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Pruebas de Identificacion Bacteriana 1[1]

Pruebas de Identificacion Bacteriana 1[1]

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Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso.

Pruebas de identificación bacteriana - 1 U.T. 16 - 1 Bloque temático III

Pruebas de identificación bacteriana
Identificación bacteriana
La identificación es un proceso por el cual debemos determinar a qué especie pertenece una determinada cepa bacteriana, mediante la comparación de una serie de características que pueden ser puestas en evidencia en el laboratorio y que han sido estudiadas para la gran mayoría de las especies importantes desde el punto de vista de la patología infecciosa humana. Cuanto más semejanza haya entre las características obtenidas en el laboratorio y las que habitualmente presenta una determinada especie, mayor será la probabilidad de que esa cepa problema pertenezca a dicha especie. Las características utilizadas en la identificación de cada grupo de microorganismos dependen de las posibilidades de cada laboratorio, fundamentalmente económicas y de cualificación del personal, así como de la epidemiología específica de la zona. Las características que se tienen en cuenta para lograr una correcta identificación son las siguientes: Características no bacterianas: ? Paciente: Edad Sexo Patología Características bacterianas: ? de cultivo: Medios en los que crece Temperatura Atmósfera de crecimiento Crecimiento en aero o anaerobiosis Morfología de las colonias

? Muestra: Obtención Conservación Transporte ? individuales: Características estructurales: - Tinción de Gram - Morfología - Dimensiones - Forma de agruparse - Presencia de estructuras: - Cápsula, Flagelos, Esporas - Movilidad Características metabólicas: Acción bacteria/sustrato Enzimáticas un enzima aislado un sistema enzimático No enzimáticas Acción agente químico/bacteria Pruebas de susceptibilidad Determinación de metabolitos libres Características inmunológicas. Análisis de DNA.

En el proceso de identificación tradicional se establecen tres niveles de procesamiento: a) el primero hace referencia a la morfología y a su comportamiento ante la tinción de Gram u otras tinciones que se utilicen específicamente para cada grupo. b) el segundo nivel de identificación debe especificar el género a que pertenece el microorganismo. c) por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie

Gustavo A. Díaz Martín. I. E. S. Jaime Ferrán Clúa.

Profesor Técnico de Formación Profesional. San Fernando de Henares. (28830 Madrid)

Curso 2006-2007 Código 28038616

Laboratorio de Diagnóstico Clínico.Hidrólisis de esculina . Quizás las más utilizadas cuantitativamente sean las pruebas bioquímicas que nos permiten determinar características metabólicas de los microorganismos objeto de identificación. Pruebas de identificación iniciales: Morfología bacteriana Tinción de Gram Agrupamiento celular Movilidad Atmósfera de crecimiento Gram positivos .Hidrólisis del hipurato Sensibilidad a novobiocina Sensibilidad a optoquina Sensibilidad a bacitracina Sensibilidad a SXT Crecimiento en ClNa Crecimiento en bilis Producción de hemólisis Pruebas inmunológicas Catalasa Citocromo . Díaz Martín. I. San Fernando de Henares. 2º curso.DNAsa . Las pruebas podríamos clasificarlas fundamentalmente en aquellas que nos permiten la identificación de Gram positivos y pruebas para identificación de Gram negativos. aunque las reacciones de aglutinación o precipitación utilizadas son más rápidas y más específicas. como son: Micobacterias Anaerobios Rickettsias y Chlamydias Micoplasmas Espiroquetas Actinomices y Nocardias Ciñéndonos a los cuatro grupos descritos más arriba.1 Bloque temático III Pruebas de identificación Tradicionalmente la identificación de una cepa bacteriana comienza con la visualización de un frotis de la colonia aislada al que se le ha realizado una tinción de Gram: Básicamente los cuatro grandes grupos que nos encontraremos en este primer paso son los siguientes: Cocos Gram positivos Cocos Gram negativos Bacilos Gram negativos y Bacilos Gram positivos La identificación puede realizarse también sobre grupos de microorganismos con características especiales que veremos específicamente cuando tratemos a dichos grupos.T.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico.oxidasa Oxidación -fermentación Fermentación de azúcares Gram negativos ß galactosidasa (ONPG) Arginina dehidrolasa Lisina y ornitina decarboxilasa Utilización de citrato Producción de SH2 Producción de indol Ureasa Triptófano desaminasa (TDA) Reducción de nitratos Rojo de metilo Voges Proskauer Kligler Hidrólisis de la gelatina Pruebas inmunológicas Gustavo A.2 U. los laboratorios deben utilizar una rutina específica que vaya realizando de forma secuencial o simultánea una serie de pruebas que nos permitirá ir diferenciando las especies más importantes desde el punto de vista infeccioso.Fosfatasa . 16 .CAMP . (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . Jaime Ferrán Clúa. aunque hay una serie de pruebas comunes a ambos grupos que vamos a enumerar. E.Coagulasa . Pruebas de identificación bacteriana . Profesor Técnico de Formación Profesional.Lisostafina . S.

