Está en la página 1de 10

PRINCIPALES ENZIMAS DE LA MIEL

INTRODUCCIÓN

La miel es una sustancia natural producida por las abejas (Apis mielifera) a partir del
néctar de las flores o de secreciones de partes vivas de plantas. Esta contiene al
menos 60% de azucares y no mas de 21% de humedad, de acuerdo a Ajlouni y
Sujirapinyokul (2010), esta composición es ampliamente influenciada por la región y
las condiciones climáticas. La miel como producto natural contiene diferentes
enzimas, lagunas producidas por la abeja y otras proporcionadas por la sustancia de
su procedencia (néctar, polen, fluidos de plantas), entre las más importantes
podemos encontrar enzimas como las amilasas, invertasas, glucosidasas, catalasas
y fosfatasas. Según Ureña, Arrieta, Umaña, Zamora y Arias Echandi en el 2007, la
miel como cualquier producto alimenticio debe cumplir con ciertas normas de calidad,
propiedades organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas, entre estos se
destacan como lo indica Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra (2009), la actividad de
diastasas (α-β-γ- amilasas) y la relación de esta enzima con el contenido de
Hidrometilfurfural (HMF) que según Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora
y Arias Echandi en 2007, indican adulteración, sobrecalentamiento y envejecimiento
de una muestra de miel.

DIASTASA (α-, β-, AMILASA)

La α-amilasa (1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa o glucogenasa) tiene la función de


romper las cadenas de almidón al azar produciendo dextrinas y β-amilasa (1,4-α-D-
glucano-maltohidrolasa o amilasa sacarogénica)
Grafico 1: Acción enzimática de la diastasa. Enzimas de la miel 2010

Según la proposición del Codex Alimentario (2001), existen dos indicadores de


calidad en la miel, el 5-hidrometilfurfural y la actividad de la amilasa (diastasa), los
cuales ayudan a identificar cuando una miel es adulterada, esto de acuerdo con
(Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra 2009) puede ser producto de daño por calor
excesivo, adición de diferentes tipos de azucares como sacarosa invertida, jarabe de
maíz de alta fructosa, e incluso azúcar de cocina, hacen que la concentración de
HMF aumente y el numero diastasico disminuya, debido a que si la miel es tratada
por un tiempo prolongado en calor, la actividad enzimática se reduce y a un menor
número diastasico, menor la calidad del producto en el mercado.

Existen varios métodos que se han ido desarrollando par detectar y cuantificar la
actividad enzimática de la diastasa entre los principales tenemos:

• Según lo planteado por Ajlouni y Sujirapinyokul en 2010, la evaluación de


la actividad de la amilasa (α-amilasa), se toma una muestra de 5g de miel
tratada con calor, se disuelven con 15 ml de agua Mili-Q y 5 ml de una
solución buffer de acetato de pH 3.5, esto se transfiere a un frasco
volumétrico que contiene 3 ml de solución de cloruro de sodio y se lleva a
volumen. Usando una pipeta volumétrica, 10 ml de la solución son trasferidos
a un frasco de 50 ml y puestos en baño de agua a 40ºC con un segundo
frasco que contiene 10 ml de solución al 1% de almidón. Después de 15
minutos, alicotas de 5 ml de la solución de almidón son agregados a la
solución de miel, mezclados y medidos. En intervalos periódicos, para un
primer tiempo de 5 minutos, alicotas de 0,5 ml de la mezcla son diluidos en 5
ml de solución de yodo (I2KI) y 22 ml de agua Mili-Q, mezclados e
inmediatamente medidos a 660 nm contra un blanco de agua. Una grafica de
absorbancia contra tiempo es usada para determinar el tiempo t x, en el que
una absorbancia especifica de 0,235 fue medida.

• El número diastasico es calculado siguiendo los métodos establecidos por


la Comisión internacional de miel en el 2002, en los cuales se plantea la
unidad Gothe es definida como el monto de enzima que puede convertir 0,01
gramos de almidón antes de prescribir el punto final en una hora a 40ºC bajo
las condiciones del test. La solución de almidón reacciona formando un
complejo con el yodo, de un color característico, el cual va disminuyendo por
la acción de la diastasa (α-amilasa), lo que ocasiona una perdida de color. La
ecuación para el calculo del número de diastasa es:

Figura 2: Calculo del número diastasico. International Honey Commission 2002.


El método establecido por la comisión Internacional de miel esta basado en el
trabajo original de Schade et al (1958).

El procedimiento de detección de adición de azucares u otros diluyentes por medio


del número diastasico puede ser reducido mediante la agregación de amilasas
foráneas, para evitar esto, Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra (2009), plantean la
comparación del número diastasico para diferentes sustratos.

