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Caracterización de Microorganismos en Aire Interior de la Universidad Autónoma de Madrid.

Sánchez Muñoz, Marta(1); Díaz Portuondo, Emiliano Enrique(2); Cobas Pupo, Guillermo(1); Amils Pibernat Ricardo (2); Sánchez Cabrero, Benigno(1). Lab. de Aplicaciones Ambientales de la Radiación Solar en Aire. CIEMAT-DER. Avda. Complutense, 22, Edif.42. 28040 Madrid, España. Tel. +34913466417. Fax 913466037. *E-mail: benigno.sanchez@ciemat.es
(2) (1)

Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid. Cantoblanco 28049-Madrid Tel. +34914978080.

Resumen: Se ha realizado un muestreo de microorganismos suspendidos en el aire interior de varios edificios de la Universidad Autónoma de Madrid. El análisis de las muestras se ha llevado a cabo por dos vías paralelas: por un lado se utilizaron técnicas de Microbiología Clásica (crecimiento y aislamiento de microorganismos) y por el otro se emplearon técnicas de Biología Molecular (PCR, DGGE y

secuenciación), siendo ambas vías complementarias. Los resultados muestran la existencia de una amplia diversidad microbiana en la que se destacan especies bacterianas de los géneros Sphingomonas, Acinetobacter, Pantoea, Micrococcus y Staphylococcus entre otras.

Palabras clave: Microbiología, Ecología Molecular, Bioaerosoles.

en la medida de lo posible. las técnicas de biología molecular nos permiten estudiar la biodiversidad de un sistema. los biológicos son capaces de reproducirse. a menudo.1. bacterias. en muchos de los cuales la calidad del aire interior se encuentra disminuida por la acumulación de compuestos orgánicos volátiles (COVs). INTRODUCCIÓN: El hombre permanece alrededor de un 90% de su tiempo en el interior de edificios. asma y otras enfermedades. Sin embargo. Desgraciadamente. Durante mucho tiempo. De este modo. el organismo mejor adaptado en los cultivos de laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del ecosistema microbiano [1]. por lo que es necesario el mantenimiento de sus niveles lo mas bajos posibles. etc. combinar ambas metodologías [3].. Cualquier foco de crecimiento de microorganismos puede conducir a la diseminación e incremento de estos organismos por toda la estructura edificada y al contrario de lo que sucede con los contaminantes químicos. la identificación de microorganismos ha dependido de la obtención de cultivos puros mediante la utilización de técnicas de aislamiento y purificación. a la hora de identificar microorganismos la morfología no suele ayudar mucho y las características fisiológicas pueden. Por otra parte. particularmente el ARN de la subunidad ribosomal menor (ARNr 16S en procariotas). así como hacer estudios filogenéticos de los organismos que forman la comunidad. la identificación utilizando secuencias de ADN o ARN resulta sencilla y sobre todo fiable. hongos. que han propiciado la aparición de una sintomatología específica denominada Síndrome Del Edificio Enfermo (SEE). ser ambiguas. La calidad del aire interior en los edificios modernos precisa de una mejor caracterización del contenido en los bioaerosoles allí existentes. . Amann y colaboradores han estimado que en la mayoría de los casos solo se cultiva un 1% del total de los organismos unicelulares de un sistema [2]. así como alergias. por lo que para el estudio completo de un sistema conviene. En cambio. En la actualidad la filogenia microbiana se basa en la información que nos proporcionan los ácidos nucleicos. la información fisiológica que nos dan estas metodologías es mucho menor que la que nos proporciona las tecnologías clásicas.

