Universidad de La Frontera.

Facultad De Ciencias Agropecuarias y Forestales

PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Iván Faundez
Nelson Peña
Osvaldo Pradel
Álvaro Suazo
Profesora: Alejandra Sandoval
Asignatura: Laboratorio Biología Molecular
Carrera Biotecnologia
Temuco - Chile
2010
 INTRODUCCIÓN

Con el avance de los años la tecnología está creciendo a gran

escala, de ahí que se han desarrollado técnicas que en siglos pasados ni
siquiera fueron imaginadas por los investigadores, pero que hoy son
indispensables para el desarrollo de la ciencia; una de esas técnicas es
la extracción de ácidos nucleicos (ADN/ARN), a través del método de
Chomczynski.
Los ácidos nucleicos son macromoléculas formados por distintas
secuencias de nucleótidos (unión entre bases nitrogenadas, azúcares y
fosfatos) y se unen a través de enlaces fosfodiester. Existen dos tipos
de ácidos nucleicos, los ácidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico
(ARN) son polímeros de nucleótidos formados por un azúcar de cinco
carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una base
nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o Uracilo)
y una molécula de fosfato. El ADN es la macromolécula que contiene la
información genética de las células procariontes, eucariontes y de los
adenovirus. Está involucrado en la síntesis de proteínas y constituye el
material genético de los retrovirus; la expresión de los genes es la base
del metabolismo celular, y por ésta se entiende que el ADN se transcribe
en ARN, que a su vez se traduce en proteínas. Esta secuencia ADN-ARN-
proteínas constituye el dogma central de la biología molecular. (1)
Para la extracción de ácidos nucleicos a través del método de
Chomczynski descrito en el año 1987, se desarrolla una serie de pasos
llevados a cabo en el laboratorio, que tienen como objetivo final una
muestra libre de residuos celulares. Este se desarrolla tras varios pasos
que tienen como función: desintegrar las membranas celulares con una
solución Guanidino Tiocianato, centrifugar para separar los contenidos
por peso molecular, desnaturar las proteínas ( tras la acción del
cloroformo) y otra serie de pasos que se deben realizar purificar y
finalmente realizar una electroforesis. En el presente informe se
detallará el proceso de extracción en 2 laboratorios diferentes, donde se
extrajo DNA plasmidial, DNA geonómico y RNA. En el primero realizamos
una extracción simultánea de DNA plasmidial y genómico, el DNA y
genómico se extrajo de material vegetal proveniente de hojas de tabaco
y el DNA plasmidial se obtuvo de bacterias, en este caso de E. Coli. En el
segundo laboratorio extrajimos RNA a partir de hojas de tabaco al igual
que para DNA genómico. Es importante destacar que el método de
Chomczynski tiene varias etapas similares para la extracción de los
ácidos nucleicos sin embargo hay consideraciones fundamentales para
el empleo de la solución en DNA o RNA.
Finalmente debemos visualizas nuestras muestras y un método que
permite visualizar ácidos nucleicos o fragmentos del mismo es la
electroforesis en gel de agarosa, en la cual el material genético se
separa en función de su tamaño. Esta técnica consiste en someter la
mezcla de moléculas de DNA depositadas en un gel de agarosa a un
campo eléctrico (3).
“Dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica, el
parámetro que rige el avance (aceleración = fuerza/masa) es realmente
la relación carga/masa.”
(Prof. Tom Jack y Prof. Bob Gross) (1998)
Por otro lado, hay cuidados que tener a la hora de trabajar en el
laboratorio, por esto y a modo de introducción a los laboratorios, se ha
de presentar el espacio físico donde se trabajará y las debidas
precauciones que se deben guardar.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Es evidente que cada laboratorio, como es el caso de un Laboratorio

de Biología Molecular, el personal está sometido a diversos riesgos, unos
de tipo general y otros específicos propios de la actividad desarrollada
en los mismos. Debido a que un laboratorio debe de ser un lugar donde
debe prevalecer la seguridad personal, es preciso mencionar que las
normas de seguridad de laboratorio son indispensables para conseguirlo,
estas son difíciles de elaborarlas tratando de abarcar completamente
todas las instancias y riesgos que puedan suceder en laboratorios en
general, por ello es necesario elaborarlas de acuerdo a las practicas,
ensayos y materiales que allí se utilicen , bajo criterios de orden general,
basados en legislación al respecto. Un punto importante más allá de lo
dicho anteriormente, es necesario que los usuarios de laboratorio
cuenten con mínimo de sentido común y conocimiento de los riesgos a
los que están expuestos al realizar experimentos no autorizados o sin la
adecuada supervisión.

