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UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Síntesis de 3’,6’Dihidroxispiro(isobenzofurano-
1(3H),9’-(9H)xanten)-3-ona (Fluoresceína)

Villanueva Flores Francisca y González Ríos Jorge Arturo


Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guanajuato.
villanueva_francis@hotmail.com
somagoss@hotmail.com

Recibido: 12 de mayo, 2008.

El presente trabajo se refiere a la práctica libre del laboratorio de química orgánica,


misma que trata acerca de la síntesis del compuesto fluorescente denominado
comúnmente fluoresceína, el cual tiene múltiples aplicaciones en medicina oftálmica,
investigación en el área de microbiología, en la utilización de los sistemas pluviales
entre otros; esto mediante un mecanismo del tipo SEAr entre dos equivalentes de
resorcinol por uno de anhídrido ftálico en medio ácido.

1
1.0 Introducción longitudes de onda y emite luz
fluorescente de longitud de onda larga.
1.1 Historia (Véase figura 2).

La fluoresceína fue descubierta


por el químico profesor y premio Nobel
de Química (1905) Johann Friedrich
Wilhelm Adolf von Baeyer (1835-
1917).
1.2 Descripción
Es un fluoróforo comúnmente
usado en microscopía, en un tipo de
láser de colorante como la ganancia
media, en medicina forense y la Figura 2. Fluoresceína bajo UV
serología para detectar manchas de iluminación.
sangre latente, y en la localización de
tinte. Fluoresceína tiene una absorción
máxima a 494 nm y de emisión máxima Los factores que afectan la
de 521 nm (en agua). Por otra parte, fluorescencia incluyen:
fluoresceína tiene un punto isosbestic
(igualdad de absorción de todos los a) Concentración de la sustancia;
valores de pH) a 460 nm. Fluoresceína
se sabe también como un color aditivo b) pH de la solución;
(D & C Yellow No. 7). La forma de sal
disódica de fluoresceína que se conoce c) Presencia de otras sustancias;
como D & C amarillo no. 8. (Véase
figura 1). d) Longitud de onda de la luz excitante.

A un pH de 8, lafluoresceína
alcanza su máxima intensidad.
1.2 Usos
Por ser un pigmento
fluorescente, tiene múltiples
aplicaciones en serigrafía,
microbiología, etc., dado que se utiliza
como medio de contraste.
La fluorescencia de esta
molécula es muy alta, y se produce la
Figura 1. Estructura 3D de la excitación a 494 nm y de emisión a 521.
fluoresceína.
Tiene un pK a de 6,4 y su
equilibrio de ionización da lugar a pH
Es hidrosoluble de color amarilla dependiente de la absorción y emisión
que pertenece al grupo de las xantinas, en el rango de 5 a 9. Por otra parte, la
que produce un color fluorescente verde fluorescencia de la vida y protonadas
intenso en soluciones alcalinas (pH deprotonado formas de fluoresceína son
mayor a 5). Cuando se expone a la luz, aproximadamente 3 y 4 ns, lo que
la fluorescencia absorbe ciertas permite una determinación del pH no de
intensidad, las mediciones. La vida 1.2.1.2 Reacciones secundarias tras la
puede ser recuperada utilizando el administración3
tiempo de correlación único fotón o Tópica, oral, intravenosa y el
contar con modulación de fase uso de fluoresceína puede causar
flourimétrica. reacciones adversas, incluida la náusea,
1.2.1 Uso en medicina1 vómito, urticaria, hipotensión aguda,
anafilaxia4 y las formas conexas de
La fluoresceína, en forma de
reacción anafiláctica, paro cardíaco, y
fluoresceína sódica, es utilizada en el
muerte súbita. Vía intravenosa tiene la
examen de fluoresceinoangiografía del
mayoría de reacciones adversas,
fondo y de la vasculatura del iris del
incluida la muerte súbita, pero esto
ojo. (Véase figura 3).
puede reflejar un mayor uso en lugar de
1.2.1.1 Aplicación mayor riesgo. Ambos orales y tópicos
La fluoresceína se administra usos se han notificado a causar
por inyección en la vena cubital2 y el anafilaxis, [8] [9], incluyendo un caso de
colorante tarda de 10 - 15 segundos en anafilaxia con paro cardíaco
5
aparecer en los vasos coroideos y (resucitado), después de uso tópico en
retinianos lo que permite detectar una caída de ojos. Las tasas de
anormalidades vasculares del fondo y reacciones adversas varían de 1% a 6%.
del iris del ojo. También puede ser Las tasas más altas pueden tener en
administrada por vía oral pero para cuenta poblaciones de estudio que
estudiar otras entidades o en caso de incluyen un mayor porcentaje de las
que la persona sujeta al estudio tenga personas con reacciones adversas
venas escondidas o inaccesibles. En esta previas. El riesgo de una reacción
condición, la sustancia puede tardar adversa es 25 veces mayor si la persona
hasta media hora en aparecer en el ha tenido una reacción adversa previa.
[12]
fondo. El riesgo puede reducirse con
anterioridad (profilácticos) el uso de
antihistamínicos6 e inmediata de
3
Noga EJ, Udomkusonsri, P. (2002).
"Fluoresceína: una rápida, sensible, Nonlethal
Método para detectar úlceras en la piel de
pescado". Vet Pathol 39: 726-731 (6). PMID
12450204. Obtenido en 2007 - 07-16.

4
Harrar N, Idali B, Moutaouakkil S, el Belhadji
M, Zaghloul K, Amraoui A, Benaguida M
(1996). "[Shock anafiláctico causado por la
Figura 3. Evaluación estática de la aplicación de fluoresceína en la conjuntiva
lente inicial por pigmentación con ocular]" (en francés). Presse Med 25 (32): 1546-
fluoresceína. 7.

5
Gómez-Ulla F, Gutiérrez C, Seoane I (1991).
"Severa reacción anafiláctica a fluoresceína
administrado por vía oral".. Am. J. Ophthalmol.
1
El diagnóstico y tratamiento de la anafilaxia - 112 (1): 94.
XXI. Reacciones anafilactoides a fluoresceína.
J Allergy Clin Immunol 1998; 101: S465-528. 6
Kwan AS, Barry C, McAllister IL, Constable I
(2006). "Angiográfica y de las reacciones
2
Kinsella FP, Mooney DJ (1988). "Anafilaxia adversas al fármaco a examinar: el Lions Eye
siguientes oral angiografía fluoresceínica".. Am. experiencia".. Clin. Experimento. Ophthalmol.
J. Ophthalmol. 106 (6): 745-6. 34 (1): 33-8.
gestión de emergencias de cualquier
subsiguiente anafilaxia. Una simple
prueba puede ayudar a identificar a las
personas con mayor riesgo de
reacciones adversas
La más común es la reacción
adversa náuseas, debido a una
diferencia en el pH del cuerpo y el pH
de la fluoresceína de sodio, colorante.
La náusea es generalmente transitorios Figura 4. Espectroscopia UV vis de la
y subvenciones rápidamente. La floresceína en solución básica, neutra y
urticaria puede ir desde una pequeña ácida.8
molestia a grave. Una sola dosis de
antihistamínicos pueden dar alivio
completo. Shock anafiláctico y la
posterior parada cardíaca y muerte
súbita son muy raros, sino porque se
producen en cuestión de minutos, un
proveedor de servicios de salud que Figura 5. Espectro en la región del
utiliza fluoresceína debe estar preparado infrarrojo de la fluoresceína.
para realizar la reanimación de
emergencia.
1.2.1.2.1 Precauciones
Antes de inyectar la sustancia
debe hacerse una prueba intradérmica
para desechar la posibilidad de alergia a
la fluoresceína.7 Figura 6. Espectro en la región del
infrarrojo de la sal sódica de
1.2.2 Indicador ácido-base fluoresceína.
Además, la flouresecína
también puede emplearse como
indicador ácido base, ya que como se Dichos espectros se
mencionó, el color depende del pH. Tal obtienencuando la molécula en cuestión
diferencia es más evidente si se analizn es irradiada con radiación
los espectros de absorción respectivos electromagnética del intervalo que va de
en l región del ultravioleta visible (UV- 300 a 800 nm.
vis). (Véase figura 4, 5 y 6).
Los espectros obtenidos son una
gráfica de las longitudes de onda que la
molécula absorbe, pero el color que
observamos es en realidad la
combinación de aquellas longitudes de
onda que la molécula nos devuelve. La
radiación absorbida por la molécula le
7
M Hitosugi, Omura K, Yokoyama T, H
provoca una transición electrónica, que
Kawato, Motozawa Y, Nagai T, Tokudome S es un cambio en forma por la molécula
(2004). "Una autopsia caso de shock
8
anafiláctico fatal tras la angiografía Kira, L. A. Enciclopedia de tecnología
fluoresceínica: reporte de un caso".. Med Sci química, Tomo XI, John Wley & sons, 3ª ed.
Ley 44 (3): 264-5. US, 1978.
y tamaño de su nube de electrones. dentro de las células. Esta aplicación es
Posteriormente la molécula regresa a su común en la levadura pantalla.
estado inicial, o basal, disipando la
energía recibida, vibrando, rotando Fluoresceína también puede ser
deformándose o emitiendo luz, este conjugado con los trifosfatos
último fenómeno permite obtener los nucleósidos e incorporarse a una sonda
espectros de emisión de la molécula.9 para la hibridación in situ. Fluoresceína
que lleva la etiqueta de sondas, se
1.2.3 Utilización de los sistemas pueden visualizar mediante FISH, o el
fluviales10 blanco de anticuerpos mediante
Uno de sus más reconocibles se inmunohistoquímica. Esta última es
utiliza en el Río Chicago, donde una alternativa a digoxigenina, y los dos
fluoresceína fue la primera sustancia se utilizan conjuntamente para el
utilizada para el tinte verde en el río etiquetado dos genes en una muestra
Santa Patrick's Day en 1962. En 1966
los ecologistas obligó a cambiar a un 1.3 Derivados
vegetal basada en tinte para proteger a
los miles de peces dorados que poblan Hay muchos derivados de
el río. fluoresceína, por ejemplo isotiocianato
de fluoresceína, a menudo abreviado
Otros usos de fluoresceína como FITC.11 FITC es la molécula
incluyen el uso como soluble en agua, original fluoresceína funcionalizado con
colorante añadido a las aguas pluviales un isotiocianato grupo (-N = C = S), en
en las pruebas de simulación del medio sustitución de un átomo de hidrógeno en
ambiente para ayudar en la localización la parte inferior del anillo de la
y análisis de cualquier fugas de agua, y estructura. Este derivado se reactiva
en Australia y Nueva Zelanda como un hacia aminas grupos sobre las proteínas
espíritu metilado tinte. en las células. A-succinimidyl ester
1.2.4 Investigaciones Biológicas grupo funcional adjunta a la
fluoresceína básicos, la creación de
En biología celular, el
NHS-fluoresceína, otra forma común de
isotiocianato de fluoresceína derivado a
amina reactiva derivados. (Véase
menudo se utiliza para etiquetar y hacer
figuras 7 y 8).
el seguimiento de las células en la
microscopía de fluorescencia
aplicaciones (por ejemplo, la citometría
de flujo). Adicional moléculas
biológicamente activas (como los
anticuerpos) también puede ser adjunta
a la fluoresceína, lo que permite a los
biólogos el objetivo fluoróforo a
proteínas específicas o estructuras
Figura 7. Estructura de la NHS-
fluoresceína.
9
Lakowics, J. R. 1986. Principles of
Fluorescence spectroscopy. New York, Plenum
Press, pp 14-18.

10 11
Sun, WC; Gee, KR; Klaubert, DH; Haugland, Fineschi V, G Monasterolo, Rosi R, Turillazzi
RP, de síntesis de Fluoresceins fluorados. E (1999). "Fatal choque anafiláctico durante
Journal of Organic Chemistry 1997, 62, (19), una angiografía fluoresceínica.". Forense Sci.
6469-6475. Int. 100 (1-2): 137-42.
De donde se observa claramente el sitio
para la sustitución aromática
electrofílica, donde el resultado final es
el rápido equilibrio entre la forma
lactoide y cinoide de la fluoresceína:

Figura 8. Estructura de la eritrosina,


pigmento sanguíneo.

Otros derivados de fluoresceína


incluir Oregon Green, Tokio Verde,
SNAFL, y carboxynaphthofluorescein.
Estos derivados, junto con las nuevas
fluors como Alexa 488 y DyLight 488,
han sido adaptados a diversos químicos
y biológicos aplicaciones en las que
mayor fotoestabilidad, las diferentes
características espectrales, o diferentes
grupos de apego son necesarios. Posteriormente, al disolverla
en una solución de NaOH, la
2.0 Resultados floureceína altera su estructura de tal
forma que genera la coloración
Los resultados obtenidos se característica:
resumen en la tabla 1.
Producto Nombre IUPAC Estructura
1 3´,6´
2.1 Observaciones Dihidroxispiro
[isobenzofuran-
Su apariencia fue de un polvo rojo 1(3H),9´-[9H]
amarillento a rojo-café. Soluble en xanten]-3-ona.
hidróxidos alcalinos diluidos e insoluble
Masa exp. %Rend.
en agua.
1
p.f teórico p.f exp.
3.0 Discución 1 320°C No determinado

La fluoresceína se obtiene
mediante una sustitución aromática
electrofílica del resorcinol sobre el
anhídrido ftálico.12

El resorcinol presenta las siguientes


estructuras resonantes:

Con objeto de mejorar el


rendimiento, podría probarse otra ruta
12
Landgrabe, J. A. 1992. Theory and practice in sintética, se usa también el resorcinol y
organic laboratory. 4ª ed. USA, Books/Cale. Pp. el anhídrido ftálico, pero en presencia
489-492.
de ZnCl2 a través de una reacción de 1.1 g de resorcinol y 0.75 g de anhídrido
Friedel-Crafts. ftálico y se colocaron en un matraz
redondo de 25 mL y 5 mL de agua
destilada y añadieron cuidadosamente
0.25 mL de ácido sulfúrico concentrado.
Posteriormente el sistema se sometió a
reflujo a temperatura entre 140 y 160º C
durante 30 minutos. Transcurrido este
Un tercer método para sintetizar tiempo se observó una masa dura colr
fluoresceína es usando ácido café rojizo oscuro. El contenido del
metanosulfánico como ácido Lewis y matraz se vertió en un vaso de
como catalizador. Esta ruta tiene un precipitado con 30 mL de agua y 2 mL
alto rendimiento bajo condiciones leves, de HCl al 36-38% y con esta mezcla se
que a nivel industrial implica menores enjugó el matraz bola.
costos de producción. La mezcla descrita se calentó
por 10 minutos a Baño María hasta
Conclusiones desintegrar los trozos de fluoresceína
cruda.
El porcentaje de rendimiento Se filtró el sólido y se lavó tres
obtenido no es del todo satisfactorio, veces con agua helada y se dejó secar.
por lo que se establecieron nuevas rutas La prueba de florescencia se
sintéticas en la sección anterior con el efectuó de la siguiente manera:
objeto de mejorarlo, o quizás es Primero se prepararon 40 ml de
necesario modificar el medio en que una solución de NaOH con un pH de 8,
reaccionan, ya que la técnica no que es con el cual, la fluoresceína
establecía el medio en que se iba a alcanza su máxima coloración, a la
reflejar y nosotros optamos por el agua, solución se le disolvió 0.1 g de
quizás, reflujando en un medio en que floresceína y se sometió a un haz UV
ambas sustancias se solubilizen la usando la onda corta de 370 nm, con
reacción será más satisfactoria. ésta se observó una coloración verde
fuorescente intensa. Se sugiere efectuar
Sección experimental:13 las misma pruebas en agua destilada
(pH=7) y medio ácido.
El nombre según la IUPAC de la
fluoresceína es 3´,6´ Resorcinol15: Punto de ebullición:
Dihidroxispiro[isobenzofuran-1(3H),9´- 280°C Punto de fusión: 110°C
[9H] xanten]-3-ona. Debe contener no Densidad: 1.28 g/cm3 Solubilidad en
menos de 97,0 por ciento y no más de agua, g/100 ml: 140 Presión de vapor,
102,0 por ciento de C20H12O5, calculado Pa a 20°C: 1 Densidad relativa de vapor
sobre la sustancia anhidra.14 (aire = 1): 3.8 Densidad relativa de la
Para la síntesis de la mezcla vapor/aire a 20°C (aire = 1):
fluoresceína, se molieron en u mortero, 1.00 Punto de inflamación: 127°C c.c.
Temperatura de autoignición: 607°C
13 Límites de explosividad, % en volumen
Yuichiro Ueno; Jiao, G.-S.; Burgess, K.,
Preparación de 5 - y 6-carboxifluoresceína.
en el aire: 1.4 ? Coeficiente de reparto
Procedimientos útiles sintéticas de 2004, 31, octanol/agua como log Pow: 0.79-0.93
(15), 2591-2593.

14 15
Eaton, David C. 1989. Laboratory Consultar riesgos en el manipuleo en
Investigations in Organic Chemistry. USA, http://www.mtas.es/insht/ipcsnspn/nspn1033.ht
McGraw-Hill, pp.406-412. m
Anhídrido ftálico16: Punto de
ebullición :285°C
Punto de fusión : 133°C
Punto de inflamación : 151°C
Temperatura de auto ignición : 580°C
Límites de explosión (inferior/superior):
1,7 / 10,4 vol. %
Presión de vapor: 20 hPa (150°C)
Densidad (20/4): 1,53
Solubilidad: 6,2 g/l en agua a 20°C

Ácido clorhídrico: Punto de ebullición:


- 121.1 °F ( - 85 °C ); Densidad del
líquido al punto de ebullición: 74.3 lb /
ft3 ( 1190 kg / m3 ):; Presión de vapor:
A 70 °F ( 21.1 °C ) 612.1 psia (4220)
kpa; Solubilidad en agua: Muy soluble.

Ácido sulfúrico:17 Densidad 1.800


kg/m3; 1.8 g/cm3 Masa 98,08 u Punto de
fusión 283 K (10 °C) Punto de
ebullición 610 K (337 °C) Solubilidad
en agua n/d KPS n/d ΔfH0gas -735.13
kJ/mol fH0líquido -814 kJ/mol S0gas, 1 bar
98.78 J·mol-1·K-1 0líquido, 1 bar 9 J·mol-1·K-1

16
http://www.panreac.com/new/esp/fds/ESP/X1
61155.htm

17
http://es.wikipedia.org/wiki/Acido_sulf%C3%
BArico