P. 1
Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

|Views: 2.338|Likes:
Publicado porDiego Flores

More info:

Published by: Diego Flores on Oct 02, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPTX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

08/21/2013

pdf

text

original

Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

Quimioluminiscencia
‡ La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada, que emite luz cuando vuelve al estado fundamental o que transfiere su energía a otra especie que, posteriormente, da lugar a una emisión. (Skoog et al, 2001)

Madrid España . Graw Hill. Editorial Mc.Skoog et al (2001). Principios de Análisis Instrumental 5ta. Edición.

. se miden bajos niveles de radiación.Aplicaciones analíticas ‡ Estos métodos generalmente tienen una elevada sensibilidad. ya que en ausencia de ruido.

donde el analito a determinar es el sustrato y los productos de la reacción enzimática se detectan por quimioluminiscencia.Análisis ‡ Para aumentar la selectividad del analito se determinan primero los que no participan en la reacción. . ‡ Es común llevar a cabo una reacción enzimática previa.

.Caso Clínico: Detección del VIH ‡ ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay). EIA). especialmente el ELISA que también se denomina análisis inmunoenzimático (abreviado. pruebas de aglutinación y análisis dotblot son las más utilizadas.

Los dos últimos suelen ser los más sensibles y específicos.Prueba de ELISA ‡ El antígeno puede proceder del lisado viral de un cultivo (como en los primeros EIA disponibles que se llamaron de 1ª generación) o bien de proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de 10-50 aminoácidos específicos del VIH (que se han calificado como EIA de 2ª. tipo sandwich y de captura. competitivo. dentro de los primeros los indirectos son más sensibles que los competitivos y éstos mas específicos que aquellos. y de 3ª. generación). Según su diseño para reconocer la presencia de anticuerpos se habla fundamentalmente de cuatro tipos de EIA diferentes: indirecto. .

Si en el suero existen anticuerpos específicos. . suero normalmente.Proceso ‡ La muestra. a un componente vírico que actúa como antígeno. la muestra es positiva cuando se desarrolla color. generalmente un pocillo de una placa de microtitulación. éstos se unen con el antígeno formando un complejo que se pone en evidencia mediante una reacción enzimocromática que puede ser visualizada a simple vista o medida con un fotómetro. Por lo general. en las técnicas ELISA no competitivas. se enfrenta en un soporte.

Inmunoflourescencia .

inmunoquimica.fcen.ar .qb.uba.Propiedad de algunas sustancias Luminiscencia o fotoluminiscencia: Almacenar energía luminosa y liberarla posteriormente como energía luminosa Fosforescencia: Períodos de almacenamiento largo con emisión mucho después de cesada la excitación Fluorescencia: Períodos de almacenamiento cortos 10-7 ² 10-9 seg y emisión www.

pasando a un estado electrónico excitado S1· 2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito (típicamente 1-10 x 10-9 segundos). lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S0. Consecuencias: La energía de S1· es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia. la energía de este fotón es menor. La diferencia de energía es llamada ´Stokes shiftµ (h EX ² h EM) que es fundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia.qb.uba. www.fcen. existen otros procesos. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado. no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia. sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular.Fluorescencia Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas (fluoróforos) Diagrama Jablonski 1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe.inmunoquimica. ya que la emisión del fluoróforo permite distinguirse del background. 3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite.ar .

longitud de 488 nm) y de la eficiencia de recolección del detector.fcen. Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos (P más cortas y P más largas respectivamente). Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo. Para moléculas poliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por un espectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión.qb. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del espectro de excitación a la longitud de onda de excitación.ar . aunque también de la fuente de excitación (comúnmente un láser de ion argón. www. Esto es importante en la elección de los filtros. El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita.Espectro de Fluorescencia El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. El ancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dos fluoróforos son detectados simultáneamente.uba. La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia.inmunoquimica.

fcen.inmunoquimica. www.uba.qb. al no rotar no emite calor y sí luz) Rodamina 6G Rodamina B Isotiocianato fluoresceína Fluoresceína Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos. en el retorno. se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).ar .Fluoróforos Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos: moléculas rígidas (varios niveles a los cuales pueden ser excitados. si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión.

