se describe en el manual. 12b. Encienda la bomba de vacío y ajuste el nivel de vacío a 8 in. permitiendo que todo el el líquido sea filtrado entre los lavados.5 ml en el colector. Hg hasta que el líquido haya pasado a través del filtro. pero resulta en una máxima cantidad de moléculas de M13 RF por célula. Cese el vacío en la llave de paso y remueva el estante de recolección que contiene los tubos. y deje la membrana secarse por 1 minuto. se describe a continuación. Derrame las muestras bien mezcladas dentro de los pozos del colector Prep-A-Gene y filtre a 8 in. Aislamiento a gran escala de M13RF (9) La doble cadena M13RF es aislada para usarse en el corte M13 SmaI. Sujete el colector con las abrazaderas blancas. Después de que el líquido ha sido filtrado. las moléculas de doble cadena son aisladas usando el método del cloruro de cesio para un aislamiento de plásmido a gran escala. usando una pipeta de repetición. la preparación del vector defosforilado. Hg. Después de remover el bromuro de etidio en una columna de intercambio de iones. Tome una placa que represente el M13 clone en cuatro alícuotas de 1. Hg. deje secar la membrana por 1 minuto. y aplique 300 ul de buffer TE 10:1 calentado a 65°C y jale el DNA eluido a 5 in. Reduzca el vacío a 5 in. y entonces cese el vacío. Precipite el DNa con etanol y resuspenda la placa de DNA secado en 30 ul de buffer TE 10:0. y extracción de DNA teñido con bromuro de etidio del gradiente de cloruro de cesio después de la ultracentrifugación. aumente el vacío a 10-12 in. sin agitación. Esto brevemente implica lisis alcalina celular. precipitación de DNA con polietilenglicol. e incube de acuerdo al . Las condiciones de cremientos de células infectadas con la bacteria M13 (ver figura 1) aparece convoluída. 10b. Hg antes de cesar el vacío en la llave de paso.5 ml de fase inicial de JM101. Mientras tanto. 8b. empape la membrana de nitrocelulosa Prep-A-Gene en isopropanol por al menos 3 minutos. y el DNA es concentrado por precipitación con etanol y analizado por digestión enzimática restrictiva y electroforesis de gel de agarosa.

Para remover el bromuro de etidio.5 ml Dowex AG (BioRad). 9. Visualice el DNA teñido con el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda larga. 4. equilibrada como antes. remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja de calibre 25. Las placas celulares pueden se congeladas a -70°C en este punto. proteínas. 2.1. Transfiera el lisado a un frasco de centrifugación de 250 ml. membranas.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml. y cloruro de cesio de manera que la concentración final de cloruro de cesio sea 1 g/ml. 8. añada etanol al 80%. 12. centrifugue a 10. mezcle gentilmente. 3. Añada un total de 24 ml solución de lisozima (6 ml por cada frasco). 6.5 ml por por cada frasco). y precipite con etanol agregando volúmenes de 2. selle con empaques de goma y cierre adecuadamente.procedimiento mostrado en la figura 1 para resultar en 4 litros de bacteria infectada con M13. e incube en un baño de hielo-agua por 5 minutos. remueva las burbujas de aire. y seque la placa de DNA en un horno a vacío. 10. Decante con cuidado el supernadante. 11. decante. mezcle con cuidado. e incube por 5 minutos en un baño de hielo-agua. Añada 48 ml de buffer TTE 50:2:10 (12 ml por por cada frasco) y 2 ml de RNasa A (10 mg/ml) (0. y DNa cromosomal por vertido a través de una capa doble de estopilla. . 5. Resuspenda las placas celulares en un total de 120 ml (30 ml por cada frasco) de buffer STB 1X removiendo suavemente la placa con una espátula.000 rpm por 45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. Incube por lo menos 2 horas a -20°C.5 ml. Resuspenda el DNA en buffer TE 10:0. Resuspenda las places celulares en medio fresco 2xTY para remover fago extracelular contaminante y transfiera a dos frascos. (Sería adecuado remover y descartar la banda superior primero). Transfiera la muestra a tubos de polialómero de 35 ml y llene con una solución 1:1 de buffer TE 100:10 TE y bromuro de cesio. y decante el medio. 7. centrifugue.5 de etanol frío al 95%. Colecte las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500 ml en el RC5-B usando el rotor GS3. Clarifique el lisado de SDS precipitado. cargue la muestra de DNA en una columna de 1. centrifugue como antes.000 rpm por 30 minutos a 4° C en el RC5-B usando el rotor GSA. centrifugue a 10. añada un volumen de ddH2O. Añada 6 ml de bromuro de etidio 5 mg/ml. y colecte fracciones de 0. Junte las fracciones con un A260 de 1. Centrifugue a 60.000 rpm de 16-20 horas a 15-20°C en el Sorvall OTD-75B ultracentrifugue usando el rotor T-865.

