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CAPITULO

FIGURA 8-1

Cristeles de quimotripsine bovina

011 mm

8

Enzimas: cinetica e lnhibiclon

Los enzimas son proteinas especializadas en la catalisis de las reacciones bioloqicas, Se encuentran entre las mas notables de las biomoleculas conocidas debido a su extraordinaria especificidad y a su poder catalitico, que es mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre.

Gran parte de la historia de la bioquimica es la historia de la investiqacion de los enzimas. El nombre enzima (een la levadura») no se empleo hasta 1877. pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores bioloqicos intervenian en la fermentacion del azucar para formar alcohol (de aqui el nombre inicial de e fermentos»}. La primera teoria general sobre la catalisis quimica, publicada por J. J. Berzelius en 1835. incluia un ejemplo de 10 que ahora se conoce como enzima, la diastasa de la malta. y sefialaba que la hidrolisis del almidon se cataliza por la diastasa con mas eficacia que por el acido sulfurico.

Aunque Luis Pasteur reconocio que la Iermentacion es catalizada por enzimas, postulo en 1860 que estes se hallaban ligados de modo inextricable con la estructura y la vida de las celulas de la levadura. Constituyo, por ello, un logro importante en la historia de la investiqacion enzimatica que. en 1897. E. Buchner consiguiera extraer los enzimas que catalizan la fermentaci6n alcoholica de" las celulas de levadura. Este hecho demostraba claramente que estos importantes enzimas, que catalizan una ruta metabolica principial productora de energia, pueden actuar independientemente de la estructura celular. Hasta muchos afios despues, sin embargo. no fue aislado por vez primera un enzima en forma cristalina; ello 10 consigui6 J. B. Sumner. en 1926. con la ureasa, aislada de extractos de la alubia Cenneoelie enzyformis. Sumner demostr6 que los cristales se hallaban constituidos por proteina y lleg6 a la conclusion. contra ria a la opinion que prevalecia por aquel entonces, de que los enzimas son proteinas. Sus puntos de vista no Iueron aceptados Inmediatamente, sin embargo. y hasta el periodo comprendido entre 1930 y 1936. durante el cual Northrop aisle la pepsina cristalizada, la tripsina y la quimotripsina (fig. 8-1). no quedo bien establecida la natu-

,j"

raleza proteica de los enzimas.'-En la actualidad se han identi-

ficado cerca de 2000 enzimas diferentes. Muchos de ellos se han aislado en forma pura y homoqenea, y alrededor de un os

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

200 se han po dido cristalizar. Aunque se han identificaclQi la mayor parte de los enzimas relacionados con eI metabolismo basico corriente de la celula quedan por resolver muchos problemas importantes, entre ellos el control genetico de la sintesis enzimatica, los mecanismos moleculares mediante los que se regula la actividad enzimatica y el papel de las formas multiples de algunos enztmas en el desarrollo y en la diferenciacion. Pero sobre todo, todavia no se conoce en terminos moleculares, como catalizan los enzimas las reacciones quimicas con tal eficacia, precision y especificidad.

En este capitulo y el siguiente. no se hara ninqun intento para catalogar y describir eI gran numero de enzimas diferentes conocidos hasta la feeha; se examinaran mas bien las propiedades y caracteristicas comunes a la mayor parte de los enzimas. Los enzimas especificos que participan en diversos ciclos metabolicos se estudiaran, mas detalladamente en capitulos sucesivos.

Nomenclatura y clasificaci6n de los enzimas

Muchos enzimas han sido designados afiadiendo eI sufijo -asa al nombre del susrraro, es decir, de la molecula sobre la eual el enzima ejerce su accion catalitica. Por ejernplo, la ureasa cataliza la hidrolisis de la urea con produccion de amoniaco y CO2, la arginasa cataliza la hidrolisis de la arginina a ornitina y urea, y la [osfatasa cataliza la hidrolisis de los esteres Iosforicos. Esta nomenclatura, sin embargo, no siempre ha resultado practica, 10 cual ha ocasionado que muchos enzimas hayan recibido nombres que quimicamente son poco informativos; por ejemplo, la pepsina, la tripsina, y la catalasa. Por dicha razon, y porque el numero de enzimas que se descubren esta aumentando rapidamente, se ha adoptado una clasificacion sistematica de los enzimas sequn recomendacion de una com is ion internacional de enzimas. El nuevo sistema divide a los enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con eI tipo de reaccion catalizada (tabla 8~ 1 ). Cada enzima es designado por un nombre recomendedo, generalmente corto y apropiado para su uso habitual; por un nombre sistematico, que identifica la raccion que cataliza, y por un nitmero de clasificaci6n, que se emplea cuando se precisa la identificacion inequivoca del enzima, tal como ocurre en las revistas internacionales de investiqacion, en los resurnenes y en los indices. Se da como ejemplo, el enzima que cataliza la reaccion

ATP + creatina ~ ADP + fosfocreatina

El nombre recomendado de este enzima, eI que se emplea normalmente, es creatin~quinasa y el nombre sistematico, que se bas a en la reaccion catalizada, es ATP: creatin~fosfotra.ns~ ferasa. Su numero de clasificacion es EC 2.7.3.2, en donde EC siqnifica, abreviadamente, Comision de Enzimas; la primera cifra (2) representa eI nombre de la cIase (transferasas), la segunda cifra (7) represent a a la subclase (Iosfotransferasas), Ia tercera cifra (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitroqeno como aceptor) y la cuarta cifra (2) designa a la creatin-quinasa (vease tabla 8~ 1 ). En este libro utilizaremos los nombres recomendados de los enzimas, tal como se

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TABLA 8-1. Clasiftcaclon Internacional de los enzimas (denominaciones de las clases, numeros de codiqo

y tipos de reacciones catalizadas},

1. 6xido-reductasas
(Reacciones de oxido-reduccion)
1.1 Actuan sobre ~CH-OH
1.2 Actaan sobre \:=0
/
-,
1.3 Actuan sobre C=CH-
/
1.4 Actuan sobre -,
/CH-NH2
1.5 Actaan sobre <,
CH-NH-
/
1.6 Actuan sobre NADH;
NADPH 2. Transferasas
(Transferencia de grupos funclo-
nales)
2.1 Grupos de un atomo de
carbono
2.2 Grupos aldehidicos 0
cetonlcos
2.3 Grupos acilos
2:4 Grupos glucosilo
2.7 Grupos fosfato
2.8 Grupos que contienen azufre
3. Hidrolasas
(Reacciones de hidrolisis]
3.1 Esteres
3.2 Enlaces glucosidicos
3.4 Enlaces peptidicos
3.5 Otros enlaces C-N
3.6 Anhidridos de acldo
4. Liasas
(Adicion a los dobles enlaces)
4.1 "- /
C=C
/ "-
4.2 '\.
c=o
/
4.3 <,
C=N-
/
5. Isomerasas
(Reacciones de Isomerizacion]
5.1 Racemasas
6. Ligasas
(Formaclon de enlaces con escision
del ATP)
6.1 C-O
6.2 C-S
6.3 C-N
6.4 C-C TABLA 8-2. Algunos de los enzimas que contienen iones metalicos 0 los necesitan como cofactores.

Zn2+ Alcohol-deshidrogenasa Anhidrasa-carb6nica Carboxipeptidasa

Mg2+ Fosfohidrolasas Fosfotransferasas Mn2+

Arginasa Fosfotransferasas

Fe2+ 0 Fe3+ Citocromos Peroxidasa Catalasa Ferredoxina

Cu2+ (Cu+) T'iroslnasa Cltocromo-cxidasa K+

Piruvato-qulnasa [tambien necesita Mg2+)

Na+

A TPasa de la membrana plasmatica

(necesita tambien K+ y Mg2+)

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

hallan catalogados en la edici6n de Enzyme Nomenclature, 1973 (vease Bibliografia), salvo unas pocas excepciones.

Cofactores enzimaticos

La actividad de algunos enzimas depende solamente de su estructura como proteinas, mientras que otros necesitan, ademas uno 0 mas componentes no proteicos, llamados cofactotes. El cofactor puede ser un ion metalico, 0 bien una molecula orqanica llamada coenzime: algunos enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras que muchas proteinas enzimaticas pierden la actividad por calefacci6n. El complejo enzima-cofactor cataliticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteina restante, que por si misma es inactiva cataliticamente, se designa con el nombre de epoenzime;

La tabla 8-2 reune algunos enzimas que precisan de iones metalicos como cofactores. En tales enzimas el ion metalico puede actuar como: 1) centro catalitico primario; 2) como grupo. puente para reunir el sustrato y el enzima, formando un complejo de coordinaci6n; 0 3) como agente estabilizante de la conformaci6n de la proteina enzimatica en su forma cataliticamente activa. Los enzimas que precis an de iones metalicos se Haman a veces metaloenzimas; en algunos de ellos, el componente metalico, por si solo, ya posee una actividad catalitica primaria, muy incrementada a su vez por la proteina enzimatica: por ejemplo, la catalasa, es un enzima ferroporfirinico que cataliza la descomposici6n muy rapida del peroxide de hidrogeno, en agua y oxigeno; las simples sales de hierro tambien cat ali zan esta reacci6n, pero a velocidad mucho menor.

L~vtabla 8-3 reune los principales coenzimas conocidos y

tlOS tipos de reacciones enzimaticas en las que participan. Cada o de los coenzimas catalog ados contiene, como parte de su ructura, una molecula de alguna de las vitaminas; estas son sustancias orqanrcas que, en cantidades mmimas (trazas), son vitales para la funcion de todas las celulas, y deben figurar en la dieta de algunas especies. Las vitaminas y sus formas coenzimaticas seran objeto de estudio en el capitulo 13 (pagina 341). Los coenzimas actuan, por 10 general, como trans-

Coenzima

TABLA 8-3. Coenzimas de reacciones de transferencia de grupos.

Entidad transferida

Nicotinamida-adenina-dinucleotido Fosfato de nicotfnamlda-adenina-dinu-

cleotldo Flavin-mononucleotido Flavin-adenina-dinucleotido Coenzima Q

Pirofosfato de tiamina Coenzima A

Lipoamida

Coenzimas cobamidicos Biocitina

Fosfato de piridoxal Coenzimas tetrahtdrofolicos

Atomos de hidroqeno (electrones)

Atomos de hidroqeno (electrones) Atomos de hidroqeno (electrones) Atomos de hldroqeno (electrones) Atomos de hidroqeno (electrones) Aldehidos

Grupos acilo

Grupos acilo

Grupos alquilo

Dloxido de carbono

Grupos amino

Grupos metilo, metileno, formilo 0 formimino

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

portadores intermediarios de grupos funclonales, de atom os especlficos 0 de electrones, los cuales son transferidos en la reacci6n enzimatica global. Cuando el coenzima se halla unido intimamente a la molecula del enzima recibe, normalmente, el nombre de gmpo prostetico; por ejemplo, el grupo biocitina de la acetil-Co.Avcarboxtlasa, que se halla incorporado covalentemente en la cadena polipeptidica (pag. 351 ). Sin embargo. en algunos casos el coenzima esta unido debilmente y actua, esencialmente, como uno de los sustratos especificos de aquel enzima,

Cinetica quimica

Antes de proceder a examinar la catalisis enztmatica de las reacciones, deben esbozarse algunas relaciones y terminos empleados para la medicion y expresi6n de las velocidades de las reacciones quimicas. Las reacciones quimicas pueden clasificarse basandose en el numero de moleculas que en total deben reaccionar para formar los productos de la reacci6n. Asi tendremos reacciones monomoleculeres, bimoleculares y trimo~ leculsres, en las que reaccionan una, dos 0 tres moleculas, respectivamente.

