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cromatografia

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CROMATOGRAFIA

Definición de cromatografía Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Las separaciones cromatografícas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser : 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera,absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. tipo líquido-sólido intercambio iónico líquido-líquido fase estacionaria fase movil

sólido inerte como gel de sílice o disolventes alúmina resina cambiadora soluciones acuosas

líquido adsorbido en un soporte líquido sólido película de líquido adsorbida gas sobre un soporte sólido

gas-líquido

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Ventajas de la cromatografía en capa fina

en general suele ser de: 0.1-0. habrán de consultarse la instrucciones del fabricante. juntos o por separados (amarillo y/o verde). Adsorbentes Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente.2 mm. Carbón activo (carbón en polvo) Celulosa Almidón Azucares Preparación de placas. y se utiliza para separar componentes insaturados. Algunos de los adsorventes más utilizados son: y Gel de sílice (silicagel): Lleva incorporado un agente aglomerante. lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. 35 gramos de adsorbente y 80 ml. Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3). como soporte del adsorbente. de agua destilada. Originariamente se utilizaban. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice. vitaminas liposolubles. láminas de vidrio. en diversos tipos de gel de sílice. Se trata de un adsorbente polar. pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles.y y y El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Óxido de aluminio (alúmina): La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina. yeso (sulfato de cálcico semihidratado). ácidos grasos. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles. A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado). El adsorvente se deslíe en agua destilada. Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. y y y y y . La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. dándole a ésta un carácter básico. pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH. para separaciones analíticas.. ceras. etc). En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta. cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte. no obstante. a este proceso se le denomina argentación. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm. para proporcionar firmeza al adsorbente. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. Pueden usarse reveladores corrosivos. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general. que sobre papel destruirían el cromatograma. aunque también se le puede añadir un adherente. de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico.

Agua. Elección del eluyente La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. 3. Ácido acético. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.2 mm. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro. luego se colocan en bandejas metálicas. Las placas. bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter Eter Ciclohexano. Los productos a examinar se disolverán.0. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades. Benceno.* Etanol. Golpear con el dedo la parte inferior del so porte. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura.* de de de petróleo. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%. etilo. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio. en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación. . el proceso a seguir es el siguiente: 1. normalmente. 5. 2. de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares. Diclorometano. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire. Agitar enérgicamente. Acetato Tetracloruro Piridina. bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire.1 µg de material. Si no se disponer de extensor..5.* Metanol. 4. Cloroformo. carbono. la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. dietílico. de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar. para separaciones preparativas. se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas. cuando sea posible. Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente. En este momento puede activarse el agente adsorbente.

mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas. esto es. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. parece ser la más conveniente para medir valores de RF. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. Después del desarrollo. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares. Desarrollo de la cromatografía en capa fina El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente. las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos. o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. La elección del eluyente se realiza de forma empírica. En la elección del eluyente influyen varios factores: y y y y y Precio. podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares.*compuestos cancerígenos. c) Aplicando un eluyente más polar. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara. no llega a los 30 minutos. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado. No utilizar compuestos muy volátiles. Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo.. b) Aplicando un eluyente poco polar. cosa que no debe olvidarse. . las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. hasta dar con el más apropiado. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. por lo general. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm. ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). Pureza. a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente. al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical. El tiempo de desarrollo. La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente. para permitir la saturación de la atmósfera. La cromatografía se realiza en una cubeta. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes. por la acción de la capilaridad. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).

Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo. que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí). aparecen . existen otros específicos: y y y y 2.dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). Métodos físicos. Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo. el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón). se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz. o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. La pulverización se realizará poco a poco. Localización de sustancias Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos. El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. Ninhidrina (para aminoácidos). Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico.4 . Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). Métodos físicos. la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta. Métodos químicos Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados. pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. y dependiendo del indicador y de la longitud de onda. Además de estos reveladores generales. para ello existen dos tipos de métodos: y y Métodos químicos. Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).

Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. la separación. fase móvil. o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X). mide la retención de un componente. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. y por tanto la resolución. El máximo valor de RFque se puede alcanzar es de 1. Una vez desarrollados se calculan losRF y si son distintos. los cálculos se simplifican si el denominador es 10. La solución que sale al final de la co lumna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. un puerto de inyección.manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes. que tenga una posición de desarrollo conveniente. Para averiguar si dos compuestos son iguales. un . se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. ya que alterarían los compuestos. Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad. una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno). La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales.RX . disminuyendo por tanto la resolución. aumenta con la longitud de la columna.65 y 0. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total. lo ideal es un RF entre 0. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso. Cromatografía de gases. Se define como: La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha. En este caso no se pueden usar reveladores químicos. De esta manera se tiene el . puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. sino indIcador ultravioleta. Constantes Rf Y Rx La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal. Sílica u Oxido de Magnesio. ya que: Cromatografía en columna Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3). hasta apreciar una separación mínima. Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa. el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta. cantidad de muestra). La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador.7. La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. fase estacionaria.

El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes. por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria. teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones). vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. Al final de la columna existe el detector que permite la detecció n y cuantificación de las sustancias.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente. La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio d onde ocurre la separación. En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna. y una bomba que inyecte el líquido a la columna. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado. y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor . . la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. Cromatografía de intercambio iónico. acero inoxidable. que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite l a aplicación de la muestra.detector y un sistema computarizado para analizar. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico. un inyector. El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna. Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). aumentando por tanto la resolución. limita el ensanchamiento por difusión de las bandas. y requiere de equipo sofisticado. Se produce una señal tipo eléctrico. registrar e imprimir el cromatógrama. lo que permite estandarizar la cromatografía. La columna de aluminio. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. se requiere un colector. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares. la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Se pueden analizar muestras proteicas.

las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante leempleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna. La Cromatografía de exclusión molecular. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño. Cromatografía de Afinidad. Es útil para la separación de proteínas. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. de forma que se genere un gradiente de tal concentración. separa en función de su tamaño. entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta. también llamada de filtración en gel. Las proteínas de menor tamaño. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando.de pH determinado. En este caso. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil. debido a que son demasiado grandes para introducirse enlos poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. Tipos de cromatografía Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción Exclusión . Cromatografía por Permeabilidad en Gel.

Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Fundamento de la cromatografía de afinidad En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. inhibidores enzimáticos. Una vez finalizada la separación. del soluto (proteína) o de ambos. lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.Cambio iónico Afinidad Líquido Naturaleza de fase móvil Liquido Partición Líquido-líquido ((partición) Líquido-sólido)adsorción. Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. también de naturaleza bioquímica. de manera reversible y selectiva. generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos. La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas Alta selectividad en el mecanismo de retención Campo de aplicación restringido Separación de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presión Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica . retienen a los solutos (analitos). cofactores. exclusión. se procede a la regeneración de la columna. lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados. se eluye así el soluto de interés. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando. cambio iónico.Afinidad. Gas Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS) Cromatografía de afinidad Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos.

Esta etapa . El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud. los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción. Inmovilización de ligandos La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos . porosidad controlable. polímeros de acrilamida. en especial para trabajar a alta presión. Y según su actuación. El general. según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie. fractogel TSK y sílices CPG. que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados. La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales: . como los anticuerpos . y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas.Ligandos de afinidad Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte. como las lectinas y nucleótidos. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa). Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza. Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Esquema de un cromatograma de afinidad. carácter suficientemente hidrofílic o para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas. tamaño del grano controlable. estabilidad mecánica.Activación del soporte. y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. respectivamente.

la purificación de la lectina. La elución invertida. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo. Métodos principales Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no. de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan. con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Bibliografía http://www. co mo una pequeña cantidad en un tiempo breve. Éste puede ser un papel. dejando una ruta abierta. para el paso de la fase móvil por el cent ro del tubo (Columna Tubular Abierta).ub. La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito.htm http://latina. En la elución no bioespecífica. no restringida. pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna. fundamentalmente con el soporte activado.com/quimica/cromatografia http://www. y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado. tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina. Las partículas de fase estacionaria sólida. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular. por lo que es retirada del sólido y eluida. Se usa lectina para purificar glucoproteína. como una pequeña cantidad en un intervalo breve. del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo. TLC). Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte. Metodos de elución Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos. Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. que es la situación más frecuente.htm .cinvestav.chem. No se utiliza ninguna fase móvil adicional Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel).textoscientificos. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida. cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular. Ejemplo. y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas. Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia. se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad.

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