Newsletter Microbial

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Núm. 3
Enero ‐ Febrero de 2009 
Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR  

La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR.

Mitos y realidades

“De los tres pasos Introducción  • Lavado del pellet. Se realiza con alcohol
En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es frío volviendo a centrifugarse
críticos que com- el analito. Por tanto, una buena muestra impli-
ponen el análisis de ca siempre un correcto proceso de obtención de • Recuperación. El sedimento se puede re-
esta molécula a partir de material biológico. suspender en agua o tampón Tris tras ser
patógenos por secado completamente.
La extracción de ADN consta de una etapa de
PCR, la extracción lisis, que consiste en romper las estructuras La confirmación de la presencia de ADN se
de ADN es quizás que confinan el citoplasma y liberar al medio su
contenido y otra de purificación, que implica la
lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa i posterior tinción con bromuro de
el más desconoci- retirada de la solución final de la mayoría de etidio y observación con luz UV o directamente
elementos que pueden interferir en la PCR. al espectrofotómetro mediante espectro de
do... ” absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado
De los tres pasos críticos que componen el aná- se puede cuantificar con un espectrofluorímetro
lisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extrac- mediante el uso de fluoróforos específicos
“...las suspensiones ción de ADN es quizás el más desconocido y (Picogreen®, Molecular Probes)
sobre el que más control podemos ejercer.
densas de bacterias El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-
gramnegativas
pueden liberar su Enriquecimiento Extracción ADN Detección PCR
ADN en condicio- Figura 1. La extracción de ADN es un paso clave en los análisis microbiológicos por PCR 

nes bastante sua- La extracción del ADN de las células o virus nicolumnas equipadas con una membrana de
donde se halla confinado es un paso previo en
ves... ”  muchos procedimientos analíticos y diagnósti-
sílica que retiene específicamente el ADN per-
mitiendo el paso de las moléculas y sales que
cos. acompañan la reacción de lisis. Finalmente se
lava con alcohol y se eluye el contenido
Etapas en la extracción de ADN
Los pasos necesarios para una correcta extrac- Inhibidores de la PCR 
ción y purificación del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las
dimiento químico son: ADN polimerasas termoestables ya sea median-
te el bloqueo directo total o parcial de su activi-
1. Lisis de las células o virus. Las sales caotró- dad catalítica o mediante la unión directa al
picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas
mensional de macromoléculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+
proteínas o los ácidos nucleicos consiguien-
“La incorporación do su desnaturalización. La adición de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR
detergente como el SDS es necesaria a me-
de controles inter- nudo para eliminar las membranas. Inhibidor Origen

nos de amplifica- 2. Degradación de la fracción proteica asocia-

Sales biliares Heces

da al ADN. Se consigue mediante la adición Polisacáridos complejos Heces, material vegetal

ción en los kits
de una proteasa. La fracción proteica puede Colágeno Tejidos
permite el control precipitarse mejor con la ayuda de sales Grupo hemo Sangre
del nivel de inhibi- como el acetato de amonio o el acetato Ácidos húmicos Suelo, material vegetal
sódico.
ción de las reaccio- Melanina y eumelanina Pelo, piel
3. Purificación. Consta de 3 fases: Mioglobina Tejido muscular
nes...”
• Precipitación del ADN. El ADN es insolu-
Proteinasas Leche

ble en alcohol, por lo que se puede preci- Iones de calcio Leche, huesos
pitar etanol frío o isopropanol i recuperar Urea Orina
mediante una centrifugación. El alcohol Hemoglobina, Lactoferrina Sangre
del sobrenadante se llevará las sales aña- Inmunoglobina G (IgG) Sangre
didas previamente.

