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3. Utilizacin Industrial de Microorganismos Recombinantes

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3.

Utilización industrial de microorganismos recombinantes

Cultivos a gran escala de microorganismos de interés industrial.

y La fuente de todas las

cepas industriales es el ambiente natural
y Las cepas industriales se

depositan en colecciones de cultivos que sirven como almacén

Microorganismos industriales
y No todos los microorganismos

tienen un uso industrial

y Microorganismos industriales

producen uno o más productos específicos

y Microorganismos industriales

y El microorganismo es

son capaces de producir específicamente y con un alto rendimiento, metabolitos particulares.

modificado antes de ingresar a la industria: se altera genéticamente por mutación o por recombinación

EMPLEO DE MICROORGANISMOS EN PROCESOS INDUSTRIALES: VENTAJAS
y y y y y y

Rápido crecimiento debido a la favorable relación área/ volumen Diversidad metabólica Estabilidad genética Crecimiento en gran escala y separación fácil de productos y sustratos Adaptabilidad a distintos ambientes y condiciones de crecimiento Facilidad de manipulación genética
‡ ‡ Incrementar la productividad Modificar los productos finales

y y

Habilidad para sintetizar enantiómeros específicos Tecnologías limpias

Requisitos de un microorganismo industrial:
y Producir la sustancia de interés y Crecer rápidamente en un medio de cultivo barato y Fabricar el producto en un período corto y Desarrollarse en cultivo puro y en gran escala y Ser estable genéticamente pero susceptible de y y y y

manipulación genética Cultivos que se mantengan durante períodos largos en laboratorio y en planta industrial Facilidad para inocular en grandes fermentadores No debe ser peligroso para el hombre o las plantas y animales de interés económico Posibilidad de retirar fácilmente las células del cultivo

Empleo industrial de microorganismos
y Productores de metabolitos primarios y secundarios y Productores de biomasa y sus constituyentes

y Proteínas y aminoácidos, y Vitaminas, y Ácidos Nucleicos y Polímeros de H de C y Esteres y Huéspedes para la expresión de genes homólogos y heterólogos y Unidades de Biotransformación

Clases de productos industriales
Metabolitos microbianos y Alcohol y Ácido acético y Ácido láctico y Aminoácidos y Vitaminas y Antibióticos y Esteroides y Alcaloides Enzimas Digestión de almidones, lípidos y proteínas Síntesis de antibióticos semisintéticos Células microbianas y Proteína unicelular: levaduras, algas, bacterias y hongos y Células para la inoculación: bacterias fijadoras de nitrógeno, micorrizas, inóculos para la fermentación de lácteos y embutidos

Productos de la microbiología Industrial
Biotransformación Células
Sustrato

Levadura

Producto

Productos de las Células

Enzimas (Glucosa Isomerasa) Antibióticos (Penicilina) Aditivos Alimenticios (aminoácidos)

Alcohol

Productos Químicos (ácido cítrico)

Bioquímica y Microbiología Industrial 2º de Bioquímica Universidad de Zaragoza

Metabolitos
primarios
y Producidos durante el

secundarios
y Sintetizados al final de la fase de

crecimiento activo o fase de crecimiento

crecimiento y en la fase estacionaria

Typical Grow h Curve for a Bacterial Population
100 Log No of Viable cells 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Time in (hrs) Biomass (g/L)

Metabolitos
primarios
y Producidos en paralelo del crecimiento primario

secundarios
y Específicos de un grupo de organismos y No esenciales para el crecimiento y Dependientes de las condiciones de crecimiento y Grupos de estructuras estrechamente ligadas
y Una cepa de Streptomyces produce 32 antibióticos distintos del tipo antraciclina

y Pueden ser sobre-producidos y Aislados del medio de crecimiento

Metabolitos Primarios y Secundarios
Sustrato de crecimiento Sustrato de crecimiento Sustrato de crecimiento

Células

Metabolito Primario

Células

Metabolito Primario

Células

Metabolito Primario

Las células y el metabolito se producen más o menos simultáneamente

Metabolito Secundario Después de producidas las células y el metabolito primario, las células convierten el metabolito primario en uno secundario

Metabolito Secundario Después de producidas las células el sustrato se convierte en un metabolito secundario durante un posterior crecimiento

Cinética de metabolitos primarios

Cinética de metabolitos secundarios

Vía metabólica primaria para la síntesis de aminoácidos aromáticos y metabolitos secundarios con anillos aromáticos
Glucosa Eritrosa Fosfoenol-piruvato Metabolito primario Metabolito secundario

D-arabinoheptulosonato

3-Desoli-7-fosfo

Ansamicina Rifamicina

Ácido shikímico Piocianina

Candicidina Nistatina Cloranfenicol Nocardicina Polimixina Fenilalanina

Ácido corísmico

Ácido antranílico

Triptófano Actinomicina

Ácido prefénico Tirosina Novobiocina

Clasificación de los productos industriales según su uso:
y Productos farmacéuticos de y y y y

origen microbiano Biotecnología microbiana en agricultura Sustancias químicas y aditivos alimentarios Productos químicos comerciales y producción de energía Biorremediación