Las reacciones quimicas pueden clasificarse tambien sobre una base cinetica, por el orden de reacci6n. Tendremos, de este modo. reacciones de orden cero, de primer orden, de se~ gundo orden y de tercer orden, segun como resulte influida la velocidad de reacci6n por la concentraci6n de los reaccionantes bajo un conjunto de condiciones determinado.

Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad exactamente proporcional a la concentraci6n de un reaccionante (fig. 8~2). El ejemplo mas sencillo es cuando la velocidad de la reacci6n

A~P

es exactamente proporcional a la concentraci6n de A. En este caso la velocidad de reacci6n en cualquier tiempo t viene dada por la ecuad6n de primer orden

-d[A) =k[A)

dt

en la que [A] es la concentracion molar de A y -d[A]/dt es la velocidad a que disminuye la concentraci6n de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad 0 velocidad de reacci6n especiiice, Las constantes de velocidad de primer orden poseen las dimensiones del reciproco del tiempo habitualmente S-l.

La forma integrada de esta ecuacion, que es mas util para la realizaci6n de calculos cineticos, es

[Ao) kt

log [A) = 2,303

en la que [Ao] es la concentraci6n de A al tiempo cero, y [A] es la concentraci6n al tiempo t.

En las reacciones de primer orden, el tiempo mitad (tI/2) de la reacci6n viene dado por

0,693 tI/2=-k-

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FIGURA 8~2

Representacion grafica del curse de una reeccion de primer orden. El tiempo medio (tYz) es el neceserio para que se consume le mitad de le centided inicial del reeccionente.

[A}

,/ Pendtente de 1a tangente dIAl

=-Tt

t_

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibici6n

relacion que se deduce facilmente. Observese que en las reacciones de primer orden, el tiempo mitad es independiente de la concentracion inicial del sustrato.

Reacciones de segundo orden son aquellas cuya velocidad es proporcional al producto de la concentracicn de dos reaccionantes 0 a la segunda potencia de uno de los reaccionantes. El ejemplo mas sencillo es la reaccion

La velocidad de esta reaccion que puede ser designada como -(d[A]/dt). -(d[B]jdt) 0 +(d[PJldt). es proporcional al producto de las concentraciones de A y de B, y viene dada por la ecuaci6n de velocidad de segundo orden

-dIAl = k[AJ[B] dt

en la que k es la constante de velocidad de segundo orden. Si la reaccion tiene la forma

2A-P

y su velocidad es proporcional al producto de la concentracion de las dos moleculas reaccionantes, la ecuacion de velocidad de segundo 'orden es

-dJtA] = k[AJ[A] = k[A]2

Las constantes de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen las dimensiones 1/ [concentracion X tiempo], 0 M-1 s+, La forma integrada de la expresion de segundo orden es

_ 2,303 [BoJ[A]

t - k([Ao] - [Bon log [AoJ[B]

en donde [Ao] y [80] son las concentraciones iniciales y [A] y [B] las concentraciones en el tiempo t.

En las reacciones de segundo orden, cuyas concentraciones de los reaccionantes son iguales, el tiempo mitad es igual a IjCok, en donde Co es la concentracion inicial de los reaccionantes y k la constante de velocidad de segundo orden.

Es importante observar que una reaccion de segundo orden, tal como

puede petecer, en ciertas condiciones, una reaccion de primer orden. Por ejemplo, si la concentraci6n de B es muy elevada, y la de A muy baja, esta reacci6n podria parecer como. de primer orden, ya que su velocidad seria casi proporcional a la concentraci6n de uno s610 de los reactivos; reacciones de seudoprimer orden 0 de primer orden aparente.

Las reacciones de tercer orden, que sonrelativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es proporcional al producto de tres terminos de concentraci6n. Algunas reacciones quimicas son independientes de la concentraci6n de cualquier reactivo; son las llamadas reacciones de orden cera. Muchas

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

reacciones catalizadas son de orden cero con respecto a los reactantes. Cuando es : este el caso, la velocidad de reaccion depende de la concentracion del catalizador 0 de alqun otro factor dis tin to a la concentracion de las especies moleculares que experimentan la reaccion, Las velocidades de reaccion no es preciso que sean necesariamente de primer orden puro 0 de segundo orden puro; en ciertas condiciones se observan con frecuencia ordenes de reaccion mixtos.

Energia libre de activaci6n y efectos de los catalizadores Una reaccion quimica, tal como A ~ P, tiene lugar porque cierta fraccion de la poblacion de moleculas A, en cualquier instante dado, posee la suficiente energia como para alcanzar un estado activado, llama do estado de trensicion, en el que es muy elevada la probabilidad de que se establezca 0 se rompa un enlace quimico para formar el producto P. Este estado de transicion reside en la cima de la barrera de energia que separa a los reaccionantes y a los productos (fig. 8~3). La velocidad de una reaccion quimica dada es proporcional a Ia concentracion de estas especies caracteristicas del estado de transicion. La energia libre de activacion AGt (el simbolo + se emplea para representar el proceso de activacion] es la cantidad de energia necesaria para llevar todas las molecules de 1 mol de sus tan cia a una temperatura determinada, al estado de transicion, en la cima de la barrera de activacion.

Hay dos metodos generales, mediante los cuales, puede acelerarse la velocidad de una reaccion quimica. Uno de ellos es la elevacion de la temperatura, ya que provoca un incre-

FIGURA 8-3

Diagrama de energia para una reeccion quimice, no catalizada y catalizada.

Energia libre

de activaci6n de la reacci6n directa (no cataltzada)

Estado

de transici6n

: '. :

. '. .

. '. .

d~ icid~----- ~1-+

. . . .

Energia libre : :

de activaci6n .

de la reacci6n

catalizada

- - Energia libre de activaci6n de la reacci6n inversa (catalizada)

---------A.--

Cambio . global de : energia libre :

de la .

reacci6n

~~

Estado final

Curso de la reacci6n ~

194

TABLA 8-4. Energia libre de activacion t:.G* calculada para la descomposicion del peroxide de hidroqeno a 20 "C.

La catalasa acelera la velocidad de la reaccion mas de 10' veces.

t:.G'"

Condiciones kcal mol?

Sin catalizar 18

Catalizada con platino coloidal 13

Catalizada por catalasa 7

FIGURA 8-4

Efecto de la concentrecion del sustreto sobre la velocided de una reeccion catalizada enzimeticemenie.

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

mento del movimiento termico y de la energia, aumenta el numero de moleculas capaces de alcanzar el estado de transicion, y acelera, de este modo, la velocidad de las reacciones qui micas. En muchas reacciones la velocidad de reaccion se duplica, aproximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura. La velocidad de una reaccion quimica puede verse incrementada tambien por la adicion de un catalizador; este se combina con los reaccionantes de modo transitorio y se produce un estado de transicion de menor energia de activacion que el correspondiente a la reaccion no catalizada. Asi los catalizadores aceleran las reacciones quimicas porque disminuyen la energia de activacion (fig. 8-3). Cuando se forman los productos de la reaccion se regenera el catalizador libre. La tabla 8-4 muestra la energia de activacion para la descomposicion del peroxide de hidrogeno, en ausencia 0 en presencia de un catalizador.

Cinetica de la~ reacciones catalizadas por los enzimas. Ecuaci6n de Michaelis- Menten

Los principios generales de la cinetica de las reacciones quimicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los enzimas, pero estas muestran tambien un rasgo caracteristico, que no se observa en las reacciones no enzimaticas: la saturadon con el sustrato. En la figura 8A vemos el efecto de la concentracion del sustrato sobre la velocidad de la reaccion catalizada por un enzima A ~ P. A una concentracion de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccion Vo es casi proporcional a la concentracion del sustrato y la reaccion, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracion de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reaccion disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracion de sustrato; en esta zona el orden de reaccion es mixto. Con un aumento posterior de la concentracion del sustrato, la velocidad de la reaccion llega a ser esencialmente independiente de la con centra cion de sustrato y se aproxima as intoticamente a una velocidad constante. En este intervale de concentraciones de sustrato la reacclon es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que el enzima se halla saturado con su sustrato. Todos los enzimas muestran el efecto de saturacion, pero varian ampliamente con respecto a la con centra cion de sustrato que se necesita para que se manifieste. El efecto de saturacion condujo a algunos

Vms.

t

Vo

[Sustrato]

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

de los primeros investigadores, en particular a J. Brown y tam bien a V. Henry, a formular lei hip6tesis de que el enzima y el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reacci6n catalizada.

L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron en 1913 una teoria general acerca de la acci6n y cinetica de los enzimas, la cual, fue ampliada posteriormente por G. E. Briggs y J. B. S. Haldane. Esta teoria, que es fundamental para el analisis cuantitativo de todos los aspectos de la cinetica de los enzimas y de la inhibicion, se ha desarrollado plenamente para el caso sencillo de una reacci6n en la que s610 hay un sustrato. La teoria de Michaelis-Menten supone que el enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuaci6n este ultimo se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P:

k+,

E+S~ES

k_,

(1)

(2)

Se supone que estas reacciones son reversibles: las constantes de velocidad para las reacciones directa e inversa poseen unsubindice positivo y otro negativo, respectivamente.

Deduciremos a continuaci6n la ecuaci6n de Mtchaelis-Menten, que expresa la relaci6n matematica entre la velocidad inicial de una reacci6n catalizada por un enzima, la concentraci6n del sustrato y ciertas caracteristicas del enzima. La ecuaci6n de Michaelis-Menten es la ecuaci6n de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que s610 actuan sobre un sustrato. En la deducci6n, debida a Briggs y Haldane, [E] representa la concentraci6n del enzima libre 0 no combinado. [ES] la concentraci6n del complejo enzima-sustrato, y [ET] la concentraci6n total del enzima (suma de las formas libre ycombinada). La concentraci6n del sustrato se representa por [S], la cual se supone que es mucho mayor que [E], de modo que la cantidad de S unida a E en cualquier

/ instante, es despreciable si se com para con la concentraci6n total de S.

El objeto de esta deducci6n es definir una expresi6n gene~ ral para vo, que es la velocidad inicial de una reacci6n cat alizada enzi~atjcamente, suponiendo que las reacciones de esta clase trans curren en dos etapas, tal como muestran las reacciones (1) y (2). La velocidad inicial es, por supuesto, igual a la velocidad de ruptura del complejo enzima-sustrato, ES, de acuerdo con la ecuaci6n (2); podemos escribir para ella la ecuaci6n de velocidad de primer orden.

(3)

Sin embargo, ya que ni k+2' ni [ES], pueden determinarse directamente, debemos encontrar otra expresi6n para Vo en funci6n de otras variables' que puedan medirse con mas Iacilidad. Para ello escribirernos en primer lugar la ecuaci6n de velocidad de segundo orden para la formaci6n de ES a partir de E y de S [vease la reacci6n (1)]:

d~tSl = k+l([ET]- [ES]) [S]

(4)

196

FIGURA 8-5

Transcurso de la [ormecion de un complejo enzime-sustreto en [unciori del tiempo

e iniciecion del estado estecionerio, tal como se deduce de la resolucion pot computador de los datos obtenidos en un expetimento real con un enzima tipico.

La potcion sombreada del gra[ico superior es la que aparece ampliada en la grafica inferior.