inmunofluorescencia) www. o cultivo de tejidos en capa única.qb.Inmunofluorescencia Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos.fcen. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.uba. frotis de microorganismos o de células. exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos.ar . Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia Clínica (Diagnósticos) Utilidades Investigación (inmunohistoquímica.inmunoquimica.

inmunoquimica.Elección de marcado para inmunoensayos Marcado Método de detección Ventajas Desventajas Enzimático sustratos cromogénicos detectados por abs Avidina/ Estreptavidina acoplada a marcadores Excitación en UV y emisión en el visible detección en micro fluorescencia Vida media alta. Enzimas endógenas Biotina Vida media alta. Alta sensibilidad Detección universal Vida media alta Alta resolución Múltiples pasos.qb. Fluorescencia Autofluorescencia quenching Método enzimático Sensibilidad Resolución Método fluorescencia www.uba.ar . Biotinas endógenas. Alta sensibilidad Múltiples pasos.fcen.

fcen.Inmunofluorescencia directa Utiliza un solo anticuerpo Inmunofluorescencia indirecta Utiliza un 2° anticuerpo conjugado Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Antígenos Anticuerpo 1° Antígenos Ventajas Se necesitan pocos pasos Menos problemas de background Posibilidad de doble marcación El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones Son comerciales Se evita la disminución de afinidad del Ac 1° Desventajas Menor sensibilidad (nec.inmunoquimica.qb. mucho Ac 1º) Señal poco amplificada Es necesario purificar el Ac El Ac puede perder afinidad Se necesitan muchos pasos de tinción Con ag múltiples se necesita que los Ac 1º sean de distintas especies www.ar .uba.

inmunoquimica.Lavados -Montar con PBS Importante: Permeabilizar Tb se fija con formamida y se permeabiliza con Tritón X100 www.ar .Inmunofluorescencia de superficie Inmunofluorescencia citoplasmática .Lavados .Lavados .Secar y fijar con metanol frío 30· .fcen.Agregado de Ac 1° e incubaciónen cámara húmeda .Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e incubar .Lavado de células -Resuspender el pellet y hacer frotis .Secar y fijar con metanol frío 30· -Hidratar los portas en PBS 30· -Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2° .Agregado de Ac 1° e incubación .qb.uba.Lavado de células -Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2° .Lavados en Koplin .Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e incubar en cámara húmeda .Hacer el frotis en porta .Resuspender el pellet .

MOYA y MISAEL CHINCHILLA ‡ Departamento de Parasitología. . A. T. BONILLA. Facultad de Microbiología y Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales. Universidad de Costa Rica.Caso Clínico ‡ ESTUDIO SEROLOGICO POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN COSTA RICA ‡ LILIANA REYES.

atendidos en la consulta externa de diversas clínicas de Costa Rica. cultivados en medios de Schneider. cruzi (cepa CR4).3. La técnica de IF se realizó según Camargo. Un 19% correspondía a personas menores de 9 años.073 sueros obtenidos por punción venosa de pacientes (470 hombres y 603 mujeres). ‡ El antígeno para IF se obtuvo de epimastigotos de T. Se consideraron como positivas aquellas muestras con títulos de 1:32 o más. Sweden.Metodología ‡ Se analizaron 1. pero la mayoría de las muestras (47%) fueron pacientes entre 20 y 39 años (Tabla 1). Lot N° SH 803905-1). molar F/P ratio = 4. utilizando anti-IgG humana marcada con fluoresceína (SBL National Bacteriological Laboratory. de estudiantes de la provincia de Limón y de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica. .

.

Cartago y Limón presentaron 1.8%) en Heredia.5% de pacientes positivos. once eran mayores de 30 años y los dos restantes tenían entre 20 y 30 años. ‡ De los veintitrés pacientes positivos 15 eran mujeres y 8 varones.1% en la población general. mientras que en Puntarenas se obtuvo un 1. encontrándose la menor (0. La mayor positividad se presentó en la provincia de San José con 3.2% de positividad. nueve se hallaban entre los 10 a 20 años. .6% seguida de Guanacaste con 1.Resultados ‡ La Tabla 2 muestra un porcentaje de positividad de 2. Las provincias de Alajuela. Con respecto a la edad.9%.

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->