El problema reside en que no siempre pueden ponerse de manifiesto las mismas transformaciones enzimáticas o la presencia de determinados metabolitos.3 U. Díaz Martín. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.Muestra estudiada . ya sean subproductos de su metabolismo intermediario. que podrían equivocarnos al mostrar falsas reacciones. Unicamente nos indicará cuál es la especie a la que el microorganismo identificado tiene mayor probabilidad de pertenecer. la ausencia de un enzima determinado impedirá esa transformación o al menos la retardará. 2º curso. el procedimiento de identificación puede darnos una certeza absoluta sobre las conclusiones obtenidas.99%.Conservar la muestra en las condiciones establecidas si no va a ser inmediatamente procesada . por lo que las enzimas y metabolitos presentes en la bacteria. si el proceso puede desarrollarse siguiendo otra vía.Realizar el menor número posible de resiembras . La dificultad en la identificación de una especie bacteriana estriba en que los enzimas o moléculas responsables de determinados procesos metabólicos no siempre se expresan fenotípicamente. puede ponerse de manifiesto mediante una serie de reacciones químicas adecuadas.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. pero aún queda un 0. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . Jaime Ferrán Clúa. Determinadas pruebas son específicas de género o de especie en un 99. I. no diferirán mucho entre sí. Las pruebas bioquímicas. 16 .No diluir la muestra en medio líquido . La presencia de determinadas moléculas. el problema de la identificación sería mínimo. Profesor Técnico de Formación Profesional. Esto hace que tengamos que utilizar simultáneamente una gran diversidad de pruebas (pruebas bioquímicas) y comparar los resultados obtenidos con aquellas especies que presentan una mayor coincidencia.Experiencia en esas pruebas En ningún caso. S. Casi todos los miembros de una misma especie bacteriana deben poseer un sistema metabólico similar. ya provengan de la propia estructura bacteriana. E.1 Bloque temático III Una bacteria es un complejo ser vivo con un sistema de estructuras y moléculas intracelulares en parte similar al nuestro. Pruebas de identificación bacteriana . hacen fiables casi en un 100% los procedimientos rutinarios de identificación bacteriana.T.Procurar realizar la identificación a partir de un cultivo puro . unidas a otras características de identificación. La presencia de ciertos enzimas hace que las bacterias puedan actuar sobre algunos substratos y transformarlos.Factores económicos . es imprescindible tener en cuenta lo siguiente: . La elección de una prueba o de una batería de pruebas debe hacerse en función de . Para que la cepa aislada del paciente no experimente un gran número de transformaciones o mutaciones.Evitar medios demasiado selectivos Gustavo A.01% que podría llevar al traste con nuestro proceso de identificación si lo hiciésemos de forma dicotómica. Si todos los miembros de una misma especie reaccionaran idénticamente ante determinados substratos y poseyeran siempre las mismas rutas metabólicas.Especies bacterianas que se pretenden identificar . San Fernando de Henares.

