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Western Blot

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Biol. Cel. Sistema de endomembranas. Maestría en Biología Experimental.

Prof. Leticia Bucio Ortiz

TÉCNICA WESTERN BLOT INTRODUCCIÓN Una parte importante en la investigación es la purificación e identificación de diferentes moléculas biológicas, cómo las proteínas. Las cuales deben de encontrarse libres de contaminantes si se han de caracterizar adecuadamente. La primera etapa es el aislamiento de las proteínas, habitualmente las proteínas son liberadas de las células. El método de elección depende del tejido de procedencia, así como la localización de las proteínas en la célula. Si la proteína se localiza en el citosol, su liberación sólo requiere la apertura de la célula por ruptura (lisis), es el método más sencillo y suave de efectuar. Ya separada la proteína de su entorno natural, debe de controlarse todas las fases del proceso de purificación. Existen diferentes métodos de purificación como por ejemplo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía sobre papel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de resolución elevada (HPLC), la electroforesis, etc. El Western Blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de proteínas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unión de las proteínas para su análisis. MATERIAL Y MÉTODOS. Extracción de proteína
Para realizar electroforesis 1 Cámara de electroforesis: Tubos ependorf de 2 ml y 600 µ l Centrífuga a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC 1 Fuente de poder 1 Juego de micropipetas con puntas 1 Baño María 95 oC. Hielo 1 Jeringa Hamilton de 50 µ l Cámara multipozos o gradilla para ependorff Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 µ l. Para realizar el Western Blot Determinación de proteínas 1 Cámara de transferencia: 2 placas de plástico. 2 Cajas de plástico para contener la membrana de transferencia 8.5 X 5.5. cm 4-5 Cajas de plástico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones. 1 Fuente de poder Para realizar 2 geles: 1 Agitador de placas. 2 Viales con agitador magnético. Regla y lápiz 1 Parrilla con agitación. Hielo Guantes Papel filtro Watman no. 3 2 juegos de vidrios limpios. 2 peines Membrana de Nitrocelulosa 1 Juego de micropipetas con puntas Tubos para centrífuga de 50 y 10 ml, Costar

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8 con HCl almacenar a 4º C (preparar sólo lo necesario o guardar por 10 días a 4ºC) Preparación de las muestras de proteínas Tris-HCl pH=6.8 (0.44 g 14.1753 g IGEPAL 0.4 ml Agua desionizada 4.197 g NaCl 120 mM 0.5 g Aforar a 1 litro H2O ajustar a pH= 8.2 ml Almacenar a T° ambiente.6 ml del de 1. Prof.8 Tris-base 18.8 Tris-base 6g Agua desionizadas 100 ml Ajustar a pH 6.5 M) 0.5 M glicerol 0.8 ml SDS al 10 % 1.0 ml Electroforesis Buffer de corrida 1X 10 X . TBS 2.105 g NaVO3 200µ M 0.05% 1. Sistema de endomembranas.4 g Metanol 200 ml SDS 0.4 ml β -mercaptoetanol 0.05 % 0.4 g Agua desionizada 50 ml SDS al 10 % SDS 10 g Agua desionizada 100 ml almacenar a temperatura ambiente Persulfato de Amonio al 10% Persulfato de amonio 1g Agua dest.125 µ l y aforar Ajustar pH 8. Tris Base 3 g 30 g Glicina 1. Maestría en Biología Experimental.42 g de Tris-HCl (20 mM) 8 g de NaCl (137 mM) Western Blot TBS-Tween 20 0.5 M tris-HCl pH 6.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS. Leticia Bucio Ortiz SOLUCIONES Extracción de Proteínas BUFFER DE LISIS Para 25 ml.6 ml del de 20% Azul de bromofenol 0. TRIS-HCl 50 mM 0. 2 .006 g Finalmente por 1 ml de buffer agregar 80 µ l de cocktail anti-proteasas (1 pastilla en 2 ml de agua) Solución Acrilamida-Bis Acrilamida 14.4 g SDS 1 g 10 g Agua desionizada 1 L 1L Transferencia Buffer de transferencia Tris-base 03.Biol.5 M tris-HCl pH 8. 8 .6 g Bis-acrilamida 0. 10 ml Buffer para muestras 4X Preparación del Gel Solución 1.0 y agregar NaF 100 mM 0.5 g Agua desionizada 100 ml Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4º C Solución 0.5 % 0.3 Metanol absoluto. Cel.03 g Glicina 14.