• Protección personal básica

Ya que no tenemos la certeza de que los medios de protección

colectiva ofrecen el máximo de seguridad es indispensable utilizar los
métodos de protección personal básica, dejando claro que es necesario
que este tipo de protección deba ser utilizado durante todo el tiempo
que se está en el laboratorio.

 Es conveniente la utilización de delantal, ya que evita que posibles

proyecciones de sustancias químicas lleguen a la piel. Por
 supuesto además, evitarás posibles deterioros en las prendas de
vestir.
 Es indispensable el uso de guantes de látex para evitar el contacto
de sustancias toxicas con la piel.
 En el caso de usar cabello largo es necesario llevarlo recogido.
 Es aconsejable el uso de gafas de seguridad.
 Si se está manipulando sustancias fuertemente corrosivas se
deben usar guantes de goma.
 Está terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni
comidas.
 Durante la jornada de trabajo no se deben usar aros, reloj de
pulsera, colgantes, bufandas, entre otros.
 Es necesario contar con zapatos cerrados.

• Instrumentación y equipamiento de seguridad

Debido al tipo de experimentación realizada en este tipo de

laboratorio es de carácter obligatorio contar con el tipo de equipamiento
antes mencionado ya que son de vital importancia a la hora de evitar un
accidente. A su vez es necesario conocer y averiguar el correcto
funcionamiento de cada uno de los equipos ubicados en el laboratorio.

• Accesorios de protección personal: Este cuenta con variados

accesorios como lo son gafas protectoras, guantes de látex, gorro
de polipropileno, inhaladores filtrantes, mascarillas, entre otros.
• Campana de extracción: Es indispensable su uso en aquellas
instancias donde el personal esta expuesto al contacto o
inhalación de gases emanados de categoría tóxica.
• Extractor: Elimina los productos no deseables del ambiente, ya
que este facilita la renovación del aire del interior de laboratorio.
• Extintor: La presencia de este instrumento en buenas condiciones
y en un lugar estratégico contribuye un rápido control de un
accidente de tipo inflamatorio.
• Partes generales del laboratorio

El laboratorio de Biología Molecular está organizado de tal forma

que distintas tareas o procedimientos se realicen en áreas o sectores
diferentes dentro del mismo laboratorio, con ello logramos conseguir
mantener en zonas específicas aquellos procedimientos que son de
mayor peligrosidad, como también, mantener ubicaciones exclusivas de
materiales de similar índole.

• Sector de electroforesis: Ésta área de trabajo utilizada para la

visualización de ácidos nucleicos presenta solo instrumentación
que se realiza para este tipo de prácticas, con esto evitamos
contaminación presentada por aquellos reactivos aquí utilizados.
Principalmente consiste en la cámara de electroforesis,
transiluminador UV, PC, entre otros.
• Mesones de trabajo: Ésta es una de las áreas de mayor
confluencia de personal de trabajo ya que es este lugar donde se
realizan todo tipo de mediciones, preparación de muestras, etc.
Aquí es posible encontrar una gran variedad de instrumentación,
como lo son: centrifugas, micropipetas, microondas, vórtex,
balanzas, agitador magnético, entre otros.
• Zona húmeda: En un trabajo de laboratorio es indispensable
contar con variados tipos de agua, ya sea para lavados, diluciones,
etc. Para ello el laboratorio cuenta con un área donde
encontramos agua potable como también agua destilada, esto con
contenedores necesarios para depositar allí material sucio o para
fines que lo ameriten.
• Área de refrigerado: Muchas veces en necesario conservar
muestras u reactivos que necesitar permanecer a bajas
temperaturas, para ello es necesario mantener un área de este
tipo en este tipo de laboratorio. El equipamiento aquí utilizado son
solo aparatos de también de uso domestico, como lo son
refrigeradores o congeladoras.
• Vitrina de reactivos: El objetivo de este lugar es para mantener
aislado o simplemente reunido todo tipo de material reactivo que
podría causar algún tipo de peligrosidad por su mala manipulación
preciso mantenerlo en un área apartada o bien reunidos en un
solo lugar para así mantener allí solo este tipo de material tipo de
reactivos
• Señalización de precaución

El laboratorio presenta señalización necesaria para advertir lugares

donde la peligrosidad es mayor, como es el caso del lugar donde se
encuentran los reactivos como también aquellos donde se llevan a cabo
practicas en las que podrían haber adheridos residuos de reactivos de
alto riesgo de contaminación del personal o usuario del laboratorio,
como es el área de electroforesis

