CROMATOGRAFIA

Definición de cromatografía Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Las separaciones cromatografícas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser : 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera,absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. tipo líquido-sólido intercambio iónico líquido-líquido fase estacionaria fase movil

sólido inerte como gel de sílice o disolventes alúmina resina cambiadora soluciones acuosas

líquido adsorbido en un soporte líquido sólido película de líquido adsorbida gas sobre un soporte sólido

gas-líquido

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Ventajas de la cromatografía en capa fina

que sobre papel destruirían el cromatograma. y se utiliza para separar componentes insaturados. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general. a este proceso se le denomina argentación. vitaminas liposolubles. Originariamente se utilizaban.2 mm. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta. pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles. 35 gramos de adsorbente y 80 ml. en general suele ser de: 0. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles. yeso (sulfato de cálcico semihidratado). habrán de consultarse la instrucciones del fabricante. Algunos de los adsorventes más utilizados son: y Gel de sílice (silicagel): Lleva incorporado un agente aglomerante. Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3). El adsorvente se deslíe en agua destilada. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. láminas de vidrio. A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado). No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.1-0. lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. en diversos tipos de gel de sílice. juntos o por separados (amarillo y/o verde). Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. como soporte del adsorbente. Se trata de un adsorbente polar. de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides. Pueden usarse reveladores corrosivos. aunque también se le puede añadir un adherente. ácidos grasos. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm. para proporcionar firmeza al adsorbente. dándole a ésta un carácter básico. y y y y y . Óxido de aluminio (alúmina): La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina. de agua destilada.. En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH.y y y El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. para separaciones analíticas. ceras. Carbón activo (carbón en polvo) Celulosa Almidón Azucares Preparación de placas. Adsorbentes Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente. no obstante. cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte. etc). Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa.

Diclorometano.2 mm. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%. 5. por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. 4.5. de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. 3. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares. bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente. Ácido acético. en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación. .. que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. Elección del eluyente La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. Las placas. para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura. 2. normalmente. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0. bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. cuando sea posible. Benceno. etilo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter Eter Ciclohexano. se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.* Etanol. dietílico. luego se colocan en bandejas metálicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente. Si no se disponer de extensor. de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar. el proceso a seguir es el siguiente: 1. para separaciones preparativas.* de de de petróleo.* Metanol. Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente. carbono. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. Los productos a examinar se disolverán.0. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire. la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Agitar enérgicamente. Cloroformo. Acetato Tetracloruro Piridina. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades. Golpear con el dedo la parte inferior del so porte.1 µg de material. Agua.

cosa que no debe olvidarse. Desarrollo de la cromatografía en capa fina El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente. o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. c) Aplicando un eluyente más polar. Pureza. para permitir la saturación de la atmósfera. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes. por lo general. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.*compuestos cancerígenos. El tiempo de desarrollo. La cromatografía se realiza en una cubeta. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos. b) Aplicando un eluyente poco polar. La elección del eluyente se realiza de forma empírica. no llega a los 30 minutos. No utilizar compuestos muy volátiles. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). Después del desarrollo. podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado. las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente. esto es. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). Esto se hace para estandarizar los valores de RF. a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.. . En la elección del eluyente influyen varios factores: y y y y y Precio. las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. hasta dar con el más apropiado. Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo. al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical. por la acción de la capilaridad. mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares. parece ser la más conveniente para medir valores de RF.

aparecen . De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta. el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón). pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Localización de sustancias Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos. Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). Métodos físicos. El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo. Ninhidrina (para aminoácidos). que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz. Además de estos reveladores generales. Métodos químicos Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados. para ello existen dos tipos de métodos: y y Métodos químicos. Métodos físicos. para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma. En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí). La pulverización se realizará poco a poco. existen otros específicos: y y y y 2.4 . Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. y dependiendo del indicador y de la longitud de onda. se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo.

