Química de la leche, Pruebas de Proteínas y Análisis de Aminoácidos

Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Escuela de Química Sección de Química Orgánica Laboratorio de Química Orgánica II QU0255 Estudiante Carne Profesores Asistente Manrique Cubero Morales A41775 Lic. Graciela Artavia Dr. Víctor Hugo Soto Yulia Yuts

Se realizaron pruebas para el contenido de componentes y el estudio de propiedades de estos componentes a varios tipos de leche (Caso particular: En Polvo Descremada y Liquida Descremada). Los carbohidratos (Lactosa), grasa (Fosfolipidos) y proteínas (Caseína) de la leche fueron separados según un esquema de separación para obtener de ellos un porcentaje de rendimiento y caracterización. Además se llevaron a cabo diferentes pruebas de caracterización de proteínas, tales como las Pruebas de Biuret, Xantoproteica, Millon, para Azufre. Estas pruebas se le aplicaron a la caseína extraída en la práctica. Por otra parte se obtuvo ácido múcico a partir de la leche, posterior a un tratamiento con ácido acético y ácido nítrico. Introducción Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas de alrededor de 20 diferentes aminoácidos, unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos y se encuentran como mezclas complejas en los tejidos orgánicos. Su separación en fracciones con características moleculares definidas ha permitido alcanzar un enorme conocimiento sobre sus funciones y estructuras.1 Estas macromoléculas poseen propiedades y características que las diferencian unas de otras y por medio de dichas propiedades, pueden ser separadas y aisladas de sus fuentes.2 Las proteínas se clasifican en dos tipos principales según su composición: en proteínas simples y conjugadas. Las proteínas simples forman aminoácidos cuando se hidrolizan, en cambio las proteínas conjugadas producen aminoácidos, carbohidratos, grasas o ácidos nucleicos. Estas últimas son más comunes que las proteínas simples.3 Otra manera de clasificar las proteínas es según su forma tridimensional, en proteínas globulares o fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno, siendo solubles en agua. Por ejemplo la hemoglobina y la insulina.4 Las proteínas fibrosas consisten en cadenas de polipéptidos, arregladas en largos filamentos. Son insolubles en agua y muy resistentes. Sirven para construir materiales estructurales como los tendones, uñas, músculos; por ejemplo la queratina y el colágeno.4 La leche contiene vitaminas, minerales, proteínas, carbohidratos y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C (Figura 1). 5

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McMurry, J. Química Orgánica. 6ª ed., International Thomson: México. 2004. pp. 1009-1012. 2 Morrison, R. T.; Boyd, R. N. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson Educación: México. 1998. pp. 1342-1343.

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Ribadeau-Dumas, B; Grappin, R. Milk protein analysis. Le Lait. 1989. pp. 357-416.

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upo.pdf. Además de caseína. 7 Universidad Pablo de Olavide. enzimas plasmáticas y suero. La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2. estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. El pH de la leche es 6. iones. 6 Miller. Sevilla. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. pp.6 La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua.6 aproximadamente. Práctica 3: Extracción de la Caseína y determinación del Punto Isoeléctrico. Visitado el 20 de oct del 2010 a las 20 horas. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico. Ca y P.7% en composición de la leche líquida. La caseína en la leche se encuentra en forma de caseinato de calcio. Si se añade ácido a la leche. La caseína no contiene puentes di sulfuro. lipasa. Componentes de la leche. 33-38.En la leche hay tres clases de proteínas: caseína. España.6 La función biológica de las micelas de caseína (Figura 2) es transportar grandes cantidades de calcio y fósforo altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina.5 (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. Estructura de la micela de la caseína. D. Química de Alimentos. lactoalbúminas y lactoglobulinas (todas globulares). 2001. Limusa Wiley: México.6.6 El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbio mol/Practica3FQB. Manual de Laboratorio.7 Figura 1. 2 . la micela formada también contiene citrato. http://www. la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza Figura 2. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche.