• Anexo

Para un correcto funcionamiento y para llevar a cabo un trabajo de

laboratorio en condiciones seguras, es necesario contar con todo lo
dicho anteriormente, por ello ésta es la instancia para mencionar
aquellas implementaciones de seguridad que en nuestro laboratorio
están ausentes;

o La ducha de disparo rápido, que debería presentarse en el

punto de mayor paso o bajo el dintel de la entrada principal,
este es de vital importancia en aquellos accidentes que lo
ameriten.
o Una fuente de lavaojos es imprescindible tenerla cercana a
los mesones de trabajo, esto porque no estamos ajenos a
tener un contacto de sustancias que podrían causarnos
problemas oculares.

OBJETIVO GENERAL
• Extraer DNA genómico, DNA plasmidial y RNA por el método de
Chomczynski.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Conocer los procedimientos específicos para la extracción de

ácidos nucleicos.
• Observar los distintos procesos a los que se somete a las
muestras para obtener una buena muestra de DNA o RNA.
• Diferenciar las propiedades de cada uno de los ácidos nucleicos;
las que hacen diferentes los protocolos empleados.
• Emplear y conocer diferentes reactivos y sus propiedades.
• Conocer los pasos que se realizan en una electroforesis.

•Precauciones

1. Se deben utilizar guantes para protección personal en especial

con el Bromuro de Etidio que se intercala entre las bases del DNA
provocando mutaciones de origen canceroso y para evitar
contaminar las muestras.
2. Realizar con mucho cuidado todos los pasos de la extracción de
ácidos nucleicos ya que cualquier error se refleja en el gel de la
electroforesis.
3. Tener precaución de no contaminar la muestra.
4. Trabajar siempre sobre un mesón limpio.
5. Utilizar una punta de micropipeta por cada muestra en cada paso
para evitar contaminación entre muestras.
6. Las condiciones de electroforesis para correr un gel varían y de
acuerdo a ello también los resultados, por ejemplo entre más
voltaje, más rápido avanza la muestra por el gel, al tener mucho
voltaje queda una mancha en el gel es por eso que se utiliza una
intensidad baja para correr los geles; entre más bajo el voltaje
más lento avanza la muestra más uniforme queda.
 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Utensilios en general:

• Espátulas • Termo
• Mortero • Hielo
• Pinzas • Tubos Eppendorf
• Bisturí • Micropipetas
• Pistilos • Puntas micropipetas
• Gradilla • Toalla nova
• Guantes • Mondadientes

Equipos:

• Centrífuga TA • Fuente de poder

• Centrifuga Refrigerada • Transluminador UV
• Cámara de electroforesis • Campana de extracción
horizontal

Reactivos en General:

• Solución de Chomczynski • Cloroformo Isoamilico

(Guanidino Tiocianato) (24:1)
• Solución de Chomczynski • Alcohol etílico absoluto
c/Fenol (Guanidino
Tiocianato) • Alcohol etílico 95%

• Agua desionizada estéril • Alcohol isopropanol

• Agua desionizada • Alcohol etílico 75% (DEPC)

estéril/DEPC • Marcador de peso
(pirocarbonatos de dietilo) GeneRuler 1kb DNA
Ladder.
 • Acetato de Sodio 3M pH 5.2 • Gel Red
• Agarosa • Buffer de carga 6X
• Buffer TAE 1X

Otros:

• Nitrógeno Liquido (-196°C)

• Medio LB Ampicilina (100 mg/ml)
• Escherichia coli cepa DH5α, Pgem-T Easy GRX
• Placas de agar LB ampicilina (100 mg/ml)

METODOS

Protocolo de extracción de DNA Genómico con solución

Chomczynski

La solución Chomczynski tiene como función desnaturalizar

proteínas y romper la membrana plasmática. Para DNA este adquiere un
pH básico no superior a 11 ya que si supera ese valor el DNA pierde
estabilidad y se desnaturaliza. Por otro lado se usa alcohol absoluto con
el fin de precipitar la molécula de DNA ya que hace que este pierda
contacto con las moléculas de agua que lo rodean y queda libre de
impurezas producto de este aislamiento y precipitación. El alcohol
isopropanol no solubiliza algunas sales que a veces continúan con el
DNA así que es recomendable usar el etanol absoluto.