También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X). una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno). La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. cantidad de muestra). Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad. Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. ya que alterarían los compuestos.65 y 0. hasta apreciar una separación mínima. y por tanto la resolución. El máximo valor de RFque se puede alcanzar es de 1.manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes. la separación. o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso. Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa. El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador. el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. mide la retención de un componente. sino indIcador ultravioleta. Para averiguar si dos compuestos son iguales. un puerto de inyección. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. un . En este caso no se pueden usar reveladores químicos. ya que: Cromatografía en columna Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3).7. lo ideal es un RF entre 0. Una vez desarrollados se calculan losRF y si son distintos. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. De esta manera se tiene el . los cálculos se simplifican si el denominador es 10. La solución que sale al final de la co lumna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.RX . puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. fase móvil. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total. aumenta con la longitud de la columna. fase estacionaria. Cromatografía de gases. Constantes Rf Y Rx La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal. Sílica u Oxido de Magnesio. que tenga una posición de desarrollo conveniente. Se define como: La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha. se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. disminuyendo por tanto la resolución.

Cromatografía de intercambio iónico. . acero inoxidable. y requiere de equipo sofisticado. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor . limita el ensanchamiento por difusión de las bandas. registrar e imprimir el cromatógrama. En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo. que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna. teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones). A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico. La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio d onde ocurre la separación. Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes. lo que permite estandarizar la cromatografía. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. Al final de la columna existe el detector que permite la detecció n y cuantificación de las sustancias. se requiere un colector. midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras. y una bomba que inyecte el líquido a la columna. identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa.detector y un sistema computarizado para analizar. un inyector. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna. la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite l a aplicación de la muestra. Se pueden analizar muestras proteicas. vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado. la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. La columna de aluminio. Se produce una señal tipo eléctrico. aumentando por tanto la resolución.

las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. debido a que son demasiado grandes para introducirse enlos poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. de forma que se genere un gradiente de tal concentración. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna. Las proteínas de menor tamaño. la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante leempleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína. Cromatografía por Permeabilidad en Gel. también llamada de filtración en gel. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil. separa en función de su tamaño. Tipos de cromatografía Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción Exclusión .de pH determinado. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso. Cromatografía de Afinidad. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño. entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta. Es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión molecular. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz.

Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular. Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido).Cambio iónico Afinidad Líquido Naturaleza de fase móvil Liquido Partición Líquido-líquido ((partición) Líquido-sólido)adsorción. Gas Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS) Cromatografía de afinidad Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos. cofactores. generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida. Una vez finalizada la separación. La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas Alta selectividad en el mecanismo de retención Campo de aplicación restringido Separación de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presión Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica . lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados. cambio iónico.Afinidad. retienen a los solutos (analitos). exclusión. se eluye así el soluto de interés. también de naturaleza bioquímica. inhibidores enzimáticos. del soluto (proteína) o de ambos. Fundamento de la cromatografía de afinidad En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. de manera reversible y selectiva. se procede a la regeneración de la columna.

polímeros de acrilamida. en especial para trabajar a alta presión. estabilidad mecánica. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie. que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud. carácter suficientemente hidrofílic o para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas. Esquema de un cromatograma de afinidad. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza. La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales: . como las lectinas y nucleótidos. Inmovilización de ligandos La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas. Y según su actuación. se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos .Activación del soporte. fractogel TSK y sílices CPG. El general. y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. tamaño del grano controlable. pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos. El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa).Ligandos de afinidad Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte. que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados. los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción. respectivamente. como los anticuerpos . porosidad controlable. Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Esta etapa .

pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta. la purificación de la lectina. como una pequeña cantidad en un intervalo breve.cinvestav.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas. Se usa lectina para purificar glucoproteína.htm http://latina. la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado. y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito.ub. dejando una ruta abierta. cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular. Éste puede ser un papel. o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte.chem. Las partículas de fase estacionaria sólida. TLC). El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular. fundamentalmente con el soporte activado. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida. Ejemplo. que es la situación más frecuente. del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo. por lo que es retirada del sólido y eluida. no restringida. Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia. tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina.produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan. o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida. para el paso de la fase móvil por el cent ro del tubo (Columna Tubular Abierta). Metodos de elución Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos.htm . Bibliografía http://www. La elución invertida. co mo una pequeña cantidad en un tiempo breve. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo.com/quimica/cromatografia http://www. Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito. con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel). y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna. Métodos principales Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico.textoscientificos. se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. En la elución no bioespecífica. produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no. No se utiliza ninguna fase móvil adicional Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano.

rincondelvago.com/cromatografia-en-capa-fina.http://apuntes.html .