CROMATOGRAFIA

Definición de cromatografía Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Las separaciones cromatografícas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser : 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera,absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. tipo líquido-sólido intercambio iónico líquido-líquido fase estacionaria fase movil

sólido inerte como gel de sílice o disolventes alúmina resina cambiadora soluciones acuosas

líquido adsorbido en un soporte líquido sólido película de líquido adsorbida gas sobre un soporte sólido

gas-líquido

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Ventajas de la cromatografía en capa fina

para proporcionar firmeza al adsorbente. Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. a este proceso se le denomina argentación.. en diversos tipos de gel de sílice. Originariamente se utilizaban. para separaciones analíticas. dándole a ésta un carácter básico. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa. etc). Pueden usarse reveladores corrosivos. pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta. habrán de consultarse la instrucciones del fabricante. pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH.2 mm. A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado). láminas de vidrio. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. El adsorvente se deslíe en agua destilada.1-0. ácidos grasos. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general. en general suele ser de: 0. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice. de agua destilada. Óxido de aluminio (alúmina): La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina. Carbón activo (carbón en polvo) Celulosa Almidón Azucares Preparación de placas. ceras. no obstante. Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3). aunque también se le puede añadir un adherente. y se utiliza para separar componentes insaturados. juntos o por separados (amarillo y/o verde). Se trata de un adsorbente polar. y y y y y . cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte. vitaminas liposolubles. de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides. Adsorbentes Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. que sobre papel destruirían el cromatograma. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm. como soporte del adsorbente.y y y El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. Algunos de los adsorventes más utilizados son: y Gel de sílice (silicagel): Lleva incorporado un agente aglomerante. yeso (sulfato de cálcico semihidratado). 35 gramos de adsorbente y 80 ml.

2. Elección del eluyente La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. dietílico. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire. que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación. luego se colocan en bandejas metálicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente. etilo. el proceso a seguir es el siguiente: 1. la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Diclorometano.2 mm. Cloroformo.0. Los productos a examinar se disolverán. para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura. bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares. Agitar enérgicamente. carbono. Agua. normalmente. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.* Metanol. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter Eter Ciclohexano. se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas. Golpear con el dedo la parte inferior del so porte.5. de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar. Acetato Tetracloruro Piridina. 3. cuando sea posible. por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. para separaciones preparativas.1 µg de material. Si no se disponer de extensor. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.* Etanol. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0. 5. Benceno.* de de de petróleo. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades. 4. Ácido acético. Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente. bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%. . Las placas.. de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido.

por lo general. las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. por la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. No utilizar compuestos muy volátiles. o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. El tiempo de desarrollo. al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado. En la elección del eluyente influyen varios factores: y y y y y Precio. b) Aplicando un eluyente poco polar. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). La elección del eluyente se realiza de forma empírica. parece ser la más conveniente para medir valores de RF. cosa que no debe olvidarse. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo. a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente. para permitir la saturación de la atmósfera. esto es. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente.*compuestos cancerígenos. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara. c) Aplicando un eluyente más polar. las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares.. Desarrollo de la cromatografía en capa fina El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente. no llega a los 30 minutos. ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. Pureza. hasta dar con el más apropiado. Después del desarrollo. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas. podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares. .

Métodos químicos Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico. para ello existen dos tipos de métodos: y y Métodos químicos. para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma. Además de estos reveladores generales.4 . La pulverización se realizará poco a poco. Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal.Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz. En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí). la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz. que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. Métodos físicos.dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). aparecen . y dependiendo del indicador y de la longitud de onda. el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón). Métodos físicos. Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta. pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminoácidos). existen otros específicos: y y y y 2. Localización de sustancias Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo.

que tenga una posición de desarrollo conveniente. o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. Para averiguar si dos compuestos son iguales. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total. y por tanto la resolución. En este caso no se pueden usar reveladores químicos. ya que: Cromatografía en columna Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3). La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. aumenta con la longitud de la columna. un puerto de inyección. puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador. lo ideal es un RF entre 0. mide la retención de un componente. la separación. el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X). ya que alterarían los compuestos. sino indIcador ultravioleta. La solución que sale al final de la co lumna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. hasta apreciar una separación mínima. Una vez desarrollados se calculan losRF y si son distintos. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso. Constantes Rf Y Rx La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal. una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno). se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. un . Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa. Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad. Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas.65 y 0. Sílica u Oxido de Magnesio. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). fase móvil. Se define como: La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha. cantidad de muestra). El máximo valor de RFque se puede alcanzar es de 1. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales. fase estacionaria. Cromatografía de gases. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. los cálculos se simplifican si el denominador es 10. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria.RX .manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes. De esta manera se tiene el .7. disminuyendo por tanto la resolución. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.