Protocolo 1. los cuales son incubados en un agitador a 37° C por 4-6 horas. Después de la incubación. Prepare un cultivo en fase inicial de JM101. y el emplacada es resuspendido en buffer. como anteriormente. Después de la precipitación con etanol. y tome placas basadas en M13 con mondadientes estériles y colóquelas en tubos Falcon de 12 X 75 . Placas de M13 son tomadas con un mondadientes estéril y colocadas en alicuotas de 1. la placa de DNA seca es resuspendida en buffer. Aislamiento de DNA de cadena simple M13 usando fenol Este procedimiento de aislamiento (23) es el método de preferencia para la preparación de plantillas basadas en M13 usadas en reacciones catalizadas de terminador teñido de Sequenase[TM]. La cubierta proteínica del fago es desnaturalizada y extraída por una o incluso dos extracciones con fenol.5 ml de cultivo en fase inicial de JM101. Las partículas de fago son precipitadas con PEG. las células bacterianas son emplacadas por centrifugación y el contenido viral supernadante es transferido a un tubo limpio. recolectadas por centrifugación.E. y la concentración y pureza son analizadas por electroforesis de gel de agarosa contra estándares conocidos. Se prepara un cultivo preincubado de fase inicial de JM101 por transfiriendo glicerol descongelado base a 50 ml de medio líquido e incubado por 1 hora a 37°C sin agitarse.

y colocar la placa de microtitulación en el Biomek. 3. Resuspenda el emplacado en 100 ul de HCl-Tris 10 mM. La placa de microtitulación es cubierta con una placa de acetate sellador. una solución de detergente Triton X-100 es agregada robóticamente a . y entonces colocado cuidadosamente en la tableta Biomek. y permite el aislamiento simultáneo de 48 DNAs de cadena simple por estación de trabajo Biomek 1000 en un lapso de 3 horas (26).mm conteniendo alícuotas de 1. 4. como antes.000 rpm a 4°C para recolectar el fago precipitado.5 ml de las células. Resuspenda el DNA secado en 6 ul de TE 10:0.5 ml conteniendo 0. sin desmontar la placa. La placa entonces es cubierta con otro sellador y centrifugada nuevamente. preparadas como se discutió antes. Incube por 4-6 horas a 37°C con agitación a 250 rpm. Basicamente. Los cultivos infectados con fago son incubados con agitación a 37°C por 4-6 horas. Extraer el DNA con fenol y dos veces con éter. F. y agregue 50 ul de fenol saturado con TE.1 para usarse en reacciones catalizadas de secuenciado de tinte terminador de cadena simple Sequenase[TM]. y después precipite con etanol. como se discutió anteriormente. 7. Centrifugue por 15 minutos a 12. pH 7. una solución diluida más de PEG es añadida robóticamente a cada pozo.2 ml de 20% PEG/2. El supernadante entonces es removido invirtiendo la placa y drenando con cuidado en una toalla de papel. Este paso de enjuague ayuda en la remoción de proteínas contaminantes y RNA. Por cada muestra.6 por arremolinamiento. Procedimiento de aislamiento automatizado Biomek Eperon modificado para DNA de cadena simple M13 Éste método semiautomatizado es una modificación del procedimiento reportado previamente (24. dos alicuotas de 250 ul son distribuidas roboticamente dentro de dos pozos de una placa de 96 pozos de microtitulación.000 rpm a 4°C. Después de remover el supernadante. centrifugados para separar las células bacterianas del viral supernadante.5 M NaCl para precipitar las partículas del fago. 6.5 ml centrifugue por 15 minutos a 12. Mezcle invirtiendo varias veces e incube por 15-30 minutos a temperatura de la habitación. incubada a temperature de la habitación para precipitar las partículas de fago. transferidos a tubos de microcentrifugación. 5. Decante el supernadante y remueva el PEG residual supernadante por succión dos veces. Después de colocar la placa de microtitulación de regreso en el Biomek. Pipeteé 1 ml de la parte superior del supernadante y colóquelo en un tubo de microcentrifugación de 1.25). 2. Una solución de polietilenglicol (PEG) después es añadida a cada pozo y mezclada. Transfiera el cultivo a tubos de microcentrifugación de 1. placas de M13 son tomadas con mondadientes estériles y colocadas en alicuotas de fase inicial de JM101. y después centrifugada. y éste proceso es repetido para cada una de las 48 muestras hasta que los 96 pozos enteros sean llenados.