Existe una relación directa entre los métodos de conservación y la calidad de este
valioso producto, el HMF es el resultado de un sobrecalentamiento para lograr la
perdida de humedad, aunque su producción es my común al pasar la miel por
grandes periodos de almacenaje, de acuerdo a Ajlouni y Sujirapinyokul (2010) el
almacenaje a una temperatura de 20 ºC aumenta el HMF en ± 1mg por cada
kilogramo mensualmente. La adulteración de mieles por adición de azucares
invertidos, aumenta los niveles de HMF, los cuales son altamente tóxicos para las
abejas. La comisión internacional de miel (2002), establece la determinación de
HMF, mediante el uso del método de Jeuring y Kupers (1980), por medio de HPLC
en fase inversa con detección de UV, la señal producida es comparada con algunos
estándares de concentración conocida, mediante el siguiente cálculo:

Figura 3: Calculo de la concentración de HMF. International Honey Commission


(2002).

INVERTASA

La invertasa es una de las enzimas más importante en el desarrollo del producto


final, ya que esta según Kotwal y Shankar en 2009 esta enzima realiza muchas de
las transformaciones químicas del néctar, este tipo de enzimas (β-D-fructofuranosida
fructohidrolasa, β-fructofuranosidasa, sacarasa) cataliza la hidrólisis de sacarosa y
glucósidos relacionados a simples carbohidratos (fructosa y glucosa), lo que aumenta
el contenido de azúcar sin cristalización del mismo reacción originada por las
glándulas hipofaringeas de la abeja mielifera (Apis mielifera). Esta enzima tiene un
gran valor comercial, principalmente la extraída de Saccharomyces sp., pero su uso
comercial es limitado por los altos costos de producción y su poca estabilidad frente
a cambios de factores como pH, Temperatura y presión osmótica.

Para su detección y cuantificación la comisión internacional de miel en el 2002,


plantea el uso del método Signthaler (1977), expresando en unidades, donde una
unidad es definida como el número de micromoles de sustrato destruidas por minuto
y expresadas por kilogramos de miel. Para esta prueba se usa como sustrato el p-
nitrofenol-α-D-glucopiranosido (pNPG) el cual es transformado en glucosa y p-
nitrofenol. La reacción enzimática es detenida en un pH de 9.5 y al mismo tiempo el
nitrofenol es transformado a anión nitrofelato, que corresponde a la cantidad de
sustrato convertido y es determinado por fonometría a 400 nm.

El cálculo de la actividad de la invertasa o numero invertasico se calcula de la


siguiente manera:
Figura 4: Cálculo del número invertasico. International Honey Commission
2002

GLUCOSA-OXIDASA

Según Pontoh y Low (2002) la β-Glucosidasa (β-d-glucoside glucohidrolasa) hidroliza


los puentes 1,4-β-Glucosa dejando β-d-glucosa de oligo y polisacáridos. Esta
enzima se ha descubierto en plantas, animales hongos y bacterias. En los insectos la
β-glucosidasa se subdivide en tres clases de acuerdo aun sustrato especifico. La
clase I incluye enzimas con actividad β-glucosidasa y aril β-glucosidasa, estas
enzimas tiene la capacidad hidrolizar celubiosa, lactosa, β-p-nitrofenil-glucosidasa (β-
PNPG), β-p-nitrofenilgalactosidasa (β-PNPGal), β-p-nitrofenilfructosidasa (β-
pPNPFru) y otros sustratos similares. La clase 2 incluye solo los que poseen
actividad glicosil β-glucosidasa, sin embargo ella solo puede hidrolizar sustratos con
celubiosa y lactosa. La clase 3 incluye enzimas con solo actividad aril (o alkil) β-
glucosidasa, estas enzimas tiene una actividad similar a la β-PNPG, así como
sustratos similares.

La identificación hecha por Pontoh y Low (2002), para la detección de actividad β-


glucosidasa en la miel, y como esta actividad esta correlacionada con la formación
de puentes tipo β-O-glicosidicos, detectan la presencia de actividad β-glucosidasa
en el intestino medio y posterior de la abeja melífera (Apis mielifera). El origen de la
actividad β-glucosidasa en miel no ha sido totalmente identificado, pero puede
porvenir de la abeja de la miel, luego la β-glucosidasa puede estar presente en el
saco de miel y los órganos segregan enzimas digestivas a la boca. Muchas glándulas
descargan secreciones en las partes bucales de la abeja, algunas torácicas, de la
cabeza y de las glándulas hipofaringeas, pueden relacionarse con la actividad β-
glucosidasa en la miel
Estudios recientes como los realizados por Zhang, Zheng, Shen en 2007, muestran
la localización de la glucosidasas tipo I esta presente en ventrículo, la glucosidasas
de tipo II esta presente en ventrículo y hemolinfa y la glucosidasas tipo III esta
presente en glándulas hipofaringeas. En abejas obreras, la glándula hipofaringea
hidroliza la sacarosa presente en el néctar, la glucosa y la fructosa mediante α-
glucosidasa, la estructura de la glucosidasa presente en las glándulas hipofaringeas
de la abeja de la miel, son muy similares a las presentes en mosca de la fruta y
mosquito

