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Bol. Micol. Vol.

23 CONTENIDO
MICOLOGIA MEDICA

pp. 1 - 101 Valparaíso (CHILE)

Diciembre 2008

Aspergilosis cerebral: reporte de caso. E. Contreras, G. ir al artículo E. Posada & S. X. Zuluaga ……................................... 43 TAXONOMIA Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: Claves para las especies ambientales y clínicas más ir al artículo comunes. E. Piontelli. …...........................................…… 49 ECOLOGIA Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo. T. I., Rojas, E. Martínez, M. J. Aira, ir al artículo & M. Almaguer. ...................................................….......... 67 Microhongos oportunistas asociados al «musgo Pompon» desecado (Sphagnum magellanicum Brid.) en Chile. E. ir al artículo Piontelli, R. Cruz & V. Vivar. …...................................… 75 Notas sobre el género Geastrum Pers. en Chile central. ir al artículo H. Madrid. ….....................................................................…. 87

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus parasiticus en niño inmunocomprometido. R. Salim & ir al artículo R. Runco. …................................................................……. 1 Caso clínico: Aspergilosis pulmonar invasiva tratada con Voriconazol en paciente con Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida. H. Arias, R. Cruz, M. de la Prida, ir al artículo W. Jensen, R. Ahumada, M. Huilcaman …............……. 9 Actividad lipasa de especies de Malassezia aisladas en pacientes sanos y con lesiones dérmicas. M. Sosa, F. Rojas, ir al artículo S. Toma, M. Mangiaterra, G. Giusiano. …................… 15 Actividad de fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios de Cryptococcus neoformans. G. Pérez, G. González & M. C. Díaz. ..........................................................................…… 21 ir al artículo Especies de Fusarium como agentes de queratitis micóticas en adultos en Tucumán, Argentina. R. Salim & R. Runco. …..................................................................……. 27 ir al artículo Zigomicosis cutanea primaria por Rhyzopus oryzae en una niña con Leucemia Linfoblastica Aguda Tipo B. R. Salim, R. Runco, C. Alvarez, S. Romano, M. Charre. ir al artículo ……...................................................................................….. 35

REVISTA DE REVISTAS, RESUMENES DE ir al artículo CONGRESOS, CURSO .................................................. 93

Universidad de Valparaíso: Boletín Micológico www.uv.cl/servicios/externos/lab_micologia/laboratorio_micologia.htm (Texto completo)

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2008

ASPERGILOSIS SINUSAL NO INVASIVA POR Aspergillus parasiticus EN NIÑO INMUNOCOMPROMETIDO
(Non invasive sinusal aspergillosis by Aspergillus parasiticus in an immunecompromised child)
R. Salim1 & R. Runco1,2
1. Cátedra de Micología. Instituto de Microbiología Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán Ayacucho 491. (4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina. 2. Lab. Micología del Hospital del Niño Jesús. Pasaje Hungría 750. (4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina e-mail: rqsalim@rectorado.unt.edu.ar Palabras claves: aspergilosis sinusal, niño, inmunocomprometido Key words: sinusal aspergillosis, immunocompromised child.

RESUMEN
El presente trabajo tiene la finalidad de exponer un caso clinico de un niño inmmunosuprimido con antecedentes de hospitalización previa, a los 6 años de edad con múltiples síntomas y signos (poliadenopatías, desnutrición, sepsis en cavidad bucal y foco pulmonar, además de pancitopenia). Permaneció en terapia intermedia durante 38 días, cumpliendo varios esquemas antibióticos sin buena respuesta a los mismos. Fue derivado al Hospital Ricardo Gutiérrez (Buenos Aires) desconociéndose la terapéutica seguida en esa oportunidad. Cinco años después (2007) es ingresado nuevamente a nuestro hospital por cuadro de epistaxis cefaléa, compromiso del estado general y neutropenia febril, por lo que se inicia tratamiento antibiótico, además de estudio con mielograma confirmándose el diagnóstico de leucemia linfocítica aguda. Cinco días después de su ingreso expulsa espontaneamente, desde las fosas nasales material granulomatoso el cual fué enviado a estudio micológico (examen directo y cultivo), detectándose alta presencia de Aspergillus parasiticus en ambos examenes, lo cual fue ratificado por histopatología como una aspergilosis sinusal no invasiva. El paciente fue remitido a la Sala de Inmunodeprimidos donde recibió tratamiento intravenoso con 350 mg/día de anfotericina B-complejo lipídico y terapia específica para LLA. Presentó una evolución tórpida y al 12º día el paciente falleció por su mal estado general y progresión terminal de su enfermedad de base.
Recibido el 1 de Octubre 2008 Aceptado 29 Noviembre 2008

ABSTRACT
This present paper is meant to reveal the clinical case of an immunesuppressed boy having been previously in a hospital, when he was 6, showing multiple symptoms and signs (polyadenopaties, malnutrition, buccal sepsis and pulmonary focus, in addition to pancitopia). He stayed under intermediate therapy for 38 day being submitted to varied antibiotic schemes, though yielding no satisfactory responses to them. Later on he was derived to the Hospital Ricardo Gutiérrez (Buenos Aires), yet therapeutics used at that place being unknown. Five years later (2007), he is admitted again in our hospital because of cephalea epistaxis, a compromised health condition and fevered neutropenia, so he is given an antibiotic treatment in addition to a mielographic study yet it is confirmed the diagnosis of an acute lymphocitic leukemia. Five days after his admittance, he discharges granulomatous matter from his nasal cavities which was sent for a mycological study. Direct exam and culture, detecting high presence of Aspergillus parasiticus on both exams which was ratified by histopathology as a non invasive sinusal aspergillosis. The patient was sent to the Immunedepressed Ward where he received intravenous treatment with 350mg/day anfotericina Blipidic complex and a specific therapy for LLA. He had a torpid evolution and on the 12nd day the patient died as a result of his very bad health condition as well as the terminal progression of his base disease.

INTRODUCCION
La patología fúngica sinusal es poco frecuente, sin embargo, su diagnóstico ha aumentado desde hace 1

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algunos años gracias al avance vertiginoso de la radiología y el desarrollo de la cirugía endoscópica nasal (1,7). Comprende una extensa variedad de entidades patológicas con diferente expresión clínica, cuyo denominador común es la presencia de hongos en los senos paranasales (10, 11). Se define como Aspergilosis sinunasal, a un grupo de afecciones relacionadas con varias especies de Aspergillus, hongos saprotrofos comunes que crecen como una masa de hifas anchas y tabicadas. Aspergillus spp. son las causas más comunes de todas las formas de patología micótica sinunasal (5, 12,17, 22, 23). Los integrantes del géneroAspergillus, son ubicuos, abundan en el suelo, en la materia orgánica en descomposición y en granos almacenados. Estudios ambientales han indicado que los humanos pueden inhalar, diariamente, acorde al ambiente, varios cientos de sus conidios (26). Sin embargo, su inhalación por individuos inmunocompetentes, raramente tiene efectos adversos, debido a que estos propágulos son eficientemente eliminados por la inmunidad celular (3, 34). Puede provocar complicaciones en individuos con alteración de la defensa celular, fundamentalmente en enfermos neutropénicos, especialmente en pacientes leucémicos o transplantados de médula ósea, terapia corticoesteroide, quimioterapia citotóxica y SIDA (16, 17, 19). El paciente típico es granulocitopénico, que ha recibido un sobre tratamiento con antibióticos de amplio espectro por fiebres inexplicables (9, 14, 30, 33). Por su oportunismo puede causar desde alergias hasta infecciones invasivas implicando las vías aéreas superiores, pulmones, y otros órganos (4, 15, 23, 25, 29). Los cambios de la mucosa y la obstrucción del orificio nasal, disminuyen la ventilación del seno, reducen el pH, y en consecuencia favorecen la colonización y la proliferación micótica (1, 31, 32). Además de los factores del huésped, se han citado diversos factores ambientales como causa del desarrollo de sinusitis micótica (1,10). El tamaño del inóculo necesario para desarrollar manifestaciones de aspergilosis es desconocido, pero parece que tiene que ser bajo en los pacientes inmunocomprometidos. Respecto al tiempo de incubación entre la exposición a Aspergillus spp. y el desarrollo de aspergilosis invasiva Chacón et al. (5), establecen que varía entre 36 horas y 3 meses. En los pacientes neutropénicos no se presentan sino hasta después de 12 días de neutropenia severa, aun cuando los pacientes pueden estar colonizados en pulmón o cavidad sinusal a su llegada al hospital (5,18). Al parecer, el clima también es un factor que puede favorecer la incidencia de esta patología, pues existen zonas donde la sinusitis micótica es endémica; entre ellas se encuentra Sudán, Norte de India y Arabia Saudita, todas con clima caliente y seco (3). 2

En los últimos años se han asociado otros factores al aumento de las aspergilosis, entre ellos, las nuevas pautas de quimioterapia antineoplásica, el incremento exponencial de los trasplantes de órganos y la utilización de fármacos inmunosupresores cada vez más potentes frente a enfermedades auto-inmunes (9, 14, 25). Si bien existe consenso que la incidencia de las diferentes formas de presentación de micosis nasosinusal es variable y la diversidad de hongos involucrados está aumentando, desafortunadamente, la verdadera incidencia de estas infecciones es desconocida (29). Según una revisión efectuada en la Clínica Mayo su frecuencia, basada en las muestras quirúrgicas codificadas como «sinusitis inflamatoria» fue 6,9%; de sinusitis fúngica alérgica, 3,7%; de bola fungosa 3,7%; y 0,003% de invasora (12). De las más de 200 especies que comprende el género Aspergillus, unas 20 han sido reconocidas, hasta la fecha, como patógenas en el hombre. De éstas, la especie más frecuentemente aislada es Aspergillus fumigatus complex. le siguen : A. flavus, A. niger, A. terreus y A. nidulans, que también juegan un papel importante en patología humana (4,18). Los brotes de aspergilosis que implican la piel, la mucosa oral o los tejidos subcutáneos, se asocian más a menudo a A. flavus que a las otras especies (3, 4, 18, 27). Se cree que el tamaño mayor de las esporas de A. flavus con respecto a las de A. fumigatus favorece su deposición en la zona respiratoria superior lo que podría explicar su incidencia como un agente etiológico común de la sinusitis fúngica y de las infecciones cutáneas. Posiblemente, las características de la superficie de las esporas también son determinantes importantes de la localización (24). A. flavus es la segunda causa de aspergilosis invasiva y es el agente más común de la infección superficial no invasiva (4, 10, 18, 19). Los síndromes clínicos comunes asociados a esta especie incluyen, particularmente, sinusitis granulomatosa crónica, queratitis, aspergilosis cutánea, infecciones de heridas y osteomielitis postraumaumáticas y/o de inoculación (18). El presente trabajo tiene la finalidad de exponer el hallazgo casual de Aspergillus parasiticus en material granulomatoso sangrante de descarga nasal espontánea en un paciente inmunocomprometido de 11 años de edad, con desenlace fatal, comentar aspectos clínicos y de diagnósticos de la aspergilosis sinusal.

CASO CLINICO
Paciente masculino de 11 años de edad, residente en San Miguel de Tucumán (R. Argentina) ingresado por 1ª vez en nuestro hospital a los 6 años de edad (Marzo de 2002) por un síndrome febril prolongado (>30 días de

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus parasiticus en niño inmunocomprometido - R.Salim & R.Runco

evolución), pérdida de peso (aproximadamente 7 kilos en un mes) y diarrea. Fue internado, en estado crítico. El examen físico reveló adenopatías en cadena latero-cervical, preauricular y submaxilar de 1 a 1,5 cm, duras, móviles, indoloras, además en región inguinal. Desnutrido de primer grado con déficit del 15% (85% peso para edad). Se diagnosticó sepsis a foco en cavidad bucal y a foco pulmonar, síndrome anémico, leucopenia severa sin diagnóstico etiológico confirmado, síndrome de colestasis con hepatomegalia, insuficiencia hepática y enteroparasitosis (huevos de Ascaris). Registraba, además, lesiones pustulosas en región lateral de cuello y perianal. La punción-aspiración de médula ósea informó ausencia casi total de la serie granulocítica (agranulocitosis). Al mismo tiempo, se diagnosticó neumonía derecha, con clínica y radiología positiva. Permaneció en terapia intermedia durante 38 días, cumpliendo varios esquemas antibióticos sin buena respuesta a los mismos, continuando febril, sin bacteriemia. Fue derivado al Hospital Ricardo Gutiérrez (Buenos Aires) desconociéndose la terapéutica seguida en esa oportunidad. El 10 de Diciembre de 2007, consulta por epistaxis de 3 h. de evolución, de difícil manejo a pesar de la colocación de un tapón nasal anterior y administración de concentrado plaquetario. Refiere padecer sensación de taponamiento nasal, sangrado nasal, cefalea, fatiga y malestar general de más de 2 semanas de evolución. Se decide su hospitalización. Al momento del ingreso presenta fiebre, neutropenia y plaquetopenia, por lo que se administra concentrado plaquetario y se inicia tratamiento con cefalotina y ceftazidima. Con diagnóstico presuntivo de leucemia linfocítica aguda (LLA) se efectúa punción-aspiración de médula ósea. A los 5 días de su admisión, por una descarga nasal espontánea (estornudo), elimina material granulomatoso y sangrante que es transportado rápidamente al laboratorio. El tejido es procesado para diagnóstico bacteriológico y micológico arrojando examen directo positivo, con abundantes hifas hialinas tabicadas compatibles con elementos fúngicos. Este resultado es inmediatamente comunicado al médico tratante, lo cual llevó a una orientación diagnóstica preliminar de sinusitis fúngica. Se decidió practicar biopsia por curetaje, obteniéndose un tejido granulomatoso, friable y sangrante, que fue enviado para estudios histopatológicos y microbiológicos (examen directo y cultivo micológico). El resultado de la biopsia fue compatible con aspergilosis sinusal sin invasión tisular.Los resultados de los cultivos y examen histopatológico fueron positivos para hongos compatibles con Aspergillus parasiticus. Con el diagnóstico de leucemia linfocítica aguda el paciente fue remitido a la Sala de Inmunodeprimidos donde recibió tratamiento intravenoso con 350 mg/día de anfotericina B-

complejo lipídico y terapia específica para LLA. Presentó una evolución tórpida y al 12º día el paciente falleció por su mal estado general y progresión terminal de su enfermedad de base. Estudios Microbiológicos Se efectuaron exámenes microscópicos directos y cultivos del material de descarga nasal espontánea, previamente macerado en mortero estéril con SF estéril. Al examen directo se observaron abundantes hifas hialinas, septadas, de 2 µm de diámetro con ramificaciones en ángulos de 45º. Coincidentemente con este hallazgo, el diagnóstico histológico de los materiales de biopsia nasal reveló abundantes hifas septadas, ramificadas, no invasivas de la mucosa sinusal. Los cultivos se realizaron en Sabouraud glucosado agar (SGA) e incubados a 37 ºC. A partir de las 72 h se observó en todos los tubos abundante desarrollo, en cultivos puros, de numerosas colonias de aspecto fúngico que fueron identificadas como Aspergillus parasiticus Link, de acuerdo a la descripción para la identificación de especies de Aspergillus provista por el Departamento Micología INEI ANLIS (R. Argentina) (28). La identificación se basó en el estudio de los caracteres macro y micromorfológicos de las colonias aisladas. Su identidad fue corroborada por comparación con la descripción de esta especie en la literatura especializada (8,20) (Fig. 1 y 2). El diagnóstico micológico se basó en la observación macro y micromorfológica de la colonia aislada en SGA y en Agar Czapeck extracto de levadura. En SGA se aísla un hongo de crecimiento rápido, color amarillo verdoso a marrón claro uniforme que se oscurece con el tiempo, borde difuso, dentado y superficie densamente tapizada de conidióforos, anverso color dorado a rojomarrón. Al esporular, la colonia toma un color verde oliva claro uniforme, que se oscurece con la edad. En Agar Czapeck extracto de levadura a 28 ºC la colonia, al principio de color amarillo, rápidamente pasa a color verde oscuro y el reverso amarillo-crema, al envejecer se torna amarillonaranja. Márgenes microlobulados, textura algodonosa. La observación microscópica muestra conidióforos de longitud variable, pared hialina, gruesa, con ornamentación equinulada, vesículas esféricas, uni o biseriadas (24-25 µm), las fiálides cubren completamente la vesícula. Conidios globosos o subglobosos verrugosos (2,5-3 µm) con paredes delgadas (20, 21).

DISCUSION
El aumento de las enfermedades infecciosas en el mundo, a expensas del creciente número de individuos 3

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Fig. 1. Colonia de A. parasiticus .En SGA a 10 días de incubación a 28 ºC que tienen afectada su competencia inmunológica, significa un enorme reto para el equipo de salud en términos de diagnóstico y tratamiento. Las infecciones oportunistas se producen cuando fallan los mecanismos defensivos del huésped para enfrentar los procesos infecciosos, en el que las micosis alcanzan un lugar cada vez más importante, por su frecuencia, difícil diagnóstico y elevada mortalidad (35, 36, 37, 38, 39). Por su baja frecuencia, alta complejidad diagnóstica y terapéutica, estas enfermedades caen generalmente en el campo del especialista, pero el clínico general debe conocer su existencia y características generales, para pedir ayuda o derivarlas oportunamente. Por ello, es necesario insistir en que la eficiencia con la que es evaluado un paciente y la eficacia de su tratamiento depende de un equipo de salud multidisciplinario (35, 38, 39). El laboratorio y la tecnología, no deben estar fuera, sino dentro del método clínico, jugando un papel muy importante y muchas veces decisivo en el diagnóstico, porque son capaces de poner en evidencia situaciones, allí donde no llega la sensibilidad de la clínica (40, 41). Para ello se debe disponer de materiales específicos y técnicas adecuadas, rápidas y confiables para proporcionar la información, acertada y precoz, sea ésta bacteriana, viral, fúngica o parasitaria (25,30). En nuestro país, los resultados de una encuesta nacional sobre micosis diagnosticadas entre enero y diciembre de 2004, con datos provistos por 72 laboratorios, mostraron que tan sólo un 8% de las muestras microbiológicas fueron sometidas a estudios micológicos (6). El caso que exponemos, es una muestra de lo importante que resulta ‘no olvidar’ la posibilidad de una patología fúngica, que puede quedar ‘oculta’ por los síntomas y signos propios de la enfermedad de base en pacientes inmunodeprimidos. De hecho, el estudio micológico del material granulomatoso y sangrante de la descarga nasal espontánea, fue un episodio fortuito, ya 4

Fig. 2. Micromorfología de A. parasiticus en agar malta, en el recuadro se aprecia la rugosidad de los conidios. D IC (1000X) que la muestra fue llevada directamente al laboratorio sin un pedido médico formal para su análisis micológico. La evaluación de un paciente con fiebre y neutropenia es un hecho frecuente en la práctica clínica y puede obedecer a una gran cantidad de situaciones patológicas, entre ellas infecciones invasivas por hongos filamentosos o levaduriformes (2, 9, 30). Los pacientes cuya neutropenia es prolongada y profunda, sobre todo si es secundaria a las quimioterapias más agresivas, habitualmente las de rescate, son los que con más frecuencia se infectan con integrantes del género Aspergillus. Es sabido que la terapia esteroidal en altas dosis, aumenta la susceptibilidad a la infección por este agente (19, 30). El diagnóstico de micosis sinusal requiere un alto grado de sospecha. Como los síntomas de sinusitis bacteriana y micótica son generalmente similares y su distinción clínica resulta prácticamente imposible es necesario sospecharla para así efectuar un diagnóstico correcto y plantearlo cuando existe recurrencia o persistencia de enfermedad en un mismo sitio (1, 4, 11, 29). En nuestro laboratorio, nos encontramos abocados a un programa rutinario de rastreo diario de muestras clínicas, no derivadas al laboratorio micológico, al menos en algunos casos seleccionados de pacientes cuyas historias clínicas nos llevan a la sospecha de una posible micosis. Esto podría justificar, en parte, el incremento en la incidencia de infecciones fúngicas en la edad pediátrica que se registró en nuestro medio, en los últimos años (35, 36, 37, 38, 39, 40, 41). Asimismo, el diagnóstico casual de micosis superficiales y profundas en nuestro hospital ha sido cada vez más frecuente en el transcurso de estudios complementarios por otras patologías o patologías no relacionadas. Esto explicaría el aumento progresivo en las solicitudes médicas de diagnóstico micológico en los últimos tiempos lo que pone en evidencia el reconocimiento médico de la importancia y frecuencia de las micosis en el

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus parasiticus en niño inmunocomprometido - R.Salim & R.Runco

Hospital de Niños de Tucumán, así como de la necesidad de la utilización racional de los recursos de laboratorio (37, 38, 39). Los hongos del género Aspergillus se distinguen por su capacidad de causar afecciones muy diferentes según el terreno del paciente. Resulta significativo que a la luz del conocimiento actual, la aspergilosis siga teniendo una alta morbilidad y mortalidad en grupos de individuos inmunodeprimidos (con enfermedades malignas, trasplantados, con SIDA, etc.) lo cual determina su condición actual de enfermedad reemergente. Se expresa con nuevas formas graves en el curso de neutropenias severas en trasplantados, enfermedades malignas bajo tratamiento, trasplante de médula ósea, enfermos de SIDA, etc. (2, 15, 16, 21, 33). En la actualidad, la aspergilosis es la micosis más común de senos paranasales. En infecciones de vías respiratorias altas se encuentran síntomas nasales, retronasales, sinusales y orbitarios Los síntomas nasales se relacionan con secreción mucoide o mucopurulenta, inflamación de la mucosa nasal, aumento de tamaño de los cornetes y en ocasiones pólipos o dolor facial. La inflamación granulomatosa es el sello histológico distintivo de esta condición. Se presenta más comúnmente en pacientes con leucemia aguda y que han recibido transplantes de médula ósea, los cuales son sometidos a terapias con corticosteroides que interfieren de manera importante con la función de los macrófagos (33). Los hospederos más frecuentes son los pacientes neutropénicos con enfermedades hematológicas malignas, los trasplantados y los que padecen de enfermedades granulomatosas. La evolución casi siempre es de curso fatal con series que reportan mortalidades entre 80-100 %. De ahí la importancia del diagnóstico precoz, la profilaxis y el tratamiento específico temprano. Hay que sospechar cuando el curso febril permanezca por más de 72 h en este tipo de paciente, pese a tratamiento antibacteriano de amplio espectro (14, 19, 33). Aun cuando las características clínicas de las aspergilosis son generalmente idénticas para todas las especies del Aspergillus, a menudo se describen algunas particularidades referidas a las infecciones causadas por A. flavus. Esta especie es más probable de ser recuperada de la zona respiratoria superior que cualquier otra especie de Aspergillus (1, 2, 4, 10, 18). Las presentaciones clínicas del rinosinusitis aspergilar incluyen síndromes granulomatosos agudos y crónicos invasivos y síndromes granulomatosos no invasivos (4, 11). Para un diagnóstico correcto, se debe obtener muestras de tejido para estudios histopatológicos, que son esenciales, con cultivos de los especimenes quirúrgicos. Los cultivos de moco nasal no son confiables para el diagnóstico porque pueden reflejar

sólo la presencia del hongo en el aire, más que la enfermedad. Es importante enfatizar que debido a su naturaleza cosmopolita, un cultivo positivo de un sitio no estéril, necesita del respaldo del estudio de microscopia directa de la muestra y el aislamiento del hongo en muestras repetidas para considerarlo significativo. Aspergillus es capaz de crecer fácilmente en los medios de cultivo de un laboratorio, de tal forma que en ocasiones es difícil diferenciar si se trata de un contaminante de la muestra, de un colonizador o de un invasor del huésped (13). Por ello, si bien el cultivo de la muestra obtenida permite la identificación del hongo, el diagnóstico se establece definitivamente mediante el estudio histopatológico (1). En un estudio realizado en la India, de 119 personas con molestias sinunasales (de los cuales sólo dos, diabéticos, tenían afección inmunitaria), el 42% tuvo cultivos positivos para hongos. En 80% de los casos, Aspergillus flavus fue el agente causal. Los demás hongos cultivados fueron A. fumigatus (6%), Aspergillus spp. (4%), Alternaria spp. (4%), Rhizopus arrhizus (4%) y Candida albicans (2%) (22). Actualmente se carece de datos confiables sobre la frecuencia de las micosis en la República Argentina. La información disponible sobre frecuencia de micosis en nuestro país ha sido fragmentaria y geográficamente limitada. Por esta razón existe muy poca bibliografía nacional sobre la incidencia de esta patología (6l). El tratamiento depende si la sinusitis micótica, es invasiva o no,requiriendo la primera tratamiento quirúrgico y antifúngicos sistémicos (9, 33). Actualmente la droga de elección es el Voriconazol, siendo la anfotericina una alternativa principalmente por su menor costo . Debe considerarse la resistencia a Anfotericina B de Aspergillus terreus. A. fumigatus es el mayor causante de la colonización e invasión de senos paranasales como ruta aérea de infección al tracto respiratorio (21, 22, 23), mientras A.parasiticus, se consiera una especie cosmopolita, común en suelos cultivados, granos, alimentos granulados, compost, vegetales, insectos, productos almacenados y otros ambientes diversos, en muchas localizaciones geográficas, incluyendo Argentina (42, 43, 44, 46, 49). Sin embargo, a pesar de ser considerada una especie alergénica no se han documentado en la linteratura casos de micosis invasivas por esta especie (8), lo que demuestra su aparente escaso poder patógeno en los mamíferos, una situación que se corrobora en este caso clínico al colonizar saprofíticamente una descarga sinusal del enfermo sin la invasión de la mucosa nasal a pesar de la neutropenia grave y terminal. Su falta de poder patógeno no se compara con su 5

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actividad toxicogénica donde A.flavus y A.parasiticus son los más comunes e importantes productores de aflatoxinas en alimentos y piensos, sin dejar de mencionar que actualmente ambos taxa pueden contener más de una especie (47, 50). Esta especie no se considera un habitante común de ambientes internos como A.flavus y A.fumigatus (47), pero se ha descrito en muy baja cantidad en ambientes hospitalarios (45). En nuestro caso no podemos precisar su orígen ambiental, sin embargo, es probable su entrada desde una fuente exógena por la particular biogeografía de la zona. Debe destacarse el raro y casual hallazgo de A.parasiticus colonizando saprofíticamente los senos nasales

12. Ferguson, B. J. (2000). Fungus balls of the paranasal sinuses. Otolaryng Clin. North Am. 33:389-98 13. Franquet, T.; Müller, N.L.; Jiménez, A.; Guembe, P. & De la Fue nte , J . (200 0). Forma s clínicas de Aspergilosis: correlación anátomo-radiológica en el paciente inmunocompetente e inmunodeprimido. XXV Congreso Nacional de la Sociedad Española de Ra diología Médica . URL disponible en: www.justeradiologia.com/webs/poster/to-1.html - 34k/ 14 . Garc ía-Ruiz, J.C. (20 02). Micosis en los pacientes hematológicos. Rev Iberoam Micol; 19:13-16 15 . Gassiot Nuño, C.; Pino , P.; Ro drígue z Vázquez, A.; Ramos Gó mez, M . & Páez Pr ats, I. (200 0). Aspergilosis pulmonar: un nuevo enfoque en la reemergencia. Acta Médica 9:67 -7 2 16 . Gillespie, M.; O´Malley, B. W. (200 0). An algorithmic approach to the diagnosis and mana gement of invasive fungal rhinosinusitis in the immunocompromised patient. Otolaryngol Clin North Am; 33:323-34 17. Gómez Llorens, T.; Palomar, V.; Ruiz Giner, A.; Latorre, J. & Romeu, C. (1998). Sinusitis fúngica. A propósito de cuatro casos. Acta Otorrinolaringol. Esp. 4:241-4 18 . Hedayati, M. T.; Pasqualotto, A. C.; Warn, P. A.; Bowyerand, P. & Denning, D. W. (2007). Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer, Microbiology 153:167 7–1692 19. Hunt, S.; Miyamoto, R.; Cornelius, R. &Tami, T. (2000). Invasive fu nga l sinu sitis in the acquired immunodeficiency syndrome. Otolaryngol. Clin. North Am. 33:335-47 20. Klich, M. A. (2002). Identification of common Aspergillus species.Utrecht, Centraalbureau voor Schimmelcultures. 21. Klich, M. A. (2006 ). Identification of clinically releva nt aspergilli. Medical Mycology 44. S127-S131 22. Kwon-Chung, K.J.; Bennett, J.E. (1 992). Aspergillosis. Medical Micology, Philadelphia, Lea & Febiger, pp 201-247 23. Latge, J.P. (1999). Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin .Microbiol. Rev. 12:310-350 24. Morrow, P. E. (1980). Physics of airborne particles and their deposition in the lung. Ann N Y Acad Sci 353:71–80 25 . Patterson, T.F.; Kirkpatric k, W.R.; White, M. (2 000 ). Invasive aspergillosis. Disease spectrum, treatment practices and outcomes. Medicine; 79:250-6 0 26 . Pére z, F.; Opazo, H.; Cr uz, R. y Piontelli, E. (2 006 ). Reporte Clínico: Dia gnóstico Endoscópico e Histológico de Aspergilosis Sinusal no invasiva en paciente inmunocompetente. Boletín Micológico 21:85-89 27 . Pila Pére z, R.; Ze que ira Peña, J. & Pila Pe láe z, M. (1998). Aspergilosis que coincide con tumor del seno maxilar. Re vista Arc hiv o M édico de Camagüe y Vol 2 Nº 2 . URL dispo nible en http://www.amc.sld.cu/amc/19 98/v2n2/ amc2(2)11 .htm/ 28. Programa Nacional de Control de Calidad en Micología.

