a) Preparación de muestra: durante toda la preparación debe mantenerse fría la muestra, para

evitar actúen las nucleasas.

- Corte finamente aproximadamente 5 gr de hígado.

- Con el homogeneizador de vidrio, cuidadosamente homogeneice el tejido en dos volúmenes de
TEK.
- Centrifugue a baja velocidad (1000 x g, durante 10 min.) para eliminar debris, recoja el
sobrenadante.
- Agregue cuidadosamente subyaciendo a la muestra 1 volumen de Sacarosa 15%- TEK, evitando
disturbar la interfase.
- Centrifugue a baja velocidad (2,000 x g, durante 10 min.) para eliminar debris, recoja el
sobrenadante
- Centrifugue a 18,000 x g durante 1 hr a 4 ºC.
- Elimine el sobrenadante y resuspenda el pelet con 10 ml de TEK.
- Centrifugue a 18,000 x g durante 30 min.
- Resuspenda el pellet en 1 volumen de TEK.

b) Preparación del gradiente de sacarosa.

- Con el formador de gradientes prepare dos tubos de centrífuga.

Notas: La mayor eficiencia del formador de gradientes se obtiene colocando en el recipiente interior
la solución 0.8 M y en la exterior la de 2 M, agitando suavemente con un agitador magnético a la
solución interior y dejando salir muy lentamente el líquido.

c) Ultracentrifuga.

- Con sumo cuidado coloque el homogeneizado sobre el gradiente de sacarosa.

- Para la ultracentrifugación, una vez que se tengan todos los tubos se deben poner al mismo peso
en milésimas de gramo (con la balanza analítica).
- Centrifugue a 80,000 x g durante dos horas a 4ºC.
- Recoja la banda de mitocondrias, caracterizada por el color anaranjado aproximadamente en la
densidad de 1 M.
- Recoja la banda de núcleos, caracterizado por el color negruzco aproximadamente en la densidad
de 1.8 M.
- En un tubo marcado coloque a las mitocondrias y resuspenda en al menos 2 volúmenes de TEK.
- Centrifugue a 20,000 x g durante 30 min a 4ºC
- Elimine el sobrenadante y resuspendiendo el pelet con el mínimo volumen de TEK, páselo a un
tubo eppendorf con tapa, para guardarse en congelación (-20ºC).
i
i
http://alpha.rec.uabc.mx/dgaa/matdidac2/biologia/molecular/practicas/centrifuga.htm