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(un cofactor crítico de la actividad catalítica) o disminuyen su do, pero muy poco eficacia en bacterias grampositivas.
disponibilidad pudiendo inhibir la PCR.
2. Ebullición (combinado con congelación). Algunos fabri-
En la tabla 1 se recogen algunas de las principales substancias cantes incorporan un paso de ebullición de la muestra
inhibidoras conocidas. previo a la PCR como única acción para extraer el ADN de
la muestra. Si bien esto puede ser usado en suspensiones
Otra importante fuente de inhibición son los propios reactivos con números elevados de bacterias gramnegativas, su baja
que se usan en el proceso de extracción de ADN, como por eficiencia especialmente con organismos grampositivos,
ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes ióni- reduce notablemente el nivel de detección del método.
cos, etanol e isopropanol, fenol y otros.
3. DNAready® (Microbial) Se trata de un tampón de lisis
Los inhibidores pueden eliminarse mediante purificación que incorpora los elementos necesarios para buscar un
química del extracto (pasos 3 a 6) o física mediante columnas equilibrio entre eficiencia y pureza que además está des-
de sílica. arrollado para ser especialmente efectivo con bacterias
grampositivas.
Extracción de ADN en suspensiones bacterianas 
De todas las muestras biológicas que podemos someter a un  
proceso de extracción de ADN, las suspensiones bacterianas,
son quizás las que ofrecen menos problemas por la homoge- Conclusiones 
neidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones En Microbiología de los alimentos, los inhibidores de la PCR
densas de bacterias gramnegativas pueden liberar cantidad provienen principalmente de la matriz alimentaria analizada o
suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pue- de los medios utilizados para el enriquecimiento. La incorpo-
den ser una simple ebullición, congelación o una combinación ración de controles internos de amplificación en los kits per-
de ambas (frezze & thaw). mite conocer el nivel de inhibición de las reacciones.
Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras, por
¿Es necesaria la purificación de ADN en la detección  lo que en la mayoría de casos una extracción primaria (lisis y
de patógenos en alimentos por PCR?  liberación del ADN) es suficiente para tener resultados satis-
El laboratorio de Microbiología que decide incorporar la PCR factorios. Esto no significa necesariamente que se puedan
a sus métodos de investigación de bacterias patógenas en siempre usar métodos poco drásticos, pues éstos no son efecti-
alimentos, lo hace buscando rapidez y simplicidad. La purifi- vos para extraer el ADN de las bacterias grampositivas.
cación del ADN tras el proceso de lisis y liberación tiene como
ventaja la obtención de un analito sin inhibidores a cambio de La utilización de métodos de purificación post-extracción
un sensible aumento del tiempo de análisis y de los pasos de como por ejemplo las minicolumnas de sílica implica un au-
manipulación. mento en el coste y en el número de manipulaciones (Tabla 2)
lo que hace que sólo sea aconsejable en aquellas matrices en
Analizar directamente un caldo de enriquecimiento tras un las que los métodos primarios no pueden eliminar los inhibi-
proceso de extracción primaria de ADN (lisis celular) suele dores.
producir resultados satisfactorios para la mayoría de matrices
alimentarias por lo que un paso
Tabla 2. Comparación del material, tiempo y costes asociados a diferentes métodos de extracción de
de purificación no es estricta- ADN comúnmente utilizados.
mente necesario. Además, los
kits de análisis de patógenos
por PCR incorporan detectores Característica Macherey-Nagel DNAready Chelex® F&T
de inhibición (controles inter-
nos de amplificación). Sola- Pasos centrifugación 6 1 2 2
mente aquellas matrices cuya Pasos pipeteo 10 2 3 3
presencia de inhibidores no
pueda ser contrarrestada dilu- Cambios de tubo 3 1 2 2
yendo el extracto de ADN obli- Coste por reacción (€) >3 <1,5 <1,5 <1,5
garán a plantear la adopción de
técnicas de extracción de ADN Tiempo (h)* 2h 30min 1h 1h 20min 1h 30min
que aseguren un extracto puro. Cambios Tª 2 3 3 7
 
Obtención de ADN sin paso de purificación.  
Cada casa comercial acompaña a sus detectores con un méto- Bibliografía 
do de extracción de ADN. Éstos son fundamentalmente tres: Rådström, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to
generate PCR-compatible samples. Mol. Biotechnol. 26, 133–
1. Chelex®. El uso de una resina de sílica ayuda a separar 46.
selectivamente el ADN de la solución. Es un método rápi-

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