Prueba Resultado/Observaciones Biuret Xantoproteica Millon Azufre Positivo. 2900.10 0. Se extrajo de la leche ácido múcico por tratamiento de la lactosa obtenida con ácido nítrico. Compuesto Lactosa Grasa Caseína Masa Recuperada (g) 0. 919. Precipitado rojo Positivo. Resultados de las pruebas de caracterización aplicadas a la muestra de caseína aislada. Coloración amarilla Positivo. HO OH OH OH O O HO HO OH O HO O OH OH HNO3 HO 2 O OH OH OH Reactivos Formula C12H22O11 HNO3 Limitant Si No e Masa de muestra 4.40 Cuadro II. Xantoproteica.45 (d). Parte Experimental Para esta practica de laboratorio.3 reactivo 235.Las proteínas que aparecen en el sobrenadante cuando se precipita la caseína en medio ácido son proteínas globulares. 2633. Resultados Cuadro I.23 (d). no se hizo uso de ningún tipo de equipo especial. hidrofílicas y solubles en agua así como susceptibles de 7 desnaturalización por calor. CDCl3) δ (ppm) 5. 1420. y no se realizaron purificaciones de ninguno de ellos antes de la práctica en mención.16 0.0 (mol/L) (*) Tomando en cuenta que la porción diaria es de 250 mL con un valor de 12 g de carbohidratos. 1 H NMR: (400 MHz. Masas y porcentajes de recuperación de otros compuestos aislados en el laboratorio. Síntesis del Ácido Múcico a partir de Leche y ácido nítrico. 668.1 687. También se aisló la lactosa por medio de la reacción del HOAC con la caseína y se purifico. Millon. Primeramente se disuelve la leche en agua y se calienta a 40 °C. 1294. 4.4 μmol 55.80 g Productos Formula Equivalente s Masa esperada (g) Mol esperados Masa medida (g) Masa de producto (g) Mol de producto Porcentaje de rendimiento (%) C6H10O8 2 288. Los ensayos realizados fueron: las Pruebas de Biuret. Por consiguiente para 100 mL = 4. La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos.10 Porcentaje de rendimiento 7.2 mg mg (g) Concentr ación --5.72% 227% 100% Cuadro III.10 Masa Esperada (g) 2. 778. Lactosa IR (fase KBr) (cm-1) 3379. para el curso de Química Orgánica I”.50 – 4. la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos. 3. 861. asi como se separaron los componentes de la leche para caracterizarlos.0 (m). 4. 2394. 1720. azul-morado Positivo. 1426. 799. 876. 899.80 (s). Después se agrega poco a poco ácido acético al 10% para acidificar la leche en polvo. y alcanzar el punto 3 . Precipitado negro Discusión Dentro del esquema de separación de la leche (Figura 3) el primer paso es la separación de las proteínas y grasas de los carbohidratos (lactosa).37 mmol 160 mg 160 mg 761. para Azufre.30 (t). la clarificación de vinos. Se siguió el procedimiento descrito por Pérez y Lamoureux en su “Manual de Practicas para laboratorio. 1059.91 2. 3.1 μmol reactivo μmol Masa de 43.78 mg 1.04 2. Los reactivos utilizados fueron proporcionados por la Proveeduría de la Escuela. 1117. 1116. 1094. Acido Mucico IR (fase KBr) (cm-1) 3293.80 --(g) Volumen 100 mL(*) 12 mL (mL) Mol de 687. 1035.

6). En este punto ya se separaron la caseína (sólida) y las grasas (disueltas en éter etílico). el análisis correspondiente es el siguiente: El reactivo de Biuret está formado por una solución de sulfato de cobre en medio alcalino. debido a que esta proteína no contiene muchos enlaces peptídicos. En la separación de los componentes de la leche. al alcanzarse el punto isoeléctrico existe una igualdad de cargas por lo que es una molécula neutra y se hace insoluble en disolventes polares. Esquema de separación de los componentes de la leche . se forma un aglomerado blanco apolar fácilmente filtrable. En la mezcla ácida restante quedan disueltas trazas de proteínas y la lactosa. En este momento es necesario agitar bien porque la caseína tiene adsorbidas las moléculas de grasa y al estar como un aglomerado semisólido es difícil poder asegurar la extracción completa de las grasas. indicando que estas proteínas contienes muchos enlaces peptídicos. Reacción del ácido acético con el caseinato de calcio para la formación de caseína sólida. el procedimiento que resulto mas fácil fue el de la obtención de la caseína (en forma de caseinato de calcio). se puede estimar el número de enlaces peptídicos que hay en la proteína. Para la caseína extraída. En este aglomerado van adsorbidas las moléculas de grasa por lo que con solo la adición de ácido acético se separan estos dos componentes. Según la intensidad del color del complejo formado. A pesar de lo anterior.(Caseína)Ca2+ + HOAc Caseína + CaOAc isoeléctrico del caseinato de calcio (pI = 4. A este sólido obtenido. Para sustancia con numerosos enlaces peptídicos se esperaría un complejo morado intenso. el complejo obtenido fue de color celeste/morado claro. también es posible utilizar Biuret para cuantificar la cantidad de 4 Figura 3. Esta prueba no es exclusiva para identificar péptidos. La acetona se emplea como disolvente de la reacción. debido a que se encuentra en una gran cantidad. Al precipitar la caseína y otras proteínas. sino que forma complejos con otros compuestos nitrogenados. lo que produce una coloración violeta. Para separar los triglicéridos y otras grasas de la leche del sólido de la caseína se agrega éter etílico para que disuelva los triglicéridos y todos los demás componentes apolares de la mezcla. Figura 4. correspondiente a la caseína. se le aplicaron una serie de pruebas para determinar la naturaleza de los grupos funcionales presentes en la misma. este reconoce el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. es decir. las aplicaciones de este método no solo van en el ámbito de la mera identificación visual de los enlaces peptídicos. son cadenas polipéptidos muy largas. induciendo la precipitación. Como en toda proteína.