Laboratorio de Diagnóstico Clínico. con la utilización de sustratos cromogénicos de conversión rápida.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Hoy día. En función del tipo de prueba o de su fundamento. Profesor Técnico de Formación Profesional. Los aspectos metabólicos que pueden estudiarse son: (ver página siguiente) Gustavo A. Pruebas lentas (de 18 a 48 horas) A este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada. entre dos y cuatro horas. En función del tiempo utilizado en la realización de la prueba podemos diferenciarlas en Pruebas inmediatas (desde segundos a algunos minutos) Dentro de este grupo tenemos la catalasa y la oxidasa. por ejemplo. I. la mayoría de las pruebas bioquímicas pueden leerse en cuatro horas aproximadamente. San Fernando de Henares. 16 .4 U.1 Bloque temático III Clasificación de las pruebas de identificación Las pruebas para realizar una identificación bacteriana deben partir de un cultivo puro donde las colonias estén perfectamente aisladas. 2º curso.T. Díaz Martín. Jaime Ferrán Clúa. También pueden incluirse todas las pruebas inmunológicas de detección de antígenos bacterianos por reacciones de aglutinación o precipitación. de manera que la identificación puede realizarse en la misma jornada laboral. S. Pruebas intermedias (menos de 6 horas) Lisostafina y coagulasa. Las pruebas de identificación bioquímica pueden clasificarse en función de la parte del metabolismo que están poniendo de manifiesto. Pruebas de identificación bacteriana . las pruebas de identificación pueden dividirse en: Pruebas bioquímicas Pruebas inmunológicas Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos Pruebas de tolerancia a condiciones especiales Hoy día se han desarrollado multitud de galerías multipruebas que permiten su lectura en un intervalo de tiempo muy corto. E. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 .

coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Por último. E.1 Bloque temático III Metabolismo respiratorio: Catalasa Citocromo-oxidasa Mecanismo de producción de energía: Oxidación-Fermentación Reducción de nitratos a nitritos Rojo de metilo Voges Proskauer Metabolismo hidrocarbonado Fermentación de hidratos de carbono Utilización del citrato Beta galactosidasa (ONPG) Metabolismo proteico: Hidrólisis de la gelatina Hidrólisis de la urea por ureasa Producción de indol Producción de ácido sulfhídrico Fenilalanina desaminasa (TDA) Prueba de las decarboxilasas LDC ODC ADH Detección de exoenzimas: Cogulasa Fosfatasa Desoxirribonucleasa Las pruebas inmunológicas utilizan las reacciones de aglutinación para poner en evidencia antígenos bacterianos. las pruebas de sensibilidad utilizan una característica de los microorganismos frente a una sustancia química o antimicrobiano que consiste en la sensibilidad o resistencia constante frente a dicha sustancia.Crecimiento en ClNa al 6. lo cual nos puede permitir confirmar o descartar la presencia del microorganismo.T. 16 . 2º curso.Sensibilidad a Metronidazol y Sulfatiazol Dentro de este grupo podríamos incluir las pruebas de crecimiento bacteriano en condiciones especiales (inhibidoras para algunos microorganismos). S. Entre las más importantes tenemos: .Sensibilidad a Novobiocina . San Fernando de Henares.5% . Jaime Ferrán Clúa. Díaz Martín.Sensibilidad a Bacitracina . Las pruebas de susceptibilidad más utilizadas son: .Sensibilidad a Optoquina . Las más utilizadas son pruebas de aglutinación para detección de: Staphylococcus aureus Estreptococos beta hemolíticos Streptococcus pneumoniae Serotipos de Salmonella Serotipos de E. Profesor Técnico de Formación Profesional.5 U. Pruebas de identificación bacteriana . Laboratorio de Diagnóstico Clínico. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . I.Crecimiento a temperatura de 10º C Gustavo A.Crecimiento (solubilidad) en bilis .Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico.