Reactivos exclusivos:

• Solución de Chomczynski (Guanidino Tiocianato)

• Cloroformo
• Alcohol etílico absoluto
• Alcohol etílico 95%
 • Agua desionizada estéril

Método:
1. Pulverizar el tejido (100 mg. aprox. Para cada tubo) en un mortero
con la ayuda de nitrógeno líquido (-196°C).
2. Homogeneizar 100 mg de tejido en 1 ml de reactivo Chomczynski.
A cada uno de los tubos Eppendorf, la finalidad al utilizar este
tipo de solución es hacer lisis de las membranas celular y nuclear
rompiendo los enlaces más débiles (no covalentes) de las
membranas y así facilitar la obtención y posterior extracción de
ADN. La solución de Chomczynski es un agente desnaturante que
provoca la pérdida de la estructura tridimensional del ADN (2).
3. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a T.A. Luego de esto en
cada uno de los tubos se logra apreciar 2 fases. La fase superior
contiene proteínas y organelos, incluido el ADN, mientras que en
la fase que precipitó al fondo del tubo, se encuentran elementos
de alto peso molecular.
4. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo; agregar 200 μl de
cloroformo, cerrar muy bien, agitar vigorosamente. Centrifugar a
10.000 g durante 10 minutos a T.A. Aplicamos el cloroformo con el
objetivo de limpiar y purificar (4) el ADN de las proteínas, ya que el
ADN no es soluble en cloroformo (3), pero en cambio las proteínas
y los lípidos si son solubles, y como el ADN tiene menor peso
molecular queda en suspensión y de esta manera lo podemos
separar.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, agregar 500 μl de
alcohol etílico absoluto.
6. Mezclar por inversión e incubar por 1-3 minutos a T.A. de modo de
buscar una buena interacción entre los componentes. El producto
de la mezcla se aprecia como pequeñas fibras de algodón blanco
que flotan en el tubo, ya que el alcohol lo deshidrata e inicia la
sedimentación. La idea es que sedimente todo el contenido de
ácidos nucleicos.
7. Centrifugar a 4000 g durante 2 minutos a T.A. para obtener un
sedimento que contenga lo ácidos nucleicos.
8. Lavar en alcohol etílico 95% mediante aplicación de un spin.
Repetir este paso. Alcohol etílico 95% (5% de agua) para lavar el
pellet y eliminar las sales y elementos copurificantes (95% de
etanol provoca que el ADN no solubilice.
9. Secar el pellet a T.A.; resuspender en 50 µl ADESI estéril.
10. Guardar a -20°C.
 Protocolo de extracción de DNA Plasmidial por lisis alcalina

Los plásmidos son moléculas pequeñas de DNA circular muy

comunes en bacterias, se replican de forma autónoma e independiente
del genoma bacteriano (6). Constituyen una herramienta fundamental
en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que son usados como
vectores para introducir en ellos genes de interés y así conseguir su
amplificación natural (7).
El desarrollo de técnicas de extracción de DNA plasmidial consta de
los siguientes pasos: el crecimiento del cultivo bacteriano; segundo, la
cosecha y lisis de las bacterias; y finalmente, la purificación del material
plasmídico. Muchos de los plásmidos que se usan actualmente se
pueden replicar en alto número mediante su inserción en Escherichia
coli (6), luego pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de
cultivos que se dejan crecer en medio de cultivo selectivo estándar
(medio LB). Después del cultivo las bacterias son cosechadas por
centrifugación y lisadas por alguno de los métodos que se han reportado
para este fin. La elección del método adecuado para la lisis depende del
tamaño de la construcción, la cepa de E. coli empleada como hospedero,
y la técnica elegida para la subsiguiente etapa de purificación del
plásmido (6).
El objetivo de este práctico es el aislamiento y purificación de un
DNA plasmídico con resistencia a ampicilina, PGem-T easy (10), que
contiene un fragmento de cDNA correspondiente a un gen que expresa α
Tubulina introducido en la cepa DH5-α de Escherichia coli para lo cual el
método de extracción de DNA plasmidial fue basado según protocolo de
extracción y purificación por lisis alcalina y el uso del detergente SDS
(dodecilsulfato sódico) a partir del cultivo de E. coli cepa portadora de la
construcción de 3215 pb. (10).
El tratamiento con detergentes en medio alcalino rompe la
estructura celular y permite la liberación del DNA puesto que en estas
condiciones el DNA se desnaturaliza (pierde la estructura de doble
hélice). La estructura de las proteínas, se ve afectada también por el pH
alto. Si después de la lisis, se neutraliza el medio, el DNA cromosomal
forma agregados insolubles con las proteínas y estos complejos pueden
ser separados por centrifugación mientras que el DNA de los plásmidos,
permanece estable en la solución (11). Esto se debe a que la estructura
del DNA plasmídico es mucho menos compleja que la del ADN
cromosomal, además posee menor peso molecular, por lo que
neutralizar el medio, lo renaturaliza en forma reversible adoptando una
estructura estable en medio acuoso (pH 8) (11).
Reactivos exclusivos:

