Química de la leche, Pruebas de Proteínas y Análisis de Aminoácidos

Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Escuela de Química Sección de Química Orgánica Laboratorio de Química Orgánica II QU0255 Estudiante Carne Profesores Asistente Manrique Cubero Morales A41775 Lic. Graciela Artavia Dr. Víctor Hugo Soto Yulia Yuts

Se realizaron pruebas para el contenido de componentes y el estudio de propiedades de estos componentes a varios tipos de leche (Caso particular: En Polvo Descremada y Liquida Descremada). Los carbohidratos (Lactosa), grasa (Fosfolipidos) y proteínas (Caseína) de la leche fueron separados según un esquema de separación para obtener de ellos un porcentaje de rendimiento y caracterización. Además se llevaron a cabo diferentes pruebas de caracterización de proteínas, tales como las Pruebas de Biuret, Xantoproteica, Millon, para Azufre. Estas pruebas se le aplicaron a la caseína extraída en la práctica. Por otra parte se obtuvo ácido múcico a partir de la leche, posterior a un tratamiento con ácido acético y ácido nítrico. Introducción Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas de alrededor de 20 diferentes aminoácidos, unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos y se encuentran como mezclas complejas en los tejidos orgánicos. Su separación en fracciones con características moleculares definidas ha permitido alcanzar un enorme conocimiento sobre sus funciones y estructuras.1 Estas macromoléculas poseen propiedades y características que las diferencian unas de otras y por medio de dichas propiedades, pueden ser separadas y aisladas de sus fuentes.2 Las proteínas se clasifican en dos tipos principales según su composición: en proteínas simples y conjugadas. Las proteínas simples forman aminoácidos cuando se hidrolizan, en cambio las proteínas conjugadas producen aminoácidos, carbohidratos, grasas o ácidos nucleicos. Estas últimas son más comunes que las proteínas simples.3 Otra manera de clasificar las proteínas es según su forma tridimensional, en proteínas globulares o fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno, siendo solubles en agua. Por ejemplo la hemoglobina y la insulina.4 Las proteínas fibrosas consisten en cadenas de polipéptidos, arregladas en largos filamentos. Son insolubles en agua y muy resistentes. Sirven para construir materiales estructurales como los tendones, uñas, músculos; por ejemplo la queratina y el colágeno.4 La leche contiene vitaminas, minerales, proteínas, carbohidratos y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C (Figura 1). 5

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McMurry, J. Química Orgánica. 6ª ed., International Thomson: México. 2004. pp. 1009-1012. 2 Morrison, R. T.; Boyd, R. N. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson Educación: México. 1998. pp. 1342-1343.

Wade, L. J. Jr. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson Educación: Madrid. 2004. pp. 1151-1155. 4 Weininger, S. J.; Stermitz, F. R. Química General. Editorial Reverté: Barcelona, España. 1988. pp. 901-944.
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Ribadeau-Dumas, B; Grappin, R. Milk protein analysis. Le Lait. 1989. pp. 357-416.

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En la leche hay tres clases de proteínas: caseína.6 La función biológica de las micelas de caseína (Figura 2) es transportar grandes cantidades de calcio y fósforo altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. pp. Limusa Wiley: México. La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. la micela formada también contiene citrato. D. Manual de Laboratorio. La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. 2001.pdf. lipasa. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. Visitado el 20 de oct del 2010 a las 20 horas. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. lactoalbúminas y lactoglobulinas (todas globulares).es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbio mol/Practica3FQB.6 aproximadamente. Ca y P.6 La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. iones. enzimas plasmáticas y suero. La caseína en la leche se encuentra en forma de caseinato de calcio. Sevilla. La caseína no contiene puentes di sulfuro. http://www. 6 Miller. 33-38. estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4. Si se añade ácido a la leche. Práctica 3: Extracción de la Caseína y determinación del Punto Isoeléctrico.6. Componentes de la leche.6 El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. El pH de la leche es 6. Además de caseína. Química de Alimentos. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico. la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza Figura 2. Estructura de la micela de la caseína.5 (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. 2 .7% en composición de la leche líquida. 7 Universidad Pablo de Olavide.upo. España.7 Figura 1.