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

en la que k+l es la constante de velocidad de segundo orden. Aunque ES puede formarse tambien a partir de E y de P por inversion de la reacci6n (2), la velocidad de la reacci6n inversa puede despreciarse, ya que estamos considerando que da reacci6n se inicia en el sentido directo, cuando [S] es muy elevado y [P] es cero, 0 pr6ximo a este valor.

A continuaci6n escribiremos la ecuaci6n de velocidad para la descomposicion de ES por suma de dos reacciones: en primer lugar, la reacci6n que rinde el producto (reacci6n directa) y despues la reacci6n que produce E + S [la inversa de la ecuaci6n (1)]. Tendremos entonces:

-dIES] = k [ES] + k [ES]

dt -1 +2

(5)

Cuando la velocidad de formaci6n de ES es igual a su velocidad de desepericion, es decir, cuando el sistema ha alcanzado el estado estecionerio, que se define como aquel en que la concentraci6n de ES permanece con stante, entonces

(6)

Tiempo

T'iempo

197

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

La figura 8~5 muestra la variaci6n a 10 largo del tiempo de los diversos participantes.

Reordenando la ecuaci6n (6), obtenemos

[S]([ET] - [ES]) [ES]

(7)

La constante global KM, que sustituye al termino (k-l + kd/k+h se llama constante de Michaelis~Menten.

A partir de esta ecuaci6n puede obtenerse la concentraci6n del complejo ES en el estado estacionario, despejando dicho termino:

[ES] = [ET] [S] KM+[S]

(8)

Ya hemos vis to (anteriormente) que la velocidad inicial de reacci6n, vo, de una reacci6n enzimatica es

Vo = k+2 [ES]

(3)

Podemos sustituir, ahora, el termino [ES], que figura en la ecuaci6n (3), por su valor en la ecuaci6n (8):

v = k [ErHS]

o +2 KM + [S]

(9)

Cuando la concentraci6n del sustrato es tan elevada que practicamente to do el enzima del sistema esta presente en forma de complejo ES, es decir, cuando el enzima se halla satllrado, se alcanzara la velocidad inicial maxima, V max, dada por

(10)

en la que [ET] es la concentraci6n total del enzima, Sustituyendo k+2 [ET] por su valor deducido de la ecuaci6n (10), se obtiene

Vmax [S] Vo= KM+ [S]

(11)

:E:sta es la ecuacion de Michaelis-Menten: es la ecuaci6n de la velocidad para una reacci6n de un solo sustrato, catalizada enzimaticamente. Relaciona la velocidad inicial, la velocidad maxima y la concentraci6n inicial del sustrato a traves de la constante de Michaelis-Menten, Es importante observar que aunque 1(;1 ecuaci6n de Michaelis-Menten perece no contener ninqtin termino para la concentraci6n del enzima, en realidad est a se halla contenida en el termino V max, que hemos visto que es igual a k+2 [ET]'

De-le-eeuaeien- de Michaelis-Menten se deriva una relaci6n numerica import ante en el caso especial en que la velocidad inicial de la reacci6n sea exactamente la mitad de la velocidad maxima; es decir, cuando Vo = Y2 V max (fig. 8A).

V max V max [S]

2 KM + [S]

Al dividir por V max, se obtiene

1_ [S]

2- K~ + [S]

198

TABLA 8-5. KM de algunos enzimas.

Bnzima y sustreto KM{mM)
Catalasa
HzOz 25
Hexoquinasa
Glucosa 0,15
Fructosa 1,5
Quimotripsina
N-Benzoiltirosinamida 2,5
N- Formiltirosinamida 12,0
N-Acetiltirosinamida 32
Gliciltirosinamida 122
Anhidrasa carb6nica
HCO,- 9,0
Glutamato-deshidroqenasa
Glutamato 0,12
a-Cetoglutarato 2,0
NH.+ 57
NADox 0,D25
NAD,..d 0,D18
Aspartato a-amino transferasa
Aspartato 0,9
o-Oxoqlutarato 0,1
Oxalacetato 0,04
Glutamato 4,0 TABLA 8-6. Efecto de la estructura del sustrato sobre la

V nuU para la n-aminoacidooxidasa (los datos se refieren a la n-alanina = 100).

Sustreto

V nuU reletive

n-Ttrosma n-Prolina n-Metionina o-Alanlna n-Valina n-Histidina Glicocola

297 231 125 100

55 9,7 0,0

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

Reordenando, se transforma en

KM + [S) = 2[S) KM= [S)

Vemos asi que la constente de Micheelis-Menten KM es igual a la concentrecion de sustreto en la que la velocidadinicial de la reeccion es la mitad de le oelocided maxima. Las dimensiones de KM para una reacci6n de un solo sustrato son moles por litro, y la constante es independiente de la concentracion del enzima.

Puede obtenerse con facilidad, una aproximaci6n al valor de KM a partir de una serie de experimentos sencillos en los que la velocidad inicial de la reacci6n se mide a diferentes concentraciones iniciales de sustrato con una concentraci6n de enzima constante. EI valor aproximado de KM se obtiene gra~ ficamente al rep res en tar la velocidad inicial frente a la concentraci6n inicial del sustrato (fig. 8~4); se obtiene una hiperbole rectangular. A concentraciones de sustrato muy bajas, la veloci dad iniciaJ, vo, es casi proporcional la [S ]; es decir, la reacci6n muestra esencialmente un comportamiento de primer orden. A concentraciones de sustrato muy elevadas la velocidad de la reacci6n se aproxima asintoticamente a la V max v es esencialmente de orden cero; 0 sea, casi independiente de la concentraci6n del sustrato. Unos cuantos enzimas, como la catalasa, parecen no mostrar saturaci6n por el sustrato; ello es debido a que la velocidad de descomposici6n del complejo ES para formar productos es tan rapida que no puede convertirse facilmente en limitante del proceso.

La tabla 8~5 reune los valores de KM para varios enzimas.

Observese que KM no es un valor Iijo, sino que puede variar con la estructura del sustrato, con el pH y con la temperatura. Para los enzimas que poseen mas de un sustrato, cada\iMde. ellos exhibe una KM caracteristica. En condiciones intracelulares, los enzimas no se hallan necesariamente saturados por sus sustratos. Recordemos que la velocidad maxima, V max' que es igual a k+2 [ET], varia ampliamente de un enzima a otro para una concentraci6n de enzima determinada. La V max varia tambien con la estructura del sustrato (tabla 8-6), con el pH y con la temperatura.

La constante de Michaelis de un enzima constituye una caracteristica util e importante, que es fundamental no s610 para la descripci6n maternatica de la cinetica enzimatica, sino tambien para la determinaci6n cuantitativa de la actividad enzimatica en los tejidos y la purificaci6n del enzima. Ademas, la concentracion de sustrato que proporciona la mitad de la velocidad maxima, facilita una indicaci6n util para el analisis de algunos mecanismos de regulaci6n enzimatica (pag. 242). Un notable ejemplo de investigaci6n medica reciente pone de manifiesto la utili dad de KM en un nuevo aspecto. Algunos tipos de leucemia humana y animal (forma de cancer en la que los gl6bulos blancos sanguineos proliferan anormalmente) pueden suprimirse por administraci6n intravenosa del enzima asparaginasa, que cataliza la reacci6n

Asparagina + HiO ~ aspartato . + NH4+

Este descubrimiento condujo a la conclusi6n de que la asparagina presente en la sangre es un principio nutritivo esencial

199

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

para el crecimiento de los leucocitos malignos; la asparaginasa intravenosa produce la hidrolisis de la asparagina en aspartato, el cual, no satisface las necesidades de aquellas. Durante la busqueda de fuentes de asparaginasa adecuadas para el tratamiento de la leucemia se hizo el desconcertante descubrimiento de que no todas las asparaginasas son eficaces en la supresion de la leucemia experimental. Al final se encontro la razon: las asparaginasas de diferentes fuentes, animales, veqetales 0 bacterlanas, difieren en gran medida en el valor de KM respecto a la asparagina. Como la concentracion de asparagina en Ia sangre es muy baja, la administracion de una asparaginasa de otra especie solo sera terapeuticamente efectiva si su valor de KM es 10 suficientemente bajo como para hidrolizar la asparagina rapidamente, dada la pequefia concentracion con que esta presente en la sangre.

EI comportamiento cinetico de la mayor parte de los enzimas es mas complejo que el sencillo e idealizado de la reaccion de un solo sustrato que acabamos de estudiar, En primer lugar, nuestra formula cion ha supuesto que en la reaccion con un solo sustrato, se forma iinicamente un solo complejo enzimasustrato , pero ahora parece probable que en muchas de las reacciones con un sustrato puedan intervenir dos 0 tres complejos intermedios, tal como indica la secuencia

E+S~.ES~EZ~EP~E+P

en la que EZ es el complejo del estado de transicion, y EP un complejo enzima-producto. Ademas, solamente una mineria de las reacciones enzimaticas son de un solo sustrato; en la mayor parte de elIas intervienen dos 0 mas sustratos, y pueden haber dos 0 mas productos. El analisis cinetico de las reacciones enzimaticas en las que intervienen varios reaccionantes y productos es complejo; no obstante, la relacion de Michaelis-Menten continua siendo el pun to de partida para el analisis de la cinetica de todas las reacciones enzimaticas,

Constante de Michaelis, KM• y constante del sustrato, Ks Tal como hemos seiialado anteriormente, la constante de Michaelis es una magnitud determinada experimentalmente y definida operativamente: es la concentracion del sustrato a la cual la velocidad de la reaccion es la mitad de la velocidad maxima. En el caso ideal utilizado en la deduccion anterior, equivale a

(7)

pero en algunas reacciones enzimaticas k-l es muy grande en comparacion con k.fJ.' en cuyo caso esta ultima puede pasar a ser despreciable, y la ecuacion (7) se simplifica a

en que KM es aproximadamente igual a la constante de disocia cion del complejo enzlma-sustratc Ks, que tambien se designa como constante del sustrato:

K = [EllS)

S [ES)

200

FIGURA 8-6

Representaci6n [Lineweever-Burk}, doble

II

tectproce.

.!. Pendiente = ;11

Vo max

-1 KM

1 [S]

FIGURA 8-7

Representacion de Eedie-Hojstee.

Pendiente = - KM

Vo

[8]

Capitulo 8 Bnzimas: cinetice e inhibicion

Desgraciadamente, KM y Ks son considerados con frecuencia y equivocadamente, como sinonimos. No deberia considerarse a KM como constante de disociacion del complejo ES, a menos que se disponga de informacion especifica que con ...

firme que el valor de k+2 es muy pequefio comparado con el de k-1•

Transformaciones de la ecuacion de Mlchaelis-Menten

~

La ecuacion de Michaelis ... Menten [ecuaci6n (11 )] puede trans ... formarse algebraicamente en otras formas que son mas utiles para la expresion de los datos experimentales. Una de las transformaciones mas corrientes se obtiene, sencillamente, tomando los reciprocos de ambos miembros de la ecuaci6n de Michaelis ... Menten (11):

Reordenando, tendremos

que se reduce a

1 KM 1 1

-= -. +--

. Vo V max [ S] V max

(12)

La ecuacion (12) es la ecuacion de Uneweaver~Burk. Cuando 1/ Vo se representa frente a 1/ [ S ], se obtiene una linea recta. La pendiente de la recta es KM/V max,.y la interseccion sobre el eje l/vo es l/V m~x; la interseccion sobre el eje 1/[S] es -l/KM (fig. 8 ... 6). Tal representaci,_on doble~re:ciproca tiene la ventaja de que permite una determinacion mucho mas exacta del valor

. de V mu, ya que en la representacion sencilla de Vo frente a

[ S ] solo se obtiene su valor aproximado (observese la figura 8 ... 4 ), puesto que es un valor limite a una concentracion del sustrato infinita. La representacion doble reciproca puede proporcionar tambien informaci6n valiosa acerca de la inhibici6n enzimatica, como veremos mas adelante (pag. 205).