10mM Na2PO4 / NaH2PO4. 5g de Extracto de Levadura. y se dejaron expuestas durante 24 horas (se quiso evitar así la pérdida de información por las posibles fluctuaciones en la carga microbiana que pueda haber a lo largo del día). Se colocaron un total de 9 placas por punto de muestreo (3 por cada medio). Punto 4: Biblioteca en el Edificio de la Facultad de Psicología. Procesamiento de las muestras: Las muestras se procesaron de dos formas distintas: A) Medios de cultivos. 5g de Cloruro Sódico y 16g de Agar.2-7. que contenían AN.1. pH: 7. Punto 2: Pasillo en el Edificio de la Facultad de Ciencias del Profesorado.4). MATERIALES Y MÉTODOS: Se realizó un muestreo en La Universidad Autónoma de Madrid. . 10g de Peptona Bacteriológica. en una de ellas se utilizaron placas Petri con los medios Agar Nutritivo (AN) (3g de Extracto de Carne. la cual se llevó a cabo por dos vías paralelas. 2. como segunda vía se escogió una solución isotónica basada en el Buffer Sodio Fosfato (PBS) (130mM NaCl.4) y el medio de Luria-Bertani (LB) (10g de Bactotriptona. El experimento se realizó por triplicado. pH: 7. 2. escogiéndose varios puntos similares frecuentados por alumnos. Punto 3: Despacho en un Edificio de la Facultad de Ciencias. pH:7). LB Y PBS. El análisis de las muestras se realizó por dos vías paralelas basadas en técnicas de microbiología clásica combinadas con técnicas de biología molecular. 5g de Cloruro Sódico y 15g de Agar.En el presente trabajo se ha llevado a cabo una caracterización de microorganismos del aire interior de varios edificios de la Universidad Autónoma de Madrid. El método escogido para la toma de muestras fue la decantación gravitatoria. Punto 1: Pasillo en el Edificio de la Facultad de Filosofía y Letras. en facultades distintas.2-7.

se aplicó a las muestras un ciclo de ruptura térmica de las células con las siguientes temperaturas: 94ºC-5 min 3min 4ºC-1 min 94ºC-1 min 4ºC . tras lo cual se amplificó un fragmento del gen 16S (gen de ARN ribosómico) de las bacterias crecidas mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 8F(5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´) y 1492R(5´-TACGGYTACCTTGTTACGACTT3´) (MWG Biotech AG) (Y= C:T. y se analizaron todas las colonias distintas desarrolladas en las placas. las muestras se purificaron siguiendo el protocolo del kit JeTquick. Transcurrido el tiempo de muestreo.1min 94ºC- 4ºC-5 min Posteriormente. PCR purification Spin Kit 50 (GENOMED GmbH). Tras la amplificación del gen 16S. se amplificó el DNA siguiendo el protocolo del kit de GenomiPhi (Amersham biosciences). M=C:A).000 rpm durante 15 minutos.025 u/µl de Taq polimerasa (Roche Diagnostics) en cada reacción. M= C:A). Se añadieron 0. descartando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet en 50µl de PBS.CCTACGGGAGGCAGCAG-3´) y 907R (5´-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3)´ (MWG Biotech AG) del gen 16S de bacterias (Y= C:T. el contenido de las placas se centrifugó a 14. B) Solución isotónica.025 u/µl de Taq polimerasa (Roche Diagnostics) en cada reacción. Se utilizó el siguiente programa: 94ºC (10 min) 94ºC (1min) 56ºC (1min) 30 ciclos 72ºC (3min) 72ºC (10min) El tamaño del fragmento amplificado fue de 1484 pares de bases. Se utilizó el siguiente programa: . Con el fin de extraer el DNA genómico. PBS: Se utilizó la solución isotónica PBS para evitar la lisis celular en la toma de muestra. universales de bacterias.Se incubaron las placas de LB y AN a 30ºC durante 2 días. Se añadieron 0. Tras la amplificación. se realizó una PCR utilizando los cebadores 341FGC (5´. Las muestras se secuenciaron utilizando el cebador 1492R.

se procedió a cortar las bandas y a la reamplificación del fragmento del gen 16S con los cebadores 341F y 907R (MWG Biotech AG). Tras la amplificación del fragmento del gen 16S las muestras se secuenciaron utilizando el cebador 1492R. Los resultados de la amplificación se secuenciaron como en el caso anterior. (www. se produjo un crecimiento significativo tanto de hongos como de bacterias (Figura 1). PCR purification Spin Kit 50 (GENOMED GmbH). 3. y por lo tanto de evadir con facilidad los protocolos de eliminación de microorganismos presentes en el aire. Las bandas se purificaron siguiendo el protocolo del kit JeTquick. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: En las placas con los medios de cultivo AN y LB que se mantuvieron abiertas durante 24 horas y se incubaron a 30ºC durante 4 días. En esta parte del trabajo nos hemos centrado preferentemente en la identificación de las bacterias.nlm.ncbi.formamida (20%-70%) secuencias de ADN correspondientes a unidades taxonómicas distintas.94ºC (10 min) 94ºC (1min) 52ºC (1min) 35 ciclos 72ºC (2min) 72ºC (10min) El tamaño del fragmento amplificado fue de 566 pares de bases. De esta forma los fragmentos de los genes de ARNr 16S amplificados en cada muestra puede separarse en un gel de acrilamida-bisacrilamida (Bio-rad). considerándose importante el proceder a una oportuna identificación de los hongos debido a su cantidad (las placas corresponden a medios diseñados para crecer fundamentalmente procariotas) y a su capacidad de esporular. basándose en las diferencias entre sus temperaturas de fusión. Las secuencias se compararon mediante BLAST con la base de datos del NCBI. Tras su separación. Con el fin de identificar los distintos microorganismos presentes en la muestra se llevó a cabo una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (DGGE) que permite separar en un gel con gradiente desnaturalizante de urea.nih. .gov/BLAST/).