REFERENCIAS
1.Alobid, I.; Bernal, M.; Menéndez, L. M.; Alós, L.; Benítez, P. y Mullol, J. (2002). Cirugía Endoscópica Nasosinusal en la Sinusitis Fúngica. Nuestra Experiencia. Acta Otorrinolaringol Esp; 53:393-397 2. Arza Fernández, S.; Coria Lorenzo, J.; Rosales Uribe R. y Gómez Barreto, D. (2006). Aspergilosis invasiva en el paciente pediátrico oncológico: Revisión del tema a propósito de un caso. Rev. Enf. Infec. en Pediatría. 75:80-92 3. Celis, G.; Parte, G.; Gil, C.; Aponte, C.; Gómez, T.; Alfaro, G.; y Solbas, A. (200 1). Aspergiloma a sintomático del seno frontal. Presentación de un caso. Acta Otorrinolaringológica. 13 :1-6 4. Cruz, R.; Barthel, M.; Piontelli, E. y Fernandez, G. (2005). Reportes Clínicos: Infección Rinosinusal probada por Aspergillus flavus y probable Infección pulmonar por Emericella nidulans en pacientes inmunodeprimidos. Boletín Micológico 20:109-115 5. Chacón, M.; Chacón, C.; Aguilar, U.; Pérez, M. T.; Facha, I.; Gutiérrez de Velasco, R.; Pichardo, M.; Martínez, L. & Alessio, P. (2002). Aspergilloma sinusal. Rev. Médica Sur Nº 3 Vol. July-September: 126-128 6. Davel, G. y Canteros, C. E. (2007). Situación de las micosis en la República Argentina. Revista Argentina de Microbiología 39: 28 -3 3 7. De Carpentie r, J.P. (199 4). An algorithmic approa ch to Aspergillus sinusitis. The Journal of Laryngology Otol; 108: 31418 8. De Hoog , G.S.; Guarro , J.; Ge né, J. & Figue ras, M. J. (2000). Atlas of Clinical Fungi 2nd ed. Utrecht, Centraalbureau voor Schimmelcultures. 9. de la Cámara, R. (2003). Características de la infección fúngica en hematología. Enf. Infecc. Microbiol Clin; 2:3-12 10. Denning, D.W. (1998). Invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis; 26:781-805 11. Ferguson, B. J. (2000). Definitions of fungal rhinosinusitis. Otolaryng Clin. North Am. 33:227-235

6

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus parasiticus en niño inmunocomprometido - R.Salim & R.Runco

Departamento de Micología INEI. ANLIS «Carlos G. Malbrán». URL disponible en http://www.anlis.gov.ar/INEI/depto_ micol/ ccalidad.htm/ 29. Pruzzo, E.; Labarca, J.; Guzman, A.; León, P.; Emmerich, L.; Rico, B. (2000). Rinosinusitis por Pseudallescheria boydii: caso clínico. Rev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello. 60:10911 6 30. Santamaría, M.; Lara Aguayo, P.; Guerrero Pavón, R. & Molina, J. J. (2007). Principios de Urgencias, emergencias y cuidados críticos: Infecciones en el paciente neutropénico. UNINET. URL disponible en http://tratado.uninet.edu/c0801i.html 31 . Sc hube rt, M.S. & Goe tz, D. W. (199 8). Eva lua tion a nd treatment of allergic fungal sinusitis. I. Demographic and diagnosis. J. Allergy Clin. Immunol. 102:387-94 32. Stringer, S.; Ryan, M. (2000 ). Chronic invasive fungal rhinosinusitis. Otolaryngol. Clin. North Am. 33:375-87 33. Vázquez Tsuji, O.; Campos Rivera, T.; García Camacho, G. & Martínez Barbabosa, E. I. (2001). Abordaje diagnóstico y terapéutico de la Aspergilosis en el paciente pediátrico. Acta Pediatr Méx; 22:368-375 34 . Verg ara, J . & Her nández, S. (200 7). Senos maxilares colonizados por Mucor en paciente inmunocompetente. Acta de Otorrinolaringología & Cirugía de Cabeza y Cuello. 35: 20-25 35. Runco, R. y Salim, R. (1995). Detección de especies de Nocardia aisladas de pacientes con compromiso pulmonar crónico en Tucumán (Argentina). Boletín Micológico 10: 33-36 36. Runco, R. ; Salim, R. y Boente, M. (1998). Zigomicosis rino-sinuso-orbital post-traumá tica. Boletín Micológico 13:1115 37 . Runc o, R. y Salim, R. (2 005 ). Fungu emias por Pichia anomala en pacientes pediá tricos inmunocomprometidos hospitalizados. Boletín Micológico 20: 95-103 38. Runco, R. y Salim, R. (2005). Candida lusitaniae en un paciente pediátrico inmunocomprometido. Éxito terapéutico del Voriconazol. Boletín Micológico 20:104-110 39 . Salim, R.; Villag ra, C. y Runco, R. (1 997).No card ia astero ide s en a bsceso pu lmonar interpreta do como de origen tuberculoso: Caso fatal. Boletín Micológico 12: 95-98

40. Salim, R. (2004). Enseñar y evaluar la micología:reflexiones y propuesta de innovación educativa. Boletín Micológico 19:2330 . 41. Silva, J.; Runco, R. ; Almendro, G. & R. Salim. (1990). Detection of opportu nistic yeast pa thogens in hospita lized immunocompromised patients. Rev. Lat Am Microb 32: 26126 4 42 . Bresler, G.; Brizzio , S.B. & Vaamonde, G. (1 995 ). Mycotoxin producing potential of fungi isolated from amaranth seeds in Argentina. Intern. J. Food Microbiol. 25:101-108 43 . Chourasia, H.K. (199 5). Mycobiota and Mycotoxins in herbal drugs of Indian pharmaceutical industries. Mycol. Res. 69770 3 44. Dalcero, A.; Magnoli, C.; Chiacchiera, S.; Palacios,G.; reynoso, M . (19 97) Mycoflora a nd incidente of afla toxin B1 zearalenone and deoxynivalenol in poultry feeds in Argentina. Mycopathologia1 37:1 79-1 84 45 . Diba, K.; Kor bac hen, P.; Mir hendi, S.H.; Re zaie,S.; mahmoudi, M. (2007). Identification of Aspergillus species using morphological characteristics. Pak. J. Med. Sci. 23:867.872 46 . Domagala, JU.; Blüthge n, A. & Heesche n, W. (19 97 ). Synthesis of aflatoxins and their precursors in feeds contaminated with toxinogenic mould cultures. Milchwissenschaft 52:543-546 47 . Frisvald J .C & Gr ave sen,s. (1 994 ). Pe nic illium a nd Aspergillus from Danish homes and workin places with indoor air problems: identification and mycotoxin determination. In: Health implications of fungi in indoor environments. Samson et al., eds, Elsevier Science, Amsterdam. pp.281-290 48. Frisvald J.C. & Thrane,U.(2004). Mycotoxin production by common filamentous fungi. In:Samson et al., Introduction to food and airborne fungi Seventh Edition CBS, Utrecht. pp. 32133 0 49. Klich, M.A. (2002). Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia 94:21-27 50. Pildain,M. B.; Frisvad, J.C.; Vaamonde, G.; Cabral D.; Vargas, J.; Samson, R.A. (20 08). Two novel aflatoxinproducing Aspergillus species from Argentinean peanuts. Int J Syst Evol Microbiol 58 :725-735

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CASO CLINICO: ASPERGILOSIS PULMONAR INVASIVA TRATADA CON VORICONAZOL EN PACIENTE CON SINDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA
(Clinical case: invasive pulmonary aspergillosis treated with Voriconazol in an AIDS patient)
H. Arias(1), R. Cruz (2) , M.de la Prida (3), W. Jensen (4), R. Ahumada (4), M. Huilcaman (4)
(1) Medicina Interna, Hospital Gustavo Fricke, (2) Cátedra de Micología U de Valparaíso, (3) Respiratorio, Hospital Gustavo Fricke (4) Infectología ,Hospital Gustavo Fricke rcruzchoappa@gmail.com Palabras clave: Aspergilosis invasiva, VIH, Voriconazol Key words: Invasive aspergillosis, VIH, Voriconazol

RESUMEN
Se reporta un caso clínico de aspergilosis pulmonar invasiva en un paciente de 29 años VIH(+) en etapa SIDA, sin antecedentes mórbidos conocidos, con diagnóstico inicial de neumonía por Pneumocystis jirovecii. Fue tratado con exito, pero sin asistir a controles posterior a su alta . Tres meses después ingresa al servicio de Urgencias del Hospital Gustavo Fricke con tos productiva mucopurulenta, disnea progresiva, fiebre intermitente y compromiso del estado general. La radiografía de tórax sugirió neumonía atípica, detectándose en los exámenes Pneumocystis jirovecii y Enterobacter aerógenes , por lo que se inicia tratamiento con Cotrimoxazol y Ertapenem. En los cultivos en agar Sabouraud se detectó abundante desarrollo de Aspergillus fumigatus , por lo que se empieza tratamiento con anfotericina B en dosis crecientes hasta alcanzar 50 mg/día, sin embargo, por reacciones adversas severas se decidió tratamiento con Voriconazol intravenoso y luego oral, con buena respuesta clínica, radiológica y de laboratorio. Es dado de alta con tratamiento con Voriconazol oral, además de profilaxis secundaria para P. jirovecii y Mycobaterium avium .

ABSTRACT
A clinical case of an invasive pulmonary aspergillosis in a 29 aged VIH (+) patient, at an AIDS stage, lacking any known morbid data, and bearing an initial diagnosis of pneumonia by Pneumocystis jirovecii is herein described. Was successfully treated even though he failed to attend subsequent health controls. Three months later he is admitted in the Hospital Gustavo Fricke, showing productive mucupurulent cough, progressive disnea, intermittent fever and his overall health condition resulting deeply compromised. Thorax X-ray revealed an atypical pneumonia together with the presence of P. jirovecii and Enterobacter aerogenes, and decided to treat him with Cotrimoxazol and Ertapenem. Meanwhile in agar cultures a heavy development of Aspergillus fumigatus was detected, thus the patient was given Anfotericina B in increasing doses up to reach 50mg/day; however due to some severe adverse reactions, the treatment with intravenous and later oral Voriconazol, which rendered satisfactory clinical, radiological and laboratory responses was ultimately preferred. The patient is discharged from the hospital and advised to continue with oral Voriconazol besides undergoing secondary profilaxis for P. jirovecii and Mycobaterium avium. agresivos (Bennet, 2005). Aproximadamente unas 20 especies de Aspergillus se han relacionado con patologías humanas. De éstas, las más importantes en frecuencia son A. fumigatus (80% del total), A. flavus, A. niger, A. nidulans y A. terreus (Thompson et al., 1987; Walsh & Dixon, 1989; Herbrecht et al., 2002). La mayoría de estas 9

INTRODUCCION
Las infecciones fúngicas invasivas han aumentado en las últimas décadas debido al aumento de los pacientes inmunodeprimidos y a tratamientos médicos y quirúrgicos
Recibido el 21 Octubre 2008 Aceptado el 15 Diciembre 2008

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especies esporulan profusamente con una alta dispersión anemófila de sus conidios, los cuales por su reducido tamaño, pueden ser inhalados causando multiplicación e invasión pulmonar o de otros órganos, en dependencia de la respuesta inmune del huésped (Bennet, 2005; Sanchez, 2000). Las aspergilosis invasivas presentan una alta mortalidad, la cual varía desde un 50% hasta un 90% dependiendo de la localización de la infección, patología de base del paciente y de la precocidad del diagnóstico e inicio de tratamiento (Pontón, 2003). En la actualidad se cuenta con exámenes como el test de galactomanano y la tomografía axial computada (TAC), cuyo signo más precoz en aspergilosis pulmonar invasiva es el signo del halo. Estas pruebas, además de cultivos, examen microscópico directo, biopsia y biología molecular (Guzmán, 2005), permiten un diagnóstico oportuno en pacientes con factores de riesgo para tales infecciones. El patrón de referencia que permite establecer de forma probada, probable o posible la existencia de una infección fúngica por un hongo filamentoso, corresponde a los criterios conjuntos de la EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer) y el Mycoses Study Group del NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) de EE.UU (Pontón, 2003; Ascioglu et al., 2002). Los factores de riesgo, criterios microbiológicos y clínicos para aspergilosis invasiva son variados, entre los factores de riesgo se destacan: (a) Menos de 500 neutrófilos /mm3 por más de 10 días, (b) fiebre persistente (más de 96 hrs) refractaria a antibióticos de amplio espectro en pacientes de alto riesgo, (c) t emperatura mayor de 38ºC o menor de 36º C, (d) neutropénia por mas de 10 días en los 60 días anteriores, (e) uso de inmunosupresores en los 30 últimos días, (f) infección fúngica invasiva (probada o probable) durante el episodio neutropénico previo, (g) coexistencia de SIDA sintomático, (h) signos y síntomas de enfermedad injerto contra huésped severa o enfermedad extensa crónica, (j) uso prolongado (más de 3 semanas) de corticoides en los 60 días previos. Dentro de los criterios microbiológicos en aspergilosis pulmonar se debe considerar: (a) cultivo positivo para Aspergillus spp. a partir de esputo o lavado broncoalveolar, (b) cultivo positivo o citología o microscopia directa positiva para Aspergillus spp. de esputo o lavado broncoalveolar, (c) antígenos de Aspergillus spp. positivo en muestras de lavado broncoalveolar, (d) citología o microscopia directa positiva para Aspergillus spp. en muestras habitualmente estériles. Dentro de los criterios clínicos de infección pulmonar por Aspergillus se deben considerar: (a) criterios mayores: cualquiera de los siguientes hallazgos de la tomografía axial computarizada: signo del halo, signo 10

del crecente aéreo (o signo de la media luna) o cavitación sin área de consolidación (excluyendo Mycobacterium, Legionella o Nocardia spp.) y (b) criterios menores: síntomas (tos, dolor torácico, hemoptisis, disnea), roce pleural, nueva opacidad radiológica, derrame pleural.

CASO CLINICO
Paciente de 29 años, soltero, homosexual, sin antecedentes mórbidos conocidos. El 15 de Enero del 2008 tras cuadro de tos seca, baja de peso y disnea progresiva, es derivado desde el Hospital de Quintero con diagnóstico presuntivo de neumonía por Pneumocystis jirovecii. En esa oportunidad se detecta una LDH de 1046 UI/l, elevación de PCR y un infiltrado radiológico intersticial de ambos campos pulmonares, por lo que se inició tratamiento con Ceftriaxona y Cotrimoxazol E.V, el mismo que se mantuvo por 14 días hasta el alta, continuando con tratamiento oral. Durante la hospitalización se realizó un test de Elisa para VIH el cual resultó positivo y un recuento de CD4 de 14 células. El examen del lavado broncoalveolar no detectó presencia de Pneumocystis y el cultivo de Koch fue negativo. El paciente no asistió a controles en policlínico de infectología hasta el 15 de abril del 2008, fecha en la que es derivado por médico particular al servicio de Urgencias del Hospital Gustavo Fricke con historia de cuadro de tos productiva mucopurulenta, disnea progresiva, fiebre intermitente y compromiso del estado general asociado a radiografía de tórax que sugirió neumonía atípica sin que se pudiera descartar un proceso tuberculoso (Fig. 1). Ingresó al Hospital Gustavo Fricke el día 17 de Abril de 2008. Dentro del examen físico destacó leucoplasia vellosa, sin adenopatías cervicales, axilares ni inguinales, murmullo pulmonar disminuido globalmente y crepitantes bilaterales pero con predominio izquierdo y condilomas acuminados en región anal. De los exámenes de laboratorio destacó una elevación significativa de PCR, no se solicitó LDH a su ingreso, leucocitos de 4.600 x mm3, hematocrito de 29%, sin falla respiratoria hipoxémica y baciloscopías negativas. El día 18 de Abril se observó en muestra de expectoración y mediante tinción de azul de toluidina presencia de moderada cantidad de Pneumocystis jirovecii por lo que se inicia tratamiento con Cotrimoxazol ev. Se solicitó fibrobroncoscopía la cual mostró una arquitectura conservada del árbol bronquial y abundante secreción mucopurulenta. El cultivo del LBA mostró desarrollo de Enterobacter aerógenes con un recuento de colonias significativo por lo que se inició tratamiento según antibiograma con Ertapenem a dosis de 1 g al día. Al mismo tiempo, los 6 cultivos en agar Sabouraud a 37º mostraron abundante desarrollo de Aspergillus fumigatus

Caso clínico: Asperguilosis pulmonar invasiva tratada con Voriconazol en paciente con VIH

- Arias et al.

Fig. 1. Radiografía de tórax que sugirió neumonía atípica

Fig. 2. Aspergillus Fumigatus

Fig 4. TAC de tórax que muestra signo del halo, característico de la aspergilosis pulmonar invasiva. Fig. 3. TAC inicial con compromiso parenquimatoso bilateral, predominantemente en pulmon izquierdo función renal, hipokalemia y datos que apoyaron una colestasia, por lo que se suspendió la Anfotericina y se inició terapia con Voriconazol en dosis de 6mg/kg cada 12 horas el primer día y posteriormente 4 mg/kg cada 12 horas inicialmente por vía endovenosa. El scanner de tórax inicial mostró lesiones pulmonares bilaterales, con compromiso predominantemente del parénquima pulmonar izquierdo (Fig.3) y lesión cavitada con signo del halo característico de aspergilosis pulmonar invasiva (Fig.4) y mínimo derrame pericárdico. Finalmente el recuento de CD4 fue de 9 células por lo que se inició profilaxis para Mycobacterium avium con Azitromicina 500 mg semanal. El paciente evolucionó favorablemente manteniendo parámetros sépticos apagados y clínicamente estable una vez iniciado el tratamiento. Se realiza TAC de tórax de control dos semanas posteriores a inicio de tratamiento, el cual muestró una resolución del patrón inflamatorio parenquimatoso y cavitaciones secuelares (neumatoceles) (Fig. 5). 11

Fig. 5 . TAC control de tratamiento complex (Fig. 2), por lo que se inició tratamiento con Anfotericina B (AMB) en dosis crecientes hasta alcanzar los 50 mg/día , tratamiento que se mantuvo por 10 días, tiempo en el cual presentó deterioro moderado de su

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Es dado de alta con indicación de tratamiento vía oral con Voriconazol en dosis de 200 mg cada 12 horas, además de profilaxis secundaria para Pneumocytis jirovecii (Cotrimoxazol forte un comprimido diario) y Mycobaterium avium (Azitromicina 500 mg semanal). Estudio micológico. Los cultivos de expectoración fueron enviados a la Cátedra de Micología de la Universidad de Valparaíso. En agar Sabouraud a 37º crecieron colonias que tanto a la macro como a la microscopia eran sugerentes de Aspergillus fumigatus, las cuales se traspasaron a agar Czapec extracto de levadura (CYA) y agar Malta (MEA) a 25 y 37ºCº. A 25ºC en CYA durante 7 días, crecieron colonias entre 45 y 65 mm de diámetro, mientras en MEA a la misma temperatura 40-60 mm. En CYA a 37ºC (60-66 mm) mientras en MEA (62-64 mm). Máximo crecimiento 52ºC (± 1º). Conidios verde oscuros a verde turquesa, micelio blanco, con exudado y sin pigmentos, reverso amarillento en CYA. A la microscopía, las cabezas conidiales fueron predominantemente columnares, con conidióforo incoloro, de pared lisa, grises cerca del ápice, vesículas piriformes a espatuladas, entre 18-25µm; fiálides uniseriadas entre 5-9 por 2-3 µm cubriendo la mitad superior de las vesícula; conidios, globosos a elipsoidales, lisos a finamente rugosos 2-3 µm. Con estas características morfofisiológicas se confirmó el aislado como Aspergillus fumigatus

DISCUSION
Distintas especies del género Aspergillus pueden colonizar las vías respiratorias y posteriormente producir una invasión en aquellos pacientes con algún grado de inmunodepresión celular, en especial los neutropénicos. A. fumigatus es la especie más aislada en todas las formas clínicas de aspergilosis, tanto en la no invasiva como en la invasiva (Henderson & Chapman, 2004; Cruz et al., 2005 ). Esta última destaca por su mayor gravedad y por su alta mortalidad dependiendo de la condición inmune del paciente, el diagnóstico precoz y el oportuno tratamiento con antifúngico de última generación. El cuadro clínico de una aspergilosis pulmonar es inespecífico y puede confundirse con una neumonía bacteriana o viral (Arteaga & Grande Argudo, 1999). Las imágenes en la radiografía son variables y difíciles de diferenciar en su etiología, razón por la cual es urgente en estos pacientes, poder contar con TAC y test de galactomanano, el cual ha demostrado su mayor utilidad diagnóstica en pacientes neutropénicos que cursan precozmente una aspergilosis invasiva, además de su utilidad pronostica en el control de la respuesta al tratamiento antifúngico (Pereira et al., 2005; Pontón, 2003). Con respecto al tratamiento, en los últimos años 12

han aparecido nuevos medicamentos que han demostrado una mejor respuesta clínica y con menos reacciones adversas que la Anfotericina B deoxicolato, entre ellos los azoles de ultima generación como el Voriconazol, las Equinocandinas como la Caspofungina y las formulaciones lipídicas de Anfotericina B como la liposomal (Saballs et al., 2000; Wieland et al., 2005). El Voriconazol es considerado como la droga de elección en la aspergilosis invasiva; es un Triazol de segunda generación, derivado sintético del Fluconazol que actúa inhibiendo la 14-alfa demetilasa y la 24 dihidrolanosterol demetilasa, disminuyendo la síntesis de ergosterol, componente fundamental de la membrana celular fúngica(Wieland et al., 2005). La casuística nacional referente a aspergilosis pulmonar se inicia en la mitad del siglo pasado, evolucionando desde aportes del diagnóstico basados solo en hallazgos microbiológicos e histológicos (estos últimos principalmente post mortem) a los primeros intentos de anticuerpos anti Aspergillus en el suero de los enfermos (Yarzabal et al., 1974). Posteriormente se han publicado varios casos de aspergilosis principalmente invasivas (Thompson et al., 1985; Mendoza et al., 1985; Pillaux, et al., 2000; Zambrano et al., 2007 ), además de los aspectos anatomopatológicos, clínicos y técnicas modernas como PCR, que apoyan al diagnóstico convencional (Oddo & Thompson, 1990). El caso expuesto evidencia lo importante de la sospecha precoz de aspergilosis en los pacientes con SIDA, su diagnóstico oportuno con cultivos e imagenología, además de la buena respuesta al tratamiento con Voriconazol y las reacciones adversas severas de la Anfotericina B deoxicolato (falla renal, colestasia e hipokalemia). Los métodos más empleados en los laboratorios en la identificación de las especies de Aspergillus de origen clínico, se basan mayoritariamente en el análisis de sus características de cultivo, propiedades fisiológicas y la morfología de sus estructuras asexuales o sexuales. Sin embargo, los esquemas morfológicos pueden presentar ciertas dificultadas cuando las cepas clínicas importantes y comunes, muestran grados de variabilidad en sus caracteres fenotípicos, situación que dificulta la determinación a nivel de especie (Samson et al., 2006). Los miembros de la sección Fumigati en particular, son unos de los ejemplos actuales a considerar por poseer características morfológicas que se superponen al incluir distintas especies genéticas dentro de una única morfoespecie (Balajee et al.,2005a; 2005b; 2007; Katz et al., 2005). A. fumigatus sigue siendo el más común agente de aspergilosis, sin olvidar que sus aislamientos clinicos no son siempre morfológicamente característicos y se han cometido errores en el pasado en su identificación aplicando solo características morfológicas (Balajee et al., 2006).

Caso clínico: Asperguilosis pulmonar invasiva tratada con Voriconazol en paciente con VIH

- Arias et al.