Otra transformaci6n util de la ecuaci6n de Michaelis-Menten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuaci6n (12) por V max, y reordenando para dar la ecuacion

Vo

Vo = -KM [8] + Vmax

La representacion de Vo frente a vol [5], Hamada l'epreseT!.(lJ::: cion_de Eadl'e ... Hotstee (fig. 8 ... 7), no solamente da los valores de V m~x y de KM en forma muy sencilla, sino que tambien amplia las desviaciones del caracter lineal que pueden no aparecer en una representaci6n doble reciproca.

Efecto del pH sobre la actividad enzimatica

La mayoria de los enzimas poseen un pH caracteristico al cual su actividad es maxima; por encima 0 por debajo de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en funci6n del pH de muchos enzimas son acam-

201

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 8~8

Curves de ectivided en [uncion del pH de algunos enzimes.

1
ctS
>
.,...... Colinesterasa
.......
~
,....r
OJ
a.c Tripsina
"1j
ro
~
.. """"
'~
• .....t
-w
U
<
6 8 10 4 6 R 10
pH pH Pepsina

Papaina

[sustrato = benzoilargininamida)

2

4

6

4

6

8

pH

pH

panados, pueden variar considerablemente de forma (fig. 8 ... 8). La relaci6n entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende del comportamientoacido.-base del enzima y del sus ... trato, asi como de otros muchos factores que son por 10 ge ... neral dificiles de analizar cuantitativamente. La forma de la curva de actividad .... pH varia con la concentracion del sustrato, ya que el valor de KM de muchos enzimas varia can el pH.

- Las mencionadas curvas son mucho mas significativas si el enzima se mantiene saturado con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinetica enzimatica, el pH se mantiene constante at 0 muy

proximo al, pH optimo. _

EI pH optimo de un enzima no es necesariamente identico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede ha ... llarse a su vez en la pendiente ascendente 0 descendente de, su curva de pH .... actividad. Este hecho sugiere que la relaci6n pH .... actividad de un enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimaticas

Al igual que ocurre can la mayoria d~ reacciones quimicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incre ... menta en general can la temperatura. dentro del intervalo en que el enzima es estable y permanece totalmente activo. La velocidad de muchas reacciones enzimaticas se duplica, apro ... , ximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura (QlO ::::; 2,0). Sin embargo, el coeficiente de temperatura Q1O, varia algo de un enzima a otro segiin la energia deactivaci6n

202

Capitulo 8 Bnzimas: cinetic« e inhibici6n

de la reacci6n catalizada: es decir, de la altura de la barrera de energia para pasar al estado de transicion (fig. 8 ... -3).

Aunque las reacciones catalizadas par los enzimas petecen, can frecuencia, poseer una temperatura. optima (fig. 8 ... 9), el pico que se observa al representar la actividad catalitica frente a la temperatura se produce porque los enzimas, al ser pro .... teinas, se desnaturalizan por la accion del calor y se inactivan cuando la elevacion de temperatura sobrepasa un cierto punto . La aparente temperatura «optima» es, por tanto. la resultante de dos procesos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reacci6n con la temperatura, y 2) el incremento en la velocidad de desnaturalizacion termica del enzima al sobrepasar una temperatura critica. Aunque la mayoria de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60 oC, al ... gunos de ellos son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores: por ejemplo, los enzimas de diversas especies de bacterias termofilicas que habitan en las termas de agua y siguen siendo activos a

temperaturas superiores a los 85 °C. .

Algunos enzimas, como la rlbonucleasa, pierden actividad por calefaccion, pero la recuperan rapidamente par enfriamien ... to, 10 cual indica que su cadena polipeptidica desplegada vuel ... ve rapidamente a adoptar su conformacion nativa (paq. 64).

FIGURA 8~9

Bfecto de la temperatura sobre la ectivided de un enzima. Los enzimas varian con tespecto a su estabilidad tetmlce.

La potcion descendente de La curve se debe a le desneturelizecion tennies.

'g 100 ."

E

....

u co

61

'1j

o

.§ 50 II<

'«I

a

20

40

60

Inhibici6n de los enzimas

A partir del estudio de los inhibidores de los enzimas se ha obtenido informacion de importancia sabre el mecanismo ylos caminos de la catalisis enzimatica, la especificidad de sustrato de los enzimas, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y la participacion de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformacion activa de la molecula del enzima.Ademas, la inhibicion de algunos enzimas por metabolites especiflcos constituye un elemento importante en la regulaci6n del metabolismo intermediario.

Los tres tipos principales de inhibicion reversible de los enzimas, competitiva# acomp-ctitiv8 y no com(!etitlv.a~# pueden distinguirse experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor sabre la cinetica de reaccion del enzima, la eual puede analizarse mediante la ecuacion basica de velocidad propuesta por Michaelis ... Menten. Para la validez del analisis cinetico, el inhibidor debe combinarse rapida y reversiblemente con el enzima 0 con el complejo enzima ... sustrato. Los inhibi ... dores que reaccionan con el enzima lentamente y/o irreversi .. blemente se estudian en otro Iugar (paqs. 207 y 226).

I nhibicion competitive

La caracteristica de la inhibicion competitiva es que el inhi .... bider puede combinarse can el enzima libre de tal modo que compite can el sustrato normal para unirse al centro activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con el en .. zima para formar un complejo enZlima ... inhibidor (EI) analoqo al complejo enzima ... sustrato:

E + I EI

203

PARTE 1

~

COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

La molecula del inhibidor no resulta quimicamente alterada por el enzima. Siguiendo el formalismo de Michaelis ... Menten, podemos definir la. constante del inhibidor KI, como la cons ... tante de disociacion del complejo enzima ... inhibidor:

K - [E][J] I - [EI]

La constante del inhibidor, KI, es comparable por tanto a K s, constante de disociacion del complejo enzima .... sustrato.

La inhibicion competitiva se reco.noce experimentalmente con Iacilidad, debido a que el porcentaje de inhihicion para una concentraci6n de inhibidor constante disminuye al incrementarse la concentraci6n del sustrato. En el analisis cinetico cuantitativo, el efecto de 1a variaci6n de la concentraci6n del sustrato [S] .sobre la velocidad inicial vo, viene determinada para una concentraci6n constante del inhibidor, Este experimento se repite de nuevo con una concentracion de inhibidor dife ... rente. Amenudo se efectuan varias series de tales experi ... mentos, cada uno con, una concentraci6n de inhibidor diferente; a continuacion, se trazan representaciones de l/vo £rente a 1/[5], para cada una de las, concentraciones del inhibidor. Estas representaciones se caracterizan por proporcionar tina £a .... milia de lineas rectas cuyo punto de intersecci6n comun se halla sobre el eje de l/vo (fig. 8 .... 10). La presencia de un inhibidor competitive incrementa, por tanto, la KM aparente del enzima por el sustrato; es decir, provoca que se precisen concentra ... ciones de sustrato superiores para que se alcance la velocidad maxima. El valor de la KM aparente del sustrato sera mayor que la verdadera KM al aumentar el valor de la interseccion sobre el eje 1/ [5]. Como la pendiente de la representacion . de la reaccion no inhibida es KM/V max (fig. 8,10; tabla 8 ... 7), y la pendiente de la recta para la reacci6n inhibida es KM/V max (1 + [I] I KI), se observa que ha experimentado un incre ... mente, expresado por el factor 1 + [I]/Kr• A partir de esta relaci6n puede calcularse el valor de Kr• Par otra parte, un inhibidor competitive se caracteriza por no afectar al valor de V max, indicando can ello que no inter Here con la velocidad · de ruptura del complejo enzima ... sustrato.

El ejemplo clasico de Inhibicion competitiva 10 constituye la inhibici6n de lasuccinato .... deshidrogenasa por el malonato (pa ... gina 469), y por otros aniones dicarboxilato (fig. 8 ... 11). La

l'A alA 8~7. Resumen de _ los efectos de los inhibidores sabre las representaciones de Lineweaver-Burk, l/Vo frente a l/[S].

Pendiente

I nterseccion sobre la ordenada

Sin inhibidor

1 Vm4x

Competitlvo

KM (1 + [I])

Vmax KJ

1

V mtfx

Acompetitivo

No competitivo (los valores de ambas KI son identlcos)

KM (1 + [I])

V max K(

1 (1 + [I])

V mlx KI

204

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

FIGURA 8~10

Representaciones doble-reciproces que muestran los eiectos de le inhibicion competitive, ecompetiiive y no competitive de los enzimes.

Pendiente

Inhlblcion competitiva de Ia reaccion Inhibida

=(1+1!l) KM

KI Vmax

-

1

Sin inhibidor Pendiente == :~

max

1

, Vmax

t

[I]

Intersecciones -1

Acompetitiva

1

-

Intersecciones

1 + ill KI

----

1 [8]

Pendiente

de Ia reacci6n inhibida

KM

---

Vmax

Sin inhibidor Pendiente == K M Vmax

. 1 ( [1] )

Intersecclones = V 1 + K

max I

i

[I]

1 [S]

Pendiente

Inhibici6n no competitiva de la reacci6n inhibida

== KM (1 + [I] )

V max KI

1

-

Sin inhibidor

P d· KM en iente== V ~

max

Intersecciones :::: 1 (1 + ill)

V 1T'RX Kl

t

[I]

1 [S]

20·5

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

succinato ... deshidroqenasa forma parte del grupo de enzimas responsables de las reacciones del cielo de los acidos tricarboxi ... licos (pag. 469). Cataliza la eliminacion de dos atomos de hi ... droqeno de los dos atomos de carbono metilenicos del succinato [la naturaleza del aceptor del hidroqeno carece de importancia en esta discusion}. El malonato, inhibidor competitive, se pa .... rece al succinato en que posee dos grupos carboxilo ionizados a pH 7, pero difiere de el, en que no es deshidrogenado por la succinato ... deshidroqenasa. Sl se afiade suficiente malonato para inhibir la deshidroqenacion de una concentraci6n determinada de succinato, en un 50 %, por ejernplo el incremento de la concentraci6n de succinato reducira el porcentaje de inhibicion que produce el malonato.

Ademas del malonato, pueden actuar como inhibidores com ... petitivos de la succinato.-deshidrogenasa los aniones de otros acidos dfbasicos que poseen la distancia adecuada entre los dos grupos anionicos: por ejemplo, el anion pirofosfato. Todo ello conduce a la conclusion de que el centro catalitico de la succi ... nato .... deshidrogenasa posee dos grupos con carga positiva, se .... parados adecuadamente, que son capaces de atraer a los dos grupos carboxilato del sustrato con carga negativa. El centro catalitico muestra, por tanto. que es complementario con res ... pecto a la estructura del sustrato.

A partir de 1a relacion entre la estructura molecular 'de un inhibidor competitive y de su afinidad por el enzima, expresada por la KI, se puede obtener informacion valiosa acerca de la estructura y la geometria del centro activo. Constituye un me .... todo importante para abordar el trazado de mapas de los cen ....

tros activos del enzima. ~,

FIGURA 8,., 11

Inhibicion competitive de le succineiodeshidro genasa.