esto podría lograrse al utilizar métodos analíticos como polarimetría. al calentar. depende directamente de la cantidad de lactosa presente en la reacción (Cuadro I). 2da Ed. Se podría determinar de manera mas eficiente la cantidad precisa de cuanto ácido múcico mediante la determinación de la cantidad precisa de lactosa presente en una muestra. la coloración del precipitado de esta prueba 8 Revilla.proteína presente en una determinada matriz. en la mayoría de los casos se utilizan procedimientos de separación que involucran el hecho básico de la diferencia de gravedad especifica entre la grasa y el resto del producto lácteo. cabe destacar. Tecnologías de las Leche: Procesamiento. Hg(NO3)2 y HgNO3). Las proteínas que dan prueba positiva ante este reactivo. las extracciones con 5 . En este caso particular se utilizó leche descremada. mientras con una se determina la presencia de residuos aromáticos. CIDIA. cromatografía o valoraciones con ácido pícrico o tricoloroamina. En dicha prueba se rompe el enlace disulfuro con NaOH y luego se precipita el azufre con el acetato de plomo. aquellas proteínas que contengan tirosina. Se obtuvo un sólido amarillento. Otros métodos para cuantificar esto podrían ser la determinación de nitrógeno por Kjeldahl o la titulación con formaldehído. La prueba Xantoproteica reconoce los grupos aromáticos presentes en las proteínas. La prueba de Millón identifica residuos fenólicos en las proteínas. es decir. en la otra determina si tales compuestos aromáticos son fenólicos o no. aquellas proteínas que contengan tanto tirosina como fenilalanina. Las pruebas Xantoproteica y de Millón están muy relacionadas entre sí.8 PRUEBA DE BIURET PROTEÍNA CuSO4 NaOH COMPLEJO VIOLETA COLORACIÓN NARANJA COLORACIÓN ROJA PRUEBA X ANTOPROT EIC A HNO3 PROTEÍNA PRUEBA DE M ILLON PROTEÍNA HNO3 Hg(NO3)2 PRUEBA PARA AZUFRE S S NH C O CH NH CH2 HN CH2 CH C O HN 1. se producen 2 equivalentes del mismo al reaccionar la lactosa con el ácido nítrico. entre más fenoles haya. el precipitado será cada vez más rojo. esto puede deberse a otros componentes de la leche no tomados en consideración (Ver Figura 1). se precipitan por acción de los ácidos inorgánicos fuertes del mismo (HNO3. pp. o sea. Actualmente también se utilizan medio mecánicos de centrífuga para realizar esta separación. dando un precipitado blanco que gradualmente se vuelve rojo. La presencia de azufre en las proteínas se determina por medio de la prueba para Azufre. Reacciones de pruebas de identificación cualitativa para las proteínas. dicho precipitado es de color negro (PbS). A. Al igual que en las pruebas anteriores. la intensidad del color depende de la cantidad de grupos aromáticos presentes en la molécula. El uso de este tipo de leche es muy factible porque reduce el procedimiento enormemente. manufactura y análisis. con el cual el ácido nítrico forma compuestos nitrados amarillosanaranjados. San José. Pb(OAc)2 PbS Figura 5. que difiere en la leche normal debido a que es eliminada una gran mayoría de su contenido graso. lo cual difiere de lo esperado (Sólido cristalino blancuzco). Costa Rica. La síntesis de ácido múcico. va a depender de la cantidad de residuos fenólicos presentes en la proteína. NaOH 2. 7 – 40.

las pruebas de identificación de las proteínas dieron los resultados esperados. aunque basándose en los resultados. de manera que ciertos compuestos precipiten y otros no. La señal a 3. junto con las grasas. En 5. También puede ser una razón para que otras sustancias liposolubles pueda que hayan permanecido en el sólido graso final y por ello el porcentaje de recuperación excediera lo esperado. La composición de la leche varía de acuerdo al mamífero que la sintetice.0 ppm corresponden a los múltiples protones de los grupos OH ligados a las estructura molecular de la lactosa. obteniendo así una mezcla fácilmente separable por medio de filtración. Conclusiones La leche es un complemento alimenticio muy importante por su alto contenido de aminoácidos esenciales.5 ppm corresponde al hidrogeno en posición 2 del componente galactosa. centrifugación o una combinación de estas. vitaminas. En esta práctica no se determinó la pureza de la caseína extraída. el producto obtenido contenía otras sustancias aparte de la caseína. 6 . La señal a 4. en conjunto con otros reactivos orgánicos comunes.3 ppm corresponde a los hidrógenos α al puente glucosídico en el componente correspondiente a la galactosa. minerales. A pesar de todas las limitaciones. carbohidratos y grasas.5 – 4.éter/acetona son reducidas significativamente debido a lo anterior. A 4.23 ppm aparece una señal correspondiente al hidrogeno α al enlace glucosídico en el componente glucosa. al adicionarse HOAc. las señales entre 3. el agua y la lactosa. decantación.8 aparece una señal correspondiente al agua. La leche puede separarse en sus componentes principales de una manera muy sencilla. La caseína es uno de los componentes mayoritarios en la leche. Una mezcla de varios componentes puede ser separada por medios simples tan sólo controlando el pH y luego la polaridad/proticidad de los disolventes utilizados. En el caso del análisis con espectroscopia 1 H-RMN.