Estudios actuales, con métodos polifásicos (morfológicos, fisiológicos y moléculares), han reevaluado la sección Fumigati (así como otras) (Hong et al., 2005; Yaguchi et al., 2007) y sus resultados determinaron que las especies anamórficas de esta sección pueden ser divididas en 5 clades: la clade I incluye A. fumigatus y sus otras 7 especies consideradas como sinónimos, la clade II: A.lentulus y A.fumisynnematus; la clade III: A. fumigatiaffinis y A. novofumigatus; la clade IV: especies atípicas de A. fumigatus incluyendo A. viridinutans y la clade V: A. brevipes, A. duricaulis y A. unilateralis. La mayoría de las cepas clínicas obtenidas en Japón se agrupan juntas en la clade I, otras en la clade II y IV, y ninguna en las clades III y V. Se han analizado también las correlaciones entre morfología, máximo crecimiento a diversas temperaturas y la filogenia de los aislados dentro de la sección (Balajee et al. 2005a, 2007; Katz et al., 2005). El máximo desarrollo a diversas temperaturas de las clades I, II, III, IV y V fueron calculadas sobre los 50 °C, 45 °C, 45 °C, 42 °C y 42 °C, respectivamente; estos datos fisiológicos son muy útiles en la separación de especies dentro de la sección Fumigati, mostrando buena correlación entre las características filogenéticas y fenotípìcas (Balajee et al., 2007; Samson et al., 2007). Nuestra cepa clínica, se clasificó morfofisiológicamente como A. fumigatus mediante cultivos en medios estandarizados, creciendo a una temperatura máxima de unos 52ºC. A 25ºC en MEA, presentó una morfología característica de sus vesículas, fiálides y conidios, por lo cual se separó de una especie similar capaz de crecer a la misma temperatura máxima, pero con una vesícula diferente como se observa en la nueva especie Aspergillus turcosus Hong, Frisvad & Samson, aislada en Korea del Sur (en Samson et al., 2007).

Balajee, S.A.; Nickle, D.; Varga, J .; Mar r, K.A. (2006 ). Molecular studies reveal frequent misidentification of Aspergillus fumigatus by morphotyping. Eukaryotic Cell 5:1705-1712 Balajee, S.A.; Houbraken, J.;. Verweij, P.E.; Hong, S-B.; Yaghuchi, T.; Varga, J.; Samson, R.A. (2007). Aspergillus species identification in the clinical setting. Studies in Mycology 59 :3 9-46 Be nnet, J . (200 5). Ha rrison, Principios de Medicina Interna Mcgraw-Hill 16ª edición. Cruz, R.; Barthel, E.; Piontelli, E. & Fernandez, G. (2005). Reportes Clínicos: infección rinosinusal probada por Aspergillus flavus y probable infección pulmonar por Emericella nidulans en pacientes inmunodeprimidos. Boletín Micológico. 20:109-115 Guzmán, D.A.M . (200 5), Importancia del labora torio en el diagnóstico de las micosis invasoras. Rev. Chil. Infect.21:39-47 Herbrecht, R.; Denning, D.W.; Patterson, T.F.; Bennett, J.E.; Greene, R.E.; Oste rmann, J,M . (20 02). Voriconazol versus anphoptericin B for primary of invasive aspergillosis. New Eng. J. Med. 347:408-414 Hong, S.B.; Go, S.J.; Shin, H.D.; Frisvad, J.C.; Samson, R.A. (2005). Polyphasic taxonomy of Aspergillus fumigatus and related species. Mycologia 97:1316-1329 Katz, M.E.; Do ugall, A.M.; We eks, K.& Che etham, B.F. (2005). Multiple genetically distinct groups revealed among clinical isolates identified as atypical Aspergillus fumigatus. Journal of Clinical Microbiology 43:551-555 Me ndo za, F.; Re tamal, C.; Ferr ada, L.; Alvarez De Oro; Pivet, H.; Salamanca, L. (1985). Aspergilosis humana en Chile: estudio del último decenio. Farmacias. 17:8-11 Oddo, D. & Thompson, L.(1990). Micosis pulmonares. Algunos aspectos de su diagnostico anatomopatologico y de laboratorio. Revista Chilena de Infectología. 7:197-207 Pontón, J. (Ed.) (2003). Aspergilosis Invasora, guía de bolsillo. Revista Iberoamericana de micología. http://www.reviberoammicol.com Pereira, C; Nero, G; Lacaz, C.S; Machado, C.M. (2005). The contribu tion of gala ctomannan detection in the diagnosis of invasive aspergilosis in bone marrow transpla nt recipients. Mycopathology. 159:48 7-493 Pille ux, L.; Ponticas, M.; Carrasco ,C.; León,A.; Salas,P.; Ro drígue z,C.;Cao rsi,I. (2 000 ). Hia lohifomicosis invasiva hepatoesplénica: Comunicación de un caso. Revista médica de Chile. vol.128. 6:641-646. Reese, S.W. & Betts. (2004) Enfermedades infecciosas. Editorial Marban Samson, R.A.; Hong, S-B. & Frisvald, C. (2006). Old and new concepts of species differentiation in Aspergillus. Medical Mycology 44: S133-S148 Samso n, R.A.; Hong , S.; Peterson, S.W.; Frisvad, J.C.; Varga1, J. (2007). Poly-phasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neosartorya. Study in Mycology

REFERENCIAS.
Arteaga, E & Grande Argudo, E. (1999). Aspergilosis pulmonar invasora en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Rev. Iberoam. Micol. 16:211-215 Ascioglu, S.; Rex, J. H.; De Paw, B.; Bennett, J. E.; Bille, J.; Crokaert, F.; De nning, D.W. et al. (2 002 ). Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.. Clin. Infect. Dis. 34:7-14 Balajee, S.A; Gribskov, J.L.; Hanley, E.; Nickle, D.; Marr, K.A. (2005a). Aspergillus lentulus sp nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryotic Cell 4: 625-632 Balajee, S.A.; Gribskov, J.; Brandt, M.; Ito, J.; Fothergill, A.; M arr, K.A. (2 005 b). Mista ken identity: Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading as Asperg illus fumigatus. Journal of Clinical Microbiology 43:5996-5999

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2008

59:147-203 Wieland, T.; Liebold, A.; Jagiello, M.; Retal, G.; Birnbaum, D. (200 5). Su periority of voriconazol over amfotericin B in treatment of invasive aspergillosis after hea rt transpla ntation. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24: 102-104 Walsh, T.J.&Dixo n, D.N. (198 9). Nosocomial aspergilosis: environmental microbiology, hospital epidemiology, diagnosis and treatment. Eur. J. Epidemiology 5:1616-1622 Yaguchi, T.; Horie, Y.; Tanaka, R.; Matsuzawa, T.; Ito, J.; Nishimura, K. (2007). Molecular phylogenetics of multiple genes on Aspergillus section Fumigati isolated from clinical specimens in Japan. Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi 48:37-46 Yarzabal, L.; Sepúlv eda,R.; Re tamal, C.; Kinzel,R; Castro,M .; Salamanca, L. (197 4). Aspergilosis respira tória humana. Rev. Médica Chile. 102:772-778

Saballs, P.; Lopez Colomes, J.L.; Gimeno Cobos, J.; Knobel, H. (2000). Tratamiento de la aspergilosis invasiva. Rev. Iberoam. Micol. 17S:93-96 Sanchez, J. (2000). Prevención de la aspergilosis nosocomial. Rev Iber de Micol.17S:100-102 Thompson, L.; Cinte, G.; Carvajao, L.C.; Oddo, D.; Paredes, P. (198 5). Aspergilosis pulmonar invasiva em pa cientes con leucemia linfoblástica aguda. Rev. Méd. Chile 113:345-352 Thompson, L.; Oddo, D. & Retamal, C. (1987).Orientaciones clínicas y de laboratorio en micosis oportunistas. Rev. Chil. Infect. 4:69 -7 4 Zambr ano , A.; Bie re, A.; Isamitt, D. (2 007 ). Aspergilosis necrotizante crónica en un paciente con secuelas de tuberculosis pu lmonar. Revista chilena de infectología . Enfermedades respiratorias. vol.23:43-48

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ACTIVIDAD LIPASA DE ESPECIES DE Malassezia AISLADAS EN PACIENTES SANOS Y CON LESIONES DERMICAS
(Lipase activity of Malassezia species isolated from healthy patients and having dermic lesions)
Maria de los Angeles Sosa, Florencia Rojas, Sergio Toma Vanacore Magdalena Mangiaterra, Gustavo Giusiano
Departamento Micología. Instituto de Medicina Regional. Universidad Nacional del Nordeste. Av. Las Heras 727, 3500 Resistencia, Argentina E-mail: gusgiusi@medreg.unne.edu.ar Palabras Claves: Malassezia, activididad lipasa Key words: Malassezia, lipase activity

RESUMEN
Las levaduras del género Malassezia forman parte de la microbiota normal de piel humana y animal. Excepto M. pachydermatis, todas las especies de este género son lipodependientes. Bajo ciertos factores, Malassezia se asocia como agente etiológico en diversas afecciones dérmicas. Uno de los principales factores de virulencia de estas levaduras es su actividad de lipasa (AL). El objetivo de este trabajo fue introducir modificaciones a las técnicas de determinación de la actividad lipasa (AL) para su aplicación en levaduras lipodependientes y estudiar la AL en cepas de Malassezia aisladas de personas con piel sana y de pacientes con pitiriasis versicolor (PV), dermatitis seborreica (DS) y psoriasis (PS). Se estudiaron 94 cepas aisladas de 34 pacientes con lesiones de PV, 20 con DS, 7 con PS y 33 cepas de personas con piel sana. Las modificaciones planteadas a la técnica, que incluyeron variación del medio de cultivo y tiempos de incubación, permitieron la determinación semicuantitativa de la AL con resultados claros y definidos. El 88,23% de las cepas presentó AL. No se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas al comparar la AL entre las cepas de pacientes con afecciones de piel y las cepas aisladas de personas sanas. La producción de lipasas de las especies de Malassezia en orden decreciente fue: M. sympodialis, M. slooffiae, M. furfur, M. globosa, M. restricta. M. globosa y M. furfur fueron las especies en que se observaron mayor cantidad de cepas no productoras de AL y cepas con gran variabilidad en la medida de AL.
Recibido el 23 Abril 2008 Aceptado el 2 Julio 2008

ABSTRACT
Yeasts of the genus Malassezia are part of the regular microbiota in human and animal skin. Except for M. pachydermatis, all the species of this genus are lipodependent. Malassezia, under certain factors, is associated as an etiological agent in diverse dermic affections. One of the main virulence factors of these yeasts is their lipase activity (LA). The objective of this research was to introduce some changes in the techniques adopted to determine the lipase activity (LA) in order to apply them to lipodependent yeasts and to study likewise the LA in Malassezia strains isolated from healthy skin people and patients diagnosed with pitiriasis versicolor (VP), greasy dermatitis (GD) and psoriasis ( PS). Ninety four strains isolated from 34 patients having VP lesions, 20 with GD, 7 with PS and 33 strains from healthy skin people. Changes suggested to the technique involved a variation in the medium of culture as well as in the time of incubation what resulted in the semiquantitative determination of the LA together with clear and precise results. The presence of LA was observed in of 88.23% strains. The comparison of the LA among strains of patients bearing injured skin and those isolated from healthy skin did not show any significant statistical difference. The production of lipasae from Malassezia species were in decreasing order: M.sympodialis, M. slooffiae, M.furfur,M.globosa and M.restricta. M. globosa and M. furfur were the species that revealed the highest number of non producting LA strains as well as strains with the highest variability in the degree of LA 15

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INTRODUCCION
En contraste con las bacterias, pocos son los hongos que se pueden definir como patógenos primarios y sus mecanismos de patogénesis son mucho menos comprendidos. La mayoría de estos organismos viven como saprófitos ambientales o como simbiontes, coexistiendo con el hospedador sin consecuencias negativas. Sin embargo, algunos son capaces de parasitar hospedadores sanos y generar desde infecciones superficiales hasta las diseminadas o invasoras (1). Actualmente el género Malassezia está conformado por las siguientes especies: M. furfur, M. sympodialis, M. globosa, M. restricta, M. obtusa, M. slooffiae, M. dermatis, M. yamatoensis, M. japonica, M. pachydermatis, M.nana y M. equii. Las 9 primeras forman parte de la microbiota normal de la piel del hombre y las 3 últimas están adaptadas al estrato córneo de los animales (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8). Desde el punto de vista fisiológico estas levaduras se distinguen por su lipodependencia, debido a que tienen un defecto en la síntesis de ácidos grasos que se manifiesta en su requerimiento exógeno; excepto M. pachydermatis, la cual es lipofílica pero no lipodendiente (9, 10, 11, 12). Bajo la influencia de ciertos factores, las especies de Malassezia pueden volverse patógenas y participar en diversas enfermedades dermatológicas superficiales e infecciones sistémicas (2, 9, 13, 14, 15). Está demostrado que este género es el agente etiológico de la pitiriasis versicolor y la foliculitis y que se asocia a dermatitis seborreica, exacerba la dermatitis atópica y se lo considera como patógeno secundario a otras afecciones de piel. (2, 3, 16, 17). La virulencia es una compleja interrelación entre el organismo infeccioso y el hospedador. La patogénesis fúngica involucra una interacción y a veces una modificación de factores para ambos (1, 12) y uno de los principales en la virulencia de estas levaduras es su actividad de lipasa (17). El conocimiento sobre los patrones bioquímicos del género Malassezia es exiguo y los escasos informes existentes sobre la producción de lipasa y lipoxigenasa, tanto in vivo como in vitro, fueron realizados antes de la revisión del género cuando se consideraban sólo dos especies, M. furfur y M. pachydermatis (17, 18, 19, 20). El objetivo de este trabajo fue introducir modificaciones a las técnicas de determinación de la actividad lipasa (AL) para su aplicación en levaduras lipodependientes y estudiar la AL en cepas de Malassezia aisladas de personas con piel sana y de pacientes con pitiriasis versicolor (PV), dermatitis seborreica (DS) y psoriasis (PS). 16

MATERIALES Y METODOS
Entre los meses de octubre del 2005 y diciembre de 2007, se estudiaron cepas de Malassezia aisladas de personas que asistieron al Instituto de Medicina Regional (UNNE) y agrupadas de la siguiente manera: Criterio de inclusión: Grupo I: Cepas aisladas de todos los pacientes con PV, DS y PS que demandaron atención. Grupo II: Cepas aisladas de personas clínicamente sanas, sin lesiones de piel. Criterios de exclusión: Grupo I: Cepas aisladas de pacientes con diagnóstico de PV, DS y PS que no hubieran suspendido el tratamiento tópico u oral 7 días previos a la toma de muestra. Grupo II: Cepas aisladas de personas clínicamente sanas que presentaran algún antecedente de afección de piel de cualquier índole en los 5 meses precedentes a la toma de la muestra.  Cepas aisladas de personas con tratamiento antibiótico y/o corticoide durante los 15 días precedentes a la toma de la muestra. En el caso del Grupo I se tomaron muestras de las lesiones y del Grupo II desde la espalda y el cuero cabelludo. Las muestras fueron recolectadas por raspado con bisturí estéril y sembradas en medio de Agar Dixon modificado e incubadas a 32ºC hasta 7 días, con observaciones diarias (21). Identificación Todas las cepas de Malassezia aisladas se tipificaron en base a sus características macro y micromorfológicas y a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas, según la metodología propuesta por Guillot et al. (21). Para confirmar la identificación se realizaron estudios moleculares, aplicando la metodología de PCRRFLP basada en la técnica de Mirhendi et al. (22). Como cepas control se incluyeron cepas de referencia CBS 7886 M. globosa, CBS 7019 M. furfur, CBS 7222 M. sympodialis, CBS 9169 M. dermatis, CBS 9432 M. japonica, CBS 10533 M. pachydermatis, CBS 7991 M. restricta, CBS 9725 M. yamatoensis y CBS 7956 M. slooffiae. Actividad lipasa La determinación de la AL se realizó tomando como base la técnica de Riciputo et al. (20), con modificaciones para el estudio de levaduras lipodependientes, introducidas por este grupo de investigación. Al medio base de acuerdo a Riciputo et al. que incluye yema de huevo como fuente de lípidos, se le agregó taurocolato

Actividad lipasa en especies de Malassezia - Sosa et al.

Tabla 1: Distribución de especies aisladas según grupo y afección de procedencia

Grupo I Especie M. furfur M. sympodialis M. globosa M. restricta M. slooffiae Total Pitiriasis Versicolor 11 9 14 0 0 34 Dermatitis Seborreica 5 3 10 1 1 20 Psoriasis 2 1 3 1 0 7

Grupo II Total Piel sana 11 6 14 1 1 33 29 19 41 3 2 94

de sodio como activador de la producción de lipasas. Las placas con medio yema de huevo-taurocolato una vez inoculadas se incubaron a 32ºC. Se hicieron lecturas los días 3, 5, 7 y 10. La formación de zonas de lipólisis o aclaración alrededor de la colonia se consideró indicativa de la producción enzimática. La medida y el cálculo de la zona de AL se realizó de acuerdo al método descripto por Price et al. (23). La AL se calculó como la relación entre el diámetro de la colonia y el diámetro de la zona de lipólisis (23, 24). Estos coeficientes posteriormente se agrupan en 3 clases, lo que permite hacer una medición semicuantitativa de la actividad enzimática: AL = Diámetro de la colonia Diámetro de la zona de producción enzimática

Se incluyeron cepas de referencia: CBS 7886 M. globosa, CBS 7019 M. furfur, CBS 7222 M. sympodialis, CBS 7991 M. restricta y CBS 7956 M. slooffiae.

RESULTADOS
Se estudiaron 94 cepas aisladas de 34 pacientes con lesiones de PV, 20 con DS, 7 con PS y 33 cepas de personas con piel sana. En la Tabla 1 se presenta la distribución de las especies aisladas según el origen de la cepa. De los 94 aislados de Malassezia spp., 83 (88,23%) presentaron AL. En la Tabla 2 se muestra el índice de AL por grupo y afección dérmica. La distribución por especie de los valores de AL de los 94 aislamientos estudiados se muestra en la Tabla 3. El valor mínimo de AL obtenido se ubicó en 0,198 y el máximo en 1. La producción de lipasas de las especies de Malassezia en orden decreciente fue: M. sympodialis, M. slooffiae, M. furfur, M. globosa, M. restricta. Respecto a los tiempos de lectura, al 3er día no se observó desarrollo de M. globosa ni de M. restrica. A partir del día 5, todas habían desarrollado e iniciado su actividad. Entre el día 7 y el 10 se observó una disminución en la relación diámetro de la colonia/diámetro de la zona de producción enzimática. Por esta razón se tomó el

AL  0.69: actividad lipasa alta (+++) 0.69 >AL < 0.89: actividad lipasa media (++) 0.9 > AL < 1: actividad lipasa baja o no detectable (+) Aquellas cepas en las que no se detectó producción de la enzima, es decir, que se obtuvo una AL=1, se categorizaron como no productoras de lipasa. Para obtener un promedio de AL se midió la AL de 3 colonias de cada cepa estudiada. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

Tabla 2: Actividad lipasa de Malassezia spp. según grupo y cuadro clínico de procedencia.

N Grupo I Grupo II Pitiriasis versicolor Dermatitis seborreica Psoriasis Piel sana Total 34 20 7 33 94

cepas con AL 30 18 7 28 83

Actividad Lipasa (AL ± SD) 0,382 ± 0,246 0,379 ± 0,235 0,292 ± 0,096 0,437± 0,270

% 88.24 85.71 100 84.85 88.23

AL: Índice de actividad lipasa. SD: Desviación estándar 17

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Tabla 3: Distribución de los valores de AL obtenidos según la especie.
Especie AL 1,00 0,90 – 0,99 0,80 – 0,89 0,70 – 0,79 0,60 – 0,69 0,50 – 0,59 0,40 – 0,49 0,30 – 0,39 0,20 – 0,29 0,00 – 0,19 M. furfur M. globosa M. sympodialis M. restricta M. slooffiae n % n % n % n % n % + 2 6.89 8 19.51 0 0 1 33.33 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ++ 0 0 1 2.44 0 0 0 0 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 +++ 1 3.44 2 4.88 0 0 0 0 0 0 +++ 4 13.80 4 9.75 3 15.79 2 66.67 0 0 +++ 11 37.93 15 36.6 2 10.53 0 0 2 100 +++ 11 37.93 10 24.39 9 47.37 0 0 0 0 +++ 0 0 1 2.44 5 26.31 0 0 0 0 29 100 41 100 19 100 3 100 2 100 * Clase +: 0.9 ≤ AL ≤ 1; clase ++: 0.69 ≤ Lz ≤ 0.89; clase +++: Lz  0.69 Clase

septimo día como punto de corte para la lectura de AL, cuando las relaciones fueron más altas. Todos los valores de las Tablas 2 y 3 corresponden a la medida obtenida el día 7. Utilizando la prueba de análisis de la varianza ANOVA para comparar la AL entre las cepas de pacientes con afecciones de piel (Grupo I) y las cepas de personas sanas (Grupo II), no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas.

DISCUSION
La asociación de las especies de Malassezia a diversas patologías ha impulsado el estudio de su capacidad patogénica. Se considera que la producción de proteinasas y lipasas juega un papel importante en la patogenicidad de estos hongos oportunistas (17). Existe un gran número de publicaciones en las cuales se examina la producción de estas enzimas hidrolíticas en aislados de C. albicans y su papel en la patogénesis de la candidosis invasiva, ya que están relacionadas con su virulencia, pero, existen escasos estudios que investiguen su existencia y su relación con la virulencia de las levaduras del género Malassezia (25-28). Los pocos trabajos publicados sobre la actividad enzimática de Malassezia fueron realizados antes de la revisión del género, cuando se conocían sólo dos especies, M. furfur y M. pachydermatis (18, 19, 20). Probablemente esos resultados deben ser reevaluados, ya sea, porque no correspondan a alguna de las especies nombradas, o bien, por la posibilidad de la existencia de mezclas en los cultivos. El amplio espectro de especies de Malassezia reconocido en la actualidad hace interesante el estudio de los patrones bioquímicos y del comportamiento de cada una de ellas. 18

En este estudio se planteó la utilización de un medio sólido que permite la determinación semicuantitativa de la AL. El agregado de taurocolato dio buenos resultados, ya que los halos de producción enzimática obtenidos siempre fueron claros y definidos, por lo tanto, de fácil lectura y apreciación. Debido a que el género Malassezia se desarrolla más lentamente en cultivo que otras levaduras, como Candida, el tiempo de incubación fue más prolongado que el de la técnica original que fue ideada para levaduras no lipodependientes (20). Malassezia se desarrolla entre 5 y 7 días, por lo que su mayor actividad se observó al 7mo día. En nuestro trabajo encontramos AL en el 88,23% de los 94 aislamientos estudiados. Neves et al. (29), en un estudio similar al nuestro, hallaron 100% de AL en 11 aislamientos de Malassezia. Probablemente la discrepancia en el porcentaje de positividad se relacione con el número de cepas estudiado ya que aquellos autores sólo encontraron M. furfur y M. sympodialis. En nuestro trabajo M. sympodialis fue la especie que mostró mayor AL. Por otro lado, las 2 cepas de M. slooffiae presentaron alta AL. Dado el bajo número de aislamientos obtenidos, es difícil obtener una conclusión de valor sobre esta especie. M. globosa y M. furfur fueron las especies en que se observaron, por un lado mayor cantidad de cepas no productoras de actividad, y por otro, cepas con gran variabilidad en cuanto a la medida de AL, como así también, en cuanto a su distribución en relación a las patologías en que se asocian y su presencia en piel sana. Si bien esta claro que la actividad lipolítica es esencial para el crecimiento de Malassezia, al parecer no es su única función. Los lípidos asociados a la pared celular

Actividad lipasa en especies de Malassezia - Sosa et al.

han demostrado estar involucrados en una forma de evasión de la respuesta, ya que inhiben la respuesta proinflamatoria normal y esto provee la explicación de su estado de biota comensal en la piel. Además se cree que estos lípidos tienen importancia en la actividad fagocítica, dificultando su internalización y posterior acción microbicida (30). Se ha postulado que la AL está directamente relacionada a la virulencia, por lo tanto, a mayor AL mayor virulencia (18). En este trabajo no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de AL de cepas de afecciones y los de piel sana. Tampoco el índice ANOVA detectó diferencias significativas entre los resultados de las AL comparando los aislamientos de las diferentes afecciones dérmicas estudiadas. La AL debe ser considerada como uno de los factores de virulencia de estas levaduras, pero no el único factor que influye sobre la patogenicidad. Esta es una contribución al avance en el estudio de la ecología y del rol patogénico de las especies hoy conocidas del género Malassezia. AGRADECIMIENTOS Agradecemos la asistencia técnica de la Sra. Liliana Alegre en el desarrollo del presente trabajo.

yamatoensis, isolated from patient with seborrheic dermatitis, and its distribution in patients and healthy subjects. Microbiol. Immunol. 48:576-583 9. Crespo, E.V. & Delgado, F. V. (2002). Malassezia species in skin diseases. Curr. Opinión Infect. Dis. 15:133-142 10. M ayser, P.; Piche l, M.; Erdmann, F.; Papavassilis, C.; Schmidt, R. (1998). Different utilization of neutral lipids by Malassezia furfur and Malassezia sympodialis. Med. Mycol. 36 :7 -1 4 11. Midgley, G. (1989). The diversity of Pityrosporum (Malasezia) yeasts in vivo and in vitro. Mycopathologia 106:143-153 12.Cunningham, A.C.; Leeming, J.P.; Ingham, E.; Gowland, G. (1990). Differentiation of three serovars of Malassezia furfur. J. Appl. Bacteriol. 67:439-446 13. Nakabayashi, A.; Sei, Y.; Guillot, J. (2000). Identification of Malassezia species isolated from patients with seborrhoeic dermatitis, atopic dermatitis, pityriasis versicolor and normal subjects. Med. Mycol. 38:337-341 14. Faegemann, J. (2002). Atopic Dermatitis and Fungi. Clin. Microbiol. Rev. 15:545-563 15. Giusiano, G; Mangiaterra, M.; Garcia Saito, V.; Rojas, V.; Gómez, V.; Díaz, M.C. (2006). Fluconazole and Itraconazole Resistance of Yeasts Isolated from the Bloodstream and Catheters of Hospitalized Pediatric Patients. Chemotherapy 52:254-259 16 . Crespo E.V.; Oje da M.A.; Vera C. A.; Crespo E.A.; Sánchez F.F.; Guèho,E. (1999). Mycology of pityriasis versicolor. J. Mycol. Med. 9:143-148 17. Giusiano, G. (2006). Malassezia: Estado del conocimiento y perspectivas en su estudio. Rev. Arg. Microbiol. 38:41-48 18. Mancianti, F.; Rum, A.; Nardoni, S.; Corazza, M. (2000). Extra cellular enzyma tic activity of Ma lassezia spp. Isolates. Mycopathologia 149:131-135 19. Cafarchia, C. & Otranto, D. (2004). Association between Phospholipase Production by Malassezia pachydermatis and Skin Lesions. J. Clin. Microbiol. 42:4868-4869 20. Riciputo, R.M.; Oliveri, S.; Micali, G.; Sapuppo, A. (1996). Phospholipase activity in Malassezia furfur pathogenic strains. Mycoses 39:233-235 21.Guillot, J.; Guého, E.; Lesourd, M.; Midgley, G.; Chèvrier, G.; Dupont, B. (1996). Identification of Malassezia species. A practical approach. J. Mycol. Med. 6:103-110 22. Mirhendi, H.; Makimura, K.; Zomorodian, K.; Yamada, T.; Sugita, T.; Yamag uchi, H. (20 05). A simple PCR-RFLP method for identification and differentiation of 11 Malassezia species. J. Microbiol. Methods 61:281-284 23. Price, M.F.; Wilkinson, I.D.; Gentry, L.O . (1982). Plate method for detection of phospholipase activity in Ca ndida albicans. 23. Sabouraudia 20:7-14 24. Coutihno, S.D. & Paula, C.R. (2000). Proteinase, phospholipase, hyaluronidase and chondroitin-sulphate production by

