CROMATOGRAFIA

Definición de cromatografía Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Las separaciones cromatografícas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser : 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera,absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. tipo líquido-sólido intercambio iónico líquido-líquido fase estacionaria fase movil

sólido inerte como gel de sílice o disolventes alúmina resina cambiadora soluciones acuosas

líquido adsorbido en un soporte líquido sólido película de líquido adsorbida gas sobre un soporte sólido

gas-líquido

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Ventajas de la cromatografía en capa fina

En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles. que sobre papel destruirían el cromatograma. en general suele ser de: 0. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. como soporte del adsorbente. de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides. vitaminas liposolubles. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta. en diversos tipos de gel de sílice. Adsorbentes Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente. de agua destilada. y se utiliza para separar componentes insaturados. ceras.y y y El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa. yeso (sulfato de cálcico semihidratado). Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro.. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general. Óxido de aluminio (alúmina): La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina. etc). a este proceso se le denomina argentación. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles. Originariamente se utilizaban. Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3). Pueden usarse reveladores corrosivos. pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH. lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos.2 mm. Se trata de un adsorbente polar. A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado). para proporcionar firmeza al adsorbente. habrán de consultarse la instrucciones del fabricante. aunque también se le puede añadir un adherente. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm. 35 gramos de adsorbente y 80 ml. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.1-0. no obstante. cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte. Carbón activo (carbón en polvo) Celulosa Almidón Azucares Preparación de placas. ácidos grasos. Algunos de los adsorventes más utilizados son: y Gel de sílice (silicagel): Lleva incorporado un agente aglomerante. juntos o por separados (amarillo y/o verde). El adsorvente se deslíe en agua destilada. y y y y y . láminas de vidrio. para separaciones analíticas. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. dándole a ésta un carácter básico.

Elección del eluyente La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter Eter Ciclohexano.* Metanol. Agua. dietílico. Los productos a examinar se disolverán. 5. el proceso a seguir es el siguiente: 1.* Etanol. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Ácido acético. .5. Cloroformo. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares. para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura. de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar. Agitar enérgicamente.1 µg de material. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades. 3. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. Benceno. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%. luego se colocan en bandejas metálicas. bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire.2 mm. Si no se disponer de extensor. se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas. En este momento puede activarse el agente adsorbente.0. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.. etilo. en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación. Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente. bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente. por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. cuando sea posible.* de de de petróleo. Diclorometano. 2. Las placas. normalmente. que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. Golpear con el dedo la parte inferior del so porte. la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Acetato Tetracloruro Piridina. carbono. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0. para separaciones preparativas. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire. 4.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado. las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. No utilizar compuestos muy volátiles. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares. hasta dar con el más apropiado.. c) Aplicando un eluyente más polar. esto es. podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares. Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo. mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas. por lo general. a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. cosa que no debe olvidarse. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). Esto se hace para estandarizar los valores de RF. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes. ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. La cromatografía se realiza en una cubeta. al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical. La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente. no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos. para permitir la saturación de la atmósfera. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). El tiempo de desarrollo.*compuestos cancerígenos. La elección del eluyente se realiza de forma empírica. parece ser la más conveniente para medir valores de RF. o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Desarrollo de la cromatografía en capa fina El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara. las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. Pureza. Después del desarrollo. por la acción de la capilaridad. b) Aplicando un eluyente poco polar. . En la elección del eluyente influyen varios factores: y y y y y Precio.

Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí). Ninhidrina (para aminoácidos). El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico. y dependiendo del indicador y de la longitud de onda.Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz. el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón). Localización de sustancias Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos. Métodos físicos. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo. Además de estos reveladores generales. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta. para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma. aparecen . La pulverización se realizará poco a poco. existen otros específicos: y y y y 2.4 . Métodos físicos. pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. para ello existen dos tipos de métodos: y y Métodos químicos. que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). Métodos químicos Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados. la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada.

