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Dr. López-Moreno HS
Directorio
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 3
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2 ........................... 4
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL ............................................................................ 5
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2 ................................................................... 5
Inmuno2– 01. Uso de micropipetas ....................................................................................... 6
Inmuno2– 02. Preparación de extractos antigénicos ......................................................... 10
Inmuno2– 03. Inmunización de animales de experimentación ......................................... 13
Inmuno2–04. Reacción Antígeno-Anticuerpo: Determinación de los Grupos Sanguíneos
ABO y Rh............................................................................................................................... 16
Inmuno2– 05. Técnicas Avanzadas: ELISA ....................................................................... 19
Inmuno2– 06. Obtención de Anticuerpos Policlonales ...................................................... 23
Inmuno2– 07. Técnicas Avanzadas: Western blot ............................................................. 26
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 30
ANEXOS ....................................................................................................................... 31
A1. Protocolos para la preparación de reactivos para la SDS-PAGE (Laemmli) ........... 31
A2. Formulación de geles ..................................................................................................... 32
A3. Protocolos para la preparación de reactivos para Western blot (Towbin) ............... 33
INTRODUCCIÓN
Deseamos que el alumno obtenga el máximo provecho de estas prácticas, que pretendemos
mejorar en cada ciclo escolar con las sugerencias e indicaciones que tengan a bien hacernos
llegar.
Disposiciones generales:
1) Toda persona que se encuentre dentro del área del laboratorio quedará sujeta al presente
reglamento, sin excepción alguna.
2) Dentro del laboratorio únicamente se admitirá a aquellas personas que tengan alguna tarea o
asunto relacionado con el mismo.
3) Toda persona que se encuentre dentro del laboratorio deberá seguir estrictamente las normas
de seguridad, que se anexan al presente reglamento.
A los alumnos:
6) El número de integrantes por equipo estará sujeto al número total de alumnos, no debiendo
exceder de 5 integrantes por equipo.
9) Todo alumno dispone de una semana a partir de la realización de la práctica, para hacer
entrega de su reporte. De no cumplir se le dará de baja en dicha práctica.
10) El área de trabajo deberá permanecer libre de objetos personales, alimentos, etc.,
permitiéndose únicamente el uso del material necesario para el registro de los datos
obtenidos.
11) El orden y la disciplina dentro del laboratorio están confiados al alumno, que de no ser
satisfactorio podrá ser acreedor a sanciones por parte del encargado del laboratorio.
12) Los alumnos que se encuentren realizando prácticas son responsables del equipo y material
de laboratorio de que hagan uso.
13) Los usuarios del laboratorio son responsables de la limpieza del área de trabajo y equipos
utilizados.
14) No se permitirá la realización de la práctica a aquellos alumnos que no hagan uso de la bata
de laboratorio.
15) Ningún experimento debe ser iniciado hasta que se haya completado la planeación del
mismo y se cuente con la aprobación del profesor.
16) Ningún equipo deberá ser operado parcial o totalmente hasta que se tenga la autorización
del profesor.
17) Se deberá permanecer en la práctica mientras ésta no se concluya a menos que se obtenga la
autorización del profesor.
18) Ningún equipo puede ser desarmado parcial o totalmente o trasladado de su posición sin la
autorización del profesor.
19) El deterioro o fallas del equipo deben ser reportadas de inmediato ante el profesor o jefe del
laboratorio.
20) Tendrán derecho a recibir comprobante de realización de prácticas, aquellos alumnos que
hayan cumplido mínimamente con el 90% de las mismas.
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2
1.0 Objetivo
1.1 El alumno comprenderá los aspectos básicos en el uso y manejo de micropipetas automáticas.
2.0 Introducción
En las prácticas de Inmunología los volúmenes de las soluciones que se necesitan medir son del
orden de microlitros (10-6 L o µL). Para tomar estas cantidades con exactitud y reproducibilidad se
emplean las micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable.
Para que las medidas sean correctas se debe de tener en cuenta las siguientes consideraciones
generales:
• Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden
solamente un único volumen. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen
dentro de un rango de valores determinado. En éstas, no se deben ajustar volúmenes
superiores o inferiores a los que se recomiendan para cada pipeta.
• Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 µL usan puntas amarillas, y las
micropipetas que toman volúmenes superiores a 200 µL hasta 1 mL usan puntas azules. Las
pipetas que toman volúmenes por encima de 1 mL y algunos modelos que toman volúmenes
de 0,5 y 10 µL, pueden usar otro tipo de puntas específicas.
• La pipeta se sujeta como un puñal. La empuñadura debe de reposar sobre su dedo índice.