Los métodos para la detección y cuantificación de la glucosidasa de acuerdo con lo


establecido por Pontoh y Low en 2002, se baso en el método Low (1986) en el cual
un volumen seleccionado de muestra fue diluido con una muestra buffer a un
volumen total de 0,1 ml y fue añadido de 1 a 2 ml de β-PNPG 0,02 M en un buffer de
acetato 0,1 M a un pH 5,0 en un tubo de prueba. Esta mezcla fue incubada en baño
de agua (35 ºC) por 20 minutos. A esta solución se le agrego 0,01 ml de buffer Tris 3
M y pH 10,0. Despues de enfriarse, la solución fue transferida en un
espectofotometro y la absorbancia fue medida a 400 nm.

De la misma manera, se realiza una prueba para determinar la presencia de


glucosidasas, mediante la producción de peroxido de hidrogeno. Se toam una
muestra de 10 gr de miel y se diluye en 40 ml de agua Mili.Q a una temperatura de
20ºC. luego de una hora se mide el máximo de peroxido de hidrogeno producido
mediante Marckoquant hydrogen-peroxide testtrips Nr. 10.011. Se compara el color
de la tira con la escala de 0 a 25 mg de peroxido/litro, este valor se multiplica por 5
para determinar la cantidad de microgramos de peroxido, creados por 1 gramo de
miel en una hora

Una unidad de β-glucosidasa es definida como la cantidad de enzima requerida para


producir un µmol de p-nitrofenol por minuto en las condiciones del ensayo.
CATALASA

Como lo plantea Weston (2000), la sustancia identificada en la miel con mayor


propiedad antibacterial es el peroxido de hidrogeno, el cual es producido por la
enzima glucosa oxidasa, cuando la miel esta diluida. La catalasa descompone el
peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno, esta enzima también se encuentra en la
miel, pero es originada por el polen de las flores, mayormente, aunque existen
pequeños rastros de catalasa en néctar.

Figura 5: Reacción de la catalasa. Enzimas presentes en la miel 2010.


REFERENCIAS

1. Said Ajlouni, Puripast Sujirapinyokul. Hydroxymethylfurfuraldehyde and


amylase contents in Australian honey. Department of Food Science and
Agribusiness, Melbourne School of Land and Environment, The University of
Melbourne, Australia- Food Chemistry 119 (2010) 1000–1005

2. Maurico Ureña Varela, Esteban Arrieta Bolaños, Eduardo Umaña, Luis Gabriel
Zamora y María Laura Arias Echandi. Evaluación de la posible adulteración
de mieles de abeja comerciales de origen costarricense al compararlas
con mieles artesanales provenientes de apiarios específicos.
ALAN v.57 n.1 Caracas mar. 2007

3. M. VOLD!ICH, A. RAJCHL, H. "Í#KOVÁ and P. CUHRA Detection of


Foreign Enzyme Addition into the Adulterated Honey. Department of Food
Preservation and Meat Technology, Institute of Chemical Technology in
Prague, 166 28 Prague, Czech Republic; Czech Agriculture and Food
Inspection Authority in Prague, 150 06 Prague, Czech Republic. Vol. 27, 2009

4. Stefan Bogdanov. HARMONISED METHODS OF THE INTERNATIONAL


HONEY COMMISSION. Swiss Bee Research Centre. FAM, Liebefeld, CH-
3003 Bern, Switzerland (2002)

5. S.M. Kotwal and V. Shankar. Immobilized invertase. Division of Biochemical


Sciences, National Chemical Laboratory, Pune-411008, India. Biotechnology
Advances 27 (2009) 311–322.
6. J. Pontoh, N.H. Low. Purification and characterization of β-glucosidase
from honey bees (Apis mellifera). Department of Applied Microbiology and
Food Science, University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada. Insect
Biochemistry and Molecular Biology 32 (2002) 679–690

7. Jian-Fen Zhang, Yu-Guo Zheng, Yin-Chu Shen. Inhibitory effect of


valienamine on the enzymatic activity of honeybee (Apis cerana Fabr.) α-
glucosidase Institute of Bioengineering, Zhejiang University of Technology,
Hangzhou 310014, People’s Republic of China. Pesticide Biochemistry and
Physiology 87 (2007) 73–77

8. Roderick J. Weston. The contribution of catalase and other natural


products to the antibacterial activity of honey: a review. Industrial
Research Ltd, Lower Hutt, New Zealand. Food Chemistry 71 (2000) 235±239