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Actividad 1: Las enzimas de restricción: tijeras moleculares.

Preparación previa:

Objetivos.

Alícuota de los reactivos, tales como enzimas de restricción, tampones, y ADN lambda
(opcional)
Vierta geles de agarosa. "Si usted prefiere tener a sus estudiantes vierten sus propios
geles en el laboratorio, preparar la agarosa antes de tiempo, si se prepara con antelación,
de agarosa disuelto debe mantenerse a 55-60 º C hasta que el gel se vierten.
Establecer los estudiantes y estaciones de trabajo docente.

Tiempo requerido.

De 30 minutos a 1 hora, dependiendo de cómo preparamos los geles de agarosa.

Que se requiere?

Cámara de electroforesis, bandejas de fundición, y peines tampón de electroforesis


(1x TAE)
Agarosa en polvo.
ADN colorante de carga.

Procedimiento.

Cada grupo necesitará muestras de enzima de restricción, ADN lambda, y tampón de


restricción. Puedes repartir alícuotas en los tubos para cada grupo, o puedes dejar los
tubos ya hechos para que los cojan cada grupo.

1. Alícuotas de restricción enzimática. Alícuotas de 5 microlitros de dicha


enzima en ocho microtubos de ensayo limpios ( un total de 24 tubos).
Rotular los tubos como: HINDIII, Pstl, y EcoRI.
Importante: Las enzimas de restricción a la temperatura y deben de estar
introducidas en hielo todo el tiempo. Colocar las enzimas en el congelador
una vez se hayan usado. El día del laboratorio, coloque los tubos en hielo y
distribuya un tubo a cada grupo.
2. Alícuotas de dión tampón de restricción. Alícuotas de 60 microlitos de
tampón de restricción en 8 microtubos de ensayos limpios. Rotúlalos
como “TR”. Colocar los tubos en hielo y distribuir un tubo para cada
grupo.
3. Alícuotas de ADN lambda. Alícuotas de 25 microlitros de ADN lambda en
8 microtubos de ensayo y rotúlalos como “lambda”. Colocar los tubos en
hielo y distribuir un tubo para cada grupo.
4. Preparación de los geles de agarosa. Se recomienda una concentración
de agarosa en los geles sea del 1% de agarosa. Esta concentración de
agarosa ofrece una buena resolución y minimiza el tiempo de ejecución
necesario para la separación electroforética de fragmentos de ADN. Se
recomienda un espesor del gel entre 0.75 – 1 cm para una fácil
manipulación del gel. Asegúrate de uses un tampón de electroforesis y
no agua en la preparación de los geles de agarosa.
a. Preparación del tampón de electroforesis. TAE (Tris-acetato-
EDTA) tampón de agarosa ofrece una concentración de 50x.
Además del tampón TAE 1x necesario para preparar gel de
agarosa se requieren de el 275 mL aproximadamente por cada
cubeta de electroforesis. Tres litros son suficientes para preparar
8 cubetas de electroforesis y 8 geles de agarosa. Para preparar
de 3 L de 1x TAE desde el de 50x TAE, cogemos 60mL del de 50x
y lo añadimos en 2,94 L de agua destilada.
b. Preparación de la agarosa. Este procedimiento se puede realizar
de 1 a 2 días de anticipación por el profesor durante la clase o
hecho por los equipos.
i. Para preparar solución de agarosa al 1% tomamos 1 g de
agarosa por cada 100 mL de tampón de electroforesis 1x
TAE. Asegúrate de que es tampón de electroforesis y no
agua.
Si las cubetas de electroforesis son limitadas, puedes usar
bandejas 7x10 cm y dos de 8 y peines para verter un gel que
se puede utilizar para ejecutar dos series de resúmenes de
los estudiantes.
Usa esta tabla como guía para los volúmenes de gel
requerido cuando introduzcamos de uno o varios geles.
Volumen de 1% de agarosa para:

Número de gel Bandeja de 7x7 Bandeja de 7x10


cm cm
1 40mL 50mL
2 80mL 100mL
4 160mL 200mL
8 320mL 400mL
ii. Añadir el polvo de agarosa a un recipiente adecuado (por
ejemplo, erlenmeyer de 500 ml 200 ml o menos). Añadir la
cantidad adecuada de tampón de electroforesis TAE 1x y
agitar para suspender el polvo de agarosa en el búfer. Si se
utiliza un erlenmeyer invertido un erlenmeyer de 25 ml en
el extremo abierto del matraz Erlenmeyer de 500 ml que
contiene la agarosa. El frasco pequeño actúa como una
cámara de reflujo, lo que permitirá a largo o vigorosa
ebullición sin mucha evaporación. La agarosa se pueden
fundir para la fundición del gel de agarosa al hervir hasta
que se haya derretido por completo en un plato caliente
magnético, baño de agua caliente, o en un horno
microondas.
Método del horno microondas. Esta técnica es la forma más rápida y segura
para disolver la agarosa. Coloque la solución de gel en una botella o frasco
apropiado en el microondas. Afloje la tapa del SI USTED ESTA UTILIZANDO
UNA BOTELLA. Use un ajuste a medio y establece en 3 minutoes. Detener el
horno de microondas cada 30 segundos y agitar el frasco para suspender
cualquier undissolver agarosa. Hervir y agitar la solución hasta que todas las
partículas de agarosa transparente pequeños se disuelven. Ponga a un lado y
deje enfriar a 55-60 º C antes de servir.
Método magnético de la placa caliente. Añadir un stirbar a la solución de
agarosa disuelta. Calentar la solución a ebullición mientras se agita en un plato
caliente magnético. Burbujas o espuma debe e interrumpido antes de subir a te
cuello del matraz.
Hervir la solución hasta que todas las partículas pequeñas transarent agarosa
se disuelven. Deje enfriar a 55-60 º C antes de verter los geles.
Procedimiento para la emisión de geles:

Esta actividad de laboratorio requiere que cada gel tenga al menos 4 pozos.
Sigue las instrucciones que vienen a continuación para preparar la agarosa al
1% y determinar el volumen que necesitas. Vierte la suficiente agarosa para
cubrir los dientes del peine de gel o hasta una profundidad de 0.5 a 0.75 cm. No
mover ni manejar hasta que esté solidificado. El gel solidificado puede ser
almacenado en bolsas sellables a temperatura ambiente hasta un día o en un
refrigerador durante una semana. Etiquetar las bolsas.
El tiempo necesario para verter el gel es aproximadamente de 30 minutos. Si es
posible, ten uno o dos más preparados.
1.- Sellar los extremos de la bandeja del gel de forma segura con tiras de cinta
estándar de laboratorio. Presione la cinta firmemente a los bordes de la bandeja
del gel de forma un sello hermético

2-. Asegurarse que el equipo de electroforesis está bien nivelado , usando el


calibrador del aparato.

3.- Preparar el concentración deseada y la cantidad de agarosa en tampón de


electroforesis TAE 1x.

4.- Enfría la agarosa a menos de 60 ºC antes de verter.

5.- Mientras la agarosa se está enfriando, coloque el peine en la ranura


correspondiente en la bandeja de gel. Los peines de gel deberían colocarse a
media pulgada del extremo de la bandeja, si es de un pozo simple. Para tener
un gel de uso doble se puede poner un peine a la distancia indicada
anteriormente y otro a mitad de camino.

6.- Dejar solidificar a temperatura ambiente durante 10 o 20 minutos. Se volverá


turbio o opaco cuando esté listo para usarse.

7.- Retirar el peine con cuidado y dejar solidificar.

8.- Retirar las tiras de cinta colocadas anteriormente en los extremos de la


bandeja.l

9.- Tienes dos opciones:

Opción 1:

Si no tienes suficiente tiempo para realizar la lección 2, almacena el gel en una


bolsa sellable a temperatura ambiente durante un día o en frigorífico una
semana antes de su uso. Etiquetar siempre la bolsa.
Opción 2:

Si tienes suficiente tiempo para realizar la lección 2, coloca la bandeja de gel


en la cámara de electroforesis de modo que los pozos de la muestra queden
por el lado del cátodo. Así, las muestras de ADN migrarán hacia en ánodo
mientras dura la electroforesis.

Digestión de las enzimas de restricción:

30 minutos de incubación de digestión en estufa a 37º C.