• LB líquido: 10gNaCl, 5g Yeast Extract, 10g Tristona

• GTE: 50 mM Glucosa, 25 mM Tris-HCL ph 8.0, 10mM EDTA
• NaOH/SDS: 0,2 N NaOH, 1% SDS, preparar fresco cada vez
• Acetato de Potasio 5M: 29.5 mL ácido acético glacial, KOH en
grano hasta pH de 4.8, H2O hasta 100 mL, Guardar a temperatura
ambiente, no esterilizar
• RNAsa
• 5M LiCl2
• Alcohol Isopropanol
• 70% Etanol
• ADESI (agua desionizada estéril)

Método
1. Centrifugar el cultivo de E. coli DH 5-alfa portadora de la
construcción en LB líquido (10gNaCl, 5g Yeast Extract, 10g
Triptona) a 12.000 rpm por 3 min.
2. Remover el sobrenadante (medio de cultivo) y mondadientes lo
que reduce la posibilidad de contaminación por fragmentos de la
pared celular del huésped que ha sido usado con el propósito de
generar un sustento al cultivo (9).
3. Resuspender el pellet con 100 µl del amortiguador GTE a 4°C (25
mM Tris-HCL ph 8.0, 10mM EDTA).
4. Agregar las RNAsa e incubar 5 minutos a temperatura ambiente,
de esta forma se elimina RNA presente en la muestra (6).
5. Agregar 200 µl NaOH/SDS, (0,2 N NaOH, 1% SDS) y mezclar, este
es el detergente responsable de la lisis celular.
6. Dejar en hielo durante 5 minutos ya que la temperatura es
responsable en gran medida de la degradación del DNA (8).
7. Agregar 150 µl Acetato de Potasio (29.5 mL ácido acético glacial,
KOH en grano hasta pH de 4.8, H2O hasta 100 mL) y mezclar para
producir la unión de las hebras de DNA y la remoción de
contaminación.
8. Dejar en hielo durante 5 minutos.
 9. Agregar 450 µl LiCl2 a temperatura ambiente y mezclar el uso de
esta sal ayuda a la precipitación del DNA (7).
10. Dejar en hielo durante 5 minutos.
11. Centrifugar a T. A por 3 min a 12.000 rpm. Recuperar solo el
sobrenadante dado que el precipitado corresponde a los restos
celulares como proteínas.
12. Llenar el tubo con Isopropanol para lograr la precipitación del
DNA.
13. Centrifugar por 3 minutos a T.A. a 12.000 rpm.
14. Lavar el pellet con 1ml etanol 70% lo que permite además eliminar
restos de sales u otros contaminantes (11).
15. Volver a centrifugar como en el paso anterior y eliminar el
sobrenadante.
16. Secar el pellet de DNA a T.A. y resuspender en 50 µl de
ADESI para guardar a -20°C.

Protocolo de extracción de RNA con solución Chomczynski

La extracción del RNA también se realiza a partir de un

homogenizado, en presencia de Guanidino Tiocianato, por adición de
fenol y cloroformo, seguido de agitación vigorosa y centrifugación, el
RNA aparece en la fase acuosa superior. A partir de ella se obtiene el
RNA por precipitación con etanol isopropanol. En el caso del ARN la
solución de Chomczynski debe poseer un pH ácido, ya que sobre pH 7,5
el ARN se hidroliza.
Existen otras técnicas más simples que no requieren dicha
extracción, como el empleo de soluciones de urea y cloruro de litio, que
también inactivan RNAsas y solubilizan el RNA. A la hora de trabajar con
RNA, deben tomarse las máximas precauciones para evitar
contaminaciones con RNAsas y la degradación del RNA. Es importante
trabajar en un ambiente libre de RNAsas, y debe tratarse todo el
material para su eliminación. Deben usarse guantes a lo largo de todo el
proceso e intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la
degradación del RNA durante la manipulación. Con el fin de obtener los
mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de
partida. Si es necesario acumular muestra, congelar las muestras tras su
recogida en nitrógeno líquido y almacenarlas a -70 ºC.