1. .A) Agar Nutritivo B) LB 1 2 3 4 Fig. Detalle de las colonias de microorganismos desarrollados en distintos puntos de muestreo y con distintos medios de cultivo.

M: Marcador de Peso Molecular Φ29.2.70% (DGGE) que se realizó a partir de las muestras recogidas mediante la solución isotónica PBS. Gel de agarosa (1%) mostrando los resultados de la amplificación del gen 16S de ARNr de bacterias. . Las bandas se cortaron. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Fig.En la figura 2 se muestran algunos de los resultados de la amplificación del gen 16S de ARNr de bacterias de distintas colonias aisladas de estas placas. Cada carril del gel muestra distintas bandas pertenecientes a secuencias distintas del gen 16S de ARNr. La figura 3 muestra un gel con gradiente desnaturalizante de urea- formamida 20% . reamplificaron y purificaron para su posterior secuenciación.

entre las que se encuentran representantes de los Fila Actinobacteria y Firmicutes y un 35% de bacterias Gram negativas entre las que se encuentran representantes de las clases Alfaproteobacterias.4 3 2 1 Fig 3 .Separación por DGGE de los genes de 16S ARNr amplificados a partir de distintas muestras recogidas en PBS. La secuenciación de los genes de ARNr 16S y la comparación de los resultados con las bases de datos del NCBI muestran la presencia de un 65% de bacterias Gram positivas. Los resultados de la afiliación filogenética muestran la existencia de los siguientes géneros y especies: BLAST Secuencias relacionadas Sphingomonas aerolata Sphingomonas aurantiaca Staphylococcus croceolyticus Curtobacterium flaccumfaciens Rhodococcus corynebacterioides Nocardia corynebacterioides % de similitud 100% 100% 100% 100% 100% 100% . B1 B2 B3 B4 B7 B6 B5 El material microbiano recogido en los distintos puntos de muestreo y la concentración de DNA genómico variaron dependiendo del lugar y la metodología del muestreo. Se referencian las bandas extraídas y secuenciadas. Gammaproteobacterias y el Filum Bacteroidete.

Kocuria rhizophila Bacterium K87 Acinetobacter sp. Acinetobacter calcoaceticus Clavibacter michiganensis Arthrobacter agilis Glacial ice bacterium G200-C1 Actinobacterium RG-54 M. Micrococcus sp.Arthrobacter sp Bacterium btn 15-2 Arthrobacter nicotianae Dermacoccus sp.agilis Micrococcus luteus Arthrobacter sp. Pantoea ananatis Pantoea agglomerans Acinetobacter lwoffii Acinetobacter lwoffii Pedobacter cryoconitis Sphingobacterium sp. Kocuria carniphila Kocuria marina Bacillus megaterium Brevibacterium sanguinis Brevibacterium aureum Brevibacterium linens Acinetobacter lwoffii Rothia sp Rothia amarae Arthrobacter crystallopoietes Arthorbacter luteolus Arthrobacter agilis Staphylococcus croceolyticus Human oral bacterium C20 Acinetobacter johnsonii 100% 99% 99% 100% 100% 99% 99% 100% 98% 100% 100% 100% 100% 100% 99% 100% 99% 99% 99% 99% 100% 100% 100% 100% 99% 99% 99% 99% 100% 99% 98% 98% 98% 99% 100% 100% 100% .

