Práctica 4

Espectrofotometría: cuantificación de proteínas

totales por el método de Biuret

Objetivo 1: que el estudiante aprenda los conceptos teóricos relacionados a la

espectrofotometría y cómo éstos son aplicados en el laboratorio de Bioquímica
para la cuantificación de sustancias.

Objetivo 2: realizar una determinación espectrofotométrica y reportar

correctamente el resultado obtenido

Fundamentos de espectrofotometría

La luz puede ser clasificada de acuerdo a su longitud de onda. La luz con

una longitud de onda corta, entre 200 nm y 400 nm se conoce como ultravioleta,
mientras que aquella que posee una longitud de onda más larga, entre 700 nm y
900 nm se conoce como luz infrarroja cercana. La luz con longitudes de onda de
entre los 400 nm a los 700 nm contempla el rango de luz de diferentes colores
visible al ojo humano. ¿Qué ocurre cuando una radiación electromagnética
atraviesa la materia? Si la radiación tiene energía adecuada con la estructura de
la materia, ésta última podrá absorberla. La medición de la cantidad de luz
absorbida puede ser usada para detectar, identificar moléculas y medir su
concentración en solución. Esta medición se basa en la Ley de Beer y Lambert o
simplemente Ley de Beer. Esta ley establece que la concentración de una
sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante
absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al logaritmo de la energía
radiante transmitida por la sustancia. Considérese un rayo de energía radiante con
una intensidad inicial Io que se hace pasar a través de una celda de vidrio
cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de
cierta longitud de onda, como se ilustra en la Figura 1.

Io Is

Figura 1. Transmisión de energía radiante a través de una celda de vidrio, donde Io

representa la intensidad de la luz incidente e Is representa la intensidad de luz
transmitida.

La intensidad de la energía radiante transmitida Is es menor a la intensidad

inicial Io. debido precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta
cantidad de energía radiante. La transmitancia para un compuesto en solución es
definida como la proporción de luz incidente que es transmitida:

43
 Transmitancia=T= Is / Io.

Esta proporción generalmente es expresada como un porcentaje de la

siguiente forma:

Porcentaje T= %T= Is / Io. X 100%

El concepto de transmitancia es importante porque solo la luz transmitida,

no la absorbida, puede ser medida directamente en el laboratorio.

Conforme la concentración del compuesto en solución aumenta, más luz

será absorbida por el mismo y por lo tanto menos luz será transmitida. El
porcentaje T varía de forma inversa y logarítmica con respecto a la concentración
(Figura 2B). A esta relación se le llama absorbancia o A. Es decir:

A= -log Is / Io.= -log T= log 1/T

Para convertir T en %T, tanto el denominador como el numerador deben ser

multiplicados por 100%:

A= log 1/T X 100%= log 100% / %T

Esta expresión es equivalente a:

A= log 100% - log %T

A= 2- log %T (ecuación 1)

Mediante esta transformación matemática se obtiene entonces una relación

entre la absorbancia y el porcentaje de transmitancia. En el laboratorio, una vez
determinado el porcentaje de transmitancia, éste se transforma a absorbancia, la
cual, según la ley de Beer es directamente proporcional a la concentración de una
sustancia, como se observa en la Figura 2A. La mayoría de los instrumentos
utilizados hoy en día para estas determinaciones, llamados espectrofotómetros,
realizan esta conversión automáticamente, de forma tal que el valor reportado es
la absorbancia, no la transmitancia.

La función matemática que relaciona a la absorbancia con la concentración

de una solución está dada por la ley de Beer en la forma:

A=abc

Donde A es absorbancia, a es el coeficiente de absortividad molar (una propiedad

física propia de cada sustancia), b es la distancia en cm recorrida por la luz dentro
de la solución (diámetro de la cubeta utilizada) y c es la concentración de la

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sustancia. Los valores de absorbancia no tienen unidades ya que las unidades del
coeficiente de absortividad molar son recíprocas a las de b y c.
Absorbancia (A)

12
100
0,35
10 0,3
8 0,25
0,2

% T
6
0,15
4 0,1
2 0,05
0
0
0 0 1 10000 1E+08 1E+12 1E+16
0 5 10 15
Concentración Concentración

(A) (B)

Figura 2. Representación gráfica de la relación que existe entre la absorbancia (A)

y el porcentaje de transmitancia (B) con respecto a la concentración de una
sustancia. La determinación se realiza utilizando muestras de concentración
conocida que se denominan patrones o estándares.

La mayoría de las sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen

color. Por lo tanto es necesario acoplar algún tipo de reacción química que
involucre la aparición o desaparición de un cromógeno con la sustancia a
cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo coeficiente de
absortividad molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por tanto
la técnica tendrá mayor sensibilidad. El siguiente paso es corroborar bajo qué
condiciones se cumple la ley de Beer, es decir cuál es la longitud de onda
apropiada para realizar las mediciones y qué concentraciones son las adecuadas.
Para ello se determina la absorbancia de la sustancia en cuestión a diferentes
concentraciones. Las soluciones de concentración conocida que se preparan para
este propósito se conocen como patrones o estándares. La relación absorbancia
versus concentración debe generar un gráfico que demuestre una línea recta cuyo
intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero (Figura 2A). Una vez
que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentración de
una solución midiendo su absorbancia y extrapolando dicho valor en el gráfico.
Debido a que existe una relación lineal entre ambas variables, es posible
relacionar la concentración desconocida a un solo estándar (generalmente el que
tiene la absorbancia más similar a la muestra) mediante una simple relación de
tres:

Ae = Ce
Am Cm

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 Donde Ae es la absorbancia del estándar, Am es la absorbancia de la
muestra, Ce es la concentración del estándar y Cm es la concentración de la
muestra. Esta relación se convierte en:

Cm= Am X Ce
Ae

Esta última ecuación es válida solo si el cromógeno a detectar cumple con

la ley de Beer y tanto estándares como muestra son medidos bajo las mismas
condiciones. Otra forma más exacta es determinar la ecuación de la línea recta
generada y de ésta extrapolar el valor de concentración de la muestra incógnita.
El rango de concentración dentro del cual un cromógeno cumple con la ley de Beer
debe determinarse experimentalmente.