REFERENCIAS
1.- van Burik, J.-A.H. & Magee, P.T. (2001). Aspect of fungal pathogenesis in humans. Ann. Rev. Microbiol. 55:743-772 2.-Guèho, E.; Boekhout, T.; Ashbee, H.R.; Guillot, J.; Van Belckum, A.; Faergeman, J. (1998). The role of Malassezia species in the ecology of human skin and as pathogen. Med. Mycol. 36 (supp1):220-229 3. Ashbee, H.R. & Evans, E.G. (2002). Inmunology of Diseases Associated with Malassezia species. Clin. Microbio. Rew. 21-57 4.Guillot, J.; Guého, E.; Lesourd, M.; Midgley, G.; Chèvrier, G.; Dupont, B. (1996). Identification of Malassezia species. A practical approach. J. Mycol. Med. 6:103-110 5.Gué ho, E.; M idg ley, G.; Guillot, J . (199 6). T he genus Malassezia with description of four new species. Antonie van Leeuwenhoek 69:337-55 6. Takashi, S.; Takashima, M.; Takako, S.; Hajime , S.; Tetsushi, U.; Ryoji, T.; Hideoki, O. (2002). New yeast species, Malassezia dermatis, isolated from patients with atopic dermatitis. J. Clin. Microbiol. 40:1363-1367 7. Sugita, T.; Takashima, M .; Kodama, M .; Tsuboi, R.; Nishikawa, A. (2 003). Description of a new yea st species, Malassezia japonica, and its detection in patients with atopic dermatitis and healthy subjects. J. Clin. Microbiol. 41:4695-4699 8. Sugita, T.; Tajima, M.; Takashima, M.; Armaya, M.; Saito, M.; Tsuboi, R.; Nishikawa, A. (2004). A new yeast, Malassezia

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Malassezia pachydermatis. Med. Mycol. 38:73-76 25. Chen, S.; Muller, M.; Zho u, J.; Wright. L.; Sorre l, T. (1997). Phospholipase activity in Cryptococcus neoformans: a new virulence factor? J. Infect. Dis. 175:414-420 26. Vidotto, V.; Sinicco, A.; Di Fraia, D.; Cardaropoli, S.; Ito Kuwa, S. (19 96). Phospholipase activity in Cryptoc occ us neoformans. Mycopathologia 136:119-123 27 . Banno, Y.; Yamada, T.; No zawa, Y. (19 85). Secreted phospholipa ses of the dimorphic fungus, Ca ndida a lbicans; separation of three enzymes and some biological properties. Sabouraudia 23:47–54

28 . Barrett-Bee , K.; Hayes, Y.; Wilson, R.G.; Ryley, J.F. (1985). A comparison of phospholipase activity, cellular adherence and pathogenicity of yeasts. J. Gen. Microbiol. 131:1217-1221 29. Nev es, R.; Magalhães, C.; Lucas da Silva, M.; SouzaMotta, C., Queiroz, L. (2005). Identification and pathogenicity of Malassezia species isolated from human healthy skin and whit macules. Brazilian J. Microbiol. 36:114-117 30. Brunke, S. & Hube, B. (2006) MfLIP1, a gene encoding an extracellular lipase of the lipid-dependant fungus Malassezia furfur. Microbiology 152:547-554

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ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA Y SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO A FLUCONAZOL EN AISLAMIENTOS CLINICOS Y AVIARIOS DE Cryptococcus neoformans
(Phospholipase activity and «in vitro» susceptibility to fluconazol in clinical and aviars isolates of Cryptococcus neoformans)
Gabriel Pérez C. (1), Gisela González H. (2), M. Cristina Díaz J. (3)
(1). Facultad de Medicina, Universidad de Chile (2). Programa Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias, Universidad de Chile (3).- Programa de Microbiologia y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. mcdiaz@med.uchile.cl Palabras clave: Fosfolipasa, Cryptococcus neoformans, susceptibilidad Fluconazol Key words:Phospholipase, Cryptococcus neoformans, susceptibility Fluconazol

RESUMEN
Se detectó la actividad de fosfolipasa en 19 cepas clínicas y 17 aviarias de C. neoformans var. neoformans, usando Agar Sabouraud con yema de huevo, incubándose a 37ºC por 5 dias. Se determinó el índice Pz estableciéndose los siguientes rangos: Pz muy alto (0.9-1), alto (0.89-0.80), bajo (0.79-0.70) y muy bajo (< 0.69). El 84% de las cepas clínicas presentaron índice Pz muy bajo, el 5% bajo y 11% muy alto. Mientras en las cepas aviarias el 82% presentaron índice muy bajo y un 18% muy alto. Los valores de Pz promedio fueron muy bajos en todos los aislamientos, sin existir diferencias significativas (p > 0,05) entre las cepas clínicas y aviarias, lo que implica una alta actividad enzimática. La susceptibilidad in vitro a Fluconazol se realizó por el método de difusión con discos y el 89,5 % de las cepas clínicas fueron sensibles y el 10,5% resistentes, mientras en las cepas aviarias, el 59% fueron sensibles, 29% sensible dosis dependiente y un12% resistentes.

ABSTRACT
Phospholipase activity was determined to 19 clinical and 17 aviars trains of C. neoformans var. neoformans, incubating the yeast for 5 days at 37º C on Sabouraud Agar supplemented with egg yolk. Pz values were determined and the following ranges were established:very high (0.9-1), high (0.89-0.80), low (0.79-0.70) and very low (<0.69). The 84% of the clinical isolates showed Pz values very low ( 5% ) and 11% very high. On the other hand, the 82% of the aviars strains presented Pz values very low and 18% very high. Average Pz values were very low in all isolates , there were no statiscally significant differences (p>0.05) impliying a high enzymatic activity. Susceptibility in vitro testing to Fluconazole was performed by a disk diffusion method (M44-A).The 89.5% of the clinical isolates were susceptible and 10.5% resistant, while in avian strains, 59% were susceptible, 29% susceptible dose dependent and 12% resistant. ción de esta enzima extracelular se relaciona eventualmente con patogenicidad (Ghannoum, 2000) . Paralelamente al aumento de la población en estado de inmunodepresión, la infección por C. neoformans ha emergido como una causa importante de morbilidad y mortalidad, afectando especialmente a pacientes con SIDA en etapa avanzada. Actualmente, representa la causa más común de meningitis fúngica en el mundo, y es una de las levaduras más frecuentemente asociadas a infección fún21

INTRODUCCION
Cryptococcus neoformans es una levadura capsulada que pertenece a los Basidiomycota (Garau, 2002) y que posee diversos factores de virulencia, entre los cuales se encuentra la fosfolipasa y por ende la producRecibido el 30 Octubre 2008 Aceptado el 5 Diciembre 2008

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gica invasora (García-Ruiz et al., 2004; Warnock, 2007). La virulencia de esta levadura es un tema ampliamente estudiado, diversas investigaciones han descrito factores de virulencia para C. neoformans, entre los que se encuentran la actividad fosfolipasa extracelular, la producción extracelular de melanina y de prostaglandinas, la producción de cápsula de polisacáridos y la habilidad de crecer a 37ºC (Vartivarian et al.,1993; Vidotto et al., 1996; Chen, 1997; Casadevall et al., 2000; Cox et al., 2001; Noverr et al., 2001; Perfect , 2006; Bovers et al., 2008). La fosfolipasa puede dañar las membranas celulares del hospedador generando disfunción y/o disrupción física de las membranas (Ghannoum, 2000) y jugar un rol importante en la patogénesis de este hongo oportunista (Vidotto et al., 1998). Más aún, la posible asociación de producción de fosfolipasa por cepas de Cryptococcus virulentas ya fue reportada por Chen et al. (1998). Con respecto a la actividad enzimática extracelular de fosfolipasa, Ganendren et al. (2006), observaron que esta es necesaria para la iniciación de la infección pulmonar, debido a que aumenta considerablemente la adhesión de la levadura al epitelio pulmonar. Santangelo et al. (2004), demostraron que la actividad fosfolipasa promueve la sobrevida y replicación de C. neoformans en macrófagos, lo que permite la iniciación de la infección pulmonar intersticial y que la fagocitosis mononuclear es el vehículo para la diseminación sistémica de esta levadura. Shea et al. (2006), observaron que la actividad fosfolipasa protege a C. neoformans de la acción lítica de las enzimas del fagolisosoma del macrófago activado, y que esto aumenta la diseminación de la levadura al sistema nervioso. La actividad fosfolipasa extracelular puede detectarse en Candida albicans y C. neoformans mediante diversas metodologías, tales como agar malta más yema de huevo, agar Sabouraud glucosado más yema de huevo (SEA) ( Price et al., 1982; Chen et al., 1997; Echeverría et al., 2002) y pruebas específicas colorimétricas y radiométricas (Banno et al.,1985; Ghannoum et al., 2000). El medio de cultivo SEA constituye un método semicuantitativo, de amplia utilización y de mayor sensibilidad para la detección de esta enzima en C. neoformans que otros similares (Chen et al., 1997 y Echeverría et al., 2002) . La sensibilidad de C. neoformans a antifúngicos utilizados en clínica para su tratamiento puede ser evaluada in vitro mediante técnicas estandarizadas tales como métodos de dilución en caldo, Etest y métodos de difusión en agar , siendo este último el de mayor uso en la actualidad debido a su elevada precisión y exactitud (Barry et al. 2002; Pfaller et al., 2004), y su mejor relación costoefectividad en comparación con otros métodos. Actualmente, no existe evidencia de que esta infor22

mación pueda correlacionarse con la respuesta terapéutica obtenida in vivo; sin embargo, un valor in vitro elevado de CIM puede predecir el fallo terapéutico de un antifúngico (Dannaoui et al., 2006 ). El objetivo de este estudio es detectar la actividad fosfolipasa en aislamientos clínicos y aviarios de C. neoformans y evaluar su susceptibilidad in vitro a Fluconazol

MATERIALES Y METODOS
Aislados de C. neoformans (Cn). Se utilizaron 19 cepas clínicas de Cn, aisladas de muestras de sangre y LCR de pacientes con criptococosis, obtenidas en diversos centros hospitalarios del país y 17 cepas de Cn obtenidas de deyecciones secas expuestas al medio ambiente de aves exóticas de 3 colecciones privadas y de psitácidas de un centro de rehabilitación de fauna nativa de la Región Metropolitana. Detección de la actividad fosfolipasa. La detección y cuantificación de la actividad fosfolipasa extracelular se realizó de acuerdo al método de Price (1982), con algunas modificaciones. Las cepas aisladas previamente fueron sembradas en placas de Agar Sabouraud sin antibiótico e incubadas a 37°C durante 48 hrs, posteriormente se inocularon en placas con medio de cultivo SEA (agar sabouraud glucosado con yema de huevo estéril) e incubadas a 37 °C durante 5 días. Se midieron los diámetros de las colonias y el diámetro total de la colonia más la zona de hidrólisis producida por la actividad enzimática y se calculó la relación entre ambos valores (índice Pz de Price). A mayor valor de Pz, menor producción de fosfolipasa por la colonia. La lectura se realizó en todas las muestras a los 5 días. Cada aislado de C. neoformans se clasificó de acuerdo al valor de su coeficiente Pz como sigue: Pz muy alto (0.9-1); Pz alto (0.89-0.80); Pz bajo (0.790.70); Pz muy bajo (< 0.69). Susceptibilidad in vitro a Fluconazol : se evaluó mediante el método de difusión con discos de 25 µg de Fluconazol (Becton Dickinson), de acuerdo a las recomendaciones del documento M44-A de CLSI, utilizando medio Mueller­Hinton con glucosa al 2% y azul de metileno (MHGAM). Las 36 cepas aisladas previamente fueron sembradas en placas de Agar Sabouraud sin antibiótico e incubadas a 37°C durante 48 hrs, el inóculo se preparó en solución salina y se ajustó a 0.5 en la escala Mc Farland por medida espectrofotométrica. Se incluyó Candida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC22019 como cepas de control de calidad. La interpretación de los resultados se llevó a

Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios.

- Perez et al. .

Tabla 1: Actividad de fosfolipasa en cepas clínicas y aviarias de C. neoformans
Valor Pz

Actividad fosfolipasa (Índice Pz)a ++++ +++ ++ +
a

Cepas de C neoformans Clínicas Aviarias n (%) n (%) 16 1 2 84,21 5,26 10,53 14 3 82,35 17,65

< 0.69 0.70 - 0.79 0.80 - 0.89 0.90 -1.0

Pz muy alto (+); alto (++); bajo (+++); muy bajo (++++)

cabo de acuerdo a la tabla Nº 1 de documento M44-A. Según el diámetro del halo de inhibición del crecimiento de la colonia; cada aislado frente al disco de 25 µg de Fluconazol se clasificó como sensible (>19mm), sensible dosis dependiente (15-18mm), o resistente (<14mm). Análisis Estadístico. Con el objeto de comparar el valor Pz del día 5 de incubación de las cepas de Cn de origen humano y aviar, se utilizó la prueba estadística de Mann-Whitney con cálculo de U para dos muestras independientes.

DISCUSION
La actividad fosfolipasa extracelular ha sido implicada en la patogénesis de infecciones bacterianas y fúngicas Ghannoum et al.( 2000), existen numerosas publicaciones en que se ha detectado esta actividad en levaduras, principalmente en Candida albicans y C. neoformans usando diferentes métodos para medirla (Price et al.,1982; Chen et al., 1997; Echeverría et al., 2002). Entre éstos, el método desarrollado por Price resulta conveniente y sencillo de utilizar en un gran número de aislados (Vidotto et al., 1998). Además la correlación entre el valor Pz y la actividad fosfolipasa ya fue demostrada (Price et al., 1982). En el presente estudio, no hubo diferencias significativas en los valores Pz entre las cepas de ambos grupos, lo que concuerda con lo comunicado por Chen et al. (1997), y difiere de lo reportado por Vidotto et al. (1998), quienes si encontraron diferencias significativas. En nuestro estudio, las cepas aviarias presentaron, con respecto a los aislados clínicos un Pz promedio mayor (0,49 vs 0,44); y un mayor número de aislados sin detección de fosfolipasa (15,8% vs 5,3%). Esta tendencia se mantuvo igual al estudio de Vidotto et al. (1998), donde las cepas Tabla 2: Susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y ambientales de C. neoformans

RESULTADOS
Detección actividad fosfolipasa. En las 19 cepas clínicas analizadas, los valores Pz al día 5 de incubación variaron en un rango de 0,26 a 1 (Promedio Pz= 0,44± 0,21 y coeficiente de variación (CV) de 48%). Cerca del 90% presentó un índice Pz bajo o muy bajo (1 y 16 respectivamente) y 2 muestras presentaron índice Pz muy alto (0.915 y 1). Sólo en una de las cepas, no se detectó actividad fosfolipasa (Pz=1) En las 17 cepas aisladas de deyecciones de aves, los valores Pz al día 5, variaron entre 0,28 y 1 (promedio Pz= 0,49 ± 0,264 y CV de 54%). Catorce cepas presentaron un Pz muy bajo (82%) y 3, muy alto (18%). En estas tres cepas no se detectó actividad fosfolipasa. No hubo diferencias significativas entre los aislados clínicos y los aviarios mediante la prueba de Mann Whitney (p > 0,05), U=144. Susceptibilidad in vitro a Fluconazol . En 19 cepas clínicas, 17 (89,47%) fueron sensibles mientras que 2 (10,53%) resultaron resistentes. En 17 aislamientos aviarios, 10 fueron sensibles (58,8%), 5 (29,4 %) sensibles dosis dependiente y 2 (11,8%) resistentes (Tabla 2).

Cepas de C. neoformans Clínicas Aviarias

N

Susceptibilidad in vitro a Fluconazolª %S %SDD %R 89,47 58,82 29,41 10,53 11,77

19 17

ª Sensible (S, ≥19mm), sensible dosis dependiente (SDD,15-18mm), o resistente (R, ≤14mm)
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aviarias también presentaron, con respecto a las cepas clínicas, un valor Pz promedio mayor (0,941 y 0,652 respectivamente) y un mayor número de cepas sin detección de fosfolipasa (74% y 4,76%, respectivamente). La mayoría de las cepas estudiadas fueron sensibles a Fluconazol (89,5% clínicas, 59% aviarias), pero en las cepas aviarias se detectó un mayor número de cepas sensibles dosis dependiente (29%). Estos resultados son similares a los obtenidos por Pfaller et al. ( 2007), en cepas clínicas, que reportan una sensibilidad de 78% a Fluconazol. Referente a las cepas aviares, un estudio identificó los aislados obtenidos a partir de un brote de Cryptococosis en psitácidas en Brasil como resistentes a Fluconazol (Raso et al., 2004), mientras que en Malasia, todos los C. neoformans aislados de deyecciones aviares fueron sensibles al antifúngico (Tay et al., 2005). En base a lo expuesto podemos concluir que los valores de Pz promedio fueron muy bajos en aislamientos clínicos y aviarios de Cn, lo que se traduce en un nivel de actividad fosfolipasa alta y sugiere un rol de la enzima en la invasión al hospedero. En muy pocas cepas no se detectó la producción de fosfolipasa.

(2002). Estudio comparativo de dos medios de cultivo para la detección de la actividad fosfolipasa en cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Rev. Iberoam. Micol. 19:95-98 Ganendren, R.; Carter, E.; Sorrell, T.; Widmer, F.; Wright, L. (20 06). Phospholipase B activity enhances adhesion of Cryptococcus neoformans to a human lung epithelial cell line. Microbes and Infection 8:1006-1015 Garau, M. & Del Palacio, A. (2002). Artritis por Cryptococcus neoformans en receptor de transplante renal. Rev. Iberoam. Micol. 19:186-189 Ghannoum, M . (200 0). Potentia l role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clin. Microbiol. Rev. Jan: 12214 3 García-Ruiz, J.C.; Amutio, E. & Pontón, J. (2004). Infección fúngica invasora en pacientes inmunodeficientes. Rev. Iberoam. Micol. 21:55-62 No ver r, M.; Phare , S.; Toe ws, G.; Co ffe y, M.; Huffnagle, G.(200 1). Pa thogenic Yea sts Cryptoco ccus neo formans and Candida albicans produce Immunomodulatory Prostaglandins. Infection and Immunity May:2957-2963 Perfect, J.R. (2006). Cryptococcus neoformans: the yeast that likes it hot. FEMS Yeast Res 6:463-468 Pfaller, M.; Hazen, K.; Messer, S.; Boyken, L.; Tendolkar, S.; Hollis, R.; Diekemal, D. (2004). Comparison of Results of Fluconazole Disk Diffusion Testing for Candida Species with Results from a Central Reference Laboratory in the ARTEMIS Global Antifungal Su rveillance Program. Jou rnal of Clinical Microbiology 8:3607-3612 Pfalle r. M.; Die kema, D.; Gibbs, D.; Ne well, V.; Meis, J .; Gould, I.; Fu, W.; Colombo, A.; Rodriguez-Noriega, E.; the Global Antifungal Surveillance Group. (2007). Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study, 1997 to 2005: an 8.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida Species and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole Determined by CLSI Standardized Disk Diffusion Testing. Journal of Clinical Microbiology 45,6:1735-1745 Price, M.; Wilkinson, I. & Gentr y, L. (1982). Plate method for detection of phospholipase activity in Ca ndida a lbicans. Sabouraudia 20:7-14 Raso, T.F.; We rther, K.; Miranda, E.T.; Me ndes-Giannini, M.J. (2004). Cryptococcosis outbreak in psittacine birds in Brazil. Med. Mycol. 42:355-362 Santangelo, R., Zoellner, H.; Sorrell, T.; Wilson, C.; Donald, C.; Djordjevic, J.; Shounan, Y.; Wright, L. (2004). Role of extra cellular phospholipases and mononuclear phagocytes in dissemination of Cryptococcosis in a murine model. Infection and Immunity Apr:2229-2239 Shea, J.; Kechichian, T.; Luberto, C.; Del Poeta, M. (2006). The Cryptococcal Enzyme Inositol PhosphosphingolipidPhospholipase C Confers Resistance to the Antifungal Effects of Macrophages and Promotes Fungal Dissemination to the Central Nervous System. Infection and Immunity; Oct: 5977–5988 Tay, S.T.; Chai, H.C.; Na, S.L.; Hamimal, H.; Rohani, M.Y.

REFERENCIAS
Banno , Y.; Yamada, T. & No zawa, Y. (19 85). Secreted phospholipa ses of the dimorphic fungus, Ca ndida a lbicans; separation of the three enzymes and some biological properties. Sabouraudia 23:47-54 Barry, A.; Pfaller, M.; Rennie, R.; Fuchs, P.; Brown, S. (2002). Precision and Accuracy of Fluconazole Susceptibility Testing by Broth Microdilution, Etest, a nd Disk Diffusion Methods. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46:1781-1784 Bovers, M.; Hagen, F.; Boekhout, T. (2008). Diversity of the Cryptococcus neoformans- Cryptococcus gattii species complex. Rev. Iberoam. Micol. 25:S4-S12 Casadevall, A.; Rosas, A.; Nosanchuk, J. (2000). Melanin and virulence in Cryptoco ccus neo formans. Current Opinion in Microbiology 3:354-358 Cox, G.; McDade, H.; Chen, S.; Tucker, S.; Gottfredsson, M.; Wrig ht, L.; Sorrell, T.; Le idich, S.; Casadev all, A.; Ghannoum, A.; Perfect, J. (2001). Extracellular phospholipase activity is a virulence factor for Cryptoco ccus neo formans. Molecular Microbiology 39:166-175 Chen, S.; Muller, M.; Zhou, Z.; Wright, L.; Sorrell, T. (1997) Phospholipa se activity in Cryptoco ccus neo formans: a new virulence factor?. J. Infect. Dis. 175:414-420 Dannaoui, E.; Abdul, M.; Ar pin, M .; Mic hel-Nyugen, A.; Piens, A.; Fav el, A.( 20 06 ). Results obta ined with va rious antifungal susceptibility testing methods do not predict early clinical outcome in patients with cryptococcosis Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50:2464-2470 Ec hev err ía, A.; Durante , A.; Arec hav ala, A.; Neg roni, R .

24

Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios.

- Perez et al. .

M.; Soo-Hoo,T.S. (2005). The isolation, characteriza tion and antifungal susceptibilities of Cryptococcus neoformans from birds excreta in Klan Valley, Malaysia. Mycopathologia 159:509-513 Vartivarian, S.E.; Anaissie, E.J.; Cowart, R.E.; Sprigg, H.A.; Tingler, M.J.; Jacobson, E.S. (1993). Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J. Infect. Dis. 161:186-190 Vidotto, V.; Sinicco, A.; Di Fraia, D.; Cardaropoli, S.; Aoki, S.; Ito-Kuwa, S. ( 1996) Phospholipase activity in Cryptococcus neoformans. Mycopathologia 136:119-123

Vidotto, V.; Leone, R.; Sinicco, A.; Ito-Kuwa, S.; Criseo, G. (1998). Comparison of phospholipase production in Cryptococcus ne oformans isola tes from AIDS patients and bird droppings. Mycopathologia 142:71–76 Warnoc k, D. (200 7). Trends in the epidemiology of invasive fungal infections. Jpn. J. Med. Mycol.; 48:1-12

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ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA Y SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO A FLUCONAZOL EN AISLAMIENTOS CLINICOS Y AVIARIOS DE Cryptococcus neoformans
(Phospholipase activity and «in vitro» susceptibility to fluconazol in clinical and aviars isolates of Cryptococcus neoformans)
Gabriel Pérez C. (1), Gisela González H. (2), M. Cristina Díaz J. (3)
(1). Facultad de Medicina, Universidad de Chile (2). Programa Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias, Universidad de Chile (3).- Programa de Microbiologia y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. mcdiaz@med.uchile.cl Palabras clave: Fosfolipasa, Cryptococcus neoformans, susceptibilidad Fluconazol Key words:Phospholipase, Cryptococcus neoformans, susceptibility Fluconazol

RESUMEN
Se detectó la actividad de fosfolipasa en 19 cepas clínicas y 17 aviarias de C. neoformans var. neoformans, usando Agar Sabouraud con yema de huevo, incubándose a 37ºC por 5 dias. Se determinó el índice Pz estableciéndose los siguientes rangos: Pz muy alto (0.9-1), alto (0.89-0.80), bajo (0.79-0.70) y muy bajo (< 0.69). El 84% de las cepas clínicas presentaron índice Pz muy bajo, el 5% bajo y 11% muy alto. Mientras en las cepas aviarias el 82% presentaron índice muy bajo y un 18% muy alto. Los valores de Pz promedio fueron muy bajos en todos los aislamientos, sin existir diferencias significativas (p > 0,05) entre las cepas clínicas y aviarias, lo que implica una alta actividad enzimática. La susceptibilidad in vitro a Fluconazol se realizó por el método de difusión con discos y el 89,5 % de las cepas clínicas fueron sensibles y el 10,5% resistentes, mientras en las cepas aviarias, el 59% fueron sensibles, 29% sensible dosis dependiente y un12% resistentes.