b) Considerar las cantidades indicadas en la siguiente tabla para la preparación de 2 geles.. III.Cuantificación de proteínas por el método de Bradford o el utilizado en cada laboratorio. Las células se lavarán con PBS y se resuspenderán en 250 µ l de buffer de lisis con inhibidores de proteasas y se incubarán en hielo por 15 min. Después de este tiempo se lavaran las células con PBS. Prof. 2.-Condiciones de cultivo y tratamiento de las células. el cual se centrifugará a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC. Se sembrarán 2. IV. 3 . Posteriormente se cambiará el medio por uno libre de SFB por 3-24 horas..5 x 106 células en cajas de Petri de 6 cm2 con medio Williams-completo. Después.6 Aforar a 1 litro Albúmina 0. etc. Sistema de endomembranas. 2.Preparación del Gel. II. Maestría en Biología Experimental. dejándolas estabilizar por 24 horas.Biol. Leticia Bucio Ortiz Ajustar el pH a 7. 1. factores de crecimiento.) y tiempo de exposición. 3.Extracción de Proteínas 1. Se requiere conocer en qué volumen de homogenado celular se tiene 50 µ g de proteínas. Cel. a) Limpiar cuidadosamente los vidrios para hacer los geles. dejar reposar 10-15 min para gelificación completa.4 g de albúmina en 40 ml de TBS-Tween 20 DISEÑO EXPERIMENTAL Leche al 5 % 2 g de leche descremadaen 40 ml de TBSTween 20 I. Recuperar el sobrenadante y tomar una alícuota para cuantificar la concentración de proteína total por el método de Bradford. acetaldegìdo. c) En un vial colocar los reactivos para hacer el gel de corrida.1% 0.. agitar suavemente. pasado este tiempo se retirará el medio y se remplazará con medio sin SFB junto con el reactivo para el tratamiento elegido (etanol. las células se cosecharan raspándolas y haciendo un homogenado celular. tener cuidado al poner el persulfato casi inmediatamente vaciar la solución ya que se inicia la gelificación en algunos minutos.

V.50 0. 5. Elaboración del gel de corrida y gel concentrador . ya que gelificará casi inmediatamente) y colocar el peine.Electroforesis 1. VI. antes de agregar las muestras de proteínas para correr la electroforesis.05 1.M.5 M pH 6. Considerar además la muestra del estándar de proteínas que llevará 10 µ l. preparar en otro vial la solución para el gel concentrador (cuidado al agregar el persulfato. 4 . Sistema de endomembranas. 1. durante 30 min. se recomienda hacer una corrida previa a 200 volts. con jeringa de 50 µ l.. y lavarla con agua caliente en cada toma de muestra.33 10 µ l 50 10 50 10 15 % 2.8 ml SDS 10 % Archilamida-Bis TEMED Persulfato de amonio µ l Volumen total ml ml ml Tris-HCl 0. dejar reposar de 10-15 min. Leticia Bucio Ortiz d) Posteriormente. Una ves hechos los geles.-Preparación de las Proteínas. Cel. 4. Prof. quitar los peines a cada uno. 3. Hervir en B. con 20 µ l de buffer de muestra.5 M pH 8.8 ml SDS 10 µ l % Archilamida-Bis µ l TEMED e) Una vez que está listo el gel.1 3. Reactivos Agua desionizada ml De Corrida 10 % 4.02 2. Agregar el volumen de la proteína equivalente a 50 µ g .M.5 0.1 5 10 Concentrador Agua desionizada ml 3. 2.25 50 650 10 µ Persulfato de amonio µ l Volumen total ml l 25 5 Tris-HCl 1. a 95oC por 5 min. Maestría en Biología Experimental.Biol.34 2. Cargar la muestra. Colocar en cada eppendorf de 200 µ l (tantos según las muestras que se tengan) 10 µ l de buffer de muestra. con mucho cuidado para mantener los carriles de los pozos. Hacer lo mismo con 8-10 µ l del estándar de P.