Voges Proskauer y Citrato. que el indicador vire hacia el color correspondiente al pH ácido. El siguiente paso fue la realización simultánea de varias pruebas. Pongamos otro ejemplo: la prueba de la oxidasa es una prueba que Escherichia coli y Proteus mirabilis darán negativa en el 100% de los casos. en el peor de los casos. conducía por un camino equivocado y terminaba en una identificación incorrecta. cada microorganismo era sometido a una batería de pruebas cuyos resultados se expresaban de forma numérica. virará hacia el color correspondiente al lado básico.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Ante un microorganismo problema. aunque tanto mejores serían cuanto más se acercasen al 100%. Sin embargo. limitando cada vez más las posibilidades. 2º curso. puede variar desde el 0% hasta el 100%. S. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . API fue una de las primeras denominaciones comerciales de este sistema que había logrado disminuir los costes y el tiempo para llegar a una identificación aceptable. una determinada característica no es exhibida siempre por todos los miembros de una especie bacteriana.T. Una prueba que discriminase solo el 80% de las bacterias estaría cometiendo un error de identificación en una de cada 5 identificaciones. Díaz Martín. Es célebre. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. La frecuencia con que una especie bacteriana muestra una determinada característica metabólica. por su importancia histórica. a veces era necesario esperar varios días hasta concluir el proceso de identificación. que deben escogerse entre aquellas que tengan mayor poder diferenciador. El procedimiento dicotómico que históricamente había servido para avanzar por el camino correcto de la identificación. Una prueba incorrecta. no tendríamos más que buscar el código numérico y comprobar a qué bacteria pertenecería. X. aumentar la velocidad de procesamiento. dicotómicos. Los microorganismos que fermenten la lactosa darán como resultado final unos productos ácidos que harán que el pH del medio disminuya y. Evidentemente ésta no es un prueba que nos permita diferenciar entre ambas especies. Como ejemplo podemos poner la utilización de un medio diferencial que contenga lactosa y un indicador de pH. El inconveniente de este procedimiento era que no se podía realizar la siguiente prueba hasta conocer el resultado de la anterior. E. coli siempre: ésta sí es una prueba que nos serviría para diferenciar entre las dos especies. San Fernando de Henares. que atendiendo a los resultados de una prueba seguían bifurcándose con otras pruebas. Estos esquemas de identificación estaban rígidamente estructurados y tenían poca flexibilidad ante cualquier prueba con menor poder de discriminación. cada prueba tarda en realizarse 18-24 horas. Jaime Ferrán Clúa. esto hace difícil la elección de pruebas para poder distinguir especies. fue posible codificar el enorme número de pruebas que se hacían mediante la asignación de un código numérico a cada microorganismo en función de los resultados obtenidos. que dos especies diferentes dieran positiva en un 50% de los casos. 16 . Cada especie estaría definida por un código numérico. Si tenemos en cuenta que. pueden ser objetivados mediante la utilización de un sistema visualizador que nos permita reconocer fácilmente si la reacción ha tenido lugar o no. por lo tanto. para así. la identificación de bacterias en el laboratorio de microbiología se hacía basándose en unos esquemas arborescentes. en general mayor del 95%. Tanto la disminución del sustrato consumido como la formación del producto resultante de la reacción. resultado de la codificación de las reacciones a que hubiera sido sometido. rojo de Metilo. Profesor Técnico de Formación Profesional. Gustavo A. en general. Pruebas de identificación bacteriana . la prueba de la TDA es positiva en P. ante la realización de determinadas pruebas. la batería de pruebas denominada IMVyC. Hasta hace relativamente pocos años. mirabilis en un 100% de casos y negativa en E. Así. en caso contrario. Finalmente aparecieron las galerías multipruebas. hasta que al final de una de las ramas se conseguía una identificación presuntiva. I. o una alteración o excepción en el metabolismo de una especie bacteriana. tampoco serviría para diferenciar las cepas. Una prueba cualquiera. pues la probabilidad de que se tratase de una u otra especie estaría repartida al 50%. Sin embargo. Con el advenimiento de la informática y la posibilidad de manejar muchos datos a velocidades impensables para el ser humano. ya solo podía utilizarse en contados casos.1 Bloque temático III Sistemas de identificación multipruebas (galerías) Las características metabólicas de un microorganismo solo buscan poner de manifiesto la existencia de enzimas bacterianas que son capaces de metabolizar un sustrato específico. que realizaba a la vez las pruebas de Indol. el pH del medio no cambiará y el indicador tampoco variará o.6 U. Estas pruebas eran elegidas de manera que tuvieran un poder discriminador muy alto. un sistema de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que se inoculaban individualmente y que permitían realizar simultáneamente entre 10 y 25 pruebas bioquímicas.