Reactivos exclusivos:
  Solución de Chomczynski
 Fenol Cloroformo
 Alcohol isopropanol
 Alcohol etílico 75% (DEPC)
 Água desionizada estéril/DEPC (pirocarbonatos de dietilo)

Método
1. Introducir en un tubo Eppendorf hasta un máximo de 100mg de
material vegetal (por cada 100mg de material se agregan 1ml de
reactivo). Tras sucesivas congelaciones (con la ayuda de nitrógeno
líquido -196°C). Es muy importante que el material este
constantemente congelado ya que el RNA es más inestable que el
DNA; por lo mismo no se utiliza mortero y la molienda se lleva a
cabo directamente en el tubo Eppendorf con la ayuda de un pistilo.
Otro elemento importante que debe ser tomado en cuenta es que
para garantizar un triturado ideal, es recomendable nunca sacar el
pistilo una vez dentro del tubo.
2. Homogenizar el tejido en 1 ml de Chomczynski (fenol y tiocianato
de guanidina). Incubar las muestras homogeneizadas por 5
minutos en hielo, esto porque con una Tº superior a 4Cº el RNA se
desnaturaliza.
3. Remover el material insoluble del homogenizado por
centrifugación a 12000 g por 10 minutos a 4 ºC. Nótese que para
realizar esta centrifugación debe ser estrictamente realizada e un
centrifuga refrigerada. Transferir la fase acuosa a un tubo
eppendorf nuevo.
4. Agregar 200 µl de cloroformo. Tapar bien y agitar vigorosamente
por 15 segundos. Incubar durante 3 minutos en hielo y centrifugar
a 12000 g por 15 minutos a 4 ºC. Repetir este paso si el material
está muy sucio.
5. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo, precipitar el RNA con
500 µl de isopropanol, incubar las muestras en hielo por 10
minutos; centrifugar a 12000 g por 10 minutos a 4 ºC.
6. Remover el sobrenadante, lavar el pellet con 1 ml de etanol 75% y
centrifugar a 7500 g por 5 minutos a 4 ºC.
7. Secar el pellet a T.A. y disolver el RNA en 50 µl agua con DEPC.
8. Guardar RNA a -80°C.
 Electroforesis

Método
1. Preparar una solución de agarosa al 1% (p/v) buffer TAE (Tris
Acetato EDTA) 1x (1 gramo de agarosa por 100 ml de buffer TAE),
que logra mantener el pH estable. Este gel tiene como función
retardar el paso de las moléculas al actuar como filtro de ácidos
nucleicos de modo de separar las moléculas por fuerza de roce
según su peso molecular tras someterlas a un campo eléctrico. El
EDTA es un quelante de cationes, captura los magnesios libres
debido a que es un cofactor.
2. Calentar en el microondas la solución hasta que esta se
homogenice, la temperatura en un factor importante en este
proceso. El punto de fusión de la azarosa es de 65ºC
3. Cuando se tenga una solución liquida agregar 2 µl de GEL RED por
cada 100 ml de solución, Gel Red es una tinción fluorescente de
ácidos nucleicos diseñada para reemplazar al Bromuro de Etidio
(BE) en la tinción de dsDNA, ssDNA o RNA en geles de agarosa,
poliacrilamida y geles prefabricados. Este fluoróforo posee la
característica de ser muy estable en el tiempo, no mutagénico ni
citotóxico y seguro para el medio ambiente. No representa un
riego directo para la salud, incluso puede ser directamente
desechado en el drenaje.
4. Llenar la cámara con el gel con una solución de buffer TAE hasta
cubrir por completo el gel de agarosa.
5. En una lámina de papel parafilm colocar 2 µl de buffer de corrida
6X (por cada 6 µl de muestra agregar 1 µl de buffer, en el caso de
este práctico en particular, se le agregaron 2 µl de buffer ya que
éste estaba más diluido) por cada una de las muestras que se van
a cargar, el buffer contiene Azul de Bromofenol que es un
indicador de pH y Xilen Cianol que es el colorante del buffer, que
permiten identificar el frente de corrido en el gel de
agarosa.además entre sus componentes tiene glicerol, que le
proporciona peso a los ácidos nucleicos para que precipiten al
fondo del pocillo.
6. Posterior a esto se toman 5ul de la muestra que contiene el ADN y
depositar sobre el Buffer de carga y succionar todo el componente
que se forma en un conjunto (el Buffer de carga mas la muestra de
ADN) y se deposita sobre un carril del gel de la electroforesis.
7. Cargar los carriles con ADN, siendo primer carril correspondiente a
1ul de un marcador de peso GeneRuler 1kb DNA Ladder. Este es
ideal para determinar el tamaño de DNA de doble cadena que va
desde 50 pb. hasta 1 kb. de modo de obtener una referencia al
momento de la lectura. El resto de los carriles son cargados con
las muestras en si.