La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene ciertas

limitaciones. Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la
relación entre la absorbancia y la concentración de una muestra no es lineal
pueden ocurrir cuando:

1. La concentración de la solución a medir es muy elevada

2. La luz incidente no es monocromática
3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a
la sustancia en solución que se desea medir
4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar
5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos
6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud
de onda: las especies “competirán” entre sí por la luz, cada una con
diferente absortividad.

Cada uno de los puntos mencionados anteriormente puede evitarse haciendo

un uso correcto del espectrofotómetro como se enseñará en la práctica de
laboratorio de hoy, además de una buena aplicación de la teoría de la ley de
Beer en la práctica. En el caso del punto uno, la mejor forma de evitar esta
situación es diluyendo la muestra a cuantificar. En el caso del punto dos, es
necesario tener una buena fuente de energía radiante. La mayoría de los
instrumentos de buena calidad la poseen hoy en día. Para el punto tres, es
necesario corroborar que la cantidad de luz absorbida por el solvente no es
significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una
determinación espectrofotométrica el blanco reactivo. El blanco reactivo es una
muestra más que contiene todos los componentes utilizados para la
determinación (por ejemplo agua, reactivo, etc) excepto el compuesto a medir
(ver sección de procedimiento). La cantidad de luz transmitida por este blanco
no debe ser detectada por el aparato. Para ello, el espectrofotómetro se ajusta
manualmente de forma tal que esta cantidad de luz no sea medida. Este
procedimiento se conoce comúnmente como “calibración del cero”, es decir, la
cantidad de absorbancia del blanco es reconocida o cuantificada como cero por
el aparato. En el caso del punto cuatro, es necesario asegurarse de que no

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 existan otras fuentes de luz cercanas cuando se hace la medición. Para evitar
la situación expuesta en el punto cinco, se deben utilizar celdas certificadas, las
cuales son hoy en día fáciles de conseguir a un precio razonable. Por último,
para evitar el aspecto mencionado en el punto seis, es necesario asegurarse
de que el compuesto a medir se encuentre en solución de forma pura o en
presencia de otros compuestos que no absorben a la misma longitud de onda.
Es también imprescindible recordar que si se hacen mediciones en el rango de
luz ultravioleta es necesario utilizar celdas de cuarzo, ya que el vidrio absorbe
luz a esas longitudes de onda.

En la práctica del día de hoy se determinará la concentración de proteínas

en una muestra de suero. Dado que la mayoría de las proteínas no absorben luz
dentro del rango de longitud de onda visible, es necesario acoplar una reacción
química que genera color y así poder cuantificarlas.

Fundamento de la prueba

Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina,

formando un quelato color violeta de configuración desconocida. La intensidad de
color es directamente proporcional a la concentración de proteínas presente en la
muestra.

Reactivos

A. Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3,35 g de

Na2EDTA en 350 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitacion
constante 100 ml de solución fresca de NaOH 5 mol/l. Aforar a 500 ml con
agua destilada.

B. Solución patrón de proteínas: preparación comercial, generalmente de 6g/dl.

C. Muestras: suero o plasma de diferentes especies animales.

Procedimiento

Precaución: el día de hoy usted trabajará con muestras biológicas. Una regla de
oro preventiva es trabajar cualquier muestra biológica como potencialmente
infecciosa. El uso de guantes es recomendado. Si ocurre algún derrame, avise
inmediatamente al instructor más cercano.

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A. Se obtienen muestras de plasma o suero por centrifugación de la sangre total
de diferentes especies animales, utilizando citrato de sodio al 3.8% como
anticoagulante o sin anticoagulante.

B. Rotular 3 tubos de ensayo como “muestra”, “patrón” y “blanco reactivo”. Añadir

a cada tubo:

Tubo blanco Tubo estándar Tubo muestra

Reactivo Biuret 2 ml 2 ml 2 ml
Agua destilada 20 μl - -
Estándar 6g/dl - 20 μl -
Muestra - - 20 μl

C. Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

D. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotómetro o
en el fotómetro a 540nm.

Notas

A. El color del complejo proteico es estable al menos por 1 hora.

B. La ley de Beer y Lambert se cumple hasta los 10g/dl

Cálculos

[Proteínas totales] = Absorbancia de la muestra X [patrón]

Absorbancia del patrón

Resultados

A. Calcule la concentración de proteínas totales de su muestra

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B. Cuáles son los valores de referencia para la especie animal a la que pertenece
la muestra que usted cuantificó? Se encuentra el valor obtenido para su muestra
dentro de los valores de referencia?

C. Qué patologías pueden presentar niveles elevados o niveles bajos de proteínas

totales. Averigüe.

D. ¿Por qué es importante agitar los tubos de ensayo después de preparar las
disoluciones?

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E. ¿Qué aparato se utiliza en esta práctica? Describa sus componentes internos.

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Bibliografía

-Amato M, S y Granados P, F. Manual de Laboratorio. Cátedra de Bioquímica.

Universidad Nacional, 1994
-Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica.
1999
-Kaplan, L et al. Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation. 2nd edition.
CW. Mosby Company, 1989
-Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in
fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999

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