Reaccion de la succineto-deshidroqenese.

cooI

CH2

I Succinato

CH2

I COO~

+

Aceptor de hidroqeno

J r S ucc inato deshidrogenasa

cooI

CH

ff Fumarato

He

I

COQ-

+

Aceptor de hidr6geno reducido

...

lnhibicion ecompetitive

Algunos inhibidores competitivos de la succineto-deshidroqenese. Obseroese ' que todos coniienen dos grupos enionicos cuyo especiedo se parece al existente en el succineto.

En este tipo de inhibicion, cuya designaci6n no es muy ade ... cuada, el inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su reacci6n con el sustrato normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo enzima ... sustrato para formar un complejo inactivo enzima ... sustrato ... inhibidor, el cual no experi ... menta su transformaci6n posterior en el producto habitual de la reacci6n:

COQ- 1

CH2

I

COQ-

Malonato

ES + I l. ESI

coo-

I COQ-

Oxalato

La constante del inhibidor es, por tanto:

K - [ES][I] I - rESI]

cooI

CH2

I

C=Q

~

COQ-

Oxalacetato

Estas relaciones demuestran que el grado de inhibicion puede aumentar cuando la concentraci6n de sustrato se ve aumentada .. La inhibici6n acompetitiva puede reconocerse con gran facilidad en las representaciones de 1/ Vo frente a 1/ [S] para concentraciones constantes del inhibidor. Tal como muestran la figura 8.-1 0 y la tabla 8 ... 7, 10 caracteristico de la inhibicion acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece cons ... tante al aumentar la concentraci6n del inhibidor, pero la V max decrece. La inhibicion acompetitiva es poco frecuente en las reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reac .... ciones de dos sustratos ..

0-

I O=P-Q-

I

o

I Q=P-Q-

I

0-

Pirofosfato

206

FIGURA 8~12

Quelato del tetracetato de etilendiamina con' suo cation metelico divelente (Me2+). La porcion sombre ada represents el plano

de los enlaces coordinados.

-

--CH

"\

\

CH2

c. .....",~ ............. \

; ~~"CH2 6-

o \ CH2

C/

II

o

Capitulo 8 Bnzimas: cinetice e inhibicion

I nhibioi6n no competitive

Un inhibidor no competitivo puede combinarse con el enzima libre 0 bien con el complejo enzima ... sustrato, interfiriendo can la accion de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un centro del enzima distinto del centro activo, a menudo para deformar al enzima, de modo que no pueda formarse el complejo ES a 5U velocidad normal y que una vez formado no se descomponga a su velocidad habitual para Iiberar los productos de reaccion. Sus efectos no se anulan al aumentar la concentraci6n del sustrato. En la inhibicion no competitiva la reaccion con el inhibidor produce dos formas inactivas, EI y ESI:

E + I 't EI

ES + I ESI

para las que existen dos constantes del inhibidor:

KP - [E][I] I - lEI]

.. KfSI _ [ES][I]

I - [ESI]

"

que pueden ser iguales 0 diferentes. La inhibicion no compe ... titiva se reconoce tambien con gran facilidad en las representaciones de 1/ Vo frente a 1/ [ S ]. en presencia de diferentes concentraciones ~l inhibidor, que se mantienen constantes (fig. 8 .... 10; tabla 8-17). Las representaciones difieren en pen ... diente pero no comparten un punto de interseccion comun sobre el eje l/v(). EI valor de la interseccicn sobre dicho eje es mayor para el enzima inhibido que para el no inhibido, 10 que indica que la V max decrece en presencia del inhibidor y no puede restablecerse su valor a pesar de que la concentra ... ci6n del sustrato pueda ser elevada.

EI tipo mas corriente de inhibicion no competitiva es produ ... cida por los reactivos que pueden combinarse reversiblemente con alqun grupo funcional del enzima (situado £uera del cen .... tro activo) que sea esencial para mantener la conformacion tridimensional cataliticamente activa de la molecula del enzima. Algunos enzimas (aunque no todos elIos) que poseen un grupo

- SH esencial, son inhibidos no competitivamente par los iones de metales pesados (pag. 88). sugiriendo que tales grupos - SH deben permanecer intactos para que el enzima conserve su conformaci6n activa normal .



. Algunos enzimas que precisan de iones metalicos para su

actividad son inhibidos no competitivamente por agentes ca .. paces de unirse al metal esencial. Por ejemplo, el agente que ... lante tetra ... acetato, de etilendiamina (EDT'A,) 'se une reversi .... blemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes. inhibiendo asi de modo no competitivo a algunos enzimas que precisan de tales iones para su actividad (fig. 8 ... 12).

Inhibici6n irreversible: modificaci6n del enzima

En 1a inhibici6n reversible de los enzimas, dis cut ida anteriormente, el inhibidor interviene en un equilibrio Iacilmente re ... versible, que se establece con rapidez, con el enzima 0 can el complejo enzima-sustrato, y que puede analizarse mediante

207

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

la formulaci6n de Michaelis-Menten. Sin embargo, algunos enzimas experimentan inactivaci6n irreversible cuando se tratan con agentes capaces de unirse covalentemente y que modifican de modo permanente a un grupo funcional, necesario para la catalisis, con 10 que se inactiva la molecule del enzima. Este tipo de inhibici6n no puede ser tratada por los principios de Michaelis-Menten, que suponen la formaci6n reversible de los complejos EI 0 ESI. Con frecuencia, la inhibici6n reversible se manifiesta lentamente en comparaci6n con la cinetica de la reacci6n normal del enzima, de modo que al principio la inhibicion es incompleta, pero aumenta continuamente con el tiempo debido a que se produce la modificacion quimica de una fracci6n creciente de las moleculas del enzima.

La inactivacion irreversible de los enzimas por modificacion covalente se estudiara con mas detalle en el capitulo 9 (pagi-na 226), ya que ha proporcionado informaci6n importante sobre la Identidad de los grupos Iuncionales cataliticos del centro activo.

Cinetica de las reacciones enzimaticas con dos 0 mas sustratos

Muchos enzimas catalizan reacciones con dos sustratos que se influyen mutuamente: estas reacciones muestran una cinetica mucho mas compleja que las reacciones sencillas de un solo sustrato consideradas anteriormente. Entre los enzimas que catalizan reacciones bisustrato se halla la numerosa clase de las transferasas, que catalizan la transferencia de un grupo funcional especifico desde un sustrato al otro (tabla 8~ 1 ).

El analisis cinetico de las reacciones de dos sustratos, simbolizado por la ecuaci6n

E A+B~P+Q

es mas complicado que el de las reacciones con un solo sustrato puesto que pueden existir varios complejos enzima-sustrato, tales como los complejos binarios EA, EB, EP y EQ y los complejos ternarios EAB, EPQ, EAQ y EPB. La determinaci6n de KM y de V max en los sistemas bisustrato es seme[ante al sistema utilizado para las reacciones con un solo sustrato. La concentraci6n de un sustrato, por ejemplo B, se mantiene con stante normalmente a nivel saturante, mientras que la concentraci6n del sustrato A se cambia para determinar su efecto sobre la velocidad inicial de la reacci6n y se obtiene asi la constante de Michaelis-Menten para el sustrato A; es decir, Ktt. Para obtener el valor de la citada constante, se emplean tres 0 mas concentraciones constantes del sustrato B. A continuaci6n se invierte el dispositivo experimental; la con ... centraci6n del sustrato A se mantiene constante a nivel saturante, y se determina el efecto que produce sobre la velocidad inicial de la reacci6n la variaci6n de la concentraci6n del sustrato B; se obtiene de este modo el valor de KM para el sustrato B; es decir, K~. Los valores de K~ y K~ se obtienen muy facilmente mediante las representaciones doble-reciprocas, Las reacciones bisustrato se reducen, por tanto, al caso de la reacci6n de un solo sustrato cuando uno de los sustratos se mantiene constante a una concentracion saturante. La tabla 8~5 muestra los valoresde KM para los dos sustratos y dos productos de la aspartato aminotransferasa (vease pag. 575).

208

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

La mayoria de las reacciones de dos sustratos pueden incluirse en una de las dos clases siguientes: reacciones de desplazamiento simple y reacciones de doble desplazamiento, las cuales pueden generalmente distinguirse por analisis cinetico, tal como se resume en la Figura 8~13. Sin embargo, el analisis cinetico no es infalible, y con frecuencia deben emplearse otros enfoques experimentales para el diaqnostico de la ruta de reaccion. En los parrafos siguientes examinaremos las ca~ racteristicas de los casos ideales.

Reacciones de desplezemienio simple

En este tlpo: de reacciones, los dos sustratos A y B, deben hallarse presentes simultaneamente sobre el centro activo del enzima para formar un complejo ternario EAB con objeto de que tenga lugar la reaccion, Las reacciones de desplazamiento simple se producen de dos formas, al azar y ordenedes: ambas difieren en la secuencia con que ambos sustratos se un en al enzima. En las reacciones bisustrato al azar, cualquiera de los dos sustratos puede unirse al enzima en primer lugar, indicando con ello, que el complejo ternario EAB (llama do tambien complejo central) puede formarse por dos caminos diferentes

E + A ;:::::= EA EA + B ;:::::= EAB

(13)

o

E + B ;:::::= EB EB + A ;:::::= EAB

(14)

Muchas de las fosfotransferasas catalizan reacciones de desplazamiento simple al azar. Constituye un ejemplo la reaccion catalizada por la creatina~quinasa (pag. 776).

ATP + creatina ;:::::= ADP + fosfocreatina

En esta reaccion tanto el A TP como la creatina se unen al centro activo, en cualquier secuencia, formando un complejo ternario. Despues de la transferencia del grupo fosfato, desde el A TP ligado a la creatina ligada, ambos productos abandonan el centro activo, en una u otra secuencia.

En las reacciones de desplazamiento simple orden ado, existe una secuencia de reaccion obligato ria, de modo que un sustrato especifico. el primer sustrato 0 sustrato conductor, es el que se fija en primer lugar, antes de que pueda unirse el segundo sustrato tam bien llama do sustrato acompaiiante. Las reacciones siguientes muestran la secuencia

E + A ;:::::= EA EA + B ;:::::= EAB

(15) (16)

en la que A es el sustrato conductor. Muchas deshidrogenasas que utilizan el dinucleotide de nicotinamida y adenina (NAD+) como coenzima para aceptar electrones de sus sustratos (pagina 491), catalizan reacciones bisustrato ordenadas. Par

209

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 8-13

Resumen de las cerecteristices de las reecciones bisustrato del tipo A + B :0= P + Q. Con [recuencie pueden distinquitse los diferentes tipos de reacciones bisustrato poria naturaleza de las representaciones doble reciptoces

de I/vo [rente a II[S] con el otto sustrato que se mantiene constante a una concenirecion fija. Los desplazamientos simples al azar habitualmente proporcionan un conjunto de linees rectes que se corten, pero a veces son mas complejos y sus reptesenieciones no figuran aqui. Los desplazamientos simples y ordenados pot 10 general dan representeciones convergentes como figura abajo, mientras que los desplazamientos dobles dan lineas paralelas en las representaciones doble reciproces.

+K~::)

\ Incremento de la

~ 1 concentracion de B

Reecctones de desplazamiento sencillo

AL AZAR: Tanto el sustrato A como el B pueden combinarse con el enzima libre E para dar un complejo binario. La adici6n del otro sustrato se produce sequidamente, y rinde el complejo terciario EAB.

