CROMATOGRAFIA

Definición de cromatografía Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc... Las separaciones cromatografícas se consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser : 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera,absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. tipo líquido-sólido intercambio iónico líquido-líquido fase estacionaria fase movil

sólido inerte como gel de sílice o disolventes alúmina resina cambiadora soluciones acuosas

líquido adsorbido en un soporte líquido sólido película de líquido adsorbida gas sobre un soporte sólido

gas-líquido

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Ventajas de la cromatografía en capa fina

Se trata de un adsorbente polar. ceras. aunque también se le puede añadir un adherente. en diversos tipos de gel de sílice. de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm. no obstante. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. Algunos de los adsorventes más utilizados son: y Gel de sílice (silicagel): Lleva incorporado un agente aglomerante. para proporcionar firmeza al adsorbente. etc). No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice. 35 gramos de adsorbente y 80 ml. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. dándole a ésta un carácter básico. Carbón activo (carbón en polvo) Celulosa Almidón Azucares Preparación de placas. en general suele ser de: 0. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa. ácidos grasos. que sobre papel destruirían el cromatograma. juntos o por separados (amarillo y/o verde). Originariamente se utilizaban. y y y y y . Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte. y se utiliza para separar componentes insaturados. A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado). Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3)..y y y El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Óxido de aluminio (alúmina): La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina. vitaminas liposolubles. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta. En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH. Adsorbentes Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente. Pueden usarse reveladores corrosivos. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles.2 mm. para separaciones analíticas. El adsorvente se deslíe en agua destilada. lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles. como soporte del adsorbente. de agua destilada. habrán de consultarse la instrucciones del fabricante. a este proceso se le denomina argentación. láminas de vidrio. yeso (sulfato de cálcico semihidratado).1-0.

la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Agitar enérgicamente. de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar. 4. En este momento puede activarse el agente adsorbente. 5. Benceno. Si no se disponer de extensor.1 µg de material. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro. Las placas. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0. Diclorometano. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades.* de de de petróleo. 3. por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter Eter Ciclohexano. en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación.5. Golpear con el dedo la parte inferior del so porte. de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. normalmente. bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. Ácido acético. carbono. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares. Cloroformo. Acetato Tetracloruro Piridina.* Metanol. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire. que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas. 2. el proceso a seguir es el siguiente: 1.0. Elección del eluyente La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. Agua. para separaciones preparativas. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. etilo. dietílico. luego se colocan en bandejas metálicas.2 mm. cuando sea posible. . Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente. Los productos a examinar se disolverán.* Etanol. para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio..

esto es. no llega a los 30 minutos. al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical. Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo. mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). cosa que no debe olvidarse. Después del desarrollo. parece ser la más conveniente para medir valores de RF. ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. No utilizar compuestos muy volátiles. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. . las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. c) Aplicando un eluyente más polar. para permitir la saturación de la atmósfera. o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen.*compuestos cancerígenos. las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. por lo general. por la acción de la capilaridad. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos. Desarrollo de la cromatografía en capa fina El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente. a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente. El tiempo de desarrollo. hasta dar con el más apropiado. Pureza. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado. La elección del eluyente se realiza de forma empírica.. La cromatografía se realiza en una cubeta. En la elección del eluyente influyen varios factores: y y y y y Precio. b) Aplicando un eluyente poco polar. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes. podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares.

existen otros específicos: y y y y 2. Localización de sustancias Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos.4 . El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. aparecen . pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). Métodos físicos. para ello existen dos tipos de métodos: y y Métodos químicos. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo. Métodos químicos Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados.Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta. En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí). Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo. para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma. se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz. Métodos físicos. El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). La pulverización se realizará poco a poco. el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón). Además de estos reveladores generales. y dependiendo del indicador y de la longitud de onda. Ninhidrina (para aminoácidos). Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico.

