PRÁCTICA 1ª DE CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA

EL MICROSCOPIO ÓPTICO. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS ANIMALES

EUCARIOTAS AL MICROSCOPIO ÓPTICO. RECONOCIMIENTO DE ORGÁNULOS
EN MICROGRAFÍAS ELECTRÓNICAS.

A) Lectura y comentario sobre el apartado “PRÁCTICAS” DE LA GUÍA

DOCENTE DEL AÑO EN CURSO.

B) Explicación del fundamento y manejo del M.O.

C) Vídeo explicativo del M.O.

D) Observación de células animales

1.- Utilizando un rascador, raspar células de la mucosa bucal.

2.- Extender sobre un portaobjetos limpio y secar al aire.

3.- Teñir consecutivamente con las tres soluciones del reactivo Panóptico, durante 10
segundos en cada una de ellas, escurriendo, en cada caso, el exceso de colorante en un papel
de filtro.

4.- Lavar con agua destilada y dejar secar.

5- Observar con objetivos de 10x primero, y después con objetivo de 40x.

E) Reconocimiento de Orgánulos y estructuras celulares (Células animales):

Núcleo, nucleolo, membrana nuclear, poros nucleares, cromatina (eucromatina,
heterocromatina), RER, REL, Golgi, lisosomas, mitocondrias, centriolos, cilios,
microvellosidades.

Micrografías recomendadas del álbum :1-10, 12-20, 24-26, 31-33.

Atlas recomendado: Kühnel. Atlas color de Citología e Histología (2005)

 El Microscopio Óptico Compuesto

• Las partes del Microscopio

• La Resolución y la Ampliación
• El Efecto de la Iluminación en la Resolución
• Controlar el Nivel de la iluminación sin afectar la resolución
• Para Usar tu Microscopio Efectivamente

El instrumento “básico” en histología es el microscopio óptico (o de luz) compuesto.

Los primeros microscopios (hechos por Antón Van Leeuwenhoek en el siglo XVII)
tenían sólo una lente, y eran “simples”, pero todos los instrumentos modernos tienen por
lo menos dos lentes y son “compuestos”. El principio operador básico del microscopio
compuesto es que la imagen formada por la primera lente es aumentada en la segunda,
así proporciona una mayor ampliación que la que se alcanzaría usando una lente.

• Las Partes del Microscopio

El microscopio óptico compuesto tiene varias partes principales, y éstas son comunes a
todos los microscopios, a pesar de la marca o el modelo. El cuerpo (llamado a veces el
soporte) sostiene al resto de las partes, y en algunos casos incorpora los filtros y el
equipo fotográfico. La platina es la parte móvil que sobresale del cuerpo, y en la que se
coloca la preparación. En la mayoría de los instrumentos modernos la platina se mueve
hacia arriba y hacia abajo para lograr el foco y las lentes permanecen fijas en el lugar,
aunque esto no es siempre así; en algunos casos (especialmente los más antiguos) la
platina es fija y las lentes se mueven. Debajo de la platina está el sistema de iluminación,
que se compone de una fuente de luz y una lente condensadora. Esta última es un
conjunto de lentes que, al ser atravesada por el rayo de la fuente de luz, lo refracta en un
estrecho rayo. Debido a que la muestra debe ser iluminada uniformemente y con el brillo
máximo, la condensadora concentra y estrecha el rayo de luz de la fuente ya que, de otro
modo, mucha de su intensidad sería malgastada iluminando el fondo de la platina y no la
muestra. Incorporado en el ensamblaje de la condensadora hay un diafragma de iris.
Puede haber un segundo diafragma (llamado el diafragma de campo) colocado entre la
fuente de luz y la condensadora; éste se omite a veces en objetivos de bajos aumentos.
Hay una tendencia por parte de los estudiantes, al comenzar a trabajar con el
microscopio, a cerrar estos diafragmas, para limitar la luz que entra en la condensadora,
pero eso se debe evitar.

AMBOS, LOS DIAFRAGMAS DE CONDENSADORA Y DE CAMPO, SE DEBEN ABRIR

COMPLETAMENTE CUANDO SE USA EL MICROSCOPIO

Cerrarlos tendrán como resultado disminución de la resolución y como consecuencia

no se ve bien el objeto. Luego se comentará más acerca de la resolución y el uso
apropiado.

En los microscopios modernos se montan de tres a cinco lentes objetivos en un eje

que gira llamado el “revolver”. Estos son las lentes que forman la imagen primaria del
objeto, y que proporcionan la mayor parte de la ampliación. Más que cualquier otra
consideración, la calidad de estas lentes determina la calidad del microscopio, y los
instrumentos más costosos ponen la mayor parte de su precio en la calidad de su
objetivo. Los objetivos llevan inscritos un conjunto de números, que indican su
ampliación (10X, 40X, etc.), y un número ( típicamente menos de 1.0 pero
ocasionalmente 1.2 o 1.3 ), llamado la abertura numérica (AN). El AN es de gran
importancia en la resolución completa de la lente. A más alto valor de AN, mejor la
resolución, como veremos más tarde.

• La Resolución y la Ampliación

La imagen primaria se forma cuando la muestra se coloca en el punto focal de la

lente objetivo del tubo del microscopio. En instrumentos más viejos, esto era
literalmente un “tubo” recto. Actualmente, el tubo posee un prisma, que refleja la luz
internamente y permite el uso de oculares angulados, que es mucho más cómodo de
usar. No obstante, el término antiguo “tubo” es usado todavía para referirse a la
trayectoria óptica de la imagen primaria, y la longitud de tubo se ha estandarizado, en
instrumentos modernos, a un total de 160 mm.