Tal como puede verse aqui, la liberaci6n de los productos P y Q se verifica en una secuencia al azar, pero este puede no ser necesariamente el caso.

A r-B-1...,..----. E • EA

B. \

EB EP

Ad. EAB _ EPQ .,hQ

ORDENADO: El enzima libre E debe combinarse en primer lugar con el sustrato conductor A para formar un complejo binario. La adici6n del siguiente sustrato B produce entonces el complejo ternario EAB.

Se indica la liberaci6n ordenada de los productos aunque no es obligatoria por necesidad.

A~E-yQ

EA EQ

B __l_ EAB _ EPQ L P

La ecuacion general de velocidad para las reacciones ordenadas, en las que A es el sustrato conductor

Vmax

Vo = K~ Kl} KAi K! [A][B] + [A] +YBI+ 1

que despejada en forma de pendtente-interseccion (doble-reciproca) con respecto a A

.i , _1 (KAi + K~ K: )(_1 ) + _1 (1 + Kj} )

Vo Vmh [B] [A] Vm~x [B]

Las representaciones de l/vo frente a lI[AJ, a diversas concentraciones del sustrato B que se mantiene constante (suponiendo que no existan acciones mutuas entre' los centros de uni6n de A y de B)

1

Pen- __ 1_ (K A diente - V m'x M

Vo

-1 K~

1 [A]

210

Reacciones de Cloble desplazamiento (ping-pong)

EI sustrato A se comb ina con el enzima E para formar el complejo EA. del cual se libera el producto P. abandonando al enzima E* substituido covalentemente. EI sustrato B se combina entonces con E. para dar

el complejo E* B. que se descompone produciendo el producto Q y el enzima libre E.

La ecuaclon general de velocidad es

que en forma de pendiente-Interseccion

.i , Kjj (_1 ) + (1 + K: )(_1 )

Vo Vmax [A] [B] Vmax

Las representaciones de l/vo frente a 11 [AJ, para divers as concentraciones del sustrato constante B.

Pen- Ktt

diente = __

j Incremento de la concentraci6n de B

Inter- = _1_ (1 + Kl't)

secciones Vmax [B]

1 [A]

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

ejemplo, la malato~deshidrogenasa, (paq. 471), que cataliza la reaccion

Malato + NAD+ ;::::= oxalacetato + NADH + H+ (17)

debe unirse, en primer, lugar al NAD+ y rinde el complejo E~NAD+; el malato se combina can este ultimo, con 10 que se forma el complejo ternario E~NAD+~malato.

Las reacciones bisustrato al azar pueden distinguirse de las ordenadas experimentalmente. La reaccion es de tipo ordenada si es inhibida globalmente por el Ultimo producto de la reaccion y este compite solemente can el primer sustrato (sustrato conductor). Por ejemplo, la reaccion de la malato deshidrogenasa (17), que es ordenada, resulta inhibida por un exceso de NADH, que compite con el primer sustrato conductor normal, el NAD+, en su union al enzima; sin embargo, el NADH no compite con el malato.

En ciertas condiciones, el complejo ternario de algunas reacciones bisustrato ordenadas, se halla en concentraciones Infimas, de suerte que los productos de la reaccion parecen provenir directamente de la reaccion entre el complejo binario EA (formado por el enzima y el sustrato conductor) y el segundo sustrato B, sin que aparentemente se forme un complejo EAB. La lactato-deshidroqenasa dependiente del NAD y la alcohol-deshidroqenasa en determinadas condiciones experimentales presentan este tipo de comportamiento, que fue descubierto y analizado por primera vez por H. Theorell y B. Chance (paq. 495).

Reacciones [ping-ponq} de doble desplezemiento

En las reacciones bisustrato de este tipo, un sustrato debe hallarse unido al enzima y debe liberarse un producto, antes de que tenga lugar la entrada del segundo sustrato y la partida del segundo producto. En estas reacciones el primer sustrato reacciona con el enzima y origina una forma modificada del mismo, habitualmente por transferencia de un grupo funcional. En la segunda etapa este grupo funcional se transfiere desde el enzima al segundo sustrato. Constituye un ejemplo de reaccion de doble desplazamiento la catalizada por la aspartato-amino-transferasa. tambien llamada aspartato-transaminasa, que cataliza la reaccion

Aspartato + a~oxoglutarato :;:= oxalacetato + glutamato

El aspartato, sustrato conductor, es el primero que se combina con el enzima, El grupo amino del aspartato se transfiere despues al fosfato de piridoxal (paq. 350), que es el grupo pros~ tetico del enzima al que se halla intimamente unido. A continuacion, el oxalacetato, primer producto de la reaccion, abandona el centro activo en el que es sustituido por el segundo sustrato, elo-oxoqlutarato, al cual el enzima transfiere el grupo amino para formar glutamato, el cual entonces, abandona el centro activo. A estas reacciones bisustrato que se verifican en dos etapas, se las ha designado con el descriptivo apelativo de reacciones ping~pong (fig. 8~ 13).

Variaciones de equilibrio en las reecciones bisustreto

Las reacciones bisustrato de desplazamiento. simple 0 doble, pueden distinguirse con frecuencia par su comportamiento cinetico caracteristico, tal como se indico anteriormente

211

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

en la Figura 8~13; sin embargo, el analisis cinetico, por si solo, no conduce siempre a conclusiones infalibles. Existe otro criterio importante que, a veces, permite distinguirIas. Lo aclararemos comparando dos reacciones enzimaticas que muestran un parecido formal: la reaccion catalizada por la secerose-Fosiotilese. de doble desplazamiento, y la de la mal~ tosa~fosforilasa, que es de desplazamiento simple.

La fosforilasa de la sacarosa cataliza la reaccion

Sacarosa + Pi :;=: «-n-qlucosa-Lfosfato + ,8~D~fructosa

en la que el disacarido sacarosa, que contiene a~D~glucosa y ,8~D~fructosa (pag. 267) experimenta una escision Iosforolitica reversible y produce a~D~glucosa~l~fosfato y n-Iructosa libre. El mismo enzima, actuando en la direccion inversa, participa en la biosintesis de la sacarosa. El estudio detallado de este enzima muestra que puede catalizar una reaccion de intercambio en la que el fosfato inorqanico libre se cambia con el grupo fosfato de glucosa~l~fosfato cuando no estan presentes ni la sacarosa ni la fructosa, sin que se produzca ninquna vvariacion neta del fosfato 0 de glucosa~l~fosfato. El curso de esta reaccion de variacion de equilibrio, puede seguirse si se inicia con un fosfato inorqanico marcado con el isotopo radiactivo 32p [indicado en color) y una glucosa~l~ -Iosfato sin marcar:

Fosfato + a~D~glucosa~ 1 -Iosfato :;=:

fosfato + a~D~glucosa~l~ fosfato

La glucosa~l~fosfato va quedando marcada con el isotope a medida que transcurre el intercambio. De modo analoqo. la fosforilasa de la sacarosa cataliza tambien una reaccion de variacion del equilibrio entre una fructosa marcada isotopicamente (en color) y la porcion de fructosa de la sacarosa no marcada, en ausencia de fosfato 0 de glucosa~l~fosfato:

Fructosa-}- glucosa~fructosa :;=: fructosa + glucosa~ fructosa

(Sacarosa)

[Sacarosa}

A partir de estos y otros hechos, se ha deducido que la reacci6n catalizada por la fosforilasa de la sacarosa es una reaccion de doble desplazamiento que se produce en dos etapas distintas y en la que interviene un intermediario covalente enzima-qlucosa, Estas etapasson las siguientes:

E + sacarosa :;=: E~glucosa + n-fructosa

E~glucosa + Pi :;=: E + a~D~glucosa~l~fosfato

La varia cion de equilibrio de la fructosa libre marcada con la porcion de fructosa de la sacarosa, se alcanza con la primera reaccion, quepuede tener lugar con independencia de la segunda, y el intercambio de fosfato isotopico con el grupo 1 -Iosfato de la a~D~glucosa~ 1 -fosfato, ocurre en la segunda reaccion, que puede transcurrir con independencia de la primera. Esta formulacion de la reaccion de la fosforilaci6n de la sacarosa se funda en la demostracion directa de la formaci6n por eI enzima de un intermediario covalente enzimaglucosa.

La reacd6n de la tneltose-josjotilese, ejemplo de desplazamiento simple, ofrece un contraste notable:

Maltosa + Pi :;=: n-qlucosa + ,8~D~glucosa~l~fosfato

212

Capitulo 8 Enzimas: cinetica e inhibicion

La maltosa que es un disacarido constituido por dos moleculas de n-qlucosa, experimenta una ruptura fosforolitica que muestra semejanza formal con la reaccion de la fosforilasa de la sacarosa. Sin embargo, la fosforilasa de la maltosa no cataliza eI cambio isotopico entre el fosfato y la ~~D~glucosa 1 -Iosfato en ausencia de maltosa y de n-qlucosa. ni tam poco cataliza un intercambio entre la n-qlucosa isotopic a libre y un res to de glucosa de la maltosa en ausencia de fosfato y de glucosa~ 1 -Iosfato. Ademas, no se ha puesto de manifiesto la existencia de ninqun intermediario no covalente enzimaazucar, en la accion de la fosforilasa de la maltosa. A partir de esta y de otras evidencias, se ha lIegado a la conclusion de que la reaccion de la maltosa-fosforilasa es una reaccion de desplazamiento simple en la que tanto la maltosa como el fosfato, deben hallarse presentes, simultaneamente, en el centro activo. Cuando tanto las experiencias cineticas como las de variacion de equilibrio estan en concordancia, puede formularse una decision segura acerca de si una reaccion enzimatica es de desplazamiento simple 0 doble.

Determinacion cuantitativa de la actividad enzimatica

La cantidad de un enzima en una disolucion determinada 0 en un extracto de tejido, puede determinarse cuantitativamente en relacion al efecto catalitico que produce. Para este objeto es necesario saber:

1. La estequiometria global de la reaccion catalizada.

2. Si el enzima precisa de la adicion de cofactores, tales como los iones metalicos 0 coenzimas.

3. Su dependencia de las concentraciones de sustrato 0 de los cofactores; es decir, el valor de KM para el sustrato y para el cofactor.

4. Su pH optimo.

5. Una zona de temperatura en que sea estable y muestre actividad elevada.

6. Un procedimiento analitico sencillo para determinar la desaparicion del sustrato 0 la aparicion de los productos de la reaccion,

Siempre que sea posible, los enzimas se en sayan empleando sistemas en que el pH es optimo y la concentracion del sustrato se halla por encima del nivel de saturacion, de tal modo que la velocidad inicial de la reaccion es de orden cero respecto al sustrato. En estas condiciones, la velocidad inicial de la reaccion solamente es proporcional a la concentracion del enzima. En el caso de enzimas que necesitan el concurso de cofactores, tales como iones rnetalicos 0 coenzimas, estos deben afiadirse tambien en concentraciones que sean superiores a la de saturacion, de modo que el verdadero factor limitante de la velocidad en el sistema sea la concentraci6n del enzima, Generalmente, la medida de la velocidad de formaci6n del producto de la reacci6n es mas segura que la medida de la desaparici6n del sustrato, ya que este debe estar, con frecuencia, en concentraciones bastante elevadas para garantizar la cinetica de orden cero.