Después de una breve centrifugación para colectar el condensado. centrifugue y drene como antes. 7. El Biomek entonces juntará robóticamente el contenido de cada par de pozos en tubos de microcentrifugación de 1. EMplaque el fago precipitado centrifugando la placa a 2400 rpm por 20 minutos en una centrífuga de mesa Beckman GPR. Regrese la placa a la tableta.5 M NaCl a cada pozo. El Biomek distribuirá dos alícuotas de 250 ul de viral supernadante por muestra en los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo plano (Dynatech). Cubra la placa con sellador. y el Biomek robóticamente añadirá 200 ul de solución de enjuague PEG:TE a cada pozo.cada pozo. Triton-Tris-EDTA. el DNA de cadena simple es precipitado con etanol. La placa es agitada suavemente y la muestra de cada par de pozos es roboticamente transferida a tubos de microcentrifugación. Separe las células bacterianas del supernadante conteniendo viral por centrifugación a 12. 8. 3. Regrese a la placa a la tableta. Prepare un cultivo en fase inicial JM101 en 50 ml de 2xTY. (Crecimiento por más de 6 horas resulta en lisis celular y contaminación del DNA fago por proteínas celulares y ácidos nucleicos). Remueva la placa selladora y drene el PEG de la placa drenando cuidadosamente de arriba abajo en un Kimwipe. 4. Abra cuidadosamente los tubos y coloque en la tableta Biomek. respectivamente. Usando mondadientes estériles. El producto de la plantilla de cadena simple es aproximadamente 2-3 ug por muestra.5 ml. 2. 5. 9. y etanol-acetato. . y el Biomek añadirá 70 ul de solución TTE a cada pozo. e incube por 4-6 horas a 37°C con agitación a 250 rpm. como anteriormente se hizo. 1. secado y resuspendido. 6. y mezclara por pipeteo de arriba a abajo. Protocolo El procedimiento requerirá 9 filas de puntas P250 (contando del centro de la tablet de Biomek hacia la izquierda) para aislar 48 plantillas (48ISOL). Remueva y agite suavemente para resuspender. Cubra la placa con una placa de acetato sellador e incube a temperatura de la habitación por 15 minutos. los cuales son tapados y colocados en un baño de agua a 80° C por 10 minutos para ayudar a la solubilización de la capa de fago de proteínas en el detergente. transfiera placas individuales de M13 a tubos Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 1 ml de cultivo celular en fase prematura.000 rpm por 15 minutos a 4°C. Una alícuota de cada muestra de DNA es sujeta a electroforesis de gel de agarosa para analizar crudamente concentración y pureza. El modulo reactive debe contener PEG-2000. El Biomek después añadirá 50 ul de solución 20% PEG/2.

Precipite con etanol el DNA agregando 500 ul etanol/acetato a cada tubo.10. Incube los tubos a 80°C por 10 minutos para desnaturalizar la cubierta de proteína viral y después centrifugue brevemente para recoger la condensación.75 ml de medio TB por pozo. Mantenga el mondadientes en el medio por alrededor de 5 minutos para permitir que las células se difundan en el medio. Un procedimiento similar que ha sido automatizado en el Biomek es presentado en otro espacio aquí. . Estas células son colectadas por centrifugación y las placas son manual o roboticamente resispendidas por la adición de solución TE-RNasa. Una solución lisis alcalina es usada para lisar las células y el lisado es precipitado con KOAc. añada 100ul de solución TE-RNAsa-A conteniendo RNAsa T1. y permita que las células crezcan por 24 horas en el agitador/incubador a 37° C a 350 rpm. Aislamiento en 96 pozos de plantillas de doble cadena Un manual como un procedimiento automatizado es dado a continuación. El lisado es clarificado por filtración y posteriormente concentrado por precipitación con etanol. 1. Basicamente colonias que contienen plásmidos de doble cadena sin tomados con mondadientes estériles y colocados en medio e incubados a 37°C por 24 horas con agitación a 350 rpm. 2. Resuspenda las plantillas de DNA en 20 ul de buffer TE 10:0. mezcle por pipeteo arriba y abajo 4-5 veces para resuspender la placa celular y después incube en el incubador/agitador a 37°C por 5 minutos a 350 rpm para mezclar más a fondo. El método automatizado es una modificación de un procedimiento previamente reportado (4) el cual permite el aislamiento de 96 DNAs por estación de trabajo de laboratorio automatizada Biomek 1000 cada dos horas. Una alícuota de cada muestra de DNA es sujeta a electroforesis de gel de agarosa para analizar crudamente concentración y pureza. remueva los mondadientes. Después de descongelar las células. cobra el bloque de 96 pozos con la tapa suelta. G. Tome clones individuales de cada placa on un mondadientes estéril y deposite cada uno por separado en el bloque de 96 pozos conteniendo 1. 12.1. El producto de la platilla de doble cadena es aproxmadamente 3 mg por muestra. Remueva el bloque del agitador/incubador y colecte las células por centrifugación a 2500 rpm por 7 minutos. 11. como se describió anteriormente. Las células pueden se guardadas congeladas a -20°C en el bloque en este punto. 3. Protocolo Manual del método de aislamiento de doble cadena Lo siguiente es un manual del procedimiento para el aislamiento secuencial de plantillas en 96 pozos de doble cadena que ha sido desarrollado en nuestro laboratorio.