72% 227% 100% Cuadro III. Compuesto Lactosa Grasa Caseína Masa Recuperada (g) 0. 668. 1 H NMR: (400 MHz. 876. 4. 3. 1117. Xantoproteica. 799.45 (d). 1720.0 (m).Las proteínas que aparecen en el sobrenadante cuando se precipita la caseína en medio ácido son proteínas globulares. para Azufre.3 reactivo 235. HO OH OH OH O O HO HO OH O HO O OH OH HNO3 HO 2 O OH OH OH Reactivos Formula C12H22O11 HNO3 Limitant Si No e Masa de muestra 4. Masas y porcentajes de recuperación de otros compuestos aislados en el laboratorio.10 0.23 (d). 1035.4 μmol 55. 861.10 Porcentaje de rendimiento 7. 899. 4. 1426.2 mg mg (g) Concentr ación --5.37 mmol 160 mg 160 mg 761.1 μmol reactivo μmol Masa de 43. Precipitado rojo Positivo. Se extrajo de la leche ácido múcico por tratamiento de la lactosa obtenida con ácido nítrico. Lactosa IR (fase KBr) (cm-1) 3379. La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos. y no se realizaron purificaciones de ninguno de ellos antes de la práctica en mención. 2633.16 0.10 Masa Esperada (g) 2. También se aisló la lactosa por medio de la reacción del HOAC con la caseína y se purifico. 778. 2394. la clarificación de vinos. asi como se separaron los componentes de la leche para caracterizarlos.80 (s). Precipitado negro Discusión Dentro del esquema de separación de la leche (Figura 3) el primer paso es la separación de las proteínas y grasas de los carbohidratos (lactosa).0 (mol/L) (*) Tomando en cuenta que la porción diaria es de 250 mL con un valor de 12 g de carbohidratos.40 Cuadro II. Después se agrega poco a poco ácido acético al 10% para acidificar la leche en polvo. Millon. 2900. CDCl3) δ (ppm) 5. para el curso de Química Orgánica I”. Coloración amarilla Positivo.04 2. Parte Experimental Para esta practica de laboratorio. no se hizo uso de ningún tipo de equipo especial. azul-morado Positivo.80 g Productos Formula Equivalente s Masa esperada (g) Mol esperados Masa medida (g) Masa de producto (g) Mol de producto Porcentaje de rendimiento (%) C6H10O8 2 288.1 687. Prueba Resultado/Observaciones Biuret Xantoproteica Millon Azufre Positivo. Por consiguiente para 100 mL = 4.80 --(g) Volumen 100 mL(*) 12 mL (mL) Mol de 687. Los ensayos realizados fueron: las Pruebas de Biuret. Primeramente se disuelve la leche en agua y se calienta a 40 °C. hidrofílicas y solubles en agua así como susceptibles de 7 desnaturalización por calor. Resultados Cuadro I. 1294. 919. Síntesis del Ácido Múcico a partir de Leche y ácido nítrico. 1094.78 mg 1. la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos.30 (t). Se siguió el procedimiento descrito por Pérez y Lamoureux en su “Manual de Practicas para laboratorio.91 2. 1116. y alcanzar el punto 3 . Los reactivos utilizados fueron proporcionados por la Proveeduría de la Escuela. 1059.50 – 4. 1420. Acido Mucico IR (fase KBr) (cm-1) 3293. 3. Resultados de las pruebas de caracterización aplicadas a la muestra de caseína aislada.

La acetona se emplea como disolvente de la reacción. En este punto ya se separaron la caseína (sólida) y las grasas (disueltas en éter etílico).(Caseína)Ca2+ + HOAc Caseína + CaOAc isoeléctrico del caseinato de calcio (pI = 4. En este momento es necesario agitar bien porque la caseína tiene adsorbidas las moléculas de grasa y al estar como un aglomerado semisólido es difícil poder asegurar la extracción completa de las grasas.6). Esta prueba no es exclusiva para identificar péptidos. son cadenas polipéptidos muy largas. Según la intensidad del color del complejo formado. A este sólido obtenido. el procedimiento que resulto mas fácil fue el de la obtención de la caseína (en forma de caseinato de calcio). induciendo la precipitación. Para sustancia con numerosos enlaces peptídicos se esperaría un complejo morado intenso. al alcanzarse el punto isoeléctrico existe una igualdad de cargas por lo que es una molécula neutra y se hace insoluble en disolventes polares. indicando que estas proteínas contienes muchos enlaces peptídicos. Esquema de separación de los componentes de la leche . debido a que se encuentra en una gran cantidad. este reconoce el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. se le aplicaron una serie de pruebas para determinar la naturaleza de los grupos funcionales presentes en la misma. el complejo obtenido fue de color celeste/morado claro. En la mezcla ácida restante quedan disueltas trazas de proteínas y la lactosa. Para la caseína extraída. Al precipitar la caseína y otras proteínas. es decir. correspondiente a la caseína. En este aglomerado van adsorbidas las moléculas de grasa por lo que con solo la adición de ácido acético se separan estos dos componentes. Reacción del ácido acético con el caseinato de calcio para la formación de caseína sólida. Para separar los triglicéridos y otras grasas de la leche del sólido de la caseína se agrega éter etílico para que disuelva los triglicéridos y todos los demás componentes apolares de la mezcla. A pesar de lo anterior. se puede estimar el número de enlaces peptídicos que hay en la proteína. el análisis correspondiente es el siguiente: El reactivo de Biuret está formado por una solución de sulfato de cobre en medio alcalino. En la separación de los componentes de la leche. se forma un aglomerado blanco apolar fácilmente filtrable. debido a que esta proteína no contiene muchos enlaces peptídicos. Figura 4. las aplicaciones de este método no solo van en el ámbito de la mera identificación visual de los enlaces peptídicos. también es posible utilizar Biuret para cuantificar la cantidad de 4 Figura 3. lo que produce una coloración violeta. Como en toda proteína. sino que forma complejos con otros compuestos nitrogenados.

Reacciones de pruebas de identificación cualitativa para las proteínas. Las pruebas Xantoproteica y de Millón están muy relacionadas entre sí. La prueba de Millón identifica residuos fenólicos en las proteínas. cabe destacar. CIDIA. va a depender de la cantidad de residuos fenólicos presentes en la proteína. 2da Ed. A. que difiere en la leche normal debido a que es eliminada una gran mayoría de su contenido graso. la intensidad del color depende de la cantidad de grupos aromáticos presentes en la molécula. Las proteínas que dan prueba positiva ante este reactivo. con el cual el ácido nítrico forma compuestos nitrados amarillosanaranjados. Se podría determinar de manera mas eficiente la cantidad precisa de cuanto ácido múcico mediante la determinación de la cantidad precisa de lactosa presente en una muestra. la coloración del precipitado de esta prueba 8 Revilla.proteína presente en una determinada matriz. La prueba Xantoproteica reconoce los grupos aromáticos presentes en las proteínas. el precipitado será cada vez más rojo. al calentar. Otros métodos para cuantificar esto podrían ser la determinación de nitrógeno por Kjeldahl o la titulación con formaldehído. dando un precipitado blanco que gradualmente se vuelve rojo. NaOH 2. es decir. se precipitan por acción de los ácidos inorgánicos fuertes del mismo (HNO3. depende directamente de la cantidad de lactosa presente en la reacción (Cuadro I). En este caso particular se utilizó leche descremada. La presencia de azufre en las proteínas se determina por medio de la prueba para Azufre. Costa Rica. El uso de este tipo de leche es muy factible porque reduce el procedimiento enormemente. Pb(OAc)2 PbS Figura 5. cromatografía o valoraciones con ácido pícrico o tricoloroamina. La síntesis de ácido múcico. aquellas proteínas que contengan tirosina. lo cual difiere de lo esperado (Sólido cristalino blancuzco).8 PRUEBA DE BIURET PROTEÍNA CuSO4 NaOH COMPLEJO VIOLETA COLORACIÓN NARANJA COLORACIÓN ROJA PRUEBA X ANTOPROT EIC A HNO3 PROTEÍNA PRUEBA DE M ILLON PROTEÍNA HNO3 Hg(NO3)2 PRUEBA PARA AZUFRE S S NH C O CH NH CH2 HN CH2 CH C O HN 1. Se obtuvo un sólido amarillento. esto podría lograrse al utilizar métodos analíticos como polarimetría. 7 – 40. esto puede deberse a otros componentes de la leche no tomados en consideración (Ver Figura 1). manufactura y análisis. se producen 2 equivalentes del mismo al reaccionar la lactosa con el ácido nítrico. Hg(NO3)2 y HgNO3). dicho precipitado es de color negro (PbS). Tecnologías de las Leche: Procesamiento. Al igual que en las pruebas anteriores. aquellas proteínas que contengan tanto tirosina como fenilalanina. San José. mientras con una se determina la presencia de residuos aromáticos. pp. o sea. en la mayoría de los casos se utilizan procedimientos de separación que involucran el hecho básico de la diferencia de gravedad especifica entre la grasa y el resto del producto lácteo. entre más fenoles haya. las extracciones con 5 . en la otra determina si tales compuestos aromáticos son fenólicos o no. En dicha prueba se rompe el enlace disulfuro con NaOH y luego se precipita el azufre con el acetato de plomo. Actualmente también se utilizan medio mecánicos de centrífuga para realizar esta separación.

minerales.3 ppm corresponde a los hidrógenos α al puente glucosídico en el componente correspondiente a la galactosa. obteniendo así una mezcla fácilmente separable por medio de filtración.0 ppm corresponden a los múltiples protones de los grupos OH ligados a las estructura molecular de la lactosa. de manera que ciertos compuestos precipiten y otros no. las pruebas de identificación de las proteínas dieron los resultados esperados. centrifugación o una combinación de estas. las señales entre 3. carbohidratos y grasas. Una mezcla de varios componentes puede ser separada por medios simples tan sólo controlando el pH y luego la polaridad/proticidad de los disolventes utilizados. La composición de la leche varía de acuerdo al mamífero que la sintetice.5 ppm corresponde al hidrogeno en posición 2 del componente galactosa.5 – 4. También puede ser una razón para que otras sustancias liposolubles pueda que hayan permanecido en el sólido graso final y por ello el porcentaje de recuperación excediera lo esperado. En el caso del análisis con espectroscopia 1 H-RMN. 6 . vitaminas. En 5. A 4. La señal a 3. el agua y la lactosa. el producto obtenido contenía otras sustancias aparte de la caseína. Conclusiones La leche es un complemento alimenticio muy importante por su alto contenido de aminoácidos esenciales. La señal a 4. decantación. A pesar de todas las limitaciones. La caseína es uno de los componentes mayoritarios en la leche.éter/acetona son reducidas significativamente debido a lo anterior. La leche puede separarse en sus componentes principales de una manera muy sencilla.23 ppm aparece una señal correspondiente al hidrogeno α al enlace glucosídico en el componente glucosa. junto con las grasas. al adicionarse HOAc.8 aparece una señal correspondiente al agua. aunque basándose en los resultados. En esta práctica no se determinó la pureza de la caseína extraída. en conjunto con otros reactivos orgánicos comunes.

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