Práctica de enzimas: Biofuel

Fundamento

Enzimas

As enzimas son xeralmente proteínas (coñécense algúns ácedos nucleicos con

función enzimática) que actúan como catalizadores, acelerando as reacciónss
químicas que terían lugar extremadamente a modo de xeito espontáneo. As
enzimas aceleran a meirande parte das reaccións químicas que ocorren nas
células. As reacción que rompen as moléculas (coma as que participan na
dixestión e na respiración celular) ou as involucradas na biosíntese de moléculas
(coma as da fotosíntese ou da replicación do ADN) requiren enzimas. Cada tipo
de enzima ten unha forma específica relacionada coa estructura do seu sustrato
(Figura 5). O sustrato és a molécula ou moléculas que a enzima convirte en
producto(s). O sustrato encaixa nun lugar da proteína globular chamado o
centro activo. As propiedades da forma e a química (distribución de cargas por
exemplo) deste sitio son críticos para a función da enzima.

Fig. 5. Un diagrama esquemático de celobiosa e celobiasa en disolución. A. A celobiosa en disolución componse de

duas moléculas de glucosa unidas covalentemente por unha ligazón beta(1-4). B. A celobiasa ten un espazo que
se axusta á molécula de celobiosa. C. A celobiasa estabiliza á celobiosa para que a ligazón entre as glucosas poda
romperse. D. Unha vez rota a ligazón glucosídica da celobiosa, as duas moléculas de glucosa céibanse, e a enzima
é quen de se unires a outra molécula de celobiosa para comezar de novo o ciclo.

Moitas das reaccións químicas catalizadas por enzimas poden ter lugar de
xeito espontáneo, pero moito máis a modo. As enzimas aceleran as reaccións
reducindo a súa enerxía de activación. Esta és a cantidade de enerxía precisa
para que a reacción teña lugar. As enzimas tamén estabilizan o estado de
transición da reacción. O estado de transición é a estructura con maior enerxía
na reacción. Ó reducires esta enerxía, a reacción pode ter lugar dun xeito máis
doado. As enzimas son "selectivas" en relación ás condicións nas que funcionan
mellor. A temperatura e o pH teñen que ser as idóneas para a enzima. Para
calquera reacción química, elevando a temperatura aumentará o movemento
das moléculas, o que terá como consecuencia que se produzan máis colisións.
Aumenta a enerxía cinética media das moléculas de modo que un número maior
delas será quen de reaccionar. Con todo, nunha reacción enzimática, demasiado
calor non é unha cousa boa. As interaccións non-covalentes dentro da proteína,
tales coma as pontes de hidróxeno e ligazóns iónicas pódense romper a altas
temperaturas. Esto produce un cambio conformacional (na forma) na enzima.
Se os cambios na forma da enzima afectan ó sitio activo, o sustrato non encaixa
axeitadamente e a enzima non é funcional.

A enzima: celobiasa

Nesta práctica imos estudar a celobiasa, unha enzima involucrada na

descomposición da celulosa. A celolosa é un homopolisacárido composto
de paquetes de cadeas de beta-D-glucopiranosa que se atopa nas paredes
celulares vexatais. É un proceso natural utilizado por moitos fungos e bacterias
(algúns presentes nos intestinos dos termes, outros nos estómagos dos
ruminantes e tamén nas pilas de compostaxe) para producir la glucosa como
fonte de alimento.
Romper a celulosa das plantas en azúcar é tamén un paso importante na
creación de etanol como combustible.

O sustrato: celobiosa

O sustrato natural da enzima celobiasa é a celobiosa (Figura 6). Trátase

dun disacarido composto por dúas moléculas de beta-D-glucopiranosa. Con
todo, cando se estuda a función desta enzima, é mellor procurar un modo de
detectar que cantidade de sustrato é utilizado ou que cantidade de producto
se forma. As disolucións de celobiosa (o sustrato) e de glucosa (o producto)
son incoloras, e non hai moitos métodos sinxelos, de baixo custo, para detectar
cuantitativamente estas moléculas.