las plantillas secadas deben ser almacenadas a -20°C. 7. Tome colonias usando un mondadientes y colocándolas en 1. y coloque el bloque en un agitador/incubador a 37°C por 5 minutos a 350 rpm para mezclar a fondo y cizallar el DNa genómico para reducir la viscosidad de la solución. Drene el supernadante y permita que las placas se drenen invertidas. 6. el emplacado es colectado por centrifugación. Coloque el bloque de 96 pozos conteniendo las células en la tableta de Biomek en la posición etiquetada “Minitubos de 1. Después añada 100ul de acetato de sodio o de potasio 3M. Coloque el filtro miniporo en la posición etiquetada "placa de titulación de fondo plano de 96 pozos". Un adicional de 75 ul del supernadante es transferido a un tubo de reacción Robbins PCR (en formato de tubo de 96 pozos) y precipitado con 200 ul de etanol al 95%.0 ml". Las placas celulares pueden ser congeladas en este punto si es necesario. 5. Transfiera 10 ul del supernadante a los respectivos tubos de reacción de ciclo secuenciado. Específicamente. siendo cuidadoso de no transferir ninguna célula de desecho.4. Remueva con cuidado 200 ul del supernadante de cada pozo en el bloque de 96 pozos con la pipeta de 12 canales y transfiéralos a una placa de microtitulación de fondo en V.8 en el tercer módulo. Centrifugue el bloque en la centrífuga GPR a 3000 rpm a 4°C por 30 minutos. Encienda el Biomek. arranque el programa DSISOL2 y configure el Biomek como se indica en la pantalla de configuración. la solución lisis alcalina en el segundo módulo de reactivo y el 3 M KOAc. lavado tres veces con etanol al 70%. Antes de agregar el terminador fluorescente a la mezcla de reacción de ciclo secuenciado. Agite el bloque a mano para mezclar los reactivos y después incube a la temperature del cuarto por 1 hora con arremolinado intermitente. . 5. 2. Colecte las células por centrifugación a 1800 rpm por 7 min. 3. Presione ENTER para continuar con el programa. 4. Después guarde a -20°C por 30 minutos. Coloque el bloque a -20degC por 30 minutos. El siguiente es un procedimiento para el aislamiento automatizado de plantillas de 96 pozos de doble cadena que se ha desarrollado en nuestro laboratorio. y precipite con 150 ul de etanol al 95% (sin acetato añadido). y secado directamente en los tubos de reacción de ciclo secuenciado. y almacenado seco at -20°C para su uso posterior. 9. Remueva el bloque del incubador/agitador y entonces añada 100ul de solución lisis alcalina. 8. debe poner la solución TERNasa en el primer módulo. pH 4.8 ml de TB con sales de TB conteniendo el antibiótico apropiado y agite por 22-24 horas a 350 rpm en un bloque de 96 pozos con cubierta. lavado tres veces con etanol al 70%. 1. pH 5.

1 para usar una química secuencial de colorante iniciador o colorante terminador. se le añade buffer y el DNA es resuspendido para incubarlo a 55°C por la noche. El Biomek añadirá 100 ml 3M KOAc. 8. transferirá el volumen entero a la placa filtro conteniendo la solución lisis alcalina y mezclará otra vez. el Biomek añadirá 100 ml de solución lisis alcalina a los pozos con la placa de filtro. 11. se agrega buffer de citrato estándar. Primero el Biomek añadirá 100 ml de solución TE-RNasa a las placas celulares y mezclará para resuspender parcialmente. Algunos escogen colocar la placa filtro a -20°C por 5 minutos en este punto. El DNA es precipitado con etanol. Decante y lave con 500 ml de etanol al 80% y centrifugue por 5 minutos adicionales a 3000 rpm. y después precipitado con etanol una segunda vez. El supernadante recolectado en el bloque de 96 pozos es el DNA crudo y debe ser precipitado con etanol antes de su uso mediante la adición de 1ml de etanol al 100% e incubando a -20°C por al menos 30 minutos. Ajuste la filtración del aparato con un bloque de 96 pozos limpio para recolectar el filtrado (lave y reuse el bloque usado para el crecimiento). 9. Seque a vacío. Una vez que el emplacado este seco. Aislamiento de DNA genómico desde sangre El aislamiento de DNA genómico es desarrollado de acuerdo al protocol del FBI (27).8 a los pozos de la placa filtro y mezclará al los lados de los pozos. El Biomek después mezclará la suspensión celular otra vez. Después de que las muestras de sangre son descongeladas (almacenadas a -70°C en tubos a vacío de EDTA). 14. 13. Protocolo (actualizado 10/30/98) . se mezcla y el tubo es centrifugado nuevamente. pH 4. H. Decante el supernadante. y después de una centrifugación la capa acuosa es removida a un tubo de microcentrifugación fresco. resuspendido en buffer. Siguiente. drene invertido en una toalla de papel. la solución de DNA genómico es analizada por la cadena de reacción de polimerasa. A la muestra entonces se le extrae el fenol una vez con una solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Transfiera la placa filtro al QiaVac Vacuum Manifold 96 y filter usando agua de vacío solamente (no force la filtración ya que las placas son frágiles y podrían perder su sello). 7. Resuspenda en 50 ml de TE 10:0. 10. el emplacado es resuspendido en una solución de detergente SDS y proteinasa Km y la mezcla es incubada a 55° C por una hora. Centrifugue por 25 minutos a 3000 rpm en una centrífuga enfriada Beckman GPR. Esto comúnmente toma menos de 20 minutos. 12. La porción superior de supernadante es descartada y se añade buffer adicional.6. se mezcla y los tubos son centrifugados. Después de que el supernadante es descartado.