1 Bloque temático III El procedimiento de codificación más sencillo hubiese sido asignar un 1 a las pruebas positivas y un 0 a las negativas. Jaime Ferrán Clúa. La codificación quedaría de la siguiente manera: Prueba 1 positivo = 1 negativo = 0 + + + + 0 1 0 1 0 1 0 1 + + + + Prueba 2 positivo = 2 negativo = 0 0 0 2 2 0 0 2 2 + + + + Prueba 3 positivo = 4 negativo = 0 0 0 0 0 4 4 4 4 Código numérico 0 1 2 3 4 5 6 7 Para cada trío de resultados se adjudicaría un dígito. . San Fernando de Henares. etc. 16 . Profesor Técnico de Formación Profesional. S. E. asignándose los dígitos de 0 a 3 en el primer caso y de 0 a 1 en el segundo. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. de manera que el resultado de cada trío de pruebas quedase reducido a un dígito. El resultado hubiese sido que los códigos numéricos deberían tener entre 10 y 25 dígitos. dependiendo del número de pruebas. Supongamos tres pruebas cualesquiera: las combinaciones posibles de positividad y negatividad de todas ellas entre sí quedan reducidas a 8 casos. con el consiguiente engorro en el manejo de un número con tantos dígitos. . podría tener el siguiente código numérico: Gustavo A. así el 0 podría indicar las tres pruebas negativas.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. 2º curso. Por ejemplo.Si la primera prueba es positiva se asigna un valor de 1.Si la tercera prueba es positiva se asigna un valor de 4. un batería de 10 pruebas con unos resultados establecidos aleatoriamente por nosotros.7 U. se efectuaría el agrupamiento de las sobrantes (dos o una prueba). (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 .T. Para codificar el dígito de un trío de pruebas se establece el siguiente sistema: .Si la segunda prueba es positiva se asigna un valor de 2. Pruebas de identificación bacteriana .Si una prueba cualquier es negativa se le asigna un valor de 0 (cero) a la prueba. En caso de que el número de pruebas no fuese múltiplo de tres. el 1 solo la primera prueba positiva. I. El código numérico se obtiene sumando los valores de las tres pruebas. Díaz Martín. Veámoslo: Prueba 1 + + + + Prueba 2 + + + + Prueba 3 + + + + - A cada combinación de resultados podríamos asignarle un dígito de 0 a 7. Los límites inferior y superior del código son 0 y 7 respectivamente. Para evitar este excesivo número de dígitos se utilizó un procedimiento ingenioso: agrupar los resultados de las pruebas de tres en tres. .

1 Bloque temático III Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5 Prueba 6 Prueba 7 Prueba 8 Prueba 9 Prueba 10 Resultado + + + + + + + Valor 1 0 4 0 2 4 1 2 0 1 Dígito 5 6 3 1 El código numérico de esta combinación de resultados sería 5631 y ese sería el código que deberíamos buscar en nuestro libro de códigos para conocer la identificación del microorganismo. E. Utilizando la teoría de probabilidades y aprovechando las capacidades actuales de los ordenadores (rapidez y memoria). podríamos predecir que si estudiásemos cualquier cepa de alguna de estas especies. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 .8 U. Jaime Ferrán Clúa. expresándolo en forma de porcentaje sobre el total de bacterias investigadas. Si la batería fuese de 20 pruebas. hemos sido capaces de valorar no una sólo. los resultados podrían ser: Indol + + Citrato + VVoges Proskauer + - E. . Una vez hecho esto podríamos encontrarnos.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. San Fernando de Henares. coli K. La razón es que en muchas ocasiones existen especies atípicas que nos desvían en el árbol de identificación sin llevarnos a ninguna caracterización concreta. con la siguiente tabla que nos permitiría diferenciar entre estos microorganismos utilizando tres pruebas Indol 96% 1% 85% Citrato 6% 98% 30% Voges Proskauer 1% 92% 1% E.: Variable negativo Gustavo A.: negativo . pneumoniae P vulgaris A la vista de estos resultados. sino varias decenas de características simultáneamente para poder identificar correctamente un microorganismo. La ventaja de este sistema de identificación es que permite calcular la probabilidad de que una bacteria muestre un perfil de pruebas bioquímicas concreto. coli K. V. Pruebas de identificación bacteriana . S. Profesor Técnico de Formación Profesional. y el último de ellos correspondería a la suma de valores de dos pruebas.T. Para ello habría que valorar un número de cepas de cada especie relativamente alto ( más de 300). I. Díaz Martín. 16 . el código numérico tendría 7 dígitos. 2º curso. El primer paso seria estudiar los porcentajes de positividad de una bacteria para una determinada prueba o característica. pneumoniae P vulgaris + : positivo. Fundamento del sistema de codificación numérica en la identificación de microorganismos La identificación de los microorganismos basándose en los sistemas dicotómicos tradicionales que valoraban las pruebas bioquímicas una a una ha dejado de ser válida. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. por ejemplo.

vulgaris Por todo ello podríamos concluir que. Sin embargo. Profesor Técnico de Formación Profesional..000784 + 0.85 * 0.25245 Sumadas las tres probabilidades tendíamos: pt = 0.0. podríamos pensar que pertenece a cualquier especie de las tres citadas que presentase una alteración en su metabolismo. coli.01) .09% 30. vulgaris p2 = p3 = 0.57024 * 100 / 0823474 = 0. E.0. S.57024 + 0.01) 0. Voges Proskauer .57024 Haciendo lo mismo con los otros dos microorganismos encontraríamos: Para K.98 * (1 .9 U. Jaime Ferrán Clúa.06 * 0.66% para E.24% 0. la probabilidad mayor de obtener una correcta identificación con estas tres pruebas y basándonos en los resultados obtenidos previamente.96 0. está claro que esta combinación no se ajusta a ninguno de los patrones normales. la probabilidad sería: Probabilidad de ser Indol positivo: Probabilidad de ser Citrato positivo: Probabilidad de ser Voges Proskauer negativo: (1. Gustavo A.000784 * 100 / 0823474 = 0. y en principio. 16 . a la vista de estos resultados.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. podríamos calcular la probabilidad de que esa combinación correspondiese a cada uno de los gérmenes estudiados. coli para K. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.1 Bloque temático III Si nosotros realizásemos estas tres pruebas a un microorganismo que queremos identificar y obtenemos los siguientes resultados: Indol +. 2º curso. sería para Escherichia coli a pesar de que el citrato no sea una prueba que esta especie dé positiva con frecuencia. (28830 Madrid) Curso 2006-2007 Código 28038616 . Pruebas de identificación bacteriana . la probabilidad relativa de que esa combinación de resultados corresponda a cada uno de los tres microorganismos será: 0.T. Esto se haría así: Para E.25245 * 100 / 0823474 = 69. pneumoniae para P.96 * 0.823474 Si la probabilidad total es la sumada. con la taxonomía numérica. I. Citrato +. p2 = 0.0.000784 p3 = 0.99 p1 = 0.06 0.99 La probabilidad total será el producto de las probabilidades: p1 = 0.25245 pt = 0.01 * 0. San Fernando de Henares.92) : 0. pneumoniae Para P.30 * (1 . Díaz Martín.

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