indican que los niveles de ocupación son altos y/o la renovación del aire es insuficiente [8].Las técnicas de Biología Molecular empleadas. que se encuentran en la piel y las secreciones respiratorias.Rhizobium sp.En los aislamientos en placas se ha observado un desarrollo importante de hongos. las bacterias dominantes deberían ser las correspondientes a la microbiota normal humana. Los resultados muestran la diversidad de microorganismos en las diferentes áreas muestreadas de la Universidad Autónoma. Concentraciones ambientales altas de estas bacterias. 2.Las metodologías utilizadas en este trabajo han resultado complementarias para la realización de estudios en aire interior. Otras especies de interés son Pantoea. Aparecen algunas especies aisladas de suelo. . frutas y vegetales. Esta abundancia será objeto de estudio en los próximos meses. como son algunas especies del género Sphingomonas [4]. descrita luteus y Micrococcus Staphylococcus croceolyticus. Se destaca la existencia de poblaciones bacterianas descritas anteriormente en aire y polvo.. 3. Se han encontrado varios representantes aislados anteriormente de piel de individuos sanos como Acinetobacter lwoffii y Acinetobacter johnsonii [5]. 100% 100% 100% 100% 99% 98% 98% Tabla 1: Resultados de la afiliación filogenética de las secuencias obtenidas a partir de las placas de cultivo. como es el caso del género clínicamente [6. es decir. o que han sido transportadas por los ocupantes de los mismos. Uncultured bacterium clone CD151 Uncultured sheep mite bacterium Llangefni 28 Phyllobacterium myrsinacearum Uncultured alpha proteobacterium clone 07-04-39 Paracoccus denitrificans Rhodobacter sp. bacterias Gram positivas pertenecientes a los géneros Micrococcus y Staphylococcus. permiten identificar especies de organismos existentes en aire interior y no cultivables por técnicas convencionales.7]. CONCLUSIONES 1. algunas fitopatógenas. Por lo general. algunas de las cuales son bacterias relacionadas con el entorno de los edificios.

Journal (PT 5). W. Rita Verhelst. 606-623 (2003). Madigan. Caroline Labit. 2. Sphingomonas aurantiaca sp. Brock. Sphingomonas aerolata sp. Journal of Clinical Microbiology. and K. Cap. financiado por el MEC(PSE-120000-205-1). air. p. and Sphingomonas faeni sp. and Mario Vaneechoutte. Microbiol. M. Sauvezie. p. John M.H. 1 (2000). 4. Dubost.18. Irma Marín. p.AGRADECIMIENTOS: Esta investigación se ha realizado como parte de los trabajos iniciales para la puesta a punto de la metodología necesaria en el proyecto ARFRISOL. S. orange-pigmented. Mirja Salkinoja- Salonen. Cap. p. p.l Sylvie Jeanjean. Bouvet.. Ed. Biotype. [5] Philippe J. nov. Ecología Molecular Microbiana. Phylogenetic Identification and in situ Detection of Individual Microbial Cells Without Cultivation.and dustborne and Antartic. BIBLIOGRAFÍA [1] Michael. Le Seaux. No. [6] Thierry De Baere. Denner. NTP 409: Contaminantes Biológicos: Criterios de Valoración. Journal of Clinical Microbiology. 143-169 (1995). Martinko. 38. [8] Ana Hernández Calleja. psychrotolerant bacteria.1253-1260 (2003). Antonio Bennasar and Peter Kämpfer. Species. and Bacteriophage Type Determinations Compared with Cell Envelope Protein Profiles for Typing Acinetobacter Strains.' Jean-Francois Vieu. p. Geert Claeys. en relación con la calidad del aire interior de los edificios: Subproyecto 7. Jack Parker. Ludwig. Biología de los Microorganismos. Amann. Sandra Buczolits. Bacteremic Infection with Pantoea ananatis. Ricardo Amils.' and Lenie Dijkshoorn. B. and emended description of the genus Sphingomonas. Isolation of Pantoea agglomerans in Two Cases of Septic Monoarthritis after Plant Thorn and Wood Sliver Injuries. Gerda Verschraegen. [2] R. Syst. 53 . Schleifer. S. No. 4393–4395 Vol. 9 (2004). de Champs. Journal of Clinical Microbiology. J. Centro Nacional de Condiciones de Trabajo. Ed. Ewald B.I. J. p. nov. 39-59 (2005).T. Sirot.. Biotecnología y Medio Ambiente. Microbiological Reviews.Ephemera. [7] C. José Luis Sanz. 42. 59(1). 460–461 Vol. J. M. [3] Elena González. Int.Georges Wauters. 170-176 (1990). nov. Pearson Prentice Hall. Evol. Boisgard. [4] Hans-Jürgen Busse. and J.

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