y mezcle. 7. 10. 2. Remueva cuidadosamente la capa acuosa y colóquela en un nuevo tubo de microcentrifugación de 1. Remueva 1 ml del supernadante y descarte en desinfectante. mezcle. 6. centrifugue como antes por 1 minuto.000 rpm en una microcentrífuga. agite. Decante el supernadante y drene. Decante el supernadante y enjuague el emplacado con 1 ml de etanol al 80%.2M NaOAc a cada emplacado y vortice brevemente. 8. Bruce A. Añada 20 ul de acetato de sodio 2 M y mezcle. Centrifugue por 1 minuto a 12.5 ml. 3.000 rpm en una microcentrífuga. e incube a 55°C por 10 minutos. Incube por la noche a 55°C. y remueva todo el supernadante. y seque el emplacado en una Speedy-Vac por 10 minutos (o hasta que esté seco). Centrifugue la muestra por 2 minutos a 12. Añada 375 ul de 0. Añada 120 ul de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y agite por 30 segundos. 4. Norman. vortice. Roe. Centrifugue por 2 minutos a 12.000 rpm en un tubo de microcentrifugación. Después añada 25 ul de SDS al 10% y 5 ul de proteinasa K (20 mg/ml H2O) (Sigma P-0390). Universidad de Oklahoma. e incube por 15 minutos a -20° C. Agregue 500 ul de etanol frío al 100%.8 ml de buffer 1X SSC. agregue 1 ml de etanol frio al 100%.000 rpm en una microcentrífuga.000 rpm en una microcentrífuga. Enjuague las muestras congeladas. Muestras de sangre son comúnmente obtenidas como 1 ml de sangre entera almacenada en tubos de EDTA a -70° C. Oklahoma 73019 broe@ou. y a cada muestra de 1 ml. añada 0. 12. 9. vortice brevemente e incube por 1 hora a 55°C.edu Extracción de DNA . 5. 13. agitando periódicamente para disolver el DNA genómico. Resuspenda el emplacado adicionando 200 ul de buffer TE 10:1 TE. mezcle. Añada 1 ml de buffer 1X SSC. Decante el supernadante.1. Centrifugue por 1 minuto a 12. y centrifugue por 1 minuto a 12. Departamento de Química y Bioquímica. Añada 180 ul de buffer TE 10:1. 11. Almacene las muestras a -20°C.

6. Sangre entera es recolectada en contenedores de EDTA disodio y almacenada a -20ºC y un numero de muestras también son almacenadas a -80ºC. Después de la centrifugación el supernadante es descartado y una placa blanca será visible al fondo del tubo. Los tubos después son incubados a una temperature de 37 . 4. Se observó que en almacenamiento prolongado de sangre entera a -20 y -80ºC . PROCEDIMIENTO: 1. 10.55ºC (temperature óptima para la actividad de la proteinasa K) por la noche en un baño de agua o en un incubador.155M NH4Cl. 5. 3ml de sangre entera son transferidos a un tubo cónico de centrifugación (15ml de volumen) al cual 9ml de buffer de lisado de eritrocito 1X (0.1. Cuando se analizó por espectrofotmetría >95% del DNA genómico extraído dió un promedio de pureza de DNA a proteínas en un rango de 1.5mls de buffer SE (75mM NaCl. el producto de DNA disminuyó considerablemente probablemente debido a la degeneración de los glóbulos blancos.. Alternativamente pueden dejarse los tubos en un rotor por 1 hora. Durante este paso el DNA es extraído en el supernadante y las proteínas son separadas en la fase inferior. 0. 1. son añadidos al emplacado. evaluado en el Laboratorio de DNA. Es importante desglosar el emplacado y enjuagarlo bien con buffer de lisado de eritrocito con el fin de limpiar las células blancas de la sangre del hemo remanente. Este emplacado debe ser lavado por al menos 3 veces por adición de 3ml de buffer de lisado de eritrocito y repitiendo los pasos 3 y 4. Malta. 7. 25mM Na2 EDTA. El DNA sera precipitado con rotación suave del tubo y se observa un hilo como hebra.75mls de cloroformo. Después de la centrifugación se observan 2 fases y debe ternerse cuidado de no crear un disturbio en la interfase. 8. 9. Después de descongelar. pH 8. Escuela Médica. Durante este paso las membranas de las células blancas de la sangre son desnaturalizadas y el DNA sale en solución. La fase acuosa superior (conteniendo el DNA) es transferida a un tubo de centrifugación cónico estéril limpio usando una pipeta Pasteur. La solución es dejada por 10 minutos a RT con mezclado occasional por inversión seguido de una centrifugación por 5 minutos a 4000 rpm.5mls de buffer SE junto con 750µ l NaCl 6M (saturado) son agregados en cada tubo. (1988). seguido de la adición de un volumen igual de isopropanol. La emulsion sera centrifugada por 10 minutos a 2000 rpm con minima fuerza de rompimiento. para facilimtar la hemólisis de RBCs se recomienda almacenar la muestra fresca por unas cuantas horas en un enfriador ya que el frío destruye las células rojas. 2. 3. Los tubos son mezclados vigorosamente (en un vórtice) por alrededor de 20 seg con mezclado ocasional por al menos 30min. 1. 10mM KHCO3.0) conteniendo 100µ g/ml de proteinasa K y 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS w/v). pH 7. En el siguiente protocolo el DNA fue extraído de leucocitos de sangre periférica usando 3ml de sangre entera. .9 y una concentración de 100ng/ml.Ésta es una modificación de un procedimiento de salado como es descrito por Miller et al. Después de la incubación.4) debe ser añadido. seguido de la adición de 3.1mM Na2 EDTA. Los volúmenes de buffers y reactivos usados deben ser ajustados de acuerdo al volumen de sangre entera a usarse.7 .