Productos farmacéuticos de origen microbiano
y Antibióticos y Hormonas esteroides y Insulina y Hormona del crecimiento y Linfocinas y Péptidos neuroactivos y Factores de coagulación sanguínea y Activador del plasminógeno tisular y Vacunas y Anticuerpos monoclonales para diagnóstico y terapia

Biotecnología microbiana en agricultura
y Productos farmacéuticos

veterinarios de origen microbiano y Inóculos radiculares y Ingeniería genética de plantas mediada por microorganismos como portadores genéticos

Sustancias químicas y aditivos alimentarios Sustancias especiales y aditivos alimentarios: y Aminoácidos:
y Glutamato: potenciar el sabor y Aspartato+alanina: modular el sabor de jugos de frutas y glicina: mejorar el sabor de alimentos dulces y Aspartame: endulzar y Lisina y metionina: aditivos nutrivos y Cisteína antioxidante de jugos de frurtas y Triptofano + histidina: evita la rancidez de los alimentos

y Vitaminas: rivoflavina, vitamina B12, vitamina C

Productos químicos comerciales y producción de energía
Productos químicos comerciales de estructura sencilla y bajo valor monetarios
y Etanol (combustible para

motores) y Ácido acético y Ácido láctico y Glicerol

Fermentaciones

y Para procesos industriales, se usan

fermentadores de hasta de 400.000 litros de capacidad y Los fermentadores son construidos de acero inoxidable y tienen una camisa externa la cual puede ser esterilizada inicialmente y enfriadada durante la fermentación.

y Spargers e impellers en el tanque

son usados para la aireación y revolver el contenido. y The vessel may contain various devices for monitoring the environmental conditions within the culture, so that these factors can be controlled to obtain high product yields.

Ejemplos: productos derivados de mo en la industria

Etanol
Producido por : 1- Levaduras * Saccharomyces (a partir de hexosas) * Kluyveromyces fragilis (a partir de lactosa) * Cándida o Pichia (a partir de pentosas) 2- Bacterias* Clostridium (a partir de celulosa) (termófilos, anaerobios) * Zymomonas 3- RecombinantesE.coli recombinante: Introducción de los genes Alcohol deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa de Zymomonas.

Aminoácidos
Principales productores: Bacterias de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium * Mutantes auxotrofas y regulatorias * Mutantes alteradas en la secrecion * Cepas recombinantes

Principales productos: Acido glutámico 600,000
U$S 915 milliones Lisina U$S 500 milliones Fenilalanina U$S 200 millones Aspartato U$S 43 milliones

Toneladas/ año

Vitaminas
Vitamina B12Microorganismos productores: Bacterias de los generos Propionibacterium shermani y Pseudomonas denitrificans. Producción: 150 mg/ L. BiotinaMicroorganismo productor: cepas modificadas (mutantes) de Serratia marcescens.Producción: 150-600 mg/ L. Vitamina B2 (Riboflavina)Microorganismos productores: -hongos (Eremothecium ashby y Ashbya gossypii) Candida sp Bacillus subtilis recombinante Producción: 20 -30 g/ L

PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS

y Los metabolitos secundarios funcionan en los organismos que

los producen como: 
Reguladores del crecimiento  Ionoforos  Defensa frente a otros microorganismos (antibióticos, toxinas,

pesticidas)  Agentes de simbiosis  Efectores de diferenciación  Respuesta a Stress

ANTIBIOTICOS
Desde 1940 se han introducido una gran variedad de moléculas con actividad antibiótico para su uso en medicina y agricultura.
yEn el mercado hay 160 antibióticos en uso por un

valor de 23,000 millones de U$S.

ySe han descrito 6,000 antibióticos de los cuales

4,000 se han aislado de Actinomycetes, y se describen alrededor de 500 antibióticos nuevos por año. Una sola cepa de Streptomyces hygroscopicus produce aproximadamente 200 antibióticos. yMuchos nuevos antibióticos se obtienen por semisíntesis, es decir, por modificación de antibióticos existentes

INHIBIDORES ENZIMATICOS yEj. Estatinas y acido zaragozico yInhibidores competitivos de la HMGCo A reductasa y escualeno ciclasa, por lo cual se emplean como anticolesterolemicos. y Microorganismo productor: Aspergillus terreus (hongos)
yEj. Acido clavulanico (inhibe

penicilasas) yEj. Acarbosa: Inhibidor de la glucosidasa intestinal. Disminuye la hiperglucemia y también la síntesis de triglicérido en los tejidos adiposos, el hígado y las paredes intestinales de individuos obesos, diabéticos o con trastornos de la lipemia. yMicroorganismo productor: Actinoplanes (actinomycetes)

BIOPESTICIDAS Se aislaron en un principio como agentes antibióticos y luego, en las sucesivas investigaciones, surgieron nuevos usos o usos mas específicos. jFungicidas: kasugamycin, polyoxins, anfotericina jInsecticidas: toxina de Bacillus thuringiensis jHerbicidas: bialaphos j antihelminticos: avermectinas jReguladores del crecimiento de plantas: giberellinas jInmunosupresores: ciclosporinas jAgentes antitumorales: mitomycin, bleomycin j Antivirales: inhibidores de la transcriptasa reversa y de la proteasa de HIV (ritonavir, nevirapine, etc)

EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS COMO VECTORES DE GENES HETEROLOGOS

Los principales huespedes que se emplean para la produccion de proteinas recombinantes son E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polimorpha y Aspergillus niger.
y

y y y y

Quimosina recombinante (Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura). Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos. Insulina humana (en E.coli) Hormona de crecimiento humana (en E.coli y levaduras) Vacuna Hepatitis (en levaduras ) Farmacos (interferon 2 alfa)

EMPLEO DE PLANTAS TRANSGENICAS CON GENES BACTERIANOS CLONADOS (bt)

‡MAIZ Y ALGODON ´BTµ

Uso de Microorganismos en biotransformaciones

Reacciones Quimicas realizadas por microorganismos: Oxidaciones
* Hidroxilacion : introduccion de grupos HO con regio y estereo especificidad. Ej obtencion de esteroides Produccion de 11OH derivados y eliminacion de cadena lateral (cortisol, prednisolona, testosterona, etc) * Epoxidaciones * Desaturaciones * Rupturas oxidativa de anillos

Reducciones Reacciones hidroliticas Condensaciones

Ingenieria metabolica: ruta artificial para la obtencion de hidrocortisona en levaduras
Artificial pathway for the biosynthesis of the hydrocortisone as rebuilt in yeast
y

The enzymes in red come from human, bovine and plant organisms and their genes were engineered before introduction in yeast cells. Those in blue are original yeast enzymes whose genes were modified to change their expression levels. The green pathway is the main pathway for hydrocortisone production, the red one corresponds to controlled side reactions and the yellow one to secondary biosynthesis pathway coexisting with the major green one.

y

y

PRINCIPALES ETAPAS DE UN PROCESO DE PRODUCCION
y Búsqueda y selección de microorganismos (´Screeningµ) y Organismos mesófilos y Organismos extremófilos SI BIEN LOS MO SON BUENOS PRODUCTORES DE UNA GRAN VARIEDAD DE COMPUESTOS, LOS PRODUCEN EN BAJA CANTIDAD, POR LO QUE SE REQUIERE : y Aumentar los rendimientos mediante: y Obtención de mutantes (técnicas de mutagénesis, recombinación genética, fusión de protoplastos) y Empleo de tecnología de DNA recombinante (para aumento genético de enzimas claves, utilización de nuevos sustratos, etc.) y Diseño y selección de medios de cultivo que maximicen la producción, disminuyan los costos o faciliten la recuperación de productos. y Diseño y selección de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes

PRINCIPALES PRODUCTOS
PRODUCTO Solventes Etanol Acetona/butanol Biomasa Starters para alimentos Proteina unicelular Acidos organicos Acido citrico Acido gluconico Acido lactico Aminoacidos Acido glutamico Lisina Fenilalanina arginina ORGANISMO PRODUCCION (Ton/año) 20 millones 2000 500,000 50,000

Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Levaduras y bacterias lacticas Candida utilis

Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii

250,000 50,000 50,000

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum

300,000 30,000 2000 1000

PRODUCTO Enzimas Proteasas Alfa-Amilasas Glucoa-amilasa Glucosa isomerasa Pectinasa Renina otras Vitaminas B12 Riboflavina Vacunas Difteria Tetanos Pertussis Polio Rubéola Hepatitis B

ORGANISMO

PRODUCCION (Ton/año) 600 500 500 500 100 50 50

Bacillus spp Bacillus amyloliquefasciens Aspergillus niger Bacillus coagulans Aspergillus niger Mucor o levaduras recombinantes

Propionibacterium shermanii Eremothecium ashbyii

10

Corynebacterium diphteriae Clostridium tetani Bordetella pertussis Virus atenuado crecido en riñon de mono o celulas diploides humanas Idem anterior Antigenos de superficie expresados en levadura

< 0.1

Alcaloides del ergot

Claviceps paspali

5

PRODUCTO Pigmentos Shikoninas Beta-carotenos Proteinas de uso terapéutico Insulina Hormona de crecimiento Eritropoyetina FactorVIII-C Activador del plasminogeno Interferon alfa2

ORGANISMO

PRODUCCION (Ton/año) < 0.1

Lithospermum (plantas) Levaduras E. coli recombinante E. coli recombinante o celulas de mamífero recombinante celulas de mamífero recombinante celulas de mamífero recombinante E. coli recombinante

< 0.1

Antibioticos Penicilinas Cefalosporinas Tetraciclinas Macrolidos (eritromicina) Polipeptidicos (gramicidina) Aminoglicosidos (estreptomicina) Aromáticos (griseofulvina) Insecticidas Esporas bacterianas Anticuerpos monoclonales

Penicillum chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythreus Bacillus brevis Streptomyces griseus Penicillum griseofulvum

80,000 15,000 15,000 10,000 2,000 1,000

Bacillus thuringiensis Celulas de hibridoma

< 0.1 < 0..01

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