La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. En este caso no se pueden usar reveladores químicos. Sílica u Oxido de Magnesio. La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta. puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Una vez desarrollados se calculan losRF y si son distintos. lo ideal es un RF entre 0. ya que: Cromatografía en columna Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3). Para averiguar si dos compuestos son iguales. mide la retención de un componente. o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. Cromatografía de gases. una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno). La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). cantidad de muestra). todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. ya que alterarían los compuestos. que tenga una posición de desarrollo conveniente. Se define como: La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha. Constantes Rf Y Rx La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales. disminuyendo por tanto la resolución. El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador. Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. la separación. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total.7. fase estacionaria.manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes. De esta manera se tiene el . y por tanto la resolución. se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes.65 y 0. fase móvil. el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X). un . hasta apreciar una separación mínima. los cálculos se simplifican si el denominador es 10.RX . Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso. aumenta con la longitud de la columna. La solución que sale al final de la co lumna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. un puerto de inyección. sino indIcador ultravioleta. El máximo valor de RFque se puede alcanzar es de 1.

En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo. y una bomba que inyecte el líquido a la columna. un inyector. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. La columna de aluminio. Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna. midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados.detector y un sistema computarizado para analizar. se requiere un colector. Cromatografía de intercambio iónico. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico. registrar e imprimir el cromatógrama. acero inoxidable. la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite l a aplicación de la muestra. que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares. aumentando por tanto la resolución. vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. lo que permite estandarizar la cromatografía. La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio d onde ocurre la separación. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor . la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado. . limita el ensanchamiento por difusión de las bandas. identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones). Al final de la columna existe el detector que permite la detecció n y cuantificación de las sustancias. El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras. por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna.

La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño. En este caso. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna. Cromatografía por Permeabilidad en Gel. Es útil para la separación de proteínas. separa en función de su tamaño. Cromatografía de Afinidad. también llamada de filtración en gel. Las proteínas de menor tamaño. la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante leempleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína. debido a que son demasiado grandes para introducirse enlos poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Tipos de cromatografía Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción Exclusión . de forma que se genere un gradiente de tal concentración.de pH determinado. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La Cromatografía de exclusión molecular. las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna.

Una vez finalizada la separación. Fundamento de la cromatografía de afinidad En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular. Gas Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS) Cromatografía de afinidad Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos.Cambio iónico Afinidad Líquido Naturaleza de fase móvil Liquido Partición Líquido-líquido ((partición) Líquido-sólido)adsorción. cambio iónico. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados. también de naturaleza bioquímica. Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas Alta selectividad en el mecanismo de retención Campo de aplicación restringido Separación de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presión Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica . cofactores.Afinidad. inhibidores enzimáticos. del soluto (proteína) o de ambos. se eluye así el soluto de interés. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando. se procede a la regeneración de la columna. de manera reversible y selectiva. generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos. lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida. retienen a los solutos (analitos). exclusión.

y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. como las lectinas y nucleótidos. carácter suficientemente hidrofílic o para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas. El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa). El general. Inmovilización de ligandos La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas. tamaño del grano controlable. como los anticuerpos . y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales: . según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa . estabilidad mecánica. pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas. El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.Activación del soporte. en especial para trabajar a alta presión. polímeros de acrilamida. Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie. porosidad controlable. que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados. Y según su actuación. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos.Ligandos de afinidad Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte. los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción. Esquema de un cromatograma de afinidad. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza. fractogel TSK y sílices CPG. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos . respectivamente.

El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular. pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Ejemplo. del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo. Éste puede ser un papel. de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan.com/quimica/cromatografia http://www. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia. o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte. No se utiliza ninguna fase móvil adicional Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada.ub. cave distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular. En la elución no bioespecífica.produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. no restringida. para el paso de la fase móvil por el cent ro del tubo (Columna Tubular Abierta).chem. Métodos principales Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. fundamentalmente con el soporte activado. por lo que es retirada del sólido y eluida. TLC). se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna. Las partículas de fase estacionaria sólida. con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas. Se usa lectina para purificar glucoproteína. Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta. como una pequeña cantidad en un intervalo breve. que es la situación más frecuente. Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito. Metodos de elución Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos. la purificación de la lectina. Bibliografía http://www. La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito. La elución invertida. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta. produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no. tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina. que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel). la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado.htm http://latina. co mo una pequeña cantidad en un tiempo breve.textoscientificos. dejando una ruta abierta.htm . Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano.cinvestav. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida. o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida.

com/cromatografia-en-capa-fina.html .rincondelvago.http://apuntes.

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