Figura 1
• Existen otros modos de pipeteo que se utilizan para soluciones muy viscosas o cuando se
tenga que pipetear repetidamente una solución.
• Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe de realizar lentamente y
con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la
• También se pueden formar burbujas si la punta no está bien ajustada a la pipeta. La solución
es ajustarla mejor
4.0 Técnica
• Se selecciona la pipeta adecuada para medir el volumen, de manera que esté dentro del
rango especificado para la pipeta
Se coloca una punta desechable en el vástago de la pipeta (Figura 3). Se asegura que está bien sujeta
ejerciendo un ligero movimiento de torsión.
• Se relaja la presión del pulgar para que el émbolo vuelva a la posición normal.
• Se elimina la punta por presión del expulsor de puntas o tirando de ella, para evitar
contaminaciones (Figura 5).
Figura 5
7.0 Bibliografía
http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropipetas.htm
1.0 Objetivo
1.1 El alumno obtendrá extractos antigénicos de patógenos de importancia médica.
2.0 Introducción
Un aspecto crítico en la realización de un gran número de metodologías inmunológicas radica en
disponer de lotes antígeno que garanticen un abasto suficiente para el diagnóstico de enfermedades
o bien, para la reproducibilidad de los experimentos en la investigación, por ello, la obtención de
preparaciones antigénicas homogéneas debe realizarse de forma sistemática.
4.0 Técnica
A partir de un cultivo celular de Leishmania mexicana se procederá a la obtención de la biomasa de
donde se obtendrá un extracto antigénico.
5.0 Resultados
a. Registrar la concentración proteica del extracto antigénico.
b. Contestar las preguntas del cuestionario (en hojas blancas)
7.0 Bibliografía
Números 1, 2 y 3 de la sección de bibliografía de este manual.
1.0 Objetivos
1.1 El alumno identificará las diferentes vías de inmunización para la generación de anticuerpos
policlonales.
1.2 El alumno elaborará emulsiones antigénicas.
1.3 El alumno conocerá los fundamentos para el manejo de animales de experimentación.
1.4 El alumno realizará un protocolo de inmunización de un animal de experimentación.
2.0 Introducción
Una de las herramientas biológicas de mayor aplicación en la inmunología y otras disciplinas
relacionadas son los anticuerpos. Mismos que permiten el diagnóstico de enfermedades, la
identificación de celular, aislamiento de moléculas de interés biomédico, terapéutica, entre muchas
otras aplicaciones, de ahí la importancia de la manipulación de animales de experimentación para la
generación de anticuerpos policlonales o monoclonales.
Pasos:
1. Realizar una emulsión antigénica con PBS (c.b.p. 250µL), 300µg del extracto antigénico y
250µL de adyuvante incompleto de Freund (aceite mineral).
2. Colocar el conejo en el cepo para sangrarlo por goteo en la vena exterior de la oreja.
3. Colocar el tubo eppendorf bien rotulado en la gradilla y dejar que la sangre coagule para
posteriormente separar el suero por centrifugación a 3000 r.p.m. durante 5m decantar el suero en
otro eppendorf perfectamente rotulado para su almacenaje a -20°C hasta su uso.
4. Inocular la emulsión antigénica al conejo por vía subcutánea en el lomo del animal.
5. Inocular el conejo por vía subcutánea 3 veces más dejando un periodo de 10 días entre cada
inmunización.
6. Haga un calendario de inmunización para definir las fechas de reestimulación del conejo.
Observaciones y Resultados
1.0 Objetivos
1.1 El alumno conocerá el fundamento de una reacción antígeno-anticuerpo.
1.2 El alumno será capaz de identificar los grupos sanguíneos ABO y Rh humanos.
2.0 Introducción
Los eritrocitos o hematíes son células sanguíneas encargadas del transporte gaseoso (oxígeno y
dióxido de carbono), en nuestro organismo. Estas células enucleadas poseen en su membrana
antígenos que permiten han permitido su clasificación en grupos sanguíneos siendo los más
importantes el ABO y el Rh. El sistema ABO está integrado por glicoproteínas formadas por la
presencia o ausencia (tipo O) de oligosacáridos llamados A y B unidos a una proteína o antígeno H
diferenciadas por el carbohidrato más distal, el tipo A, por N-Acetilglucosamina y el tipo B, por
Galactosa. Existen individuos que poseen ambos tipos denominados AB. El sistema Rh está
formado por varias glicoproteínas que fueron identificadas inicialmente en eritrocitos del Macacus
rhesus y de allí su nombre de Rh.