Rama Genética. El emplacado seco es resuspendido en buffer TE (1M Tris-HCl.29 g f. absoluto HCl Alcohol Isoamílico Sigma. Después de descartar el supernadante el emplacado es secado del exceso de etanol usando centrifugación a vacío o dejando los tubos abiertos e invertidos e un horno a alrededor de 50 . NCI Instituto Nacional de Salud Reactivos Cloruro de amonio (NH4Cl) Cloroformo Mallinckrodt. [10 mM] Na2EDTA 0.5 M f.c.11.65ºC por una hora.c.0) y dejado por la noche en un rotador. I-3643 Isopropanol (2-Propanol) Fenol Carbonato de potasio (KHCO3) Proteinasa K EM Science. Cat.034 g or 200  l EDTA 0. pH 8. 12. Usando una espátula estéril o un bucle se transfiere la hebra de DNA a un tubo estéril de microcentrifugación conteniendo 1ml de etanol al 75%.5M EDTA. 24568-2 (100 mg) Acetato de sodio Cloruro de sodio EDTA de sodio (Na2EDTA) Dodecilsulfato de sodio (SDS 10%) Digene Diagnostics. La concentración de DNA es determinada por electrophoresis de gel de agarosa o por espectrofotometría y ajustando a la concentración deseada adicionando más buffer TE. Cat. Cat. WV.c. Repita este paso una vez más. pH 8. Cat. [0. El supernadante es descartado teniendo cuidado de no descartar el emplacado. Para ajustar una concentración menor uno debe usar otros métodos cuantitativos tales como Picogreen (Molecular Probes) usando espectrofluorometría ya que la espectrofotometría no es precisa y sensitiva a muy bajas concentraciones. 0. Preparación de DNA desde sangre Sección Genómica de Cáncer.0 Preparación Buffer lisis NH4Cl 8. 14. Es importante notar que antes de ajustar y leer la concentración de DNa uno debe obtener una muestra homogénea de DNA lo cual no es muy fácil de conseguir ya que el DNA es muy viscoso. El DNA es entonces lavado por inversión para limpiarlo de cualquier sal remanente y el tubo es centrifugado a 11000g por 4 minutos. [155 mM] KHCO3 1 g f. 15. 3400-1016 Buffer Tris EDTA. Inc. 13. Gibbstown.1mM] Llenar a 1000 ml con agua destilada . 4440 Etanol.

Remueva el supernadante y congele el emplacado. añada 1 ml de buffer SE y resuspenda el emplacado.2 con CH3COOH Proteinasa K (10mg/ml) Disolver 100 mg de Proteinasa K en 10 ml de TE por 30 min a la temperatura del cuarto Alicuote y almacene a –20°C Procedimiento 1. agite suavemente.c. 5. y centrifugue por 10 min a 4°C (1200 rpm). agite a mano por 10 min. Añada 5 ml de buffer SE y 10 ml de fenol. [75 mM] Na2EDTA 8.) Añada 5 ml de buffer SE y resuspenda el emplacado. añada 300 μl de acetato de sodio 3 M (pH5. Remueva el supernadante (sangre de desecho). 3.0 con 1 M NaOH por cada uso Acetato de sodio 3 M acetato de sodio 246 g/L Ajustar pH 5. Remueva el supernadante (sangre de desecho). . Use un criotubo y centrifugue a 1200 rpm por 10 min a 4°C. Transfiera el supernadante a un nuevo tubo. 4. Para hacerlo. Transfiera el supernadante a un tuboe nuevo. y centrifugue por 10 min a 4°C (1200 rpm). y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.5-1 ml de buffer TE por la noche a 4°C en un agitador rotativo.4 con 1 M HCl o NaOH por cada uso Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 Cloroformo 24 ml Alcohol isoamílico 1 ml Buffer SE NaCl 4. 9. y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C. y centrifugue a 1200 rpm por 10 min a 4° C. incube por 30 min en hielo. Remueva el supernadante (sangre de desecho). 8. (Es posible almacenar el emplacado a -80°C. De nuevo transfiera el supernadante a un tubo nuevo.2) y 10 ml de isopropanol. use una pipeta de vidrio. resuspenda el emplacado.41 g o 50 ml EDTA 0. (Si el DNA no se disuelve déjelo más tiempo a 4°C en el agitador rotativo). agite a mano por 10 min. añada 10 ml de buffer lisis. haga un gancho sobre un mechero bunsen y capture el DNA.Ajustar pH 7. A 10 ml de sangre entera (EDTA. añada ml de buffer SE. agite a mano por 10 min. 6. citrato) añada 30 ml de buffer lisis. e incube por la noche a 37°C en un baño de agua. añada 40 l proteinasa K (10 mg/ml) y 250  l 20% SDS.c. Lave el DNA en etanol al 70% y disuelva el DNA en 0. y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.5 M f. añada 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). resuspenda el emplacado. añada 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). 7. agite suavemente.39 g f. [25 mM] Llenar a 1000 ml con agua destilada Ajustar pH 8. agite suavemente hasta que el DNA sea precipitado. heparina. 2.