ABSTRACT
Phospholipase activity was determined to 19 clinical and 17 aviars trains of C. neoformans var. neoformans, incubating the yeast for 5 days at 37º C on Sabouraud Agar supplemented with egg yolk. Pz values were determined and the following ranges were established:very high (0.9-1), high (0.89-0.80), low (0.79-0.70) and very low (<0.69). The 84% of the clinical isolates showed Pz values very low ( 5% ) and 11% very high. On the other hand, the 82% of the aviars strains presented Pz values very low and 18% very high. Average Pz values were very low in all isolates , there were no statiscally significant differences (p>0.05) impliying a high enzymatic activity. Susceptibility in vitro testing to Fluconazole was performed by a disk diffusion method (M44-A).The 89.5% of the clinical isolates were susceptible and 10.5% resistant, while in avian strains, 59% were susceptible, 29% susceptible dose dependent and 12% resistant. ción de esta enzima extracelular se relaciona eventualmente con patogenicidad (Ghannoum, 2000) . Paralelamente al aumento de la población en estado de inmunodepresión, la infección por C. neoformans ha emergido como una causa importante de morbilidad y mortalidad, afectando especialmente a pacientes con SIDA en etapa avanzada. Actualmente, representa la causa más común de meningitis fúngica en el mundo, y es una de las levaduras más frecuentemente asociadas a infección fún21

INTRODUCCION
Cryptococcus neoformans es una levadura capsulada que pertenece a los Basidiomycota (Garau, 2002) y que posee diversos factores de virulencia, entre los cuales se encuentra la fosfolipasa y por ende la producRecibido el 30 Octubre 2008 Aceptado el 5 Diciembre 2008

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gica invasora (García-Ruiz et al., 2004; Warnock, 2007). La virulencia de esta levadura es un tema ampliamente estudiado, diversas investigaciones han descrito factores de virulencia para C. neoformans, entre los que se encuentran la actividad fosfolipasa extracelular, la producción extracelular de melanina y de prostaglandinas, la producción de cápsula de polisacáridos y la habilidad de crecer a 37ºC (Vartivarian et al.,1993; Vidotto et al., 1996; Chen, 1997; Casadevall et al., 2000; Cox et al., 2001; Noverr et al., 2001; Perfect , 2006; Bovers et al., 2008). La fosfolipasa puede dañar las membranas celulares del hospedador generando disfunción y/o disrupción física de las membranas (Ghannoum, 2000) y jugar un rol importante en la patogénesis de este hongo oportunista (Vidotto et al., 1998). Más aún, la posible asociación de producción de fosfolipasa por cepas de Cryptococcus virulentas ya fue reportada por Chen et al. (1998). Con respecto a la actividad enzimática extracelular de fosfolipasa, Ganendren et al. (2006), observaron que esta es necesaria para la iniciación de la infección pulmonar, debido a que aumenta considerablemente la adhesión de la levadura al epitelio pulmonar. Santangelo et al. (2004), demostraron que la actividad fosfolipasa promueve la sobrevida y replicación de C. neoformans en macrófagos, lo que permite la iniciación de la infección pulmonar intersticial y que la fagocitosis mononuclear es el vehículo para la diseminación sistémica de esta levadura. Shea et al. (2006), observaron que la actividad fosfolipasa protege a C. neoformans de la acción lítica de las enzimas del fagolisosoma del macrófago activado, y que esto aumenta la diseminación de la levadura al sistema nervioso. La actividad fosfolipasa extracelular puede detectarse en Candida albicans y C. neoformans mediante diversas metodologías, tales como agar malta más yema de huevo, agar Sabouraud glucosado más yema de huevo (SEA) ( Price et al., 1982; Chen et al., 1997; Echeverría et al., 2002) y pruebas específicas colorimétricas y radiométricas (Banno et al.,1985; Ghannoum et al., 2000). El medio de cultivo SEA constituye un método semicuantitativo, de amplia utilización y de mayor sensibilidad para la detección de esta enzima en C. neoformans que otros similares (Chen et al., 1997 y Echeverría et al., 2002) . La sensibilidad de C. neoformans a antifúngicos utilizados en clínica para su tratamiento puede ser evaluada in vitro mediante técnicas estandarizadas tales como métodos de dilución en caldo, Etest y métodos de difusión en agar , siendo este último el de mayor uso en la actualidad debido a su elevada precisión y exactitud (Barry et al. 2002; Pfaller et al., 2004), y su mejor relación costoefectividad en comparación con otros métodos. Actualmente, no existe evidencia de que esta infor22

mación pueda correlacionarse con la respuesta terapéutica obtenida in vivo; sin embargo, un valor in vitro elevado de CIM puede predecir el fallo terapéutico de un antifúngico (Dannaoui et al., 2006 ). El objetivo de este estudio es detectar la actividad fosfolipasa en aislamientos clínicos y aviarios de C. neoformans y evaluar su susceptibilidad in vitro a Fluconazol

MATERIALES Y METODOS
Aislados de C. neoformans (Cn). Se utilizaron 19 cepas clínicas de Cn, aisladas de muestras de sangre y LCR de pacientes con criptococosis, obtenidas en diversos centros hospitalarios del país y 17 cepas de Cn obtenidas de deyecciones secas expuestas al medio ambiente de aves exóticas de 3 colecciones privadas y de psitácidas de un centro de rehabilitación de fauna nativa de la Región Metropolitana. Detección de la actividad fosfolipasa. La detección y cuantificación de la actividad fosfolipasa extracelular se realizó de acuerdo al método de Price (1982), con algunas modificaciones. Las cepas aisladas previamente fueron sembradas en placas de Agar Sabouraud sin antibiótico e incubadas a 37°C durante 48 hrs, posteriormente se inocularon en placas con medio de cultivo SEA (agar sabouraud glucosado con yema de huevo estéril) e incubadas a 37 °C durante 5 días. Se midieron los diámetros de las colonias y el diámetro total de la colonia más la zona de hidrólisis producida por la actividad enzimática y se calculó la relación entre ambos valores (índice Pz de Price). A mayor valor de Pz, menor producción de fosfolipasa por la colonia. La lectura se realizó en todas las muestras a los 5 días. Cada aislado de C. neoformans se clasificó de acuerdo al valor de su coeficiente Pz como sigue: Pz muy alto (0.9-1); Pz alto (0.89-0.80); Pz bajo (0.790.70); Pz muy bajo (< 0.69). Susceptibilidad in vitro a Fluconazol : se evaluó mediante el método de difusión con discos de 25 µg de Fluconazol (Becton Dickinson), de acuerdo a las recomendaciones del documento M44-A de CLSI, utilizando medio Mueller­Hinton con glucosa al 2% y azul de metileno (MHGAM). Las 36 cepas aisladas previamente fueron sembradas en placas de Agar Sabouraud sin antibiótico e incubadas a 37°C durante 48 hrs, el inóculo se preparó en solución salina y se ajustó a 0.5 en la escala Mc Farland por medida espectrofotométrica. Se incluyó Candida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC22019 como cepas de control de calidad. La interpretación de los resultados se llevó a

Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios.

- Perez et al. .

Tabla 1: Actividad de fosfolipasa en cepas clínicas y aviarias de C. neoformans
Valor Pz

Actividad fosfolipasa (Índice Pz)a ++++ +++ ++ +
a

Cepas de C neoformans Clínicas Aviarias n (%) n (%) 16 1 2 84,21 5,26 10,53 14 3 82,35 17,65

< 0.69 0.70 - 0.79 0.80 - 0.89 0.90 -1.0

Pz muy alto (+); alto (++); bajo (+++); muy bajo (++++)

cabo de acuerdo a la tabla Nº 1 de documento M44-A. Según el diámetro del halo de inhibición del crecimiento de la colonia; cada aislado frente al disco de 25 µg de Fluconazol se clasificó como sensible (>19mm), sensible dosis dependiente (15-18mm), o resistente (<14mm). Análisis Estadístico. Con el objeto de comparar el valor Pz del día 5 de incubación de las cepas de Cn de origen humano y aviar, se utilizó la prueba estadística de Mann-Whitney con cálculo de U para dos muestras independientes.

DISCUSION
La actividad fosfolipasa extracelular ha sido implicada en la patogénesis de infecciones bacterianas y fúngicas Ghannoum et al.( 2000), existen numerosas publicaciones en que se ha detectado esta actividad en levaduras, principalmente en Candida albicans y C. neoformans usando diferentes métodos para medirla (Price et al.,1982; Chen et al., 1997; Echeverría et al., 2002). Entre éstos, el método desarrollado por Price resulta conveniente y sencillo de utilizar en un gran número de aislados (Vidotto et al., 1998). Además la correlación entre el valor Pz y la actividad fosfolipasa ya fue demostrada (Price et al., 1982). En el presente estudio, no hubo diferencias significativas en los valores Pz entre las cepas de ambos grupos, lo que concuerda con lo comunicado por Chen et al. (1997), y difiere de lo reportado por Vidotto et al. (1998), quienes si encontraron diferencias significativas. En nuestro estudio, las cepas aviarias presentaron, con respecto a los aislados clínicos un Pz promedio mayor (0,49 vs 0,44); y un mayor número de aislados sin detección de fosfolipasa (15,8% vs 5,3%). Esta tendencia se mantuvo igual al estudio de Vidotto et al. (1998), donde las cepas Tabla 2: Susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y ambientales de C. neoformans

RESULTADOS
Detección actividad fosfolipasa. En las 19 cepas clínicas analizadas, los valores Pz al día 5 de incubación variaron en un rango de 0,26 a 1 (Promedio Pz= 0,44± 0,21 y coeficiente de variación (CV) de 48%). Cerca del 90% presentó un índice Pz bajo o muy bajo (1 y 16 respectivamente) y 2 muestras presentaron índice Pz muy alto (0.915 y 1). Sólo en una de las cepas, no se detectó actividad fosfolipasa (Pz=1) En las 17 cepas aisladas de deyecciones de aves, los valores Pz al día 5, variaron entre 0,28 y 1 (promedio Pz= 0,49 ± 0,264 y CV de 54%). Catorce cepas presentaron un Pz muy bajo (82%) y 3, muy alto (18%). En estas tres cepas no se detectó actividad fosfolipasa. No hubo diferencias significativas entre los aislados clínicos y los aviarios mediante la prueba de Mann Whitney (p > 0,05), U=144. Susceptibilidad in vitro a Fluconazol . En 19 cepas clínicas, 17 (89,47%) fueron sensibles mientras que 2 (10,53%) resultaron resistentes. En 17 aislamientos aviarios, 10 fueron sensibles (58,8%), 5 (29,4 %) sensibles dosis dependiente y 2 (11,8%) resistentes (Tabla 2).

Cepas de C. neoformans Clínicas Aviarias

N

Susceptibilidad in vitro a Fluconazolª %S %SDD %R 89,47 58,82 29,41 10,53 11,77

19 17

ª Sensible (S, ≥19mm), sensible dosis dependiente (SDD,15-18mm), o resistente (R, ≤14mm)
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aviarias también presentaron, con respecto a las cepas clínicas, un valor Pz promedio mayor (0,941 y 0,652 respectivamente) y un mayor número de cepas sin detección de fosfolipasa (74% y 4,76%, respectivamente). La mayoría de las cepas estudiadas fueron sensibles a Fluconazol (89,5% clínicas, 59% aviarias), pero en las cepas aviarias se detectó un mayor número de cepas sensibles dosis dependiente (29%). Estos resultados son similares a los obtenidos por Pfaller et al. ( 2007), en cepas clínicas, que reportan una sensibilidad de 78% a Fluconazol. Referente a las cepas aviares, un estudio identificó los aislados obtenidos a partir de un brote de Cryptococosis en psitácidas en Brasil como resistentes a Fluconazol (Raso et al., 2004), mientras que en Malasia, todos los C. neoformans aislados de deyecciones aviares fueron sensibles al antifúngico (Tay et al., 2005). En base a lo expuesto podemos concluir que los valores de Pz promedio fueron muy bajos en aislamientos clínicos y aviarios de Cn, lo que se traduce en un nivel de actividad fosfolipasa alta y sugiere un rol de la enzima en la invasión al hospedero. En muy pocas cepas no se detectó la producción de fosfolipasa.

(2002). Estudio comparativo de dos medios de cultivo para la detección de la actividad fosfolipasa en cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Rev. Iberoam. Micol. 19:95-98 Ganendren, R.; Carter, E.; Sorrell, T.; Widmer, F.; Wright, L. (20 06). Phospholipase B activity enhances adhesion of Cryptococcus neoformans to a human lung epithelial cell line. Microbes and Infection 8:1006-1015 Garau, M. & Del Palacio, A. (2002). Artritis por Cryptococcus neoformans en receptor de transplante renal. Rev. Iberoam. Micol. 19:186-189 Ghannoum, M . (200 0). Potentia l role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clin. Microbiol. Rev. Jan: 12214 3 García-Ruiz, J.C.; Amutio, E. & Pontón, J. (2004). Infección fúngica invasora en pacientes inmunodeficientes. Rev. Iberoam. Micol. 21:55-62 No ver r, M.; Phare , S.; Toe ws, G.; Co ffe y, M.; Huffnagle, G.(200 1). Pa thogenic Yea sts Cryptoco ccus neo formans and Candida albicans produce Immunomodulatory Prostaglandins. Infection and Immunity May:2957-2963 Perfect, J.R. (2006). Cryptococcus neoformans: the yeast that likes it hot. FEMS Yeast Res 6:463-468 Pfaller, M.; Hazen, K.; Messer, S.; Boyken, L.; Tendolkar, S.; Hollis, R.; Diekemal, D. (2004). Comparison of Results of Fluconazole Disk Diffusion Testing for Candida Species with Results from a Central Reference Laboratory in the ARTEMIS Global Antifungal Su rveillance Program. Jou rnal of Clinical Microbiology 8:3607-3612 Pfalle r. M.; Die kema, D.; Gibbs, D.; Ne well, V.; Meis, J .; Gould, I.; Fu, W.; Colombo, A.; Rodriguez-Noriega, E.; the Global Antifungal Surveillance Group. (2007). Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study, 1997 to 2005: an 8.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida Species and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole Determined by CLSI Standardized Disk Diffusion Testing. Journal of Clinical Microbiology 45,6:1735-1745 Price, M.; Wilkinson, I. & Gentr y, L. (1982). Plate method for detection of phospholipase activity in Ca ndida a lbicans. Sabouraudia 20:7-14 Raso, T.F.; We rther, K.; Miranda, E.T.; Me ndes-Giannini, M.J. (2004). Cryptococcosis outbreak in psittacine birds in Brazil. Med. Mycol. 42:355-362 Santangelo, R., Zoellner, H.; Sorrell, T.; Wilson, C.; Donald, C.; Djordjevic, J.; Shounan, Y.; Wright, L. (2004). Role of extra cellular phospholipases and mononuclear phagocytes in dissemination of Cryptococcosis in a murine model. Infection and Immunity Apr:2229-2239 Shea, J.; Kechichian, T.; Luberto, C.; Del Poeta, M. (2006). The Cryptococcal Enzyme Inositol PhosphosphingolipidPhospholipase C Confers Resistance to the Antifungal Effects of Macrophages and Promotes Fungal Dissemination to the Central Nervous System. Infection and Immunity; Oct: 5977–5988 Tay, S.T.; Chai, H.C.; Na, S.L.; Hamimal, H.; Rohani, M.Y.

REFERENCIAS
Banno , Y.; Yamada, T. & No zawa, Y. (19 85). Secreted phospholipa ses of the dimorphic fungus, Ca ndida a lbicans; separation of the three enzymes and some biological properties. Sabouraudia 23:47-54 Barry, A.; Pfaller, M.; Rennie, R.; Fuchs, P.; Brown, S. (2002). Precision and Accuracy of Fluconazole Susceptibility Testing by Broth Microdilution, Etest, a nd Disk Diffusion Methods. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46:1781-1784 Bovers, M.; Hagen, F.; Boekhout, T. (2008). Diversity of the Cryptococcus neoformans- Cryptococcus gattii species complex. Rev. Iberoam. Micol. 25:S4-S12 Casadevall, A.; Rosas, A.; Nosanchuk, J. (2000). Melanin and virulence in Cryptoco ccus neo formans. Current Opinion in Microbiology 3:354-358 Cox, G.; McDade, H.; Chen, S.; Tucker, S.; Gottfredsson, M.; Wrig ht, L.; Sorrell, T.; Le idich, S.; Casadev all, A.; Ghannoum, A.; Perfect, J. (2001). Extracellular phospholipase activity is a virulence factor for Cryptoco ccus neo formans. Molecular Microbiology 39:166-175 Chen, S.; Muller, M.; Zhou, Z.; Wright, L.; Sorrell, T. (1997) Phospholipa se activity in Cryptoco ccus neo formans: a new virulence factor?. J. Infect. Dis. 175:414-420 Dannaoui, E.; Abdul, M.; Ar pin, M .; Mic hel-Nyugen, A.; Piens, A.; Fav el, A.( 20 06 ). Results obta ined with va rious antifungal susceptibility testing methods do not predict early clinical outcome in patients with cryptococcosis Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50:2464-2470 Ec hev err ía, A.; Durante , A.; Arec hav ala, A.; Neg roni, R .

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Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios.

- Perez et al. .

M.; Soo-Hoo,T.S. (2005). The isolation, characteriza tion and antifungal susceptibilities of Cryptococcus neoformans from birds excreta in Klan Valley, Malaysia. Mycopathologia 159:509-513 Vartivarian, S.E.; Anaissie, E.J.; Cowart, R.E.; Sprigg, H.A.; Tingler, M.J.; Jacobson, E.S. (1993). Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J. Infect. Dis. 161:186-190 Vidotto, V.; Sinicco, A.; Di Fraia, D.; Cardaropoli, S.; Aoki, S.; Ito-Kuwa, S. ( 1996) Phospholipase activity in Cryptococcus neoformans. Mycopathologia 136:119-123

Vidotto, V.; Leone, R.; Sinicco, A.; Ito-Kuwa, S.; Criseo, G. (1998). Comparison of phospholipase production in Cryptococcus ne oformans isola tes from AIDS patients and bird droppings. Mycopathologia 142:71–76 Warnoc k, D. (200 7). Trends in the epidemiology of invasive fungal infections. Jpn. J. Med. Mycol.; 48:1-12

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ESPECIES DE Fusarium COMO AGENTES DE QUERATITIS MICOTICAS EN ADULTOS EN TUCUMAN, ARGENTINA
(Fusarium species as agents of mycotic keratitis in adults, in Tucumán, Argentina)
R. Salim (1) & R. Runco (1, 2)
(1). Cátedra de Micología. Instituto de Microbiología Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán Ayacucho 491. (4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina. (2). Lab. Micología del Hospital del Niño Jesús. Pasaje Hungría 750. (4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina. e-mail: rqsalim@rectorado.unt.edu.ar Palabras clave: Queratitis, Fusarium spp, diagnóstico micológico. Key words: Mycotic keratitis, Fusarium spp, Laboratory diagnoses

RESUMEN
Las queratomicosis por hongos filamentosos son una de las causas de daño en la córnea en los países de climas tropicales y subtropicales y se consideran dentro de las micosis de difícil tratamiento. El presente estudio evalúa la etiología de las queratitis micóticas en Tucumán (R. Argentina) para determinar su incidencia e importancia clínica regional. En un lapso de 5 años se estudiaron 48 muestras (biopsias, raspados corneales y/ o aspirados oculares) recogidas por el oftalmólogo y enviadas al laboratorio para análisis micológico. Mediante examen directo, cultivos y estudios macro y micromorfológicos se confirmó etiología micótica en 13 pacientes (27%). De ellos, se identificaron 7 cultivos como Fusarium solani complex, 4 F. oxysporum y 2 F. verticillioides. Estos hallazgos permiten profundizar el conocimiento de los agentes etiológicos locales involucrados y los factores de riesgo, dos aspectos importantes en la prevención y la terapéutica de estas micosis.

ABSTRACT
Keratomycosis caused by filamentous fungi is one of the agents of damage to the cornea in subtropical and tropical climate countries and belongs to those mycoses identified as of difficult treatment. This study evaluates the etiology of mycotic keratitis in Tucumán (R.Argentina) with the purpose of assessing its incidence and regional and clinical significance. In a 5-year period, 48 samples (biopsy, corneal scrapes and/or ocular aspiration) collected by the oculist were examined and sent to the laboratory for a mycological analysis. By means of direct exam, macro and micromorphological cultures and studies of the presence of mycotic etiology in 13 patients (27%) was confirmed. Among them 7 cultures such as a Fusarium solani complex, 4 F. oxysporum and 2 F. verticillioides were identified. These findings allow to enlarge the knowledge of the local etiological agents involved as well as the risk factors, two elements that are significant in the prevention and therapeutics of these mycoses. factores: diagnóstico tardío, tipo de enfermedad primaria o de base, reducida penetración ocular del medicamento y baja susceptibilidad antifúngica de ciertos agentes etiológicos (9, 10, 19, 31, 37, 39). Los hongos son agentes oportunistas que raramente infectan las córneas saludables de los individuos inmunocompetentes (26, 28, 29). Estos microorganismos no pueden penetrar en el epitelio corneal intacto por lo que, obviamente, es necesario un traumatismo o una microlesión previa para iniciar su acción oportunista. El agente traumatizante origina abrasiones en la córnea y al 27

INTRODUCCION
Las queratomicosis representan una de las formas de queratitis más difíciles en su diagnóstico y tratamiento, constituyendo un problema oftalmológico importante que puede llevar rápidamente a la destrucción de la córnea y a la pérdida de la visión (3, 4, 38, 39). Las tasas de fracasos terapéuticos son muy altas y estarían relacionadas a varios
Recibido el 23 Abril 2008 Aceptado el 2 Julio 2008

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estar contaminado con propágulos fúngicos, éstos se implantan en el tejido corneal. Una vez que se localizan en el estroma, se reproducen, provocan necrosis y reacción inflamatoria en la membrana Descemet para llegar a la cámara anterior o al segmento posterior, pudiendo ocasionar endoftalmitis (1, 7, 39). Una amplia variedad de hongos, filamentosos y levaduras, han sido citados en la literatura mundial especializada, como agentes etiológicos de queratomicosis, de los cuales las especies integrantes de los géneros Candida, Aspergillus, y Fusarium son los más comunes (24,31). Las queratitis debidas a hongos filamentosos ocurren con más frecuencia en hombres jóvenes sanos, especialmente agricultores y trabajadores del campo o jardinería, que sufren un traumatismo o erosión del epitelio ocular por fragmentos de madera, restos vegetales, polvo o materiales provenientes del suelo o los animales (2, 20, 31, 32, 33). Se han descrito numerosos factores predisponentes a la queratomicosis, tales como el uso tópico de corticoides, solos o combinados con antibióticos de amplio espectro, el uso frecuente y prolongado de lentes de contacto, enfermedades oculares preexistentes, cirugías de córnea, infecciones postquirúrgicas, enfermedad sistémica, cuerpo extraño, edad, sexo, clima y estación (3, 4, 5, 29, 32). Ciertos factores ambientales como la humedad, pluviometría elevada, altas temperaturas y viento intenso, explican las variaciones en el aislamiento de los diversos hongos fitopatógenos ambientales, así como la aparición estacional de las queratomicosis (9, 17, 19, 28). La mayoría de los hongos filamentosos asociados con ulceraciones de la córnea en las zonas tropicales y subtropicales son saprotrofos y termotolerantes que se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo y la vegetación, en especial las especies de Fusarium que son fitopatógenos comunes particularmente en los cereales (20). Su incidencia se correlaciona con la época de las cosechas y las estaciones con alta temperatura y humedad (4 ,9). Durante las últimas cuatro décadas se ha informado, de manera creciente, el aumento de esta micosis en diferentes partes del mundo, debido a un mejor diagnóstico (2, 5). El presente estudio evalúa la etiología de las queratitis micóticas en Tucumán (R. Argentina) para determinar su incidencia e importancia clínica regional.

torio para su procesamiento. Con una porción de las muestras se realizaron preparaciones microscópicas para examen con KOH 10% entre porta y cubre y tinciones con Gram y Giemsa. El material restante fue sembrado según el tamaño de la muestra en un máximo de 4 tubos con Agar-Sabouraudglucosado (SGA) adicionado de Penicilina (50 U.I./mL) y Estreptomicina (80 µg/mL). Los cultivos fueron incubados 2 a 27 ºC y 2 a 37ºC durante 3 a 20 días y fueron examinados diariamente. Las muestras fueron consideradas positivas cuando los hallazgos de la microscopía directa fueron confirmados con el aislamiento de Fusarium a ambas temperaturas en 2 ó más tubos. A partir de todas las colonias obtenidas en SGA, en cada caso se procedió con la metodología siguiente (23): se tomaron pequeños inóculos desde los esporodoquios o de los conidios presentes en el micelio aéreo, diluyéndose la muestra en un tubo con 5 mL de agua destilada estéril. Previa agitación se dispersaron 0,2 mL sobre una placa de PDA para obtener inicios de crecimiento a partir de conidios aislados en el lapso de 2 días a 25ºC. Posteriormente, con un asa de platino se transfirió en el centro de 2 placas de PDA un trozo de una de las colonias en desarrollo. El mismo procedimiento se efectuó en agar agua con hojas de clavel (CLA), esterilizadas con hipoclorito de sodio durante 5 minutos y lavadas 3 veces en agua destilada estéril (Modificación de la técnica de Nelson et al. (25)). Dos a tres hojas de unos 2-3 cm se distribuyeron en forma equidistante cerca de los bordes de las placas, sembrándose trozos de las colonias en desarrollo en sus orillas. Ambos medios de cultivo se incubaron en oscuridad durante 7 a 14 días a 25ºC (12). La identificación de las especies se realizó según De Hoog & Guarro (8) y Nelson et al.(24), que incluyen estudios macro y micromorfológicos de los cultivos (aspecto, textura, color de las colonias, velocidad de crecimiento, forma y tamaño de los macroconidios, forma, cantidad y modo de formación de microconidios, presencia de mono o polifialides y clamidosporas).

RESULTADOS
De las 48 muestras procesadas, se confirmó etiología micótica en 13 pacientes (27%). El examen microscópico directo fue positivo en el 84.6% de los casos (11:13). La concordancia entre los examenes directos (elementos hifales, hialinos, finos, ramificados) y los cultivos fue del 100%. De ellos, 7 (53,8%) cultivos fueron identificados como Fusarium solani complex ; 4 (30,8%) F. oxysporum y el resto (15,4%) F. verticillioides. La Tabla 1 muestra la población afectada por edad y por sexo y los agentes etiológicos encontrados. Del total de 13 pacientes evaluados, 9 fueron de sexo de masculino,

MATERIALES Y METODOS
En un lapso de 5 años se procesaron 48 muestras obtenidas por biopsia, raspado de cornea y/o aspirados oculares de pacientes con diagnóstico presuntivo de queratitis micótica. Las muestras, obtenidas asépticamente por el oftalmólogo fueron enviadas de inmediato al labora28

Especies de Fusarium como agentes de queratitis micóticas en adultos en Tucumán, Argentina - R.Salim & R. Runco

Tabla 1. Factores predisponentes, ocupación, edad, sexo y agentes etiológicos aislados
Edad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 22 24 33 36 37 40 48 48 50 50 58 64 66 Sexo M F F M M M F M M M M M F Ocupación / F. predisponente Agricultor Traumatismo por cuerpo extraño Absceso corneal Antibióticos y corticoides tópicos Lentes de contacto / úlcera corneal Agricultor , Traumatismo por cuerpo extraño/ Antibióticos tópicos Transportista de soja/ Diabetes/ Traumatismo por cuerpo extraño Cirugía ocular Antibióticos y corticoides tópicos Lentes de contacto / úlcera corneal Traumatismo por cuerpo extraño Leucemia /terapia antiblástica Cirugía ocular Antibióticos y corticoides tópicos Agricultor Traumatismo por cuerpo extraño Agricultor Traumatismo por cuerpo extraño Agricultor Corticoterapia prolongada Traumatismo por cuerpo extraño Cirugía ocular Antibióticos tópicos Aislamiento F. solani F. verticillioides F. oxysporum F. solani F. solani F. oxysporum F. verticillioides F. solani F. oxysporum F. solani F. solani F. solani F. oxysporum

con un rango de edad entre 22 y 64 años y 4 de sexo femenino con un rango de edad entre 24 y 66 años. La mayor incidencia fue encontrada en el grupo de 33-50 años (8:13) con predominio en el sexo masculino (9:4) dedicados a la agricultura (6:9). De los 9 hombres estudiados, 6 poseían antecedentes de traumatismos durante el desempeño de su actividad laboral. Del total de mujeres estudiadas, 2 eran portadoras de lentes de contactos blandas, una de ellas sufrió un traumatismo con las mismas, mientras el otro caso sufrió un traumatismo con partículas de un vegetal. No se hallaron factores predisponentes diferentes a los ya descritos. Los encontrados incluyeron: traumatismo (54%), uso de antibióticos tópicos (38%), uso de lentes de contacto (15,4%) inmunosupresión sistémica (7,7%), y cirugía ocular previa (23%). La mayoría de los pacientes (7:13) presentaron lesión corneal causada por traumatismo con partículas vegetales. El uso prolongado de corticoides como factor predisponente fue observado en 1 paciente, y la queratitis fúngica con enfermedad sistémica en 2 pacientes (Tabla 1).