8. Para finalizar el proceso de extracción de ADN se corre el gel por

20 minutos a 100 volts y 250mA, donde las moléculas con carga
positiva (cationes) migran hacia el polo captador de cationes
(ánodo) y las moléculas con carga negativa (aniones) migran hacia
el polo receptor de cargas negativas (cátodo); que son las
condiciones más estables para que el gel corra correctamente,
pasado este tiempo el gel se debe visualizar en un
transluminador de luz UV.
 RESULTADOS Y

DISCUSIÓN

En la siguiente imagen podemos observar el resultado de la

electroforesis correspondiente al grupo N°1, el gel se compone de 20
carriles, siendo los dos primeros de cada columna (1 y 11) los
indicadores de carga y el resto de los carriles corresponden a los ácidos
nucleicos de todos los compañeros del práctico.

1 2 3 4 5

1 6 7 8 9 1
0
 El primer carril de cada fila corresponde a los marcadores de peso
de 10.000pb pero los podemos observar un tanto menos corridos de lo
que se esperaba y sin gran diferencia en los marcajes aun así estos son
los que mejor representan la corrida de electroforesis.
El numero tres corresponde a las dos extracciones de DNA
genómico del grupo 1 que fueron extraídas desde champiñón.
El numero 5 corresponde a las dos extracciones de DNA genómico
del grupo 2 que fueron extraídas desde plantas de tabaco cultivadas in
vitro.
El numero 7 corresponde a las dos extracciones de DNA genómico
del grupo 3 que fueron extraídas desde plantas de tabaco cultivadas in
vitro.
El numero 9 corresponde a las dos extracciones de DNA genómico
del grupo 4 que fueron extraídas desde plantas de tabaco cultivadas in
vitro, estas son las extracciones realizadas por nuestro grupo.
El numero 10 corresponde a las dos extracciones de DNA genómico
del grupo 5 que fueron extraídas desde plantas de tabaco cultivadas in
vitro.
De las muestras visualizadas en el gel, todas presentan
contaminación, el marcador de peso no está lo suficientemente claro
como para establecer un patrón, esto puede ser causa de poco tiempo
de corrida del gel a un muy alto voltaje.
Las bandas que se presentan en el fondo de los pocillos pueden
pertenecer a DNA degradado producto de todo el proceso de extracción,
los carriles presentan bandas inespecíficas pueden ser producto de
contaminaciones por fenoles, siendo visibles en la electroforesis, otro
motivo es que en muestra cargada también se encuentren fragmentos
de RNA no degradado completamente los que al igual pueden se
visualizan en la electroforesis.
En ninguno de los carriles de DNA genómico es posible distinguir si
existe DNA producto de la extracción. Las bandas visibles en la parte
superior de los pocillos, son signos de contaminación, que puede
deberse a errores de manipulación o un mal deposito de la muestra
sobre estos.
Los carriles rotulados como 2, 4, 6 y 8 corresponde a la extracción
de DNA plasmidial extraído desde la cepa DH5-Alfa de E. Coli con la
construcción de PGem-T easy y alfa-tubulina donde se puede observar
que en el carril 4 y 8 no hay presencia de contaminantes, posiblemente
se trata de DNA genómico, esto no ocurre así en los carriles 2 y 6 donde
a la altura de los marcajes de peso molecular cercanos a los 10.000 pb.
Se aprecia una línea tenue que evidencia la presencia de contaminación
por DNA genómico.
Como se había mencionado anteriormente los carriles 2, 4, 6 y 8
presentan contaminación en sus pocillos al igual que la mayoría de las
cargas en el gel lo que se podría atribuir a deficiencias en la
manipulación por parte del personal que efectuó el procedimiento,
podría deberse también a contaminación por mala ejecución del
protocolo de extracción del material genético.
Los carriles cargados con DNA plasmidial tienen una alta
concentración de material alrededor de los 200 a 250 pb. lo que indica
que el material genético fue degradado, se determina la posibilidad de
esta por la ausencia de material genético en los rangos de 3000 a 3500
pb.
Las muestras realizadas por el grupo 4, presentan claros signos de
contaminación, no se distinguen las bandas de extracción, presentan
una clara línea blanca en el fondo propia de una degradación del
material genético, pero en el centro de la barra de corrido hay otras
líneas que indican signos de contaminación por fenoles lo que indica un
error de procedimiento o una mala aplicación de los reactivos.