La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna. y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. y requiere de equipo sofisticado. por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria. que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La columna de aluminio. Se produce una señal tipo eléctrico. En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo. acero inoxidable. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). registrar e imprimir el cromatógrama. un inyector. . En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor . se requiere un colector. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico. La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio d onde ocurre la separación. El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente. la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite l a aplicación de la muestra. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna. vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. aumentando por tanto la resolución. midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla.detector y un sistema computarizado para analizar. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna. Cromatografía de intercambio iónico. limita el ensanchamiento por difusión de las bandas. Al final de la columna existe el detector que permite la detecció n y cuantificación de las sustancias. lo que permite estandarizar la cromatografía. teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones). la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. Se pueden analizar muestras proteicas.

La Cromatografía de exclusión molecular. Cromatografía de Afinidad. la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante leempleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína. entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta. debido a que son demasiado grandes para introducirse enlos poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. En este caso. separa en función de su tamaño. de forma que se genere un gradiente de tal concentración. Cromatografía por Permeabilidad en Gel. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. Las proteínas de menor tamaño. las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. también llamada de filtración en gel. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil. Es útil para la separación de proteínas.de pH determinado. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna. Tipos de cromatografía Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción Exclusión .

también de naturaleza bioquímica. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos. cofactores. se eluye así el soluto de interés. se procede a la regeneración de la columna. inhibidores enzimáticos.Afinidad. exclusión. La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas Alta selectividad en el mecanismo de retención Campo de aplicación restringido Separación de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presión Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica . lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida. Una vez finalizada la separación. retienen a los solutos (analitos). Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. del soluto (proteína) o de ambos. lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados. Fundamento de la cromatografía de afinidad En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Gas Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS) Cromatografía de afinidad Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.Cambio iónico Afinidad Líquido Naturaleza de fase móvil Liquido Partición Líquido-líquido ((partición) Líquido-sólido)adsorción. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando. de manera reversible y selectiva. cambio iónico.

polímeros de acrilamida. y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud. pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas. respectivamente. El general. que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. Esquema de un cromatograma de afinidad. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. Esta etapa . La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales: . como los anticuerpos . que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados. y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos.Ligandos de afinidad Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte.Activación del soporte. se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos . El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa). carácter suficientemente hidrofílic o para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos. los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción. porosidad controlable. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie. Y según su actuación. estabilidad mecánica. Inmovilización de ligandos La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas. fractogel TSK y sílices CPG. tamaño del grano controlable. como las lectinas y nucleótidos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. en especial para trabajar a alta presión. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido.

El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel). y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito. No se utiliza ninguna fase móvil adicional Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Ejemplo. o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida. En la elución no bioespecífica. Metodos de elución Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos. La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito. se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad.htm http://latina.htm .cinvestav. o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte. la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado. Métodos principales Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina. Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular. que es la situación más frecuente. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. la purificación de la lectina. fundamentalmente con el soporte activado. cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular. con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna. Se usa lectina para purificar glucoproteína. de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo. como una pequeña cantidad en un intervalo breve.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia. por lo que es retirada del sólido y eluida. Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.chem. La elución invertida. no restringida. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta. TLC). Las partículas de fase estacionaria sólida. produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no.textoscientificos. dejando una ruta abierta. co mo una pequeña cantidad en un tiempo breve. del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo. Bibliografía http://www. Éste puede ser un papel.com/quimica/cromatografia http://www. para el paso de la fase móvil por el cent ro del tubo (Columna Tubular Abierta). y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna.produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua.

html .rincondelvago.com/cromatografia-en-capa-fina.http://apuntes.

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