ya que alterarían los compuestos. Se define como: La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha. De esta manera se tiene el . una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno). Constantes Rf Y Rx La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal. y por tanto la resolución. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. ya que: Cromatografía en columna Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3). todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. un puerto de inyección. disminuyendo por tanto la resolución. puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. La solución que sale al final de la co lumna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. hasta apreciar una separación mínima. el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. un .manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes. sino indIcador ultravioleta. También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X). mide la retención de un componente. Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. El máximo valor de RFque se puede alcanzar es de 1. o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales. Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad. En este caso no se pueden usar reveladores químicos. Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.65 y 0. los cálculos se simplifican si el denominador es 10. fase estacionaria. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). la separación. aumenta con la longitud de la columna. Sílica u Oxido de Magnesio. lo ideal es un RF entre 0. Para averiguar si dos compuestos son iguales. cantidad de muestra). fase móvil. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso. Cromatografía de gases. El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes.7. Una vez desarrollados se calculan losRF y si son distintos. La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. que tenga una posición de desarrollo conveniente.RX .

que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna. que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite l a aplicación de la muestra. La columna de aluminio. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor . A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna. . El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria. Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). aumentando por tanto la resolución. Se pueden analizar muestras proteicas. teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones). midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. y requiere de equipo sofisticado. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente. limita el ensanchamiento por difusión de las bandas. La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio d onde ocurre la separación. identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. un inyector. y una bomba que inyecte el líquido a la columna. se requiere un colector. El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna. Cromatografía de intercambio iónico.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). acero inoxidable. Se produce una señal tipo eléctrico.detector y un sistema computarizado para analizar. En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo. registrar e imprimir el cromatógrama. y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detecció n y cuantificación de las sustancias. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado. vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico. lo que permite estandarizar la cromatografía. la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH.

Las proteínas de menor tamaño. también llamada de filtración en gel. Cromatografía de Afinidad. La Cromatografía de exclusión molecular. Cromatografía por Permeabilidad en Gel. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. separa en función de su tamaño. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño. Es útil para la separación de proteínas. las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. debido a que son demasiado grandes para introducirse enlos poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Tipos de cromatografía Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción Exclusión . La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. En este caso. de forma que se genere un gradiente de tal concentración. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil. entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta. la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante leempleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.de pH determinado.

Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular. se procede a la regeneración de la columna. cofactores. generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad.Cambio iónico Afinidad Líquido Naturaleza de fase móvil Liquido Partición Líquido-líquido ((partición) Líquido-sólido)adsorción. Fundamento de la cromatografía de afinidad En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. exclusión. del soluto (proteína) o de ambos. La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas Alta selectividad en el mecanismo de retención Campo de aplicación restringido Separación de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presión Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica . Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido).Afinidad. Una vez finalizada la separación. retienen a los solutos (analitos). lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida. cambio iónico. también de naturaleza bioquímica. se eluye así el soluto de interés. Gas Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS) Cromatografía de afinidad Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos. inhibidores enzimáticos. lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados. de manera reversible y selectiva.

los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos. Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Esta etapa . Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. respectivamente. como los anticuerpos . porosidad controlable. según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza. que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados. en especial para trabajar a alta presión. como las lectinas y nucleótidos. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie. La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales: .Activación del soporte. Inmovilización de ligandos La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas. Esquema de un cromatograma de afinidad. y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. tamaño del grano controlable. El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa). estabilidad mecánica. polímeros de acrilamida. se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos .Ligandos de afinidad Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte. y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas. El general. El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud. que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Y según su actuación. fractogel TSK y sílices CPG. carácter suficientemente hidrofílic o para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas.

o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte. que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel). La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna. y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna. o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida. Éste puede ser un papel. co mo una pequeña cantidad en un tiempo breve. como una pequeña cantidad en un intervalo breve. Metodos de elución Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos. la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular. cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular. del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo.produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua.textoscientificos.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia. de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan. fundamentalmente con el soporte activado. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La elución invertida.htm http://latina. dejando una ruta abierta. Métodos principales Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta. Las partículas de fase estacionaria sólida.com/quimica/cromatografia http://www. para el paso de la fase móvil por el cent ro del tubo (Columna Tubular Abierta). La muestra se alimenta al sistema en forma discreta. produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo. Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito. En la elución no bioespecífica.chem. TLC). No se utiliza ninguna fase móvil adicional Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada.htm . Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida. con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito. por lo que es retirada del sólido y eluida. tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina. Ejemplo. se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas. Bibliografía http://www.cinvestav. la purificación de la lectina. no restringida. que es la situación más frecuente.ub. Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Se usa lectina para purificar glucoproteína.

http://apuntes.com/cromatografia-en-capa-fina.html .rincondelvago.

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