La imagen primaria es aumentada secundariamente por las lentes oculares, que

se apoyan en los oculares (10X, 5X, etc.)

LA AMPLIACIÓN FINAL DE UNA IMAGEN ES EL PRODUCTO DE LAS

AMPLIACIONES INDIVIDUALES DEL OBJETIVO Y LAS LENTES OCULARES:

AMP final = AMP obj X AMP ocl

La consideración más importante a la hora de escoger un microscopio es su

resolución. La resolución ( R ) es la habilidad de un instrumento de discriminar entre dos
puntos en una muestra. En los mejores microscopios ópticos, está cerca de 0.2 micras (µ)
. Si dos puntos claros son separados por esta distancia o más, ellos pueden ser vistos
como tales. La fórmula para la resolución de un microscopio es:

R = λ / 2 AN

Donde λ (lambda) es la longitud de onda de luz y AN es la abertura numérica

de la lente objetivo. Se deben fijar en varias cosas acerca de esta ecuación. Ante todo,
debe ser obvio que a más alta la AN, mejor será la resolución, porque R será más
pequeño. En segundo lugar, debe ser también obvio que a más corta la longitud de onda,
mejor la resolución. Lograr la resolución alta es una cuestión de obtener la AN tan alta
como sea posible y la longitud de onda de la luz tan baja como sea posible. Tener en
cuenta también que la ampliación no tiene nada que ver con resolución. Usted no mejora
la resolución con objetivos de mayores aumentos, a menos que el AN de la lente sea más
alto.

• El Efecto de la Iluminación en la Resolución

La longitud de onda se ha mencionado, y esto nos trae al segundo punto acerca

del uso apropiado del microscopio óptico.

EL SISTEMA DE ILUMINACIÓN DEBE SER RESULTADO DEL BRILLO TOTAL, Y EL FILTRO

AZUL SIEMPRE SE DEBE USAR

Hay una tendencia a bajar la iluminación, y quitar el filtro. La razón usual es

que la luz es demasiado “brillante”. Bajar la intensidad de la iluminación afecta, más que
al brillo, a la resolución.
 Todos los microscopios ópticos poseen una bombilla incandescente de filamento de
tungsteno para producir la luz. Estas son simplemente como las bombillas usadas en
hogares, y funcionan pasando una corriente por un alambre de tungsteno y calentándolo.
Como en cualquier bombilla, el filamento caliente resplandece, el resplandor es
combinación de luz y calor, y el calor y la luz son realmente la misma cosa,
(electromagnéticamente hablando). El filamento emite desde longitudes de ondas lejanas
infrarrojas (en otras palabras, el calor) hasta las cortas, el violeta, y por tanto abarca la
mayor parte del espectro visible. En la distancia visible de la luz, las longitudes de ondas
(λ) más largas son las correspondientes al rojo del espectro, y las λ del violeta son las
correspondientes a las más cortas. Ahora, cuando la corriente que fluye por el alambre se
reduce, cambia el espectro de la emisión hacia las longitudes de ondas más largas.
Proporcionalmente a la disminución de la luz cambia hacia las longitudes de ondas más
infrarroja, roja, naranja y amarilla. Este cambio causa una pérdida de la resolución, a
causa de la relación expresada en la ecuación dada arriba. Para lograr el máximo
provecho el filamento debe ser blanco caliente y el filtro azul, método para no
seleccionar la mayor parte de la luz roja y amarilla de longitud de onda larga. Además de
aumentar la resolución, el filtro azul es necesario para ver apropiadamente los colores
“normales” con la mayoría de las tinciones biológicas, especialmente hematoxilina-
eosina.

• Controlar el nivel de la Iluminación sin afectar la Resolución

La manera apropiada de reducir la intensidad de la iluminación sin afectar la resolución

es usar los Filtros neutros de Densidad (ND). Estos se venden, de varios tamaños, en
tiendas de fotografía, por unos pocos euros, y se llaman “filtros de parada” (“stop”)
como los de un objetivo de cámara fotográfica. Un “one stop ND filter” reducirá la luz a
un 50% sin afectar la longitud de onda. Un par de filtros (uno “one stop” y otro “half
stop”) reducirá la luz un 75% (50%+25%) y te proporcionará una gran variedad de
posibilidades en el control de la intensidad y permitirá obtener lo mejor de tu
microscopio, que para eso lo tienes.

• Para usar tu Microscopio Efectivamente, considera los pasos siguientes:

1. Enciende la luz
2. Pon el filtro azul y (si la luz es demasiado brillante para tu confort) pon el filtro
ND si lo tuvieras.
3. Coloca un portaobjeto en la platina, y lo enfocas como mejor puedas con la lente
de menor aumento que tengas en el microscopio.
4. Cierra el diafragma de condensadora hasta la mitad, hasta que veas un círculo
de luz. Mueve la lente condensadora hacia arriba y abajo hasta que los bordes
del diafragma sean visibles nítidamente.
5. Abre el diafragma de condensadora completamente para iluminar
completamente el campo; si hay un granulado al fondo del campo, mueve
levemente la condensadora hacia abajo hasta eliminarlo.
6. El diafragma de condensadora debe estar abierto completamente, todo el
tiempo. Generalmente, moverás la condensadora hacia arriba para las lentes de
mayor aumento y hacia abajo para las de menor.