en agitación constánte. 8. lavados y colocación de los anticuerpos: 1.Biol. sacar la membrana con la cara transferida hacia arriba y bloquearla con 15-20 ml de leche al 5% . Una vez terminada la transferencia. además cortar 4 papeles filtro (Watman No. lavar la 4.Bloqueo.5 X 5. 9. Lavar la membrana con solución de TBS-Twen 20 y se puede dejar la membrana en esta solución hasta el día siguiente para continuar. a 4° C. Prof. sacar la membrana con la cara transferida hacia arriba y bloquearla con 1520 ml de leche al 5% en TBS-Tween 20. Si quedan carriles sin muestra.-Transferencia: 1.. de la siguiente manera: negro/fibra/2 papel filtro/gel/membrana/2 papel filtro/ fibra/blanco Las fibras y el papel filtro se mojan en el buffer de transferencia. Poner la transferencia a 110 V durante 60 min. cuidando que no se mezclen.. En lo que corre la electroforesis. dentro del refrigerador y con agitación constante del buffer de transferencia. Terminada la transferencia. Cargar cada una de las muestras en los carriles del gel. para ello se coloca la cámara en una tina con hielo) o toda la noche a 30 volts. Hacerlo utilizando guantes. durante 15-60 min. 3. Maestría en Biología Experimental. VIII. cuidar de lavarla cada que se coloque una nueva muestra. Llenar la cámara con buffer de transferencia y el depósito blanco con agua. Activar la membrana de nitrocelulosa sumergiéndola en metanol absoluto por 30 seg. 8. 5 . 4. cortar la membrana de nitrocelulosa a la medida del gel aprox. despegar el gel de los cristales. para ello utilizando la jerina Hamilton. 3. agregarles sólo buffer de muestra. colocarla en la cámara de transferencia. 3) del mismo tamaño. Leticia Bucio Ortiz 2.5 cm. antes de acomodarlos. Colocar los geles en la cámara de electroforesis y llenar con el Buffer de Corrida en el interior y exterior de los geles. Sistema de endomembranas. 7. Cel. Terminado el tiempo de la electroforesis. 2. Correr la electroforesis a 200 volts durante 60 min. Colocar todos los componentes en la unidad de transferencia. 6. cortar el gel de concentración y con mucho cuidado sumergirlo en el buffer de transferencia. Una vez cerrada la placa de plástico. membrana con agua desionizada y después colocarla en el buffer de transferencia. VII. 5. Serrar 5.

2 Revelar y fijar la película. Colocar la membrana en la placa reveladora cubierta con plástico y exponerla a una película Kodak por 30 seg.0 X. Sta.0.. Cel. pero utilizando como anticuerpo primario a la Actina y como anticuerpo secundario Solución de estripeado Tris-Base 50 mM pH=2. Poner a la membrana 2 ml de sustrato luminiscente (Kit SuperSignal® West Pico Substrate). exponer más o menos tiempo.. Leticia Bucio Ortiz 2. Sistema de endomembranas. Actina goat polyclonal Anticuerpo Secundario Goat anti-rabbit.Revelado 1 Realizarlo en cuarto obscuro. Poner 3 µ l del anticuerpo secundario. Poner el anticuerpo primario policlonal o monoclonal de la proteína que se desea visualizar. Cruz. Dependiendo de la intensidad de las bandas. durante1 h o toda la noche en agitación. en 12 ml de la solución de albúmina en TBS-Tween 20 (para dos membranas). Lavar: 2 veces con TBS-Tween 20. Sta. 2 ó 3 veces para eliminar el exceso de leche. IX. 7. Nota: considerar siempre en que está hecho el anticuerpo primario para usar correctamente el anticuerpo secundario. cambiando la soluciòn cada 30 min. 5.Biol. Nota: Para normalizar la cantidad de proteína de las bandas. 4. 3 Cuantificar por análisis densitométrico. Pasado este tiempo lavar con TBS-Tween 20 la membrana. generalmente diluída (1:200 o 1:500 o 1:1000) según se indique. Lavar la membrana con Tris-Base pH= 2. por 15 min. Lavar 2 veces 10 min con TBS-Tween 20 y 1 vez por 5 min con TBS-solo. Maestría en Biología Experimental. 6. Anticuerpo Primario policlonal de conejo. por 2 h. manejando la membrana con pinzas. Cruz Mouse anti-goat 6.057 g en 1 L de agua desionizada. en 30 ml de la solución de albúmina en TBS-Tween 20 por 1 h. se “estripea” la membrana (se lava de las proteínas adheridas) y se repiten los puntos del 3 al 7 del paso VIII. 3.“Estripeado”. Prof. 6 .

Maestría en Biología Experimental.Biol. Cel. Sistema de endomembranas. Prof. Leticia Bucio Ortiz 7 .

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