Actualmente, podemos definir el tipo sanguíneo de un individuo mediante reacciones de antígeno-
anticuerpo basadas en la aglutinación de sus eritrocitos con sueros hemoclasificadores específicos.
4.0 Técnica
Observaciones y Resultados
Interpretación de los resultados:
• Los eritrocitos pertenecientes al tipo A, son aglutinados con el suero anti-A pero no con él
anti-B.
• Los eritrocitos pertenecientes al tipo B, son aglutinados con el suero anti-B pero no con él
anti-A.
• Los eritrocitos pertenecientes al tipo O, no son aglutinados por ninguno de los sueros
hemoclasificadores.
• Los eritrocitos pertenecientes al grupo Rh, son aglutinados con el suero anti-D.
1.0 Objetivos
1.1 El alumno conocerá el fundamento del ELISA.
1.2 El alumno realizará una aplicación diagnóstica del ELISA.
1.3 El alumno conocerá las variantes metodológicas de un ELISA.
1.4 El alumno conocerá las diferentes aplicaciones del ELISA.
2.0 Introducción
Una de las técnicas más empleadas en el campo de la inmunología con fines diagnósticos y de
investigación lo constituye el ELISA (del inglés “Enzyme Linked Immunosorb Assay”). Esta
técnica nos permite evidenciar la presencia de anticuerpos o antígenos en una muestra biológica
mediante una reacción Ag-Ac sobre un soporte sólido de poliestireno (placa de microtitulación),
puesta en evidencia mediante la actividad de una enzima sobre su sustrato.
4.0 Técnica
De acuerdo a protocolos estándar.
Preparación de reactivos:
a) PBS-T 0.1%: Para cada placa de prueba diluir 1mL de Tween 20 en PBS hasta obtener
1000mL. Este reactivo será usado como solución de lavado y como disolvente de varios
reactivos.
Pasos:
1. Diseño del experimento: Diseñar la distribución de las muestras y testigos de referencia (si
los hubiere) antes de iniciar.
2. Sensibilización de las placas: En cada uno de los pozos o pocillos donde colocará el
antígeno para sensibilizar la placa, colocar 100µL de la muestra/pozo.
3. Incubación de las muestras: Cubrir las placas de prueba con papel parafilm e incubar a
37°C durante 40’.
4. Lavado: Decantar el contenido en la tarja y colocar en cada pozo aproximadamente 300µL
de PBS-T, repetir este proceso 2 veces más.
5. Bloqueo: Colocar en cada pocillo 200µL de la solución de bloqueo si la placa es de fondo
plano o 150µL si es de fondo en “U”.
6. Incubación con el bloqueador: Incubar las muestras como en el paso 3.
7. Lavado: Lavar como en el paso 4.
8. Distribución del suero problema: Agregar a cada pocillo 100µL de diluciones séricas
(humanas o de conejo) disueltas en PBS-T, con base en el diseño.
9. Incubación con los sueros problemas: Incubar las muestras como en el paso 3
10. Lavado: Lavar como en el paso 4.
11. Distribución del conjugado: Siguiendo el diseño experimental, colocar en cada pozo
100µL de la solución del conjugado (anti-IgG o anti-IgM de humano o de conejo, conjugada a
peroxidasa de rábano picante) a la dilución sugerida por el fabricante.
11. Incubación con el conjugado: Incubar las muestras como en el paso 3.
12. Lavado: Lavar como en el paso 4.
13. Distribución del cromógeno: Colocar en cada pozo 100µL de SC.
14. Incubación del sustrato: Cubrir la placa de prueba con papel aluminio durante 10 o 15’ al
abrigo de la luz.
15. Detener la reacción: Descubrir la placa de prueba y agregar 50µL de H2SO4 a 2M.
Mantener el mismo ritmo y distribución que para la distribución del sustrato.
Observaciones y Resultados
1.0 Objetivos
1.1 El alumno conocerá el fundamento de la generación de anticuerpos policlonales.
1.2 El alumno obtendrá anticuerpos policlonales a partir de un animal de experimentación
previamente inmunizado.
2.0 Introducción
Un paso fundamental para la realización de las técnicas serodiagnósticas radica en la obtención de
una muestra sérica de los pacientes o bien de animales de experimentación previamente
inmunizados a fin de poder evaluar la respuesta de anticuerpos que ha sido evocada contra el
antígeno o el patógeno a investigar. En dicha porción sérica podemos encontrar una mezcla de
inmunoglobulinas provenientes de diferentes clonas de linfocitos B que han reconocido a diferentes
determinantes antigénicos de un mismo antígeno o patógeno produciendo una mezcla heterogénea
de anticuerpos específicos conocida como suero policlonal o anticuerpos policlonales.