De los 4 F. oxysporum aislados, 3 provinieron de muestras de pacientes con cirugía ocular previa. Descripción de las especies Fusarium solani (Mart.) Appel & Wollenw. Emend. Snyd. & Hans. complex. En APD es de crecimiento rápido: >50 mm en una semana. La colonia presenta un aspecto liso y algodonoso de color blanco grisáceo, crema a ante. Generalmente el reverso no es coloreado o es de color crema pálido a tonos café. En CLA, los microconidios son abundantes, en falsas cabezas, ovoides a oblongos 0-1 septo. Su tamaño oscila entre 8-16 x 2-4,5 µm y son producidas en monofiálides alargadas y finas que suelen medir 40-80 x 2,5-3 µm. Las monofiálides nacen lateralmente de la hifa y a veces son ramificadas. Hacia la punta se adelgazan y presentan collaretes poco definidos. Los macroconidios, cuyo tamaño aproximado es de 28-65 x 4-6 µm, se observan en menor cantidad que los microconidios y nacen de conidióforos cortos y ramificados que frecuentemente forman esporodoquios en la superficie del agar, generalmente de color crema. Presentan entre 3 y 5 29

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tabiques y tienen forma de media luna, con las superficies ventrales y dorsales paralelas en la mayor parte de su longitud. La célula apical es corta y redondeada y la célula basal redondeada o claramente con forma de pie. Las clamidosporas son frecuentes, con una pared lisa o rugosa. Se observan aisladas o en parejas, terminales o intercalares y tienen un tamaño de 6-10 µm de diámetro. Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr. complex. En APD a 25ºC presenta un crecimiento rápido: > 50 mm en una semana. Al principio la colonia es lisa y algodonosa. Con el tiempo se torna de color blanco a salmón pálido, tiñéndose de violeta pálido en su zona central. El reverso es generalmente de color púrpura. Produce un pigmento púrpura-violeta que difunde al medio. Los esporodoquios, presentes en algunas cepas, dan una coloración crema anaranjada al cultivo. En CLA, los microconidios siempre en falsas cabezas, son ovoides o en forma de riñón, con un tamaño de 5-12 x 2,3-3,5 µm y, ocasionalmente, con 0, 1 o 2 tabiques. Nacen de monofiálides laterales, cortas y anchas, afiladas hacia la punta, con collaretes poco definidos, solitarias o ramificadas. Los macroconidios tienen de 3 a 5 septos. Su tamaño es de 25- 42 x 3-4,5 µm. Tienen forma de media luna, ligeramente curvadas, con pared fina y delicada. Su célula apical es afilada y la célula basal con forma de pie, pero pueden presentar ambos extremos aguzados. En la mayoría de los cultivos las clamidosporas son abundantes. Son grandes, hialinas, de pared lisa o rugosa y pueden observarse aisladas, en parejas o en cadenas ya sea intercalares o terminales. Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg. En APD a 25ºC es de crecimiento rápido, >60 mm en una semana con abundante micelio aéreo algodonoso, de color blanco, rosa salmón que se tiñe de color azulado o púrpura en pocos días. El color del reverso varía de crema a violeta. En CLA los microconidios son ovoides o en forma de maza con base truncada, generalmente sin septos o 1 o 2 tabiques. Se disponen en largas cadenas y en falsas cabezas y su tamaño es de 7-10 x 2,5-3,2 µm. La presencia de abundantes microconidios condiciona el aspecto pulverulento de la colonia. Los conidióforos nacen lateralmente de la hifa y son escasamente ramificados. Las células conidiógenas son monofiálides, habitualmente delgadas y largas, pero menores que la de F. solani (20-30 x 2,3 µm). Los macroconidios a veces son escasos en algunas cepas. Cuando existen son ligeramente fusiformes, casi rectos, con superficies dorsales y ventrales levemente paralelas, de pared fina y delicada. Las células basal y apical son alargadas y ligeramente curvadas. Pueden tener entre 3 y 7 tabiques y su tamaño es de 31-58 x 2,7-3-6 µm. No forma clamidosporas. Los esporodoquios se formaron raramente en algunos aislamientos, presentando un color naranja pálido. 30

DISCUSION
A nivel mundial, la incidencia de los diferentes hongos causales de queratomicosis varía según el área geográfica, y zonas climáticas. Los climas tropicales o subtropicales, calurosos y húmedos, favorecen la proliferación ambiental de los hongos filamentosos de hifas tabicadas, generalmente Fusarium y Aspergillus, mientras que se da una mayor presencia de Candida en los climas más fríos (6, 31, 39). Dependiendo de las variaciones climáticas en un mismo país, se observa que la presentación de estas infecciones varía de acuerdo a las regiones, al grado de exposición de la población, a los factores de riesgo y al origen, urbano o rural, de la población estudiada. Tucumán, su ubica en el noroeste argentino, región cálida subtropical, con 1000 -1200 mm de lluvias anuales, de vegetación abundante, con economía agrícola. En este contexto, las úlceras corneales, al parecer resultan más frecuente en economías agrícolas (20, 22, 28). La cornea humana puede ser infectada por más de 70 especies pertenecientes a cuarenta géneros de hongos de los cuales Candida, Aspergillus, y Fusarium son los más comunes (24, 31). En concordancia con los resultados de otras investigaciones realizadas en países Latinoamericanos (2, 6, 21, 22), en el presente estudio Fusarium ha sido el agente más frecuente de queratomicosis en nuestro medio, resultando Fusarium solani la especie más aislada. En todos los casos en que se aisló F. solani, los pacientes, dedicados a la agricultura, refirieron haber sufrido un traumatismo reciente de córnea. Estos datos son coincidentes con los observados en otros estudios (2, 21). En la mayoría de los casos, las especies de Fusarium son las predominantes. Por ejemplo, en una revisión de 156 casos de queratomicosis realizada en la India el 32.3% fueron causadas por Fusarium, 29% por Aspergillus, 12.9% Alternaria, y 6.4% por Candida (35). Sin embargo, cada vez se van incluyendo nuevas especies a la larga lista de agentes fúngicos capaces de causar queratitis, especialmente en climas tropicales, tales como Curvularia senegalensis (12), Phaeoisaria clematidis (13), Sarcopodium oculorum (14), Beauveria bassiana (16) y especies de Fusarium que no habían sido diagnosticadas como agentes de queratomicosis humana (15). Los integrantes del género Fusarium (Ascomycota, Pezizomycotina, Hypocreales, Hypocreaceae) son hongos filamentosos, hialinos y septados. Su frecuencia como agente causal de queratomicosis, en otras investigaciones, es de hasta un 37% para F. oxysporum, y 24% para F. solani (7). La queratitis causada por especies de Fusarium es clínicamente similar a la producida por otros hongos pero su pronóstico es peor (21, 33, 38). La presencia de

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glaucoma maligno es una complicación severa de la queratitis producida por Fusarium (18). La especie más común que causa infecciones oculares es F. solani complex (8, 30, 32, 40). Los miembros de este complex han aumentado su importancia como agentes causantes de micosis humanas, particularmente en pacientes inmunocomprometidos. Son conocidos como saprofitos y fitopatógenos. El complejo incluye muchas especies filogenéticos distintas, distribuidas en 4 mayores linajes, en todos ellos se encontraron especies aisladas desde infecciones oculares (40). F solani complex, ha sido descrita en casos de queratitis relacionadas con el uso de lentes de contacto (3, 18). Le sigue en frecuencia F. oxysporum (3, 9, 36, 38). F. verticillioides, F. dimerum y F. sacchari, están más raramente implicadas en infecciones oculares (11, 15, 26, 36, 38). Guarro et al. (2003), ha reportado un caso de queratitis producido por F. polyphialidicum (15). Nuestros resultados son concordantes con los de diversos estudios, realizados en diferentes países,así como en Argentina (42, 43, 44, 45) a pesar que no todos los agentes corresponden a integrantes del género Fusarium, por lo que se puede afirmar que el traumatismo es el factor predisponente más frecuente (44-55%) a las infecciones fúngicas de los ojos, seguido por la enfermedad sistémica (11,2%) y la cirugía previa (9,8%). Los traumatismos con elemento vegetal son responsables del 60-70% de las lesiones que son consideradas predictoras de una queratitis fúngica (21, 27, 28, 30). Como las lesiones no son patognomónicas de infección micótica del ojo, es el oftalmólogo quien debe considerar, además, otras causas microbianas (bacterianas, virales y/o parasitarias). Si bien el diagnóstico comienza con la sospecha clínica, éste se establece, principalmente, mediante los cultivos o la biopsia de córnea. Como uno de los diagnósticos diferenciales de queratomicosis es la queratitis bacteriana, la terapia inicial con antibióticos tópicos sólo se justifica cuando no se cuenta con el soporte del laboratorio. Es por ello que, en el 38% de los casos que hemos analizado existe el antecedente de medicación previa con corticoides y/o antibióticos tópicos entre el momento en que aparecieron las manifestaciones y el diagnóstico de queratomicosis. Al respecto, Torres Rodríguez (34) señala que, en su gran mayoría (a veces más del 50%), los enfermos reciben tratamiento tópico con corticoides y/o antibióticos y que, por lo general, el diagnóstico definitivo sobreviene tarde, tanto si se trata de una queratitis micótica como bacteriana. A menudo, y desafortunadamente, muchos oftalmólogos piensan en una queratomicosis después que una presunta queratitis bacteriana se empeora durante terapia antibiótica. Nos parece importante señalar que el diagnóstico

de las infecciones fúngicas requiere que el especialista pueda establecer la presencia de patología oftálmica (lo que requiere de instrumental especial) y pueda obtener tejido en el que el microorganismo causal sea visualizado (17). Frente a cualquier úlcera corneal es imprescindible descartar que el agente causal sea un hongo, y si lo es, es necesario identificar de qué hongo se trata, ya que estos datos son fundamentales en el enfoque terapéutico del paciente (17). El traumatismo de córnea es la primera causa de las queratitis microbianas y siempre existe riesgo de infección micótica cuando el paciente tiene antecedente de trauma corneal. En nuestro estudio, hemos corroborado la alta frecuencia de queratitis micótica en pacientes con traumatismo de córnea por cuerpo extraño (54%), que se describe en la literatura mundial. Las infecciones fúngicas del ojo han sido comunicadas en forma progresiva durante las últimas décadas a nivel mundial. Si bien no se trata de las afecciones más frecuentes entre las infecciones de la córnea, la dificultad para su tratamiento, los problemas para la identificación etiológica, la diversidad de presentaciones clínicas observadas en cada caso, y también los nuevos casos que emergen cada año, hacen de esta micosis un importante objeto de estudio. Por ello, coincidimos con Lek et al.(20), en que es fundamental conocer la etiología ‘local’ de queratitis en una región particular ya que guarda relación con el tratamiento, debido a que no siempre existen laboratorios especializados y entonces el diagnóstico depende del conocimiento clínico y el tratamiento instituido, será, en el mejor de los casos, empírico. La incidencia de esta micosis en Tucumán no ha sido establecida anteriormente. Si bien el diagnóstico debe basarse en un alto nivel de sospecha, sobre todo atendiendo a los factores de riesgo mencionados y la evolución del cuadro clínico, el laboratorio de microbiología es el que establece el diagnóstico específico.

CONCLUSIONES
El bajo número de pacientes con diagnóstico micológico confirmado, revela la poca sospecha de esta infección en nuestro medio. La comprensión de los aspectos epidemiológicos regionales, factores de riesgo y agentes etiológicos (hongos levaduriformes o filamentosos) son importantes en la sospecha clínica, prevención y terapéutica apropiada de estas micosis. En nuestro estudio el principal factor de riesgo correspondió a traumatismo relacionado con partículas vegetales. Si bien varias especies de hongos capaces de crecer 31

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a 37ºC pueden causar queratomicosis, los hongos que hemos diagnosticado en Tucumán, pertenecen a tres especies del género Fusarium: F. solani complex, F. oxysporum y F. verticillioides. La rápida intervención del laboratorio es importante para establecer el diagnóstico y tratamiento adecuado.

L.; Hofling -Lima, A. L.; Fisc hman, O.; Zo rat-Yu, C.; Figueras, M. J. ( 2000). Phaeoisaria clematidis as a cause of keratomycosis. J. Clin. Microbiol. 38:2434-2437 15. Guar ro, J., Höfling-Lima, A. M.; Gené, J.; de Freitas, D.; Godo y, P.; Zorat-yu, M. L.; Zaror, L.; Fisc hman, O. (2 002 ). Cornea l u lcer caused by the new fungal species, Sarcopodium oculorum. J. Clin. Microbiol. 40:3071-3075 16. Guarro, J.; Rubio, C. & Gené, J. (2003). Case of Keratitis Caused by an uncommon Fusarium Species. J. Clin.Microbiol. 41:5823-5 826

REFERENCIAS
1. Alexandrakis, G. (200 5). Fu nga l www.emedicine.com/specialties.htm Kera titis. http://

17. Kisla, T.; Cu-Unjieng, A. & Sugar, J. (2000). Medical management of Beauveria bassiana keratitis. Cornea 19:405-6 18. Klotz, S. A.; Penn, C. C.; Negvesky, G. J. & Butrus, S.I. (2000). Fungal and Parasitic Infections of the Eye. Clin. Microbiol. Rev. 13:662-685 19. Kuriakose, T. & Thomas, P. A. (1991). Keratomycotic malignant glaucoma. Indian J. Ophthalmol. 39:118-121 20. Lalitha, P.; Prajna, N.; Kabra, A. et al. (2006). Risk factors for trea tment outcome in funga l k era titis. Ophthalmology 113 :526 -30 21. Leck, A. K.; Thomas, P A.; Hagan, M.; Kaliamurthy, J.; Ackuaku, E.; John, M. (2002). Aetiology of suppurative corneal ulcers in Ghana and sou th India, and epidemiology of fungal keratitis British J. Ophthalmology 86:1211-1215 22. Muniz de Andrade, A.; Vieira, L.; Hofling -Lima, A.; Zo rat Yu, M .; Fischman, O.; Gompertz, D.; Barbo sa de Sousa, L. (2000). Laboratorial Analyses of Fungal Keratitis in an University Service. Arquivos Brasileiros de Oftalmología. Volume 63 - fascículo 1- Resumos e Artigos Completos. 23. Mino de Kaspar, H.; Zoulek, G.; Paredes, M.E.; Alborno R.; Medina, D.; Centurion de Morinigo, M.; Ortiz de Fresco M.; Aguero, F. (1991). Mycotic keratites in Paraguay. Mycoses 34:251-411 24. Nelson, P. E.; Dignani, M. C. & Anaissie, E. J . (1994). Taxonomy, biology, and clinical aspects of Fusarium species. Clin. Microbiol. Rev. 7:479-504 25 . Nelson, P.; Tousson, T.A. & M arasas, W.S.O . (19 83 ). Fusarium species. An illustrated manual for identification. The Pennsylvania State University Press. 26. Prajna, N.; Rao, R.; Mathen, M. (2002 ). Simulta neous bilatera l fungal k era titis cau sed by different fu ngi. Indian J. Opthalmol. 50:213-214 27 . Ran Nir-Paz & Str ahilev itz, J . (200 4). Clinica l a nd Epidemiological Aspects of Infections Caused by Fusarium Species: a Collaborative Study from Israel J. Clin. Microbiol. 42:345634 61 28. Rubio Calvo, M. C.; Rezusta, A. & Gil, J . Infecciones Oculares por el género Alternaria. http://www.seimc.org/control/ revi_Mico/a lterna .htm 29. Sedó, S.; Iribarne, Y.; Fossas, M.; Vendrell, C.; Ortiz, F. (2003). Queratitis fúngica. Annals d’Oftalmologia 11:168-175

2. Balle ste ros, C.; Cor vino, V. & Brunzini, R. (2002 ). Recubrimientos conjuntivales en queratomicosis. Rev. Oftalmológica Santa Lucia 1:129-136 3. Barry, M.A.; Pendarvis, J.; Rosenberg, J.; Chen, S.; Mshar, P.; Leguen, F.; Robertson,C.; Genese, C.; Tan, C.; Bresnitz E.; Johnson, G., Anand, M.; Smith, P.; Kainer, M.A., et.al. (2006). Fusarium Keratitis Multiple States. http://www.cdc.gov/ mmwr/preview/mmwrhtml/mm55d410a 1.htm 4. Behrens-Baumann, W. (19 99). Mycosis of the eye and its adnexa. In W. Behrens-Ba uma nn (ed.), Developments in ophthalmology, vol. 32. Karger, Basel, Switzerland. 5. Chowdhar y, A. & Singh, K. (200 5). Spectru m of Fungal Keratitis in North India. Cornea 94:8-15 6. Cuero RG. (1980). Ecological distribution of Fusarium solani and its opportunistic action related to mycotic keratitis in Cali, Colombia. J. Clin. Microbiol. 12:455-61 7. De Anda-Turati, Gómez Céspedes, A.; Naranjo-Çtackman, R. & Vanzini, V. (20 01). Manejo de absceso corneal y endoftalmitis por Fusarium . Anales Médicos 46:36-39 8. De Hoog, G. S.; Guarro, J.; Gene, J. & Figueras, M. J. (2000). Atlas of Clinical Fungi, 2nd ed, Vol. 1. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands. 9. Dó czi, I.; Gye tvai, T.; Kredics, L. & E. Nag y. (20 04 ). Involvement of Fusarium spp. in fu nga l keratitis. Clinical Microbiology and Infection 10:773–776 10. Dursun, D.; Fernández, V. & Miller, D. (2003). Advanced Fusarium keratitis progressing to endophthalmitis. Cornea 22:30030 3 11. Guarro, J. & Gené, J. (1995). Opportunistic fusarial infections in humans. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14:741-754 12. Guarro, J., & Gené, J. (1992). Fusarium infections. Criteria for the ientification of the responsible species. Mycoses 35:109-114 13. Guarro, J.; Akiti, T.; Almada-Horta, R.; Leite-Filho, L.; Ge ne, J.; Ferreir a-Gome s, S.; Ag uilar, C.; M . Orto neda. (1999). Mycotic keratitis due to Curvularia senegalensis and in vitro antifungal susceptibilities of Curvularia spp. J. Clin. Microbiol. 37:4170-4 173 14. Guarro, J.; Vieira, L. ; de Freitas, D.; Gené, J.; Zaror,

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30. Strelow, S. A.; Kent, H. D.; Eagle, R. C. & Cohen E. S. (1992). A case of contact lens related Fusarium solani keratitis. Contact Lens Assoc. Ophthalmol. J. 18:125-127 31. Tanure, M. A.; Cohen, E. J.; Grewal, S.; Rapuano, C. J.; Laibson, P. R. (2000). Spectrum of fungal keratitis at Wills Eye Hospital, Philadelphia, Pennsylvania. Cornea 19:307-312 32. Thomas, P. A. (1994). Mycotic keratitis-an underestimated mycosis. Medical Mycology 32:235-256 33 . T homa s, P.A. (200 3). Fungal infec tio ns of the co rne a. Eye 17:852-62 34. Thomas, P. A.; Leck, A. K. & Myatt, M. (2005). Characteristic clinical features as an aid to the diagnosis of suppurative keratitis caused by filamentous fungi. British J. Ophthalmology 89:155415 58 35. Torres-Rodríguez, J.M. (1987). Micosis que afectan piel y mucosas. Ed. Doyma S.A. España. 36. Vajpayee, R.B.; Gupta, S. K.; Bareja,U. & Kishore, K. (1990). Ocular atopy and mycotic keratitis. Ann. Ophthalmol. 22:369-372 37 . Visme r, H. F.; Mar asas,W.; Rhe eder, J . & J. Jouber t . (2002). Fusarium dimerum as a cause of human eye infections. Med. Mycol. 40:399-406 38. Xie, L.; Dong, X.; Shi, W. (2001). Treatment of fungal keratitis by penetrating keratoplasty. Br.J. Ophthalmol. 85:107074

39. Zapater, R. C. (1986 ). Opportunistic fungus infections. Fusarium infections (keratomycosis by Fusarium). Jpn. J. Med. Mycol. 27:68-69 40. Zloti, P. (2002). Diagnosis and management of fungal keratitis. Am. Acad. of Ophthalmology. 20:1-13 41. Zhang, N.; O’Donnell, K.; Sutton, D.A.; Nalim, F. A.; Summe rbe ll, R.C.; Padhye , A. A.; Geiser, D. M . (2006 ). .Members of the Fusarium solani Species Complex That Cause Infections in Both Hu mans a nd Pla nts Are Common in the Environment. J. Clin. Microbiol. 44:2186-90 42. Zapater, R. C.; Br unzini, M .A.; Albesi, E. J.; Arturi, C.A.S. (1976). El género Fusarium como agente etiológico de micosis oculares. Arch. Oftal. B. Aires. 51:279-286 43. Nicola, F. (2005). Queratitis infecciosa no viral: factores predisponentes, agentes etiológicos y diagnóstico de laboratorio. Rev. Argent. Microbiol. 37:229-239 44. Demonte, C. & Perez, F. (2006).Características Clínicas, Epidemiológicas y Bacteriológicas de los Abscesos Corneales en el Hospital Sa nta Lu cía . Período ma rzo 20 05 - febrero 20 06 Oftalmológica Santa Lucía 3:97-104 45.-Luque, A. G.; Nanni, R. & Bracalenti, B. J. C. (1986). Mycotic keratitis cau sed by Curvularia lunata va r. ae ria. Mycopathologia 93:9-12

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ZIGOMICOSIS CUTANEA PRIMARIA POR Rhyzopus oryzae EN UNA NIÑA CON LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA TIPO B
(Primary Cutaneous Zygomycosis by Rhyzopus oryzae in a girl diagnosed with an Acute Lymphoblastic Leukemia B Type)
R. Salim (1), R. Runco (1, 2), C. Alvarez (2), S. Romano (3) & M. Charre (2)
1. Cátedra de Micología-Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán Ayacucho 491. (4000) Tucumán. R. Argentina. 2. Lab. Micología del Hospital del Niño Jesús. Pasaje Hungría 750.(4000) Tucumán. R. Argentina. 3. Cátedra de Dermatología- Fac. de Medicina. U. N. T. Ayacucho 491. (4000). R. Argentina. e-mail: rqsalim@rectorado.unt.edu.ar Palabras claves: zigomicosis cutánea primaria, leucemia, Rhizopus oryzae Key words:Primary cutaneous zygomycosis, leukemia, Rhizopus oryzae

RESUMEN
La Zigomicosis es una infección infrecuente causada por hongos oportunistas integrantes del orden Mucorales, que se presenta en pacientes de alto riego como en: leucemia, linfomas con neutropenia prolongada, cetoacidosis diabética, malnutrición severa, ruptura de la integridad de la barrera cutánea y terapia inmunosupresora. Se presenta un caso de Zigomicosis cutánea en una paciente pediátrica con leucemia linfoblástica aguda de tipo B, con severa neutropenia y tratamiento con corticoides. A los cinco días de su hospitalización desarrolló en el antebrazo (zona de punción venosa), una lesión indurada, eritematosa, que progresó y ulceró. A partir de exudados y biopsias del tejido subcu-táneo se realizaron exámenes microscópicos directos con KOH, cultivos en agar Sabouraud y estudio histológico a través de técnicas convencionales de hematoxilina-eosina y PAS. Los análisis de los materiales clínicos revelaron la presencia de hifas hialinas, no tabicadas, gruesas, compatibles con un Zygomycete. En todos los tubos se obtuvo abundante desarrollo de un hongo filamentoso, identificado como Rhizopus oryzae. Posteriormente a la escisión quirúrgica y tratamiento con anfotericina B se obtuvo una evolución favorable del paciente hasta el presente.