La determinacion cuantitativa de la actividad enzimatica se efectua del modo mas rapido y conveniente cuando el sus-

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

trato 0 el producto son coloreados 0 absorben luz en la region del ultravioleta, ya que la velocidad de aparicion 0 de desaparicion de un producto 0 de un sustrato que absorbe la Iuz puede seguirse con un espectrofotometro, y permite efectuar un registro continuo del curso de la reaccion si se emplea un registrador provisto de una banda de papel movil, No deberan hallarse presentes otros componentes que absorban 0 dispersen la luz, pero en caso contrario, deberan prepararse los correspondientes blancos para efectuar la adecuada sustraccion, Por ejemplo, tenemos la medida de la actividad del enzima lactato~deshidrogenasa, que transfiere electrones desde el lactato a la forma oxidada del dinucleotide de nicotinamida y de adenina (NAD+) (tabla 8~3; vease tambien pagina 493) y rinde piruvato, el coenzima reducido NADH, y un proton:

Lactato + NAD+ ,.: piruvato + NADH + H+

La forma reducida del coenzima, NADH, absorbe luz en el ultravioleta a 340 nm (pag. 492), mientras que la forma oxidada NAD+, ellactato y el piruvato no 10 hacen. El progreso de la reaccion, en el senti do. directo, puede seguirse midiendo el incremento de absorcion de la luz del sistema a 340 nm en un espectrofotometro 10 cual es mucho mas sencillo que la determinacion quimica de cualquiera de los sustratos 0 de los productos.

Las determinaciones opticas son tan sencillas y comodas, que se emplean a menudo para seguir la variacion de una reaccion enzimatica con el tiempo, en la que ni el sustrato(s) ni el producto(s), exhibe ninqun maximo de absorcion de luz caracteristico; para ello, se ha acoplado la reaccion con otra reaccion enzimatica, en la que pueda medirse con facilidad, alqun cambio optico. Tenemos como ejemplo la reaccion' entre el fosfoenolpiruvato y el AD P que proporciona piruvato y ATP por transferencia de un grupo fosfato, catalizado por la piruvato~quinasa:

Fosfoenolpiruvato + ADP ,.: piruvato + ATP

Aunque los sustratos y los productos de tal reaccion no absorben la luz en la zona de 300 a 400 nm, esta es Iacil de medir si se afiade al sistema un exceso del enzima lactatodeshidrogenasa y de NADH para dar las siguientes reacciones acopladas, cuyo intermediario comun es el piruvato:

Fosfoenolpiruvato + ADP ,.: piruvato + ATP Piruvato + NADH + H+.,.: lactato + NAD+

En presencia de excesos de Iactato-deshidroqenasa y de NADH, la formaci6n de piruvato en la primera reaccion va seguido por la rapida reducci6n del piruvato a lactato en la segunda. Por cada molecula de piruvato que se forma y se reduce, se oxida una molecula de NADH a NAD+, 10 cual produce una disminucion de la absorci6n de la luz a 340 nm, maximo de absorci6n del NADH. En estaexperiencia a'Co~ plada el enzima cuya actividad se mide constituye el componente limitante de la velocidad por ajuste adecuado del sistema reaccional.

214

TABLA 8-8. Actividad molecular t de alqunosvenzlmaa en el Intervale

de 20 a 38°C.

Enzima

Actividad moleculart

Anhidrasa carb6nica C

/15 -3-cetosteroide-isomerasa Catalasa

/3-Amilasa

/3-Galactosidasa Fosfoglucomutasa Succinato-deshidroqenasa

36000000 17100000 5600000 1100000 12500

1240 1 150

t La actividad molecular de un enzima es el mimero de moleculas de sustrato transformadas por una sola molecule del enzima por minuto en condiciones 6ptimas.

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

Unidades de actividad enzimatica

La unidad de actividad enzimatlca empleada mas corrientemente se define como la cantidad de enzima que oriqina' la transformacion de 1,0 {tmol (10-6 mol) de sustrato por minuto a 25 °C, en condiciones optimas de medida. La actividad espe~ cifica es el numero de unidades del enzima por miligramo de proteina. Constituye una medida de la pureza del enzima, que aumenta durante el proceso de su purificacion, y llega a ser maxima y con stante cuando este se halla en estado puro. La activ.idad molecular 0 molar, que antiguamente se llamaba nu~ mero de recembio, es el numero de molecules de sustrato transformadas por minuto por una sola molecula de enzima (0 por un solo centro activo}, cuando el enzima es el factor limitante de la velocidad (tabla 8~8). La actividad molar de un enzima con un centro activo unico puede calcularse a partir del valor de su V max y de su peso molecular. El enzima anhidrasa carbonica posee la actividad molar mas elevada de cualquiera de los enzimas conocidos, 36 000 000 min"! por molecula.

La Comision de Enzimas (vease Biblioqrafia] ha recomendado una nueva unidad internacional para la actividad enzimatica el cetel (abreviadamente cat), que se define como la cantidad de actividad enzimatica que transforma 1 mol S-1 de sustrato. La nueva unidad se halla en correlacion con las dimensiones de las constantes de velocidad en la cinetica qui-

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Complejos enzima-sustrato

y compuestos covalentes enzima-sustrato

Como hemos visto, la evidencia cinetica da a entender claramente que todos los enzimas se combinan de modo transitorio con sus sustratos para formar complejos enzima-sustrato durante su ciclo catalitico, Pero debido a la inestabilidad de los complejos enzima-sustrato que, por definicion, se descomponen rapidamente, podria esperarse que hubiese dificultad en obtener pruebas de su formacion. No obstante, la evidencia de que se forman tales complejos se ha conseguido mediante medidas fisicas y quimicas. El problema puede abordarse mediante la observacion espectroscopica de las variaciones espectrales pasajeras que se producen cuando se mezcla el sustrato con el enzima. La catalasa y la peroxidasa son hemo-enzimas que poseen espectros de absorcion caracteristicos debido a sus grupos prosteticos hemo, y muestran cambios transitorios en sus espectros cuando se mezclan con su sustrato, el peroxide de hidroqeno, 10 cual es el reflejo de la Iormacion y la descomposicion de sus complejos enzima-sustrato. De modo analoqo, algunos enzimas, al mezclarse con sus sustratos, experimentan cambios de rotacion optica a ciertas longitudes de onda (pagina 154), los cuales se interpretan como manifestaciones de los cambios de conformacion del enzima que acompaiia a la pro. duccion del complejo enzima-sustrato.

Es especialmente convincente la demostracion "de la existencia de complejos enzima-sustrato bastante estables, como cuando algunos enzimas reaccionan con un sustrato perezoso, es decir, uno que forme con facilidad un complejo no covalente enzima-sustrato. pero que se descomponga muy lentamente en comparacion con el sustrato blologico normal. La existencia de tales complejos enzima-sustrato perezosos se ha observado en la lisozima (pag. 239), en la n-aminoacido-oxidasa y en otros varios enzimas. De hecho, un complejo. perezoso enzima-sustrato de la lisozima ha sido cristalizado y sometido al analisis por rayos X, proporcionando algunos rasgos reveladores acerca de la estructura del centro activo (paq. 238). Tambien es posible demostrar la formaclon de complejos estables de algunos enzirnas, con inhibidores competitivos, cuya estructura se parece a la del sustrato y que se unen al mismo centro del enzima sobre el que 10 hace el sustrato. La forma. cion de complejos enzima-sustrato puede observarse tambien directamente en algunas reacciones con dos sustratos, cuando se aiiade uno de ellos en ausencia del otro. Por ejemplo, la alcohol-deshidroqenasa forma un complejo con el dinucleotide de nicotinamida y de adenina oxidado en ausencia de eta no I, que es el otro sustrato.

Es probable que todos los enzimas formen complejos enzimasustrato reversibles no covalentes del tipo de Michaelis-Menten, cuya descomposicion constituye la etapa limitante de la velocidad cuando la concentracion del sustrato es la saturante. Ademas, algunos enzimas forman como intermediarios compuestos covalentes enzima-sustrato, sobre todo los que ca. tali zan reacciones de doble desplazamiento. Un ejemplo clasico 10 constituye elenzima fmctosa.difosfato.aldolasa (pag. 435), que cataliza la reaccion reversible

1,6.difosfato de fructosa ~

fosfato de dihidroxiacetona + 3.fosfato de gliceraldehido

216

FIGURA 8-14

Reduccion del compuesto enzime-substreto entre la [nictosa-dijosieto-eldolsse y el fosfato de dihidroxiacetona.

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

Enz

I

NH2

+ o

II

HOCH,-C-CH,OPQ,H,

HP 1~HP

Enzima con un grupo e-amino del resto de lisina esencial

Fosfato de dihidroxiacetona (substrato)

Enz

I N

II

Compuesto enzima-substrato (base de Schiff)

HOCH2-C-CH,OP03H2 1 Hidruro de boro

Enz

I NH

I

Compuesto enzlma-substrato reducido

HOCH2-CH-CH,OP03H2 1 Hidrolisis

COOH I HN-C-H

2 I

CH2

I

CH2

I

CH.

I

CH2

I NH

I

HOCH,-CH -CH20H

EoN -qllcerfl-llslna libre

La adici6n de borohidruro sodico, poderoso reductor a una mezcla de aldolasa y de fosfato de dihidroxiacetona marcado origina la formaci6n de un compuesto covalente, marcado isot6picamente, a fosfato aldolasa-dihtdroxiacetona, que es cataliticamente inactivo. Por hidrolisis com pl eta de este compuesto con un acido, se encuentra en el hidrolizado un derivado estable e-N-glicerilo de un solo resto de lisina [figura 8-14). Este derivado no se forma en ausencia del reductor. De la estructura del compuesto marcado se dedujo que la aldolasa se combina de modo covalente, aunque reversible, con el fosfato de dihidroxiacetona formando una base de Schiff inestable (pag. 436) entre el grupo e -amino de un resto de lisina situado en el centro activo del enzima y el grupo carbonilo del sustrato. El tratamiento con borohidruro reduce a este intermediario, que es muy Iabil, a un derivado covalente pero inactivo. De esta manera se han aislado con exito compuestos enzima-sustrato covalentes y muy labiles, de varios enzimas que actuan sobre sustratos con grupos funcionales amino 0 carbonilo, transformandolos en sus formas reducidas y estables.

En algunas reacciones bisustrato de doble desplazamiento, puede aislarse un compuesto enzima-sustrato si el otro sustrato est a ausente del sistema. Por ejemplo, cuando la fosforilasa de la sacarosa actua sobre la sacarosa en ausencia de fosfato, se forma un compuesto enzima-qlucosa (pag. 212).

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Enzimas y sustratos en las celulas vivas

Los enzimas pueden actuar en las celulas vivas en condiciones muy diferentes de las que 10 hacen en los sistemas experimentales, tales como las experiencias cineticas in vitro descritas en este capitulo. Sl una celula hepatica contiene 1000 enzimas diferentes y su peso molecular medio es de alrededor de 140 000, la concentraci6n media en que cada enzima se hallara en el citoplasma sera menor que 10-6 M (1.0 I'M). Algunos enzimas, sobre to do los que catalizan las reacciones en las rutas centrales, pueden existir en concentraciones muy superiores: por ejemplo, la hexoquinasa, que cataliza la fosforilaci6n de la glucosa por el ATP, est a presente en el musculo en cantidad que excede a 10-4 M (100 pM). Por otra parte, algunos enzimas, como por ejemplo los que catalizan la bio .... sintesis de los coenzimas estan presentes, probablemente, en concentraciones tan bajas como 10-8 M (0,01 pM) .

Se han efectuado tambien medidas de la concentraci6n citoplasmica de diversos metabolitos que actuan como sustratos, La mayoria se hallan presentes en una concentraci6n total comprendida entre 5 y 500 pM. En muchos casos, por no decir la mayoria, la concentraci6n del sustrato en las celulas intact as es insuficiente para saturar al enzima: de hecho, en algunos de ellos, la concentraci6n del sustrato, no es mucho mayor que la concentraci6n del enzima. Esta claro que los enzimas, en la celula intacta, no exhiben necesariamente el comportamiento cinetico clasico de Michaelis-Menten, que supone que la concentraci6n del enzima es despreciablemente pequefia com parada con la concentraci6n del sustrato. El analis is cuantitativo de la cinetica de los enzimas en la celula intacta constituye un campo de la enzimologia apenas iniciado y reviste la maxima importancia para la comprensi6n de la regulaci6n biol6gica de la actividad enzimatica (cap. 9, pagi~ na 240).

Resumen

Los enzimas se clasifican basandose en la reaccion que catalizan. Algunos enzimas son proteinas simples; otros son proteinas conjugadas y contienen grupos prosteticos constituidos por iones metalicos, por coenzimas, 0 por ambos. Los coenzimas y los grupos prosteticos actuan como transportadores intermediarios de grupos funcionales especificos, de atomos 0 de electrones. Muchos coenzimas contienen una molecule de una vitamina determinada, nutriente orqanlco del que solo se precis an vestigios para la funcion celular normal.

En las reacciones catalizadas por enzlmas, un incremento de la concentracion del sustrato aumenta la velocidad de reaccion hasta que se alcanza un punto en que dicha velocidad se hace independiente de la concentracion del sustrato. En este punto el enzima se halla saturado y la reacclon es de orden cero con respecto al sustrato. Para cada enzima hay una concentracion de sustrato caracteristica (KM• la constante de Mtchaells-Menten) a la que la velocidad de reaccion es la mitad de la velocidad maxima. La relacion cuantitativa entre la velocidad inicial de la reaccion, la concentracion del sustrato KM y la velocidad maxima de un enzima vienen dadas por la ecuacion de Michaelis-Menten. Su deduccion se basa en la suposicion de que se forma un complejo enzima-sustrato que es reversible. como etapa esencial de la catalisis, Los enzimas exhiben tambien un pH optimo y un intervalo de temperatura en el que son estables y activos.

Los inhibidores competitivos de los enzimas son aquellos que reaccionan reversiblemente con el enzima libre en competencia con el sustrato para formar un complejo enzlma-Inhibldor: su accion puede invertirse por incremento de la concentracion del sustrato. Los inhibidores acompetitivos

218

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

no reaccionan con el enzima libre, pero se combinan reversiblemente con el complejo enzima-sustrato, impidiendo la formaclon de los productos. Los inhibidores no competitivos reaccionan reversiblemente tanto con el enzima libre como con el complejo enzima-sustrato. Los inhibidores irreversibles producen una modificacion quimica permanente de alqun grupo funcional esencial en la molecula del enzima. Las experiencias cineticas se utilizan para distinguir entre los diversos tipos de Inhiblclon reversible de los enzimas: las representaciones doble reciprocas son especialmente utiles para el analtsis de estos datos cineticos,

En las reacciones bisustrato de desplazamiento simple al azar, el enzima forma un complejo ternario con ambos sustratos. los cuales pueden adicionarse en cualquier orden. En las reacciones de desplazamiento simple ordenadas, existe una secuencia obligatoria en la adicion de los sustratos para formar el complejo ternario. En las reacciones de doble desplazarniento, 0 ping-pong, un sustrato reacciona con el enzima y su correspondiente producto se libera antes de que se combine el otro sustrato.

Las experiencias con enzimas se efectuan normalmente midiendo la velocidad inicial de la reaccion bajo condiciones en las que el enzima este saturado con el sustrato y el pH es optimo. La existencia de complejos enzima-sustratos y de compuestos covalentes se ha deducido de estudios cmeticos, de experiencias de captacion, y de mediciones espectrofotometricas.

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Articulos

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Problemas

Dado que la cinetica de las reacciones enzlmaticas constituye el punto clave de gran parte de la investiqaclon bioquimica, se da a continuacion una amplia seleccion de los problemas que se presentan comiinmente.

1. En la reaccion de primer orden A ~ B. la concentracion de A en el tiempo cero es de 0.50 mM. Al cabo de 2 s, es de 0.25 mM. lCual sera al cabo de 5 s?

2. En la reaccion de segundo orden A + B ~ C. las concentraciones de los reactivos en el tiempo cero son las siguientes: la del reactivo A es de 5.0 mM y la del reactivo B de 4.0 mM. Cuando ha transcurrido 1 s, la concentracion de A es de 4.0 mM y la de B de 3.0 mM. lCual sera al cabo de tres segundos la relacion de las concentraciones entre A y B?

3. 8) ,Cua! sera la constante de velocidad k de una reaccion de primer orden cuyo tiempo mitad es de 0.3 s?

b) lQue intervalo de tiempo deberia transcurrir para que desapareciese el 95 % del reactivo?

4. Los datos siguientes se refieren a la reacclon

t, S

120

30

60

[SCN-], X 10" M-l 2,92 5,89 10,79

Calciilese la constante de velocidad de seudo primer orden de la reaccion, si la concentracion inicial de CN- era 0.125 M. y la RSO,S- de 0.0035 M.

5. lQue relacion existe entre KM y [SJ, cuando una reaccion catalizada enzimaticamente, alcanza el 80% de la Vm .. ?

6. Demuestrese que en la inhibiclon competitiva de una reaccion enzimatica, las intersecciones sobre el eje horizontal en la representacion del lIvo frente a I/[S]. para diferentes concentraciones del Inhibidor, es igual a

-1

7. A 10.0 ml de una dlsolucion de un enzima puro que contiene 1.0 mg de proteina por miltlitro, se le afiade la cantidad de Ag N03 exactamente precisa para inactivar el enzima. Se necesitaron en total 0.342 pM de AgN03; Calciilese un peso molecular mlnimo del enzima.

8. La transaminasa cataliza la reaccion

Glutamato + oxaloacetato ~ a-oxoglutarato + aspartato

EI fosfato de piridoxal (PP) actiia como coenzima en el proceso catalitico, Calciilese la KM para el complejo apoenzima-coenzlma a partir de los datos siquientes, obtenidos al variar la concentracion de PP mientras que las concentraciones de glutamato y de oxalacetato y las demas condiciones. se mantuvieron constantes:

Glutamato
que desapa-
rece por mi-
nuto.en mq 0,17 0.27 0.43 0.65 0.73 0.78 0,79 0,81
PP afiadido,
pM 0.30 0,50 1.0 2.0 3.0 4.0 5,0 10,0 9. EI salicilato inhibe la accion catalitica de la glutamato-deshidrogenasa. 8) Determinese el tipo de inhiblcion mediante el anallsis grafico de los siguientes datos. Sup6ngase que la concentraclon de salicilato se mantiene constante y es de 40 mM. Calculese tambien b) la KM para el sustrato y c) la KI constante de disociacion para el complejo enzfma-inhibldor,

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Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

Concentraci6n

de sustrato mM

1,5

2,0

3,0

4,0

8,0

16,0

Producto por minute, en mg

Sin salicilato

Con salicilato

0,21 0,25 0,28 0.33 0,44 0,40

0,08 0,10 0,12 0,13 0,16 0,18

10. A partir de los siguientes datos de una reacci6n enzimatica. deterrninese a) el tipo de inhfbiclon, b) la KM del sustrato y c) la KJ para el complejo enzbna-inhibldor.

Concentraci6n Producto pot hore, en p.g

de sustrato

mM Sin inhibidor Inhibidor 6 mM

2,0 3,0 4,0

10.0 15,0

139 179 213 313 370

88 121 149 257 313

11. La gliceroquinasa cataliza la reacci6n

Glicerina + ATP ~ glicerofosfato + ADP

Por adicion a la mezcla de reacci6n de la sal de cromo del ATP, se obtuvieron los resultados siguientes:

Concentraci6n v» (unidades etbitreries]
de ATP-cromo
tM 0,100 0,050 0,033 0,Q25 mM glicerina
0 50.0 40,0 33.3 33,3
10 6,25 6,06 6.06 5,88
20 3,45 3,13 3.08 3,23
30 2,38 2,27 2,35 2.33 a) Clasifiquese la inhibici6n con respecto a su tipo.

b) Calculese el valor de la constante de inhiblcion, Ki.

12. En una reaccion de desplazamiento simple y ordenada, en la que A es el sustrato conductor (primer sustrato) y B el sustrato siguiente; formulese la expresion algebraica de: a) la pendiente, b) la interseccion, c) la coordenada horizontal del punto de intersecci6n y d) la coordenada vertical del punto de intersecci6n cuando 1/vo se representa como funcicn de 1/ [B]. a diferentes concentraciones constantes de A.

13. La nucleosido difosfato quinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato terminal del ATP a un difosfato de nucleoside que actua como aceptor. Los estudios cineticos referentes a la reacci6n

ATP+ UDP~ADP + UTP

han proporcionado los resultados siguientes. Las representaciones de l/vo frente a 11 [ATP]. a diversas concentraciones constantes de UDP proporcionan rectas paralelas, y 10 mismo ocurre con las representaciones de 1/vo frente a 1/[UTP] a concentraciones constantes diferentes de ADP. Pudo verse que el ADP y el UDP son inhibidores mutuamente competitivos. igual que el ATP y el UTP. Se via tambien que el enzima cataliza reacciones de intercambio isotoplco entre el UTP y el UDP. y entre el ATP y el ADP. Proponqase un mecanisme compatible con estas observaciones.

14. La glicerol deshidrogenasa cataliza la reaccion

Glicerina + NAD+ :;:: dihidroxiacetona + NADH + H+

Se han descrito las siguientes propiedades del enzima procedente de Aerobacter aerogenes: las representaciones de 1/vo frente a 1/[glicerina] a diversas concentraciones constantes de NAD+ proporcionan lineas rectas cuya intersecci6n se efectua a la izquierda del eje 1Ivo' Analoqamente, las representaciones de l/vo frente a l/[NADH] a diversas concentraciones constantes de dihidroxiacetona muestran una intersecci6n a la izquierda del eje l/vo. EI NADH resulto ser un inhibidor competitive con respecto al NAD+, y la

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

dihidroxiacetona era un inhibidor acompetitivo con respecto al NAD+, al igual que la glicerina con respecto al NADH a concentraciones elevadas de los sustratos constantes. Prop6ngase un mecanisme que sea compatible con las observaciones anteriores.

15. La citrato sintetasa cataliza la reacci6n

Acetil-CoA + oxalacetato :;:: CoA + citrato

Al estudiar las propiedades cineticas del enzima de cerebro de rata. se obtuvieron los siguientes resultados. Las representaciones de 1/vo frente a 1/ [acetll-CcA] a diversas concentraciones constantes de oxalacetato proporcionan un conjunto de lineas rectas cuya intersecci6n estaba a la izquierda del eje 1/vo. Se obtuvieron resultados semejantes cuando se emplearon como sustrato variable el oxalacetatoo el coenzima A y el citrato. Los estudios de inhibici6n mostraron que el acetil-CoA y el Coenzima A eran mutuamente competitivos. mientras que el citrato era un Inhibidor competltivo del oxalacetato y del acetil-CoA. Prop6ngase un mecanisme cinetico que sea compatible con estas observaciones.

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