lave las células dos veces con 10 ml de buffer DNA y resuspenda en 10 ml de buffer DNA. Cat. Cat. Preparación de DNA desde Células Linfoblastoideas Reactivos Cloroformo Mallinckrodt.5 M EDTA 100 ml dH2O agua 300 ml Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1 Cloroformo 24 ml Alcohol isoamílico 1 ml Procedimiento 1.0 100 ml 0. Lave el emplacado celular dos veces con 10 ml 1X PBS. 10010-023 Proteinasa K Gibco BRL. Tome el matraz con el cultivo celular y transfiera el contenido a un tubo de centrifuga de 15 o 50 ml. Cat. 24568-2 Acetato de sodio. incube por 10 min en hielo. 15513-039 Buffer fosfato salino (PBS).2 Dodecilsulfato de sodio (SDS). Cat. I-3643 Buffer fenol Gibco BRL. pH 8. pH 5. 10% Buffer TAE Bio Whittaker. 2. 1X Gibco BRL. Mida la concentración de DNA en un espectrofotómetro (Pharmacia. 16-011V Tris HCl.0 Trypsin Gibco BRL. pH 8. 15230-170 Preparación Buffer DNA 1M Tris HCl. Cat. Centrifugue los cultivos celulares por 10 min a 1200 rpm. centrifugando entre lavados. . 25200-056 Agua destilada Gibco BRL. 3 M. Cat. Remueva el supernadante. GeneQuant) y corra 200 ng en un 1% gel de agarosa. Cat. Cat. 4440 Etanol. absoluto Alcohol isoamílico Sigma.10.

5. Remueva y descarte el supernadante y repita los pasos del 2-4 dos veces más. Añada 200 µl de buffer lisis a cada tubo y arremoline para suspender uniformemente. Use una pipeta de vidrio estéril para transferir el DNA precipitado a un tubo de 30 ml de 70%. Reactivos: 1) Buffer Lisis 0. centrifugue por 10 min a 10°C a 3000 rpm. Microfugue 25 segundos a 16000xg para emplacar el nuclei. Añada 36 μl (1/10) de acetato de sodio 3 M (pH 5.5 ml conteniendo 20 µl de 10 mM EDTA. 6. agite suavemente hasta que el DNA se precipite. 5. 4. DNA desde sangre entera para PCR (from Higuchi.2). (1989) Amplifications 2: 1-3) 1. Obtenga de 65-100 µl de sangre por sangrado retroorbital con un tubo microcapilar heparinizado. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Resuspenda el emplacado nuclear en 100 µl PBND con 60 µg/ml de proteinasa K e incube a 55 C por 60 minutos (o por la noche si es conveniente). Seque el emplacado en un speed vac por 5 min. Añada 3 ml de buffer DNA. Mida la concentración de DNA y corra de 1-5  l (aproximadamente 200 ng) por electroforesis en gel de agarosa (1%) en buffer 1X TAE.8 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). 4. Añada 3. Transfiera el DNA a un tubo eppendorf estéril. 2. 8. Centrifugue por 10 min a 1200 rpm y remueva el supernadante. Almacene en hielo hasta el procesamiento. Agite suvemente e incube a 45°C en unbaño de agua por la noche. 6. R. Coloque en un estante de invertido e invierta por 2 hr para enjuagar a fondo. Disuelva el DNA en 300  l agua estéril y coloque en un agitador rotativo por la noche a 4°C. y agregue 3 volumenes de etanol al 100%. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 3.8 ml de fenol y 1. resuspenda el emplacado.32 M Sucrosa 10mM Tris-HCl (pH 7.6 ml de cloroformo/alcohol isoamílico y agite a mano por 10 min (RT). Añada 1. 7. Expulse la sangre inmediatamente a un tubo de microcentrifugación de 1. 10. mezlce suavemente. o hasta que no haya remanentes de hemoglobina. centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm). Añada 1-5 µl de solución de DNA para 25 µl de reacción PCR. Agregue 100 μl de Proteinasa K (10 mg/ml) y 400 μl de 10% SDS. Centrifugue por 20 min a 14.3) . Caliente las muestras a 97 C por 10 minutos para inactivar la proteinasa K. 9. 7. Mezcle inmediatamente para prevenir la formación de coagulos. 3.6 ml de fenol.3.000 rpm. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. agite a mano por 10 min (RT).5) 5 mM MgCl2 1% v/v Triton X-100 2) PBND (PCR Buffer con detergentes no iónicos)* 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl (pH 8. Agite a mano por 10 min (RT). centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm).

Asi. 200 µM final) 0.45% (v/v) Nonidet P40 0. Comprende la separación de la fracción de células blancas de la sangre entera. lisis con detergente.5 mM MgCl2 (final) 2 µl 2.5 µl 20 µM reverse primer (0. La gran variedad de adsorbentes de vidrio se ha reportado los últimos años para ser usados en la extracción de DNA desde varias fuentes. la sangre entera representa una cierta dificultad para la extracción de DNA inmediata debido a la presencia de grandes cantidades de protein en la muestra. cuando intentamos aplicar . El procedimiento tradicional para el aislamiento de DNA de sangre es laborioso y consumidor de tiempo. extracción con fenol y precipitación del DNA con alcohol. Para referencia. La gran recuperación y la calidad del product son provistas por el uso del seleccionado adsorbente basado en video y la optimizada composición del lisado y de las soluciones de lavado.1 mg/ml gelatina 0. citomegalovirus asi como otros virus potencialmente presentes en la sangre.45% (v/v) Tween 20 Autoclave para esterilizar y disolver la gelatina Almacene en congelación *Añada proteinasa K (60 µg/ml) inmediatamente previo a su uso) Reacción típica de 25 µl PCR: 1-5 µl DNA 2. Sin embargo. conteniendo ácidos nucleicos.1 µl Taq DNA polimerasa (puede decrecer a 0. digestion con proteinasa. DNA plásmido de E.coli (3) y DNa genómico de células eucariótidas o procariótidas (1) podría ser traida.05 µl) dH2O to 25 µl Extracción de DNA desde sangre entera por silica gel.5 µl 10x Perkin Elmer buffer.4 µM final) 0.5 mM MgCl2 0. 1.5 mM dNTP mezcla (2. fue la razón de que extractos de DNA aparecieron contaminados por material rojo. Siendo aplicado a pruebas humanas tal procedimiento complicado lleva al personal de laboratorio a un riesgo elevado de ser infectado por SIDA.4 µM final) 0. Introducción Aquí presentamos elnuevo simple y economic procedimiento en el cual el DNA puro es extraído de sangre entera en 15-20 min. inhibiendo la amplificación de PCR.2.5 µl 20 µM forward primer (0. Con respecto a esto un enfoque parece muy atractivo a tratar la sangre entera con un reactive tal que simultaneamente lise la sangre y desnaturalice las partículas virales. hepatitis.5 mM each dNTP. El uso del fuerte agente caotrópico GuSCN para lisar células humanas seguido de la adsorción de DNA en vidrio en polvo se describió por Boom (1) y Bush (2). el aislamiento de fragmentos de DNA de gel de agarosa (4). Esta aproximación emplea la habilidad de los adsorbents basados en vidrio de ligar ácidos nucleicos en altas concentraciones de sal y liberar a bajas.

5. Peletice el adsorbente por giro corto (a 5000 g). 6.851-9) en 100 ml de solución de guanidina. 10 mM Tris-HCl (pH 6. Colecte silica gel por giro corto (3 seg. 7. La mezcla ligadora fue preparada por resuspendido de 4 g de silica gel (Aldrich.2 ml 0. Resuspenda el emplacado en 1. El producto de DNA en el procedimiento es rutinariamente 40 ug por mililitro de sangre. desarrollar un aparato automatizado para la extracción de DNA preferimos el concepto biomecanico basado en vidrio. centrifugue por 10 seg.0 ml de mezcla ligadora. 4. todos los reactivos pueden ser almacenados a la temperatura del cuarto. producto y calidad El tiempo total del procedimiento es 15-20 minutos. Mezcle en un tubo de minicentrifugación de 2. 20 mM EDTA. Reactivos • • • La composición de la solución de guanidina fue: 6 M GuSCN. 9. Parámetros del procedimiento . Procedimiento 1. Resuspenda la silica gel en 100 ul de buffer TE. 5000 g). Resuspenda mezcla otra vez. El lavado de propanol contenido de 25% iso-propanol. 8. Eluya DNA a 65oC por 3 min. La calidad del DNA provee una confiable amplificación de PCR y restricción enzimática. Remueva a fondo el etanol y seque la silica gel a vacío aplicando calor. que permitio la aplicación del procedimiento entero en un tubo. Después. El tamaño del DNA es mayor de 50 kb. La ausencia de nucleasas es provista por la incubación por la noche del DNA a 37oC en presencia de 10 mM MgCl2.5). tome el supernadante.procedimientos de aislamiento de DNA basados en vidrio disponible directamente a la sangre entera. 2. Repita el lavado de la silica gel con la solución de guanidina. Parámetro optimizados del procedimiento. #28.5 ml de sangre entera (conteniendo 50 mM de EDTA como anticoagulante) con 1. 40 g/l Triton X-100 y 10 g/l DTT.0 ml de solución de guanidina por arremolinamiento. 3. composición mejorada de las soluciones de lavado junto con la nueva selección de adsorbente de vidrio resulto en un nuevo corto y económico protocolo el cual provee DNA de perfecta calidad para reacciones enzimáticas y análisis PCR. 25% etanol.0). 10. Incube a la temperatura del cuarto por 3 min. 100 mM NaCl y 10 mM Tris-HCl (pH 8. Las muestras pueden ser almacenadas a temperatura del cuarto por meses sin problema de degradación. Sin embargo. lave la silica gel con propanol de lavado (dos veces) y etanol puro (una vez) de la misma forma. Tiempo.

La sal caotrópica de tiocianato de guanidina fue usada en combinación con el detergente no iónico Triton X-100 a 4% de concentración y el agente antioxidante DTT a 1% de concentración en solución de guanidina. Los parámetros del procedimiento fueron sistematicamente optimizados para proveer los requerimientos dichos.851-9) fue seleccionada como resultado de pruebas comparativas de adsorbentes basados en vidrio comerciales disponibles. Iso-propanol y NaCl fueron incluidos en la composición de la solcuón del alcohol de lavado. 4. La silica gel Aldrich (#28.Los siguientes nuevos elementos han sido introducidos en el procedimiento con el fin de proveer una maxima productividad y calidad de DNA y eliminar de contaminantes el producto: 1. 3. 2. .

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