Fig. 6. Ruptura de celobiosa por acción da celobiasa. O sustrato natural da celobiasa é o disacárido celobiosa.
Cando a celobiosa se xunta á celobiasa, esta rompe a ligazón glucosídica beta(1-4) ceibándose dúas moléculas de
beta-D-glucopiranosa.

Para estudar esta reacción é máis doado usar un sustrato artificial, o p-nitrofenil-
glucopiranósido. Este sustrato artificial é quen de se xuntar á mesma enzima de
xeito semellante a como o fai a celobiosa. Cando p-nitrofenil-glucopiranósido
se rompe por acción da celobiasa, prodúcese glucosa e p-nitrofenol (Figura 7).
Cando o p-nitrofenol se mestura cunha solución de pH básico (por exemplo, a
solución de parada que se usa nesta práctica), as disolucións viran ó amarelo.
Ademáis, a cantidade de cor amarillo é proporcional á cantidade de p-nitrofenol
presente. Por cada molécula de p-nitrofenol, fórmase outra de glucopiranósido.
Para as reaccións enzimáticas con celobiasa, outra das vantaxes de utilizar
unha disolución pH alcalino para revelar a cor do p-nitrofenol, é que ese pH
provoca a desnaturalización da enzima e, con ela, a parada da reacción.

Fig. 7. Desdobre do p-nitrofenil-glucopiranósido en glucosa e p-nitrofenol por acción da celobiasa. Cando a celobiasa
rompe o p-nitrofenil-glucopiranósido, céibanse unha molécula de glucosa e unha de p-nitrofenol. Se se pon o p-
nitrofenol nunha disolución básica, prodúcese unha cor amarela, que pódese cuantificar por un sinxelo método
colorimétrico.
Medida da cantidade de producto producido

Dado que o producto (p-nitrofenol) da reacción vira ó amarelo ó engadir unha

disolución básica, pódese coñecer a cantidade de producto que se está a
producir. Canto máis intensa sexa a cor, maior é a cantidade de producto
producido. Un método sinxelo de estimación da cantidade de producto é
comparar o amarelo das mostras de reacción enzimática con un conxunto de
patróns de cor coñecidos, que conteñan unha cantidade tamén coñecida de
producto. Comparando a mostra cos patrón e escollendo aquel ó que máis
se achegue na cor, temos unha estima da cantidade de producto na mostra.
Alternativamente, pódese utilizar un espectrofotómetro (ou un colorímetro), que
mide a cantidade de cor amarela facendo que un raio de luz atravese a mostra
(lonxitude de onda de 410 nm). O espectrofotómetro mide a cantidade de luz
absorbida pola mostra. Canto máis escura sexa a cor amarela da mostra, máis
luz absorbe. Compre medir previamente un conxunto de patróns de p-nitrofenol
de concentracións coñecidas para establecer unha curva estándar. Logo,
coa curva estándar, pódese transformar un valor de absorvancia nun valor de
concentración.

Medida da tasa de actividade da celobiasa

Co gallo de determinar que factores inflúen na capacidade dunha enzima

para descompoñer o seu sustrato, determínase a velocidade de reacción, ou
cantidade de producto formado nun periodo de tempo dado.
Para estudiar a actividade da celobiasa, imos medir a velocidade de reacción
mediante a adición de enzima ó sustrato. A enzima e o sustrato disólvense nun
tampón que está nun valor de pH ideal (pH 5.0) para que a reacción se produza.
A determinados tempos, se elimina unha mostra da reacción enzimática e
engádese a unha solución de pH básico que provoca a detención da reacción.
Calculando como se produce o p-nitrofenol en función do tempo, pódese calcular
a velocidade de reacción. Observando en pequenos incrementos de tempo,
pódese determinar se o ritmo da enzima é constante ou se disminúe a medida
que baixa a cantidade de sustrato dispoñible. Tamén se pode detectar calquera
efecto do pH, da temperatura, a concentración de sustrato ou a concentración da
enzima teñen sobre a velocidade inicial de reacción.
-oOo-