En cambio los carriles que presenta demasiada fluorescencia,

puede deberse a una contaminación por proteínas, o simplemente por la
mala aplicación de algún reactivo u error de procedimiento.

Muestra 1 Muestra2 170mg/µl

 128mg/µl

260/280 1,71 260/280 1,89

230/260 0,64 230/260 0,92

260/320 0,033 260/320 0,060

Conclusiones

Luego de terminado el práctico se puede concluir lo siguiente:

• Es posible la extracción de ácidos nucleicos de células vegetales a
través del método de Chomczynski, el cual nos detalla todos los
pasos y reactivos a utilizar.

• Los ácidos nucleicos no son solubles en cloroformo, por lo que este

puede ser utilizado para desintegrar las proteínas y lípidos que
acompañan al DNA para que este quede libre de contaminación.

• El etanol absoluto deshidrata el ADN, asiéndolo visible como

pequeñas fibras de algodón que al dejarlo reposar comienzan a
sedimentar, en cambio el alcohol de 95% tiene como objetivo
lavar el pellet y eliminar las sales.

• El gel de agarosa nos permite separar las moléculas de acuerdo a

su peso molecular, tras ser sometidas a un campo eléctrico,
debido a la porosidad del gel, es por ello que si tenemos moléculas
de gran tamaño debemos utilizar bajas concentraciones de
agarosa.

• Las moléculas de ácidos nucleicos tras ser sometidas a un campo

eléctrico son separadas por carga; las positivas migran al polo
negativo y las cargas negativas migran hacia el polo positivo.

• Para realizar la extracción de DNA plasmidial es necesario realizar

lisis alcalina. Este método explota las diferencias en las
propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA
plasmídico y el DNA cromosómico. La alcalinización con NaOH en
presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca
la lisis de la pared celular, la desnaturalización del DNA
cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos.
Los plásmidos se ven menos afectados por su pequeño tamaño y
estructura superenrollada. La aplicación de fenol y cloroformo
provoca la precipitación de las proteínas. Los agregados insolubles
de proteínas y DNA cromosómico se separan por centrifugación
del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva
mayoritariamente su estructura nativa. La utilización del RNAsa o
ribonucleasa se realizó para no tener presencia de ARN, ya que
esta enzima degrada el ARN en componentes más pequeños.

• En el caso del ARN es mucho más complicado que en el ADN

realizar el protocolo de extracción, ya que siempre hay que
mantener la muestra en frio para evitar la degradación de este, en
 este caso la lisis celular se realiza con un detergente acido y se
sigue el mismo procedimiento que para DNA.

Referencias

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Moleculares.
2. Luque José Herráez Ángel Biología Molecular e Ingeniería Genética tema 13 año 2000.

3. J. Clàriaa, M. Sánchezb y R. Queraltc Herramientas básicas de análisis genético.

4. M. Somma Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en
Muestras de Alimentos Sesión nº 4 Extracción y Purificación de ADN
5. Gene X-Press 19 de junio de 2009
6. Prácticas Biología Molecular, Técnicas básicas en el laboratorio de biología Molecular.
Daniel Yero Corona, Yamilé López, Instituto Finlay.
7. Purificación de ADN plasmídico y electroforesis del mismo en gel de agarosa, José Luís
Caballero Repullo, Enriqueta Moyano, Juan Muñoz Blanco, Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular.
8. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN, Blgo. Carlos Augusto
Yábar Varas División de Biología Molecular Centro Nacional de Salud Pública Instituto
Nacional de Salud, Lima-Perú
9. Purificación y análisis de DNA cromosómico bacteriano, Gabriel Dorado Pérez,
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Univer
10. Technical Manual Promega Corporation, Madison, WI., The pGEM(R)-T Easy Vector has
been linearized with EcoRV at Base 60 of this sequence (indicated by an asterisk *) and a
T added to both 3' -ends.
11. GENÉTICA MICROBIANA, Capítulo 4, MÉTODOS DE AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE
LOS ACIDOS NUCLEICOS, Lojo M.M.

Bibliografía

• Normas de seguridad – laboratorio de química y física, universidad de Pablo de Olavide

• Normas de Seguridad en el Laboratorio - Anatomía patológica y citológica.

Citopreparación. Seguridad.
• Riesgos de uso de sustancias químicas - Efectos tóxicos. Riesgo biológico.Anatomía
patológica. Responsabilidad legal
• http://www.cienciafacil.com/paginanormas.html