ABSTRACT
Zygomycosis is an infrequent infection caused by opportunistic fungi which belong to the order Mucorales and which is present in high risk patients diagnosed with : leukemia, lymphomas with prolonged neutropenia, diabetic cetoacidosis, severe malnutrition, rupture of the entire cutaneous barrier and immunesuppressing therapy. This paper deals with a case of cutaneous Zygomycosis in a pediatric patient diagnosed with acute lymphoblastic leukemia B type, suffering a severe neutropenia and corticosteroid treatment. On the fifth day of hospitalization, her forearm (venous puncture zone) showed an indured, erimatose lesion which progressed and ulcerated. Collection of exudates and biopsies of subcutaneous tissue served to carry out direct microsco-pic examinations with KOH, cultures in Sabouraud Agar and a histologic study through conventional hematoxilin-eosin and PAS techniques. Analyses of the clinical materials revealed the presence of hyaline, not septated and broad hyphae suitable to a Zygomycete. In all the tubes there was an abundant development of filamentous fungus identified as Rhizopus oryzae. After the surgical scission and treatment with anfotericine B, the patient showed a favorable evolution up to now. o zigomicosis. Los géneros y especies de la familia Mucoraceae, son los que causan más frecuentemente zigomicosis y de ellos los más comunes son Rhizopus oryzae y R . microsporus var. rhizopodiformis. Otros agentes etiológicos descritos en el hombre son: Rhizomucor pusil lus, Absidia corymbifera, Cunninghamella 35

INTRODUCCION
Los hongos del orden Mucorales son los agentes causantes de lo que clásicamente llamamos mucormicosis
Recibido el 12 de Abril 2008 Aceptado el 8 de Octubre 2008

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bertholletiae y con menor frecuencia se diagnostican casos originados ocasionados por Saksenaea vasiformis, Mucor circinelloides, M. ramosissimus, Apophysomyces elegans, Cokeromyces recurvatus y Syncephalastrum racemosum (20, 21, 23, 29, 32). En pacientes pediátricos, los agentes etiológicos identificados han sido fundamentalmente Rhizopus spp. y esporádicamente Absidia spp. (1, 20, 23, 28, 37). Los Mucorales no forman parte de la microbiota residente del hombre. Ocasionalmente es posible encontrarlos como agentes saprobios de la piel y mucosas de individuos sanos o de pacientes hospitalizados (14, 21, 22, 35). Esta cualidad, junto con su facilidad para crecer en los medios habituales para hongos, hace que los cultivos positivos constituyan, en sí mismos, tan sólo una sospecha de infección, y que ésta deba ser confirmada por la demostración de los hongos en los tejidos afectados (8, 28). La característica epidemiológica más relevante de los Zygomycetes es su ubicuidad. Han sido identificados en el medio ambiente hospitalario e incluso en los sistemas de aire acondicionado, lo que representa, al igual que Aspergillus spp., una amenaza para la población de pacientes inmunocomprometidos (35, 36). Las esporangiosporas pueden ser vehiculizadas en el ámbito hospitalario por corrientes de aire o por objetos en contacto directo con los pacientes (gasas, vendas, una variedad de productos adhesivos usados en su ajuste y bajalenguas de madera contaminados), que pueden originar infecciones nosocomiales (7, 9, 12, 22, 25, 32). La infección se adquiere principalmente por inhalación de esporas, las que colonizan los senos paranasales y nasofaringe; ocasionalmente se puede adquirir por inoculación cutánea de esporas o ingestión inadvertida de productos contaminados. No se ha documentado transmisión de persona a persona (14). Los factores que predisponen la infección por estos hongos son múltiples. Entre ellos: acidosis metabólica, cetoacidosis diabética, el uso de Desferoxamina, leucemia en fase de neutropenia prolongada, linfoma y síndrome mielodisplásico, trasplante de órganos sólidos y de precursores hematopoyéticos, desnutrición severa, ruptura de la integridad de la barrera cutánea (cirugía, traumatismos, quemaduras graves, punciones con agujas contaminadas, mordeduras o picaduras de insectos, vendajes contaminados, inserción de catéter, pinchazos y otros tipos de lesiones cutáneas, etc.) (12, 13, 17, 23, 25, 26, 29 ,31, 37). También pueden afectar a enfermos bajo terapéuticas inmunosupresoras, niños prematuros y a infectados por VIH (1, 8, 13, 17, 18, 19, 32, 34, 38). Después del contacto con los tejidos, estos hongos raramente producen infecciones e invasión, y en una alta proporción de los casos se comportan como meros 36

colonizadores (32). La integridad de las barreras cutáneomucosas y un sistema inmunitario competente son las primeras líneas de defensa con que se encuentran las esporas. La enfermedad se caracteriza por la rápida invasión de tejidos y estructuras vasculares con las consiguientes vasculitis y trombosis que conducen a infartos y necrosis tisular (2, 3, 5, 7, 12, 14, 15, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 32, 38). Típicamente, la infección implica el área rhino-facial-craneal, los pulmones, el tracto gastrointestinal, la piel, y menos comúnmente otros sistemas de órganos (21, 22). Se describen seis formas clínicas de mucormicosis: cutánea, gastrointestinal, pulmonar, rinocerebral, diseminada y una forma miscelánea, que engloba localizaciones como endocarditis, miocarditis, meningitis, absceso cerebral, endoftalmitis, cistitis, peritonitis, osteomielitis, artritis, miositis y pielonefritis (14, 20, 29, 32). En niños se han descrito principalmente las formas cutánea e intestinal en neonatos y las formas pulmonares y rinocerebral en pacientes diabéticos e inmunocomprometidos (1, 17, 37, 38). La zigomicosis cutánea primaria se clasifica en: superficial, nodular, y gangrenosa. En cualquier caso, se inicia como vesículas o pústulas que pronto se transforman en úlceras o escaras. El tipo superficial es poco sintomático y tiene el aspecto de una úlcera que no sana. El tipo gangrenoso muestra una progresión fulminante con extensión hacia los tejidos profundos. Otras formas incluyen púrpura, induración y ulceración con formación de escara. En la periferia de las lesiones cutáneas, generalmente existen áreas de celulitis que pueden ser intensamente dolorosas a la palpación, aunque algunas zonas pueden ser insensibles debido a la necrosis (19). Pueden ser rápidamente agresivas, incluso frente al desbridamiento apropiado y al tratamiento médico (32). En el huésped immunocompetente, se manifiesta con vesículas o pústulas que eventualmente progresan formando costras (12). Por el contrario, en el paciente inmunocomprometido las lesiones, rojas e induradas, progresan formando costras negras que, al desprenderse, dejan úlceras grandes. La preferencia angioinvasiva de los zygomycetes, con la consecuente diseminación por debajo de las estructuras cutáneas, culmina con la necrosis rápida y progresiva no sólo de los tejidos cutáneos y subcutáneos, sino también de la grasa, músculos, tendones, el hueso adyacente y seguir un curso fulminante (3, 12, 15, 23, 26, 30, 31). Frente a este tipo de lesiones cutáneas, se debe realizar diagnóstico diferencial con infecciones bacterianas necrotizantes, aspergilosis, tuberculosis, sífilis y otros procesos granulomatosos. El diagnóstico de zigomicosis

Zigomicosis cutánea primaria por Rhyzopus oryzae - R. Salim et al.

se establece por la demostración de las hifas en el material de biopsia. En este trabajo describimos los aspectos histológicos y clínicos de una zigomicosis cutánea primaria causada por Rhizopus oryzae en el antebrazo de una paciente pediátrica con leucemia linfoblástica aguda de tipo B, con severa neutropenia y tratamiento con inmunosupresores.

CASO CLINICO
Paciente femenina, de 2 años de edad, residente en Alto Verde, Concepción, (Tucumán – R. Argentina) consulta por cuadro clínico de 15 días de evolución, con lesión ampollar en la región submaxilar izquierda, tos y fiebre persistente. Es medicada con Cefalexina (140/mg/ kg/día) durante 9 días. Debido a la mala evolución de la lesión, fiebre persistente y disminución de peso, se decide su internación en el Hospital de Concepción. El día 20 de febrero de 2008 ingresa febril, con palidez mucocutánea, poliadenopatía latero-cervical, supraclavicular izquierda, axilar e inguinal y hepatoesplenomegalia. Es tratada con Clindamicina y Dipirona. Después de recibir los resultados de laboratorio se diagnostica pancitopenia febril. Es derivada con urgencia al Hospital del Niño Jesús el 22/2/ 2008. A su ingreso impresiona como una paciente en estado general grave, hemodinámicamente compensada, con síndrome linfoproliferativo y absceso submaxilar izquierdo de etiología desconocida. Con diagnóstico presuntivo de leucemia, es derivada a la Sala de Inmunodeprimidos. Presenta poliadenopatias móviles y dolorosas a la palpación, petequias en los miembros inferiores y tumefacción eritematosa en región submaxilar izquierda. Es medicada con Ceftazidima, Amikacina y Clindamicina. Sus exámenes

Fig. 2. Hifas cenocíticas en el examen directo (KOH 10%) de muestra de exudado seropurulento

Fig. 3. Hifas anchas no tabicadas, Coloración HE (100X)

Fig. 4. Aspecto micromofológico (Gueguén 40X)

Fig. 1. Zigomicosis cutánea primaria con necrosis

de laboratorio iniciales mostraron: leucocitos 25.000 cel; células blásticas 97%, linfocitos 2%, monocitos 1%, hemoglobina 6,20 g/dl, hematocrito 19,6% y plaquetas 18000. Se observa marcada hipocromía y anisocromía. glicemia normal; proteínas totales 8.6 g/dl, urea 0.42 g/L; 37

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GPT 45 U/L. El laboratorio de Microbiología informó hemocultivo negativo, E. coli en urocultivo y Staphylococcus aureus en el exudado del absceso submaxilar. Al examen micológico directo del exudado no se observaron elementos fúngicos ni se aislaron hongos en los medios de cultivo específicos. A los cinco días de su hospitalización (27/2/08), desarrolló en el antebrazo derecho, correspondiendo a la zona de punción venosa, una lesión indurada, eritematosa, que progresó y en cinco días se ulceró (3/3/08). La lesión, de 7 por 5 cm, dolorosa, tórpida, irregular, de bordes policíclicos e hipertróficos, centralmente necrótica, rodeada de piel eritematosa que presentaba un fondo irregular con exudado seropurulento (Fig. 1). Se realizó toma de muestra por punción aspiración de la lesión y sangre que se enviaron para examen bacteriológico y micológico (directo y cultivos). Los hemocultivos fueron negativos. Los cultivos bacterianos fueron positivos para S. aureus meticilino resistente. Al examen micológico directo (KOH, Giemsa y Gram) se observaron hifas hialinas cenocíticas semejantes a Zygomycetes (Mucorales) resultado que fue inmediatamente informado al médico tratante (Fig.2). Se inició tratamiento con antibióticos parenterales (Ceftazidima y Amikacina), sin presentar mejoría. A las 72 h de incubación a 37 ºC en los cultivos en Agar Sabouraud Glucosa (SGA), se obtuvo el desarrollo de colonias lanosas y blanquecinas de un hongo filamentoso, hialino, con hifas cenocíticas, compatible con Rhizopus sp. Respecto a este resultado se mantuvo conducta expectante. Dos días después (5/3/08), se recibió muestra de una escarectomía de la lesión necrótica para análisis microbiológico. Al examen micológico directo nuevamente se observaron hifas hialinas cenocíticas. En los cultivos en SGA a las 72 h de incubación a 37 ºC se obtuvo, otra vez, el desarrollo de colonias lanosas y blanquecinas de un hongo filamentoso, hialino, con hifas cenocíticas, posteriormente identificado como Rhizopus oryzae (Fig. 3 y 4). Se informaron los cultivos de hongos como positivos y ante el diagnóstico presuntivo de zigomicosis, el día 6/ 3/08 se realizó exéresis quirúrgica amplia y se inició medicación con Anfotericina B liposomal (1,5mg/Kg/dia) por vías intravenosa y tópica, más limpiezas quirúrgicas cada 3-4 días manteniendo terapia antibacteriana. El día 13/03/08 se recibió nuevo material de tejido subcutáneo necrótico y músculo para estudios micológicos e histopatológicos. El examen directo y cultivos de la muestra de músculo fueron negativos mientras que el análisis microscópico del tejido subcutáneo volvió a revelar hifas idénticas a las muestras anteriores. Nuevamente se obtuvo cultivo puro de R . oryzae, en todos los cultivos del tejido subcutáneo. El estudio histopatológico, a través de técnicas 38

convencionales de hematoxilina-eosina y PAS, reveló extensas áreas de necrosis en dermis e hipodermis con presencia de abundantes hifas no septadas y anchas penetrando la dermis y los vasos sanguíneos, confirmando el diagnóstico micológico (Fig. 2). Como complemento de la terapia antifúngica, la zona fue lavada en reiteradas oportunidades con solución salina fisiológica estéril y tratamiento topico con el antifúngico, repitiéndose los aseos quirúrgicos. Se procedió a la ampliación quirúrgica y repetición de las limpiezas curativas cuando se consideró necesario. Con diagnóstico final de Leucemia Linfoblástica Aguda Tipo BII y zigomicosis cutánea primaria, a la fecha, la paciente presenta una evolución ligeramente favorable y continúa con quimioterapia específica para LLA, tratamiento antifúngico con Anfotericina B y aseos quirúrgicos periódicos. Por su pronóstico reservado, se evalúa la posibilidad de su traslado a Buenos Aires.

Estudio Micológico
Al examen microscópico directo de las muestras con KOH al 10%, coloración de Gram y Giemsa, se observaron abundantes hifas hialinas, no septadas, anchas como cintas, de 10-20 m de diámetro, con ramificaciones en ángulo recto. Las muestras fueron sembradas en Agar Sabouraud Glucosa (SGA) adicionado de Penicilina (50 U.I./ml) y Estreptomicina (80 g/ml), e incubadas a 37 ºC. El diagnóstico microbiológico se basó en la observación macro y micromorfológica de las colonias en SGA. A partir de las 72 h se observó en todos los tubos abundante desarrollo de un hongo de crecimiento rápido. Las colonias cubrieron prácticamente toda la superficie del medio de cultivo, con micelio aéreo denso, algodonosas, de aspecto consistente, al principio blancas, después gris oscuras que se fueron ennegreciendo con el transcurso de los días, anverso claro, típicas de los integrantes del género Rhizopus (Fig.3). Para la observación macro y micromorfológica se resembró la cepa en Agar Malta siguiendo la metodología de Schipper (27). Colonias café grisáceas, esporangióforos café-grisaceos, rizoides cafesosos, esporangioforos y estolones hasta 1200 µm de largo y de 9-15 µm de ancho, solitarios o agregados en grupo, frecuentemente ramificados. Esporangios cafesosos a negros, globosos a subglobosos, lisos a finamente espinosos, 55-130 µm; columelas elipsoidales a ovoides de base trunca, 40-100 µm de alto, de color gris; esporangiosporas esféricas, ovoides o irregulares, estriadas, pálidas, 4-8 µm de largo. Clamidosporas escasas, globosas a elipsoidales. Zigosporas ausentes. Crecimiento óptimo a 37ºC, máximo 42-43ºC . No crece a 45ºC. Determinación final: Rhizopus oryzae (Fig. 4).

Zigomicosis cutánea primaria por Rhyzopus oryzae - R. Salim et al.

DISCUSION
La presentación clínica de la zigomicosis cutánea es variable, sin embargo, los signos clave que deben advertir al clínico son la necrosis y la rapidez del curso evolutivo (25). Una herida en cuyo margen aparece una necrosis progresiva en un paciente con factores de riesgo, debe orientar hacia zigomicosis. La triada constituida por necrosis cutánea, progresión veloz del cuadro, junto con los factores de riesgo del paciente, debe alertar al médico sobre un cuadro grave. La sospecha clínica de esta entidad, su estudio mediante examen directo de la escara, y el procesamiento rápido del material de biopsia para estudio convencional y cultivo, son determinantes para instaurar el tratamiento con la mayor celeridad posible, lo que redundará en un mejor pronóstico de esta grave enfermedad (8). Los Zygomycetes esporádicamente forman parte de la microbiota saprofita normal de la piel y mucosas y crecen fácil y rápidamente en los medios de cultivo (22). Por esto, se explica que su diagnóstico no se puede establecer sólo por la positividad de los cultivos, sino que resulta indispensable demostrar la invasión fúngica en los tejidos, para lo que se requieren procedimientos agresivos como la obtención de biopsia de tejidos (5, 22). La invasión del tejido por hongos no tabicados mostrando áreas de necrosis e infartos con vasculitis, trombosis y hemorragias características de esta enfermedad constituye la prueba determinante de esta micosis (25, 28, 29), y su cultivo es definitivo para la identificación final del agente (8). A pesar de que el diagnóstico de la zigomicosis se basa en exámenes histopatológicos, es necesario tener en cuenta que éstos no suelen estar disponibles en forma rápida. Esta limitación justifica que, en algunas series, hasta el 50% de los casos sólo fueron diagnosticados post mortem (16,18). Por ello, el examen micológico directo de la escara es de gran rendimiento diagnóstico y en sólo unos minutos orientará hacia esta posibilidad. En un estudio que reunió datos de 50 hospitales de España, el aislamiento de Zygomycetes fue muy bajo, demostrando que menos del 8% de los pacientes con cultivo positivo estaban realmente infectados, mientras que la gran mayoría presentaban colonización o contaminación de laboratorio (33). Aún así, consideramos que, si bien la trascendencia del cultivo puede ser baja, el aislamiento de estos hongos tiene importancia si se considera el tipo de lesión y procedencia de la muestra clínica. La observación de abundantes hifas hialinas no tabicadas junto al aislamiento de un zygomycete debe ser la voz de alarma para el seguimiento de los pacientes de riesgo, aun cuando su carácter ambiental les permite colonizar pacientes sin causar enfermedad, o contaminar los cultivos en el propio laboratorio.

La literatura médica nacional es escasísima acerca de esta patología. Al presente carecemos de datos confiables sobre la frecuencia de esta micosis en la República Argentina. De un estudio que integra los datos de patología fúngica generados por un número importante de laboratorios distribuidos a lo largo de todo el país, surge que el porcentaje de muestras derivadas para diagnóstico micológico es bajo. Entre enero y diciembre de 2004, tan sólo 0,78% de los casos correspondieron a zigomicosis lo que probablemente no refleja la incidencia de esta patología en la Argentina (4). Por otra parte, el diagnóstico de especie hasta ahora no parecía tener mayor trascendencia clínica; sin embargo, existen diferencias significativas de susceptibilidad in vitro de los distintos géneros y especies de la familia Mucoraceae a los azoles, lo que podría traducirse dentro de los próximos años en importantes decisiones terapéuticas (6, 30). Como todas las especies de Mucorales presentan hifas anchas no septadas que se ramifican en ángulo recto, y además causan invasión vascular, para su identificación es necesario realizar un diagnóstico morfológico en cultivos. El diagnóstico serológico no es útil para detectar infecciones por Zygomycetes. Éstos comparten varios determinantes antigénicos, lo que dificulta la distinción entre especies e incluso entre géneros (32). Las técnicas moleculares para la detección de zigomicosis invasora son escasas y se emplean fundamentalmente para determinar asignaciones taxonómicas. Aunque estas herramientas pueden ser útiles en los estudios epidemiológicos de brotes de zigomicosis, se conoce mal su rendimiento en el diagnóstico primario (10, 11). En el caso clínico que presentamos concurrieron varios factores de riesgo para el desarrollo de zigomicosis cutánea: leucemia, neutropenia severa, infección bacteriana mixta y tratamiento inmunosupresor. Consideramos, junto a Chandra (3), del Palacio (5) y Runco (25) que en estos casos los pacientes presentan una evolución rapidísima y generalmente fulminante. Habitualmente, la imposibilidad de llegar a un diagnóstico que permita el tratamiento oportuno de esta patología, induce a la medicación empírica del paciente lo que aumenta, innecesariamente, su situación de riesgo. En estos últimos años se ha descrito un incremento importante en la incidencia de esta enfermedad en instituciones aisladas o unidades específicas alcanzando un 8% en pacientes con leucemia. Este aumento del número de casos se produce generalmente en pacientes y unidades donde se administra con exceso profilaxis antibacteriana de amplio espectro, sin la sospecha de una micosis (33). 39

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CONCLUSIONES
La triada constituida por necrosis cutánea, gran agresividad y rápida evolución, principalmente en pacientes inmunocomprometidos, debe poner al médico en alerta sobre una posible patología fúngica. La sospecha clínica y los criterios de infección fúngica probable o posible son determinantes para establecer el diagnóstico apropiado, aún frente a la negatividad del examen directo y los cultivos. La observación de abundantes hifas hialinas no tabicadas y el aislamiento de un zygomycete deben ser una voz de alarma cuando se trata de enfermos inmunocomprometidos. La demora en el diagnóstico produce un impacto desfavorable en la toma de decisiones terapéuticas acertadas.

10. Iwen, P.; Sigler, L.; Noel, R. & Freifeld, A. (2007). Mucor circinelloides identified by molecular methods as a cause of primary cutaneous zygomycosis. J. Clin. Microbiol. 45:636-640 11. Iwen, P.; Freifeld, A.; Sigler, L. & Tarantolo, S. (2005). Molecular identification of Rhizomucor pusillus as a cause of sinusorbital zygomycosis in a patient with acute myelogenous leukemia. J. Clin. Microbiol. 43:5819-5821 12. Kapadia, S. & Polenkovic, H. (2004). Cutaneous Zigomicosis following atte pte radial arte cannulation. www.medscape.com. m d ry viewarticle/4957 13. Kontoyiannis, D.; Wessel, V.; Bodey, G. & Rolston, K. (2000). Zygomycosis in the 1990s in a tertiary-care cancer center. Clin. Infect. Dis. 30:851-856 14. Kwon_Chung, K. J. & Bennett, J. E. (1992). Mucormycosis (Phycomycosis, Zygomycosis) En: Medical Mycology. Editorial Lea and Febiger. pp.524-559 15. Lenane, P.; Keane, C. & Loughlin, S. (2003). Mucormycosis infection presenting as a non-healing ulcer in an immunocompromised patient. Clin. Exp. Dermatol. 28:157-159 16 . Nosari, A.; Oreste, P.; M ontillo, M.; Carrafie llo , G.; Draisci, M.; Muti, G.; Molteni, A.; Morra, E. (2000). Mucormycosis in hematologic malignancies: an emerging fungal infection. Hematologica 85:1068-1071 17. Oh, D. & Notrica, D. (2002). Primary cutaneous mucormycosis in infants a nd neonates: Ca se report and review of the literature. J. Pediatr. Surg. 37:1607-11 18. Pagano, L.; Ricci, P.; Tonso, A.; Nosari, A.; Cudillo, L.; Montillo, M.; Cenacchi, A.; Pacilli, L.; Fabbiano, F.; Del Favero, A. (1997). Mucormycosis in patients with haematological malignancies: a retrospective clinical study of 37 cases. British J. Haematology. 99:331-336 19 . Pére z-Ur ibe , A.; Mo lina de Sosc hin, D. & Arenas, R. (2005). Mucormicosis cutánea primaria en un paciente con virus de la inmunodeficiencia humana. Rev. Iberoam. Micol. 22:11812 1 20. Ribes, J.; Vanover-Sams, C.; Baker, D. (2000). Zygomycetes in human disease. Clin. Microbiol. Rev. 13:236-301 21. Rinaldi, G. M. (1989). Zygomycosis. Inf. Dis. Clin. North Am. 3:19-41 22. Rippon, J. W. (1988). Zygomycosis. En: Medical Micology (3rd ed). Philadelphia, Saunders Co. 681-713 23. Robertson, A. F.; Joshi, V.; Ellision, D.; Cedars, J. (1997). Zygomycosis in neonates. Pediatr. Infect. Dis. J. 16:812-5 24 . Rode n, M.; Zao utis, T.; Buchanan, W.; Knudsen, T.; Sarkisova, T.; Schaufele, R.; Sein, M.; Sein, T.; Chiou, C.; Chu, J.; Kontoyiannis, D.; Walsh, T. (2005). Epidemiology and outcome of zygomycosis: A review of 929 reported cases. Clin. Infect. Dis. 41:634-653 25. Runco, R.; Salim, R. & Boente, M. (1998). Zigomicosis rino-sinuso-orbital post-traumá tica. Boletín Micológico 13:1115

AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Dr. Eduardo Piontelli por haber realizado la identificación de R.oryzae y por sus sugerencias en la elaboración de este manuscrito.

REFERENCIAS
1. Amin, S. B.; Ryan, R.; M etlay, L.; Watson, W. (1 998 ). Absidia corymbifera infections in neonates. Clin. Infect. Dis. 26: 9 00 -90 2 2. Baker, R. (1957). Mucormycosis–a new disease? Jama 163:805 3. Chandra, S. & Wo odg yer, A. (200 2). Primary cuta neous zygomycosis due to Mucor circinelloides. Austral. J. Dermatol. 43 :3 9-42 4. Davel, G. & Canteros, C. E. (2007). Situación de las micosis en la República Argentina. Rev. Arg. de Microbiología 39:28-33 5. Del Palacio, A.; Ramos, M.; Pérez, A.; Arribi, A.; Amondarain, I.; Alonso, S.; Ortiz, M. (1999). Zigomicosis. A propósito de cinco casos. Rev. Iberoam. Micol. 16:50-56 6. Diekema, D.; Messer, S.; Jones, R. & Pfaller, M. (2003). Activities of caspofungin, posaconazol, ravuconazol, voriconazol and a mphotericin B a gainst 44 8 recent clinical isolates of filamentous fungi. J. Clin. Microbiol. 41:3623-6 7. Elgart, M. (1996). Zygomycosis. Derm. Clinics. 14:141-146 8. González Morán, A.; Ramos Nieto, M.; Martín López, R.; Ibáñe z Pére z, R. (2 007 ). Mu cormicosis Cu tánea Primaria (Rhizopus microsporus) en paciente con Leucemia Linfoide Crónica B. 9º Congreso Virtual Hispanoam Anatomía Patológica http:// www.conga nat.org/9 congreso/vista Impresion.asp?id_traba jo= 67 4&tipo= 2/ 9. Holzel, H.; MacQueen, S.; MacDonald, A.; Alexander, S.; Campbell, C.; Warnock, D. (1998). Rhizopus microsporus in wooden tongue depressors: a major threat or minor inconvenience? J. Hosp. Infect. 38:113-8

40

Zigomicosis cutánea primaria por Rhyzopus oryzae - R. Salim et al.

26. Scheffler, E.; Miller, G. & Classen, D. (2003). Zygomycosis infection of the neonate upper extremity. J. Pediatr. Surg. 38: E21 27. Schipper, N.A.A. (1984). A revision of the genus Rhizopus I. The Rhizopus stolonifer group and Rhizopus oryzae. Studies in Mycology 25:1-19 28. Spalloni, M.; Chavez, A.; Aviles C. & Cofré, J. (2004). Mucormicosis en pediatría. Rev. Chil. Infectol. 21:17-25 29. Sugar, A. M. (2000). Chapter 249: Agents of mucormycosis and related species. En Mandell G L, Bennett J E and Dolin R editors, Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. Fifth edition. Chu rchill Livingstone, Philadelphia; 2685-2694 30 . Sun, Q.; Fotherg ill, A.; McCarthy, D.; Rinaldi, M .; Gr aybill, J . (200 2). In vitro activities of posacona zole, itracona zole, voriconazole, amphotericin B, a nd flu conazole against 37 clinical isolates of zygomycetes. Antimicrob Agents Chemother 46:158 1-1582 31. Toro, C.; del Palacio, A.; Alvarez, C.; Rodríguez-Peralto, J.; Carabias, E.; Cuétara, M .; Carpintero, Y.; Gó mez, C. (1998). Zigomicosis cutánea por Rhizopus arrhizus en herida quirúrgica. Rev. Iberoam. Micol. 15:94-96 32. Torres-Narbona, M.; Guinea, J.; Muñoz, P. & Bouza, E. (2007). Zigomicetos y zigomicosis en la era de las nuevas terapias antifúngicas. Rev. Esp. Quimioterap. 20:375-386

33. Torres-Narbona, M.; Guinea, J. & Martínez-Alarcón, J. (2007). Impact of zygomycosis on microbiology workload: A survey study in Spain. J. Clin. Microbiol. 45:2051-2053 34. Vázquez, J. (2005). Zygomycosis. http://www.emedicine.com/ cgi-bin/foxweb.exe/ 35 . Walsh, T. & Pizzo , P. A. (19 88). Nosocomia l Fungal Infections: A classification for hospital-acquired fungal infections and mycoses arising from endogenous flora or reactivation. Ann. Rev. Microbiol. 42:517 36 . Weems, J. J.; Davis, B.; Tablan, O.; Kaufman, L.; Martone, W. J. (1987). Construction activity: an independent risk factor for invasive aspergillosis and zygomycosis in patients with hematologic malignancy. Infect. Control. 8:71-75 37. Wiedermann, B. L. (1998). Zygomycosis. En: Textbook of Pediatric Infectious Diseases, Ralph D. Feigin _ James D. Cherry editors. 4 th edition. W.B.Saunders Company, Phhiladelphia. pp: 23 54 -2 36 0 38. Zaoutis, T. E.; Roilides, E. & Chiou, C.C. (2007). Zygomycosis in children: A systematic review and analysis of reported. Pediatr. Infect. Dis. J. 26:723-727

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ASPERGILOSIS CEREBRAL: REPORTE DE CASO
(Brain aspergillosis: a case report)
Eduardo Contreras Zúñiga (1) Gloria Elena Posadan (2) Sandra Ximena Zuluaga Martínez (3) (1) Medicina Interna Universidad del Valle. Cali. Colombia. Correspondencia: edo11@hotmail.com. Dirección: Calle 4 No, 65 – 14. Cali. Colombia. (2) Medicina Interna. Clínica de Occidente S.A. Cali. Colombia. (3) Cirujano general. Angiografía se Occidente SA. Cali. Colombia. Palabras claves: Aspergilosis cerebral, aspergilosis invasiva. Keywords: Brain aspergillosis, invasive aspergillosis.

RESUMEN
En los últimos años la incidencia por infecciones de hongos del genero Aspergillus han aumentado de forma significativa como consecuencia del incremento de pacientes con estados de inmunodepresión, fundamentalmente por la alta incidencia de SIDA y por el mayor empleo de tratamientos inmunosupresores. Las aspergilosis son infecciones infrecuentes en el sistema nervioso central, constituyendo el 4% de las enfermedades invasoras, tratandose de una entidad grave, con un pobre pronóstico (mortalidad mayor del 95%). Se presenta un caso clínico de un paciente masculino de 48 años, con miocardiopatia dilatada terminal que fue sometido a transplante cardiaco, tratamiento inmunosupresor y profilaxis antimicrobiana. Después de su alta ( 23 días post cirugia), regresa con compromiso del sensorio y focalidad neurológica, por lo que se practica RNM que evidenció lesión microangiopatica, con edema y realce periférico anular. Cultivos microbiológicos negativos y LCR dentro de lo normal. Posteriormente (10 días después del ingreso) empeora su condición neurológica e imagenológica, por lo que se realizó biopsia estereotaxica obteniéndose exámenes directos negativos e histología sin evidencia de microorganismos, sin embargo, en los cultivos se obtuvo Aspergillus fumigatus. Se inició tratamiento con Voriconazol con buena respuesta inicial, pero posteriormente empeora su condición neurológica y general, con signos y síntomas de rechazo del transplante cardiaco, falleciendo a los 62 días postransplante.

SUMMARY
In recent years the incidence of fungal infections of the genera Aspergillus have increased significantly as a result of the increase in patients with immunocompromised states, primarily by the high incidence of AIDS and the increased use of immunosuppressive treatments. The aspergillosis infections are rare in the central nervous system, constituting 4% of invasive disease, in the case of a serious entity with a poor prognosis (mortality greater than 95%). We report a case of a 48-year-old male patient with terminal dilated cardiomyopathy underwent heart transplantation, immunosuppressive therapy and antimicrobial prophylaxis. After his high (23 days post-surgery), is back with commitment and focal neurologic consciousness, so that is practiced MRI showed microangiopathic injury, edema and peripheral enhancement cancel. Microbiological cultures and negative CSF within normal. Later (10 days after admission) her neurological condition worsened and imagery, so stereotactic biopsy was obtained and histology tests negative without direct evidence of microorganisms, however the culture was positive to Aspergillus fumigatus. Voriconazole treatment started with good initial response, but later his condition worsened neurological and general signs and symptoms of heart transplant rejection, died 62 days postranplantation.

INTRODUCCION
En la última década se ha producido un incremento sustancial de los casos de aspergilosis invasiva como consecuencia de la generalización de tratamientos 43

Recibido el 18 de Diciembre 2008 Aceptado el 30 de Diciembre 2008

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inmunosupresores cada vez más potentes. Este incremento en la frecuencia de esta enfermedad no se ha visto acompañado de una reducción en la mortalidad, que sigue siendo elevada (1, 2). La aspergilosis pulmonar es, sin duda, la forma clínica más frecuente de presentación de esta entidad, seguida por la sinusitis, la infección del árbol traqueobronquial y la del sistema nervioso central (2, 10). La aspergilosis cerebral puede verse en un 4% hasta un 20% de las formas invasivas. El diagnóstico precoz de la infección por Aspergillus del Sistema Nervioso Central (SNC) es un gran desafío, donde la sospecha clínica fundamentada es clave por la alta letalidad de la entidad aún con tratamiento oportuno. La importante dificultad diagnóstica es favorecida por algunas características de la entidad: baja incidencia, compromiso de individuos inmunocomprometidos que presentan múltiples infecciones, manifestaciones neurológicas clínicas e imagenológicas inespecíficas y métodos diagnósticos etiológicos de resultados tardíos (1, 3, 4). CASO CLINICO Paciente masculino, de 48 años de edad, con antecedentes de miocardiopatía dilatada idiopática, por la que fue sometido a transplante cardíaco, recibiendo dentro del protocolo de manejo perioperatorio profilaxis antibiótica con Ceftriaxona y Vancomicina, además de bolos de Metilprednisolona. Se adicionó Micofenolato Mofetil y Ciclosporina. También se inicio profilaxis con Trimetropinsulfametoxazol (TMS), Aciclovir, Nistatina y Pirimetamina (seronegativo para anticuerpos contra Toxoplasma gondii). Se realizaron ecocardiogramas transtorácicos que evidenciaban adecuado funcionamiento del injerto. Se realizaron 2 biopsias endomiocárdicas (Semana 1 y 2) negativas para rechazo celular del injerto. El paciente es dado de alta a los 18 días después del transplante para seguir con Ciclosporina, Prednisolona, Micofenolato Mofetil, Aciclovir, Nistatina, ASA, Omeprazol, Calcio, Calcitriol, Enalapril, Metoprolol, TMS. El paciente reingresa a los 23 días postransplante por 72 horas de evolución de malestar general, disnea subjetiva e irritabilidad. Al examen físico se encontró en regular estado general, TA 126/72 mmHg, Fc:100 l.p.m., Fr:18, sin hallazgos anormales al examen físico. Paraclínicos evidencian sodio: 118mEq/lt, potasio: 5.2mEq/lt. Resto de los estudios dentro de límites normales. Ecocardiograma evidencia hipertrofia marcada del ventrículo izquierdo con fracción de eyección del 65% 24 horas después del ingreso: A pesar de la corrección de las alteraciones hidroelectrolíticas, se observa mayor deterioro neurológico, confusión y desorientación. A los 25 días postrasplante: Se observa mutista, no obe44

dece ordenes, hay respuesta plantar flexora bilateral y marcado temblor distal en miembros superiores. Se realiza una resonancia magnética cerebral (RMN) (Fig. 1, 2, 3) observándose múltiples lesiones secundarias a microangiopatía con edema perilesional y realce periférico anular. Se solicita una tomografía de tórax sin lesiones específicas. Los hemocultivos fueron negativos y Galactomannano fue negativo en dos oportunidades. EL fisicoquímico y citológico del LCR estaba dentro de los parámetros normales, con cultivo negativo. El paciente evoluciona en forma favorable durante los siguientes 7 días. A los 32 días postrasplante: Control escanográfico (Fig. 4 y 5) evidencia mejoría parcial de las lesiones. El paciente permaneció con temblor distal pero con mejoría neurológica importante. A los 37 días postrasplante: Presenta episodio convulsivo, relajación de esfínteres, sialorrea y desviación de la mirada. Se realiza nueva resonancia magnética cerebral que muestra aumento del edema perilesional, aparición de nuevas lesiones con efecto de masa y realce periférico (Fig.6 y 7). A los 40 días postrasplante: Se realiza biopsia cerebral estereotáxica obteniendo abundante material purulento. El examen directo del material coloreado con Gram fue negativo; en el estudio histológico se observo necrosis sin evidencia de microorganismos. A los 44 días postrasplante: El paciente se deteriora neurológicamente, presenta hemiparesia. El reporte preliminar del cultivo es informado como positivo para un hongo filamentoso el cual, posteriormente fue tipificado como un Aspergillus fumigatus. Se inicia tratamiento con Voriconazol 4 mg/kg cada 12 horas. A los 50 días postrasplante: El paciente mejora neurológicamente, queda secuela de hemiparesia izquierda. Se realiza control escanográfico que evidencia mejoría de todas las lesiones previas excepto una a nivel de de hemisferio cerebral izquierdo. A los 55 días postrasplante: El paciente presenta disnea progresiva, cifras tensionales bajas y disminución de fracción de eyección (30%) mediante ecocardiograma. Teniendo en cuenta la mejoría neurológica y radiológica del paciente, se reajusta dosis de esteroide para manejo del rechazo celular con compromiso Hemodinámico. A los 60 días postrasplante: Empeoramiento de hemiparesia izquierda y disartria. Se realiza nuevo estudio imagenólogico (Fig. 8 y 9) que evidencia sangrado intraparen-

Aspergilosis cerebral: reporte de caso - E. Contreras et al.

Figuras 1 - 9 Estudio imagenólogico. Fig.1, 2, 3. Múltiples lesiones secundarias a microangiopatía con edema perilesional y realce periférico anular a los 25 días post transplante Fig. 4, 5. Control escanográfico a los 32 días . Fig. 6, 7. Control escanográfico a los 37 días. Fig. 8, 9. Control escanográfico a los 60 días. quimatoso con sangre en el sistema ventricular y desviación leve de línea interhemisférica. Se le realizo a drenaje neuroquirúrgico urgente del hematoma cerebral. El paciente fallece 2 días después (37 días postransplante cardiaco).

DISCUSION
El primer caso de Aspergilosis en seres humanos fue descrito en 1842 por Bennet en Edimburgo. Sin embargo los casos descritos correspondían a personas inmuno45

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competentes donde se presentaba como una enfermedad granulomatosa. No fue sino hasta 1950, cuando el uso de los esteroides y medicamentos citotóxicos se introdujo en la práctica diaria que se reconoció su papel como enfermedad oportunista y en 1953 se describe el primer caso de Aspergillosis Invasora (AI) en un paciente inmunocomprometido (1, 2). En pacientes trasplantados de corazón la incidencia de esta infección parece ser menor que en pacientes trasplantados de otros órganos como hígado y pulmón. Sin embargo la mortalidad es igual de alta en estos pacientes y las dificultades existentes en cuanto al diagnóstico y manejo antimicótico son también similares (1, 3). Se han identificado algunos factores de riesgo para desarrollar esta infección, tanto en pacientes transplantados de corazón como de otros órganos. Dentro de estos factores se destacan el uso de esteroides a altas dosis, el uso de antibióticos pretransplante, la colonización previa por Aspergillus, complicaciones quirúrgicas, el exceso de inmunosupresión, el rechazo crónico, la enfermedad por CMV, la ocurrencia en la institución de un episodio de Aspergillosis invasora en los dos meses previos o posteriores al trasplante y la necesidad de retrasplante (2, 4, 5). La especie aislada con mayor frecuencia es A. fumigatus y la importancia de otras especies es menos dramática aunque se han diagnosticado infecciones por A. niger, A. flavus y A .terreus (3). La incidencia de Aspergillosis invasiva en trasplantados cardiacos oscila entre 1 y 15%, con una frecuencia en promedio de 5.2%, representando el 69.8% de las infecciones micóticas, siendo la infección mas frecuente en su grupo (4, 6). La Aspergillosis cerebral ocurre en el 10 a 40% de las infecciones invasivas, sin embargo, es raro el compromiso aislado cerebral y es generalmente el resultado de diseminación desde otro órgano, generalmente los pulmones (2). La mortalidad en trasplante cardiaco es del 53-78% con aspergillosis invasora y cercana al 100% si compromete el sistema nervioso central (4). La infección se presenta con mayor frecuencia durante los primeros meses postransplante. El riesgo disminuye en forma importante después del primer año de transplante. Se ha observado una frecuencia de infección en los primeros 3 meses postransplante de 0.15 episodios/ paciente/mes y disminuye hasta 0.05 episodios/paciente/ mes despues de los tres meses (5, 7). El SNC puede afectarse de distintas maneras en esta infección, incluyendo la formación de abscesos o granulomas en el parénquima cerebral, aracnoiditis difusa, infartos cerebrales o medulares, aneurismas micóticos o 46

abscesos epidurales espinales (4, 7, 8). La aparición de abscesos cerebrales es un signo ominoso. Generalmente el paciente presenta síntomas focales. Cuando Aspergillus invade el sistema nervioso central por vía hematógena las hifas producen oclusión vascular o pueden atravesar las paredes capilares produciendo infarto hemorrágico que puede evolucionar a un infarto séptico con cerebritis y formación de abscesos. La distribución más común suele ser las regiones irrigadas por la arteria cerebral media y por la arteria cerebral anterior (1, 2, 6). Los síntomas son inespecíficos, y a pesar de su propensión a realizar invasión vascular los hemocultivos suelen ser negativos. El diagnostico suele ser un reto y hasta el 18% de los pacientes se diagnostican post mortem. La dificultad en el diagnóstico tiene varias razones: 1. En primer lugar la aspergillosis tiene presentaciones atípicas e inespecíficas que hacen primero pensar en otras infecciones que son además más frecuentes (2, 9). 2. Se presenta en un amplio y variado grupo de personas algunos de los cuales están expuestos por mucho tiempo al patógeno y otros que solo se exponen un tiempo corto (3, 8). 3. No hay un solo método diagnóstico. Se requieren varios exámenes y descartar otras infecciones antes de confirmar esta infección, cuyo patrón de oro para diagnosticarla es histopatológico y/o por cultivos y de cuya rapidez en el diagnóstico y tratamiento, dependerá la vida del paciente (7, 9). El tratamiento de elección de la enfermedad invasora es el Voriconazol a una dosis de 8 mg/kg/día. Algunos expertos recomiendan como alternativa la administración de Anfotericina liposomal en dosis elevadas (10 mg/kg/día) basándose en estudios que demuestran una mayor eficacia sin mayor toxicidad. También es posible la utilización de Caspofungina (la única Equinocandina comercializada en nuestro país hasta el momento) que ha demostrado su utilidad en tratamientos de rescate (8, 9).

REFERENCIAS
1. Turgut, M.; Oncu, S. & Tekin, C. (2008) Invasive fungal granuloma of the brain caused by Aspergillus fumigatus: a case report and review of the literature. Surg Neurol. 69:169-74 2. Singh, N. & Pursell, K.J. (2008).Combination therapeutic approaches for the management of invasive aspergillosis in organ transplant recipients. Mycoses. 51:99-108 3. Haas, A. (2007). Invasive aspergillosis: epidemiology, diagnosis and mana gement in immunocompromised pa tients. Drugs. 67:1567-601 4. Schwartz, S. & Thiel, E. (2004). Update on the treatment of

Aspergilosis cerebral: reporte de caso - E. Contreras et al.

cerebral aspergillosis. Ann Hematol. 83 Suppl 1:S42 5. Muñoz, P. (2007). Infection in heart transplantation. Enferm Infecc Microbiol Clin. 25:587-97 6. Koffla, G. & Otto, K. (2007). CNS aspergillosis: recognition, diagnosis and management. CNS Drugs. 21:659-76 7. Nadkarni, T. & Goel, A. (2005). Aspergilloma of the brain: an overview. J Postgrad Med. 51 Suppl 1:S37-41

8. Silveira, M.P. (20 07). Fungal infections in solid organ transplantation. Med. Mycol. 45:305-20 9. Drew, R.H. & Davis, R. (200 4).Compara tive safety of amphotericin B lipid complex and amphotericin B deoxycholate as aerosolized antifungal prophylaxis in lung-transplant recipients. Transplantation. 77:2 32-7 10. Del Brutto, O.H. (2000) Infecciones Micóticas del Sistema Nervioso Central. Rev. Neurol. 30:447-459

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APORTES MORFOTAXONOMICOS EN EL GENERO Aspergillus Link: CLAVES PARA LAS ESPECIES AMBIENTALES Y CLINICAS MAS COMUNES
(Morphotaxonomic contributions in the genus Aspergillus Link: keys for the most common environmental and clinical species)
Eduardo Piontelli L.
Universidad de Valparaíso, Escuela de Medicina, Cátedra de Micología, Casilla 92 V, Valparaíso Chile eduardo.piontelli@uv.cl Palabras clave: Aspergillus, claves especies comunes. Key words: Aspergillus, key common species.

RESUMEN
Se condensan los principales alcances en el género Aspergillus y las metodologías de diagnóstico morfo-taxonómico de las especies más comunes de utilidad para el micólogo en áreas clínicas y ambientales. Se aporta información bibliográfica actualizada para las determinaciones polifásicas de las especies y algunas claves morfofisiológicas tentativas en ciertos taxa de importancia médica, con énfasis en la Sección Fumigati.

ABSTRACT
The main information about the Aspergillus genus together with methodologies for the morphotaxonomic diagnosis of the most common species useful for the mycologist in clinical and environmental areas are here condensed. An updated bibliography is forwarded in order to carry out polyphasic identification of the species as well as tentative morphophysiological keys in some taxa having medical significance with emphasis in Section Fumigati. Thom & Raper, 1945), pero la más completa en su época y aún consultada fue la escrita por Raper & Fennel en el año 1965, que incluyó varias nuevas especies; sin embargo, a pesar de incluir la diagnosis latina de las nuevas especies, no designaron las especies tipo, describiendo además los teleomorfos bajo el mismo nombre de los anamorfos (Aspergillus). Los aportes posteriores fueron agregando nuevas especies y reordenaron el género hacia una línea más acorde al Código Internacional de Nomenclatura Botánica (CINB) dilucidando sus relaciones con los teleomorfos de Aspergillus. Las nuevas especies descritas desde 1965 fueron publicadas en la literatura por Samson (1979, 1992, 1993, 2000) y otros autores (Al Musallan, 1980; Christensen, 1981-1982, entre otros), aportándose al mimo tiempo varios métodos de identificación. La taxonomía tradicional del género se basa principalmente en sus caracteres fenotípicos y fisiológicos, los cuales han aportado satisfactorias delimitaciones de las especies, sin embargo, existen variaciones morfológicas en varias secciones que han llevado a controversias en sus esquemas taxonómicos. En el nuevo siglo 21, Aspergillus y sus teleomorfos han sido recientemente investigados con métodos polifásicos (morfológicos, fisiológicos y moleculares) para examinar 49

INTRODUCCION
Las especies de Aspergillus Link, se consideran entre los organismos de más amplia distribución cosmopolita, capaces de colonizar una gran variedad de substratos en los diferentes nichos ecológicos del suelo; en general, son frecuentes en climas tropicales y subtropicales pero disminuyen en los climas fríos, mientras algunas epecies son restringidas a hábitat específicos. Se consideran contaminantes comunes de varios substratos, en especial alimentos, granos, suelos (salinos, cultivados, desérticos y de pastoreo), bosques subtropicales deciduos y ambientes internos, entre otros. Un buen número de sus integrantes tiene importancia ecológica, genética, biotecnológica, sin olvidar sus aspectos patogénicos y micotoxicogénicos relacionados con el hombre y otros mamíferos (Powell et al., 1994). Se reconoce a Link (1809) como al autor que validó al género (CINB), a pesar que Micheli (1729) fue el primero que lo describió. En el siglo XX se publicaron varias monografías del género (Thom & Church, 1926;
Recibido el 1 de Septiembre 2008 Aceptado el 28 de Noviembre 2008

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Cabeza radiada biseriada Fiálides Métulas

Cabeza columnar monoseriada

Tipos de vesículas

Vesícula Globosa Piriforme Espatulada Clavada

Conidios Conidióforo Estipe

Célula pié Células Hülle
Figura 1. Estructuras morfológicas en el género Aspergillus: cabezas radiadas y colomnares, tipos de vesículas, célula pie, células Hülle la variabilidad entre sus especies (Samson & Pitt, 2000; Samson et al, 2006; Samson & Vargas, 2007). Las especies de Aspergillus se estudian mediante sus características macro y micromorfológicas, junto a caracteres de crecimiento en diferentes medios de cultivo, perfiles de extrolitos (micotoxinas) y técnicas moleculares, tales como; secuencias del gen de la b-tubulina, calmodulina y actina, mientras otras técnicas de análisis como, amplificación de DNA polimórfico al azar (RAPD) entre otras, han sido utilizadas (Geiser et al., 2000-2004 -2007; Balajee et al., 2005; Pringle et al., 2005; Samson et al., 2007; Varga et al., 2007) En clínica, los análisis moleculares e inmunológicos han sido un avance prometedor en el diagnóstico rápido, sin embargo, la microscopía y los cultivos (con un adecuado entrenamiento profesional), siguen siendo las herramientas esenciales no solo en este campo, sino en muchos otros (McClenny, 2005). Las secciones de Aspergillus Fumigati, Circumdati, Flavi y Nigri, contienen los más importantes patógenos humanos, sin embargo, A. fumigatus fue considerado como el único y más importante Aspergillus patogénico conocido dentro de la Sección Fumigati, una situación que ha cambiado recientemente con reportes clínicos que incluyen, Neosartorya pseudofis50 cheri, A. lentulus (resistente a múltiples antifúngicos) y A. undagawe (Neosartorya) como patógenas relacionadas con A. fumigatus (Balajee et al.,2005). Los estudios moleculares han revelado frecuentes errores en la identificación de A. fumigatus cuando se usa solamente la morfología, sin otros datos fisiológicos de apoyo, especialmente en cepas de baja esporulación (Balajee et al., 2006). b) Características macroscópicas. Estas son importantes en la clasificación subgenérica, tales como el color de los conidios, que se observa en placas de Petri en los diferentes medios de cultivo (debido a su utilidad en la clasificación subgenérica); el color puede variar desde el negro, blanco, amarillo, ocre, azul verde, o una mezcla de ellos, por lo que es recomendable emplear a veces una tabla de colores determinada. Las colonias pueden producir gotas de líquidos en su superficie, ya sea incoloras o con diferentes tonalidades, así como pigmentos de varios colores en el reverso de la colonia, si éstos son solubles difunden al agar. El diámetro de las colonias (en mm), es otra característica fisiológica útil, debido a que las especies del género pueden variar en su habilidad de crecer a diferentes potenciales de agua, y a

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

diferentes temperaturas en medios estandarizados. Algunas especie pueden producir en los cultivos estructuras de variado tamaño, pero observables a simple vista o bajo la lupa estereoscópica, de aspecto generalmente redondo, de diversos colores y consistencia firme, llamadas esclerocios (Sección: Candidi, Circumdati, Flavi, Nigri), pero también pueden presentarse cleistotecios (ascomata), principalmente de los géneros Eurotium, Neosartorya y Emericella). c) Características microscópicas Aspergillus es un género anamórfico que produce esporas asexuales (conidios, mitosporas) sobre estructuras especializadas características que se componen de un: conidióforo (estipe) que se dilata en el ápice, formando una vesícula de diferentes formas (Fig. 1). Las vesículas pueden variar en tamaño y forma, desde esféricas (globosas), clavadas, piriformes y espatuladas. La vesícula nace sobre un corto o largo pie, usualmente aseptado, liso o rugoso y que se une a la hifa portadora generalmente en ángulo recto mediante
Ascos y ascosporas

a

una estructura en forma de T invertida llamada célula pie (Fig.1), que forma parte integral del estipe. La célula pie y el estipe son comúnmente llamados conidióforos, que apicalmente terminan siempre en una vesícula dilatada, la cual puede dar origen en su superficie a 1 o 2 tipos de estructuras ya sea en una sola alineación de fiálides (monoseriados o uniseriados), que son las célula conidiógenas, que originan siempre conidios secos o presentar una segunda estructura bajo las fiálides llamadas métulas (biseriadas) que pueden sostener 1 a 10 fiálides c/u (Fig.1). Algunos taxa pueden ser monoseriados y biseriados a la vez, mientras otros son estrictamente monoseriados o biseriados. Ambas estructuras (fiálides y métulas) se forman sincrónicamente en la superficie de la vesícula pudiéndola cubrir parcial o totalmente. Las vesículas, fíalides y métulas (si estas últimas están presentes), junto con los conidios, forman lo que llamamos cabeza conidial, la cual por la disposición de los conidios puede ser de aspecto columnar o radiado (redonda). Pueden presentarse situaciones intermedias, como columnar laxa, que forma varias columnas divergentes o radiada laxa, con cortas columnas que abren la cabeza radiada, pero mantienen el aspecto redondo. Algunos miembros del género pueden producir células de gruesa pared y de variado tamaño (siempre mayores que los conidios o mitosporas), llamadas células de Hülle, generalmente entremezcladas con el micelio o asociadas a las formas sexuales del género (ej.Cleistotecios de Emericella). Si bien es cierto que su función parece ser protectiva, pueden actuar también como propágalos de dispersión. d) Presencia de teleomorfo. Algunos miembros del género son capaces de reproducirse sexualmente en cultivos mediante la formación de cleistotecios (Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Trichocomaceae), que contienen ascosporas formadas en ascos más o menos redondos, evanescentes, dispuestos desordenadamente en el centrum. El tipo de ascoma, tamaño, forma, estructura, superficie y color de las ascosporas, son importantes en la determinación de los taxa. Actualmente se consideran 11 géneros teleomórficos dentro del género anamórfico Aspergillus y sus subgéneros (Tabla 1). Chaetosartoria (Sección Cremei) Dichlaena y Eurotium (Sección Aspergillus, Fig. 2a) Emericella (Sección Nidulantes, Fig. 2b) Fennellia (Sección Flavipedes), Hemicarpenteles, Sclerocleista y Warcupiella (Sección Ornati), Neopetromyces (Seccion Circumdati), Neosartorya (Sección Fumigati, Fig. 2c), Petromyces (Sección Flavi). e) Producción de Micotoxinas Los Aspergillus no se han considerado como causa de enfermedades en las plantas, sin embargo, algunas especies son responsables de algunos proble51

Ascos y ascosporas

b

Células Hülle Ascos y ascosporas

c

Figura 2. Principales tipos de ascomata en teleomorfos de Aspergillus. a) Eurotium, b) Emericella, c) Neosartorya.

Boletín Micológico Vol. 23 : 49 - 66

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Tabla 1. Nomenclatura de los taxa infragenéricos del género Aspergillus y sus Secciones (Modificada de Gams et al., 1985 y Klich, 2002). Subgénero Aspergillus Uniseriados, xerofílicos, conidios gris-verdosos Secciones* Aspergillus (A. glaucus grupo).Teleomorfo Eurotium, cleistotecios amarillos Restricti (A. restrictus grupo). Crecimiento lento en los medios

Fumigati Fumigati (A. fumigatus grupo).Conidios gris verde a azul verdosos Uniseriados,vesículas preCervini (A. cervinus grupo). Conidios naranja claros a gris naranja dominantemente piriformes, conidios gris-verdes, azul-verde a naranja Ornati Ornati (A. ornatus grupo) Uniseriados, conidios gris verdosos, amarillo-verdosos u oliva-café Clavati Uniseriados, vesículas clavadas, conidios gris-verdosos Nidulantes Biseriados, conidios de colores variables Clavati (A. clavatus grupo) (Incluida en Fumigati por Peterson, 2008)

Nidulantes ( A. nidulans grupo). Estipe corto cafesoso, células Hülle a menudo presentes. Teleomorfo Emericella, ascosporas rojo púrpura. Versicolor (A. versicolor grupo). Estipe hialino a café, conidios verdes, verde grises o azul verdosos. (Incluida en Nidulantes por Peterson 2008). Usti (A. ustus grupo). Estipe café, conidios café a oliva, rugosos. Terrei (A. terreus grupo). Estipe hialino, conidios naranja café a ante. Flavipedes (A. flavipes grupo). Estipe hialino a café claro, conidios blancos a crema.

Wentii (A. Wentii grupo).Conidios color ante, amarillo-café o oliva-café. Flavi (A. Flavus grupo). Estipe rugoso, conidios amarillo verde a oliva-cafè . Nigri (A. niger grupo). Estipe liso, conidios oscuros cercanos al negro. Circumdati (A. ochraceus grupo).Predominantemente biseriados, conidios amarillos, ante u ocráceos. Candidi (A. candidus grupo). Conidios blancos o cercanos al blanco. Cremei (A. cremeus grupo). Conidios café, amarillos o azul verdosos. Sparsi (A. sparsus grupo).Conidios gris pálido a oliva-ante. Stilbothamnium (especies que forman sinnemata) Ochracxeoroseus Ochraceoreosei (A.ochraceoroseus y A.rambelli). Biseriados, vesícula redonda, conidios gris-amarillentos (Frisvald et al., 2005) incluyