P. 1
biotecnología vegetal

biotecnología vegetal

|Views: 838|Likes:
Publicado porNataly Soto

More info:

Published by: Nataly Soto on Feb 13, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPT, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

08/18/2013

pdf

text

original

Biotecnología Vegetal

‡ Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos y micropropagación y mejoramiento de plantas y producción de compuestos de interés comercial producción de metabolitos secundarios producción de proteínas producción de polímeros biodegradables y establecimiento de plantas transgénicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metabólicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas, aceites, etc. y fitorremediación remoción de xenobióticos remoción de metales pesados

Sumario

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Micropropagación vegetal Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Sistemas de micropropagación vegetal Alcances de la propagación clonal masiva de plantas Referencias

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro

‡ Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales

‡ La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc. ‡ La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas. ‡ Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales ‡ Micropropagación vegetal ‡ Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis) ‡ Cultivo de meristemos ‡ Cultivo de suspensiones de células vegetales ‡ Cultivo de protoplastos ‡ Cultivo de anteras ‡ Cultivo de óvulos y embriones Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Micropropagación vegetal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

o propagación clonal masiva de plantas superiores.La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales ‡ La micropropagación vegetal. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . ‡ Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura. posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala. luz y fotoperíodo.

Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Asepsia. . .Area de rusticación. . esterilización. ‡ Material vegetal .Luz y fotoperíodo.Cámara de cultivo. . . etc.Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). .Temperatura.Explantes (elección.).Area de preparación de medios. ‡ Condiciones de cultivo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . disección. . .Area de lavado y esterilización.Cuarto estéril.Recipientes.La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo ‡ Laboratorio . .

PO43. glucosa. Ca2+. Co2+. SO42Micronutrientes: Fe2+. Mo2+..7 a 1%) Gelrite® pH 5.. Mg2+. mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0.6 ± 5. Cu2+.Medios de cultivo: composición general Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO3. ICarbohidratos Sacarosa. Zn+.8 Esterilización 1 atmósfera. 15 a 20 minutos en autoclave . K+. Mn2+.

Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales ‡ Soluciones concentradas de macroelementos (100x) ‡ Soluciones concentradas de microelementos (100x) ‡ Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) ‡ Mio-inositol (100 mg/L) ‡ Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L. ‡ Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

.Propiedades físicas de los medios de cultivo Semisólido Consistencia del medio Líquido ‡ El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). *también en medio semisólido . la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad. etc.Cultivo de suspensiones celulares.Inducción de embriogénesis*.).Cultivo de protoplastos. . crecimiento lento. ‡ En el caso de un medio sólido. ‡ El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías: Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . . .La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes.Constituye un factor crítico. .Propiedades físicas de los medios de cultivo ‡ Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite”) para posibilitar el intercambio de gases.5 ± 5.Se ajusta en el rango 5. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.8. .Se modifica durante el crecimiento de los cultivos. ‡ pH: .

Composición de medios de cultivo comúnmente usados .

Composición de medios de cultivo comúnmente usados .

Reguladores del crecimiento comúnmente usados en los medios de cultivos vegetales .

Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).Etileno ‡ Generalidades: .Actúan a bajas concentraciones . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Giberelinas .Citocininas .Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.Reguladores del crecimiento ‡ Grupos básicos de reguladores del crecimiento: .Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.Auxinas .Acido abscísico . . Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta. .

La concentración endógena en la planta varía entre 0. las hojas jóvenes.Crecimiento de secciones de hojas.Acido naftalen acético (ANA) .001 y 0.Formación de raíces adventicias .2.1 mg·Kg-1.Estimulación de la producción de etileno ‡ Se sintetizan en las yemas. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Su transporte es polar ‡ Auxinas sintéticas: .Dominancia apical . .4-diclorofenoxiacético (2.Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis O OH N Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) ‡ Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero químico responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleóptilo de gramíneas. los frutos y en el embrión. tallos y frutos .Acido indol butírico (IBA) .Acción herbicida .4-D) .Alargamiento y división celular .

1 y 500 Qg·Kg-1.Citocininas: en combinación con las auxinas. .Retardo de la senescencia .Cinetina (Kin) .Zeatina (Zea) .Benziladenina (BAP) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Se sintetizan en el embrión y las raíces. determinan diferentes respuestas morfogenéticas ‡ Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro. ‡ Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: . ‡ Su transporte es no polar.Promoción de la división celular . La concentración endógena en plantas varía entre 0.Isopenteniladenina (2iP) ‡ Citocininas sintéticas: .Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos ‡ Citocininas endógenas: . se encuentran en todos los tejidos.Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citocininas) .

Estructura química de las principales citocininas .

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Se sintetizan en hojas jóvenes. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.Germinación de semillas en dormancia . Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos.Floración . ‡ El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. .Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales .Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo Acido giberélico (GA3) ‡ Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi. a partir de plantas de arroz infectadas. ‡ Algunos efectos mediados por las giberelinas son: .Crecimiento de yemas latentes . yemas y en el embrión. ‡ Su transporte no es polar.Movilización de reservas en la semilla.

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo .Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre .Establecimiento del cultivo in vitro ‡ Multiplicación .Multiplicación del material stock ‡ Enraizamiento .Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro ‡ Rusticación .Etapas de la micropropagación vegetal ‡ Iniciación .Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Desinfección superficial de los explantes .

La embriogénesis se presupone de origen unicelular. El resultado es una planta completa. Una célula del explante se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico.Organogénesis . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal.La organogénesis es de origen pluricelular.Embriogénesis ‡ Diferencias entre las dos posibles vías: . No se obtienen por esta vía plantas completas directamente. .Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novo de brotes y/o plantas completas ‡ Posibles vías morfogenéticas: .

Etapas implicadas en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal Elección de una planta madre selecta Explantes ETAPA 1 Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación ETAPA 2 Formación de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernadero Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ETAPA 3 ETAPA 4 .

Elección del explante inicial .

el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar. entre el 0.Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%.05%.Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces). . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2).Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: . .Etanol 70%.01 y 0. entre 5 y 10 segundos. .En el caso del HgCl2.

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro .

Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Propagación vegetativa por embriogénesis somática .

Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato .

Sistemas de micropropagación vegetal .

Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de yemas axilares o apicales Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

m.m.Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes.Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes ‡ Proliferación de yemas apicales o axilares . con una t.) se calcula con base en el número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explante inicial. entre otras variables. entre una resiembra y otra sucesiva. .Por ejemplo. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos. de 5/mes podrían obtenerse 10.El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta técnica. a partir de una única yema inicial. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .La tasa de multiplicación (t. .000 plantas en un solo año. .000. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes. dependiendo de la especie en cuestión.

.

Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de tejidos desdiferenciados Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Esto debe tenerse en cuenta.Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja. debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . células en suspensión.Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos. . etc.Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes. especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala. meristemo.Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro ‡ Consideraciones generales: .) .

Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta .

Sistemas de propagación vegetativa in vitro Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

.

Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de meristemos Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

‡ Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservación y conservación de germoplasma. hongos y/o bacterias. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus.Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos ‡ Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales.

Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos pimarios del tallo y la raíz. persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Meristemos intercalares . .Derivan de la transformación de meristemos apicales. .Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces.Son organogénicos.Dan lugar a los tejidos de conducción. .Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales. .En el cuerpo de una planta se reconocen diferentes tipos de meristemas ‡ Meristemos apicales .En el curso del desarrollo de la planta.Están localizados en la porción terminal o distal del vástago y de la raíz.Se limitan a la producción de órganos florales. .Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces . ‡ Meristemos florales . ‡ Meristemos secundarios .

El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas Cultivo de meristemas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

. . .El número de partículas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White.El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción). Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus. 1934).El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos .Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

.Elección del explante: escencialmente meristemos apicales de vástago. . . .Rusticación.Lupa estereoscópica.Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtención de plantas completas. .5 mm. . etc. . Tamaño aproximado 0.) .Aspectos Asp técnicos del cultivo de meristemas ‡ Equipamiento .Instrumental de disección. ‡ Etapas del cultivo . Eliminación de las primeras hojas.Disección del meristemo bajo lupa.Propagación del material (a partir de estacas uninodales.Elementos generales para cultivo in vitro. Domo meristemático desnudo o acompañado por 2 ó 3 pares de primordios foliares. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Regeneración de yemas axilares.Esterilización de la yema o porción apical del vástago conteniendo al meristemo propiamente dicho.

. ‡ Existe una situación de compromiso entre el tamaño mínimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro.22 mm. Ejemplos prácticos: . . 10% de plantas sanas. 100% de plantas sanas. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Consideraciones prácticas sobre el cultivo de meristemos ‡ La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtención de plantas sanas dependerá del tamaño del explante.1 mm (o menor). Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor.Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no más de 2 pares de primordios foliares.Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: Explantes de 0.Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?: Explantes de 0.

Alcances de la micropropagación vegetal ‡ Propagación vegetativa rápida y a gran escala ‡ Uniformidad seleccionada del material clonado ‡ Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales ‡ Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin ‡ Mayor control sobre la sanidad del material propagado ‡ Introducción rápida de nuevos cultivares Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Conservación de germoplasma ‡ Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal .

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->