4.0 Técnica
Pasos:
8. Colocar al conejo en un cepo fijándolo por el cuello y sujetándole por la parte
posterior de tal manera que no se mueva para prevenir que se lastime el cuello.
9. Limpiar con una torunda el área posterior de una de las orejas identificando la vena
más prominente de la parte media o exterior de la oreja.
10. Introducir cuidadosamente la aguja con el bisel hacia arriba a la vena seleccionada.
11. Colectar por goteo aproximadamente 1mL de sangre en un tubo eppendorf de 1.5 o
2.0mL.
12. Liberar al conejo del cepo y colocarlo en su jaula de transporte.
13. Permitir que se forme el coagulo de sangre en el tubo de colecta dejándolo reposar
durante unos 15 o 20min a temperatura ambiente en una gradilla.
14. Remover el coagulo con un aplicador de madera.
15. Centrifugar la muestra durante 10min a 3000 rpm a 4°C.
16. Transferir el suero a un nuevo tubo eppendorf perfectamente rotulado.
17. Almacenar el suero a -20°C hasta su uso.
Observaciones y Resultados
1.0 Objetivos
1.1 El alumno conocerá el fundamento del Western blot.
1.2 El alumno realizará una aplicación diagnóstica del Western blot.
1.3 El alumno conocerá las diferentes aplicaciones del Western blot.
2.0 Introducción
Dentro de las técnicas más poderosas que se emplean en la inmunología con fines diagnósticos y de
investigación encontramos al Western blot conocido también como Inmunoblot o
Inmunoelectrotransferencia. Esta técnica nos permite evidenciar por una parte, la presencia de
anticuerpos en una muestra biológica mediante una reacción Ag-Ac sobre un soporte sólido
generalmente de nitrocelulosa o PVDF, puesta en evidencia mediante la actividad de una enzima
sobre su sustrato; y por otra parte, el tamaño del antígeno identificado.
4.0 Técnica
1. Realice el diseño de la distribución de las muestras y verifique que cuenta con todos los
reactivos y equipos necesarios.
2. Prepare el molde con los cristales donde se colocará la mezcla para hacer el gel de
poliacrilamida (ver Anexo 4).
3. Coloque la mezcla del gel separador hasta ¾ partes del tamaño de los cristales, antes de
que polimerice la acrilamida adicione aproximadamente 200µL de isopropanol para eliminar
las burbujas generadas por el SDS y eliminar las irregularidades de la superficie del gel y
dejarlo “plano”.
4. Una vez que el gel ha polimerizado, retire el isopropanol por decantamiento, lave con
agua desionizada y coloque el “peine” analítico o preparativo, llene completamente el
Observaciones y Resultados
aa) Contestar las preguntas del siguiente cuestionario (en hojas blancas)
BIBLIOGRAFÍA
1. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA y Kuby J. Inmunología. 6a edición, McGraw Hill 2007,
México.
2. Abbas AK, Litchman AH. Immunología Celular y Molecular. 7a edicion, Elsevier 2008, USA.
3. Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM. Inmunología Fundamentos. 11a edición,
Panamericana 2006, México.
4. Brostoff J, Male D, Roitt IM. Immunology. 7th edition, Mosby 2007, UK.
ANEXOS
5. Amortiguador de muestra
1. Prepare la solución monomérica del gel mezclando todos los reactivos excepto el APS 10% y el
TEMED.
Desgasifique durante 10 minutos.
Na2HPO4 10 mM 14.2 g
NaH2PO4 10 mM 13.7 g
NaCl 150 mM 87.6 g
KCl 2.7 mM 2.0 g
Disuelva en 900 mL de agua desionizada todas las sales y posteriormente ajuste el pH a 7.2-7.4 y
afore a 1L esterilice por filtración a 0.22 µm y almacene a temperatura ambiente hasta su uso.
Alternativamente puede esterilizar el PBS en autoclave, sin embargo si se excede el tiempo de 20
min pueden generarse precipitados.
4. Solución de bloqueo
Leche descremada (Svelty) 5 g
PBS, pH 7.2-7.4 suplementado con Tween-20 al 0.05% v/v 90 mL
Disuelva la leche Svelty en 90 mL de PBS-Tween-20 y afore a 100 mL.
Prepare la solución bloqueadora el día en que la utilizará
5. Solución cromogénica
PBS, pH 7.2-7.4 10 mL
Diaminobenzidina (DAB) 50 mg
Peróxido de hidrógeno (H2O2) 0.001% v/v
Disuelva la DAB en el PBS, adicione el peróxido y mezcle la solución.
Prepare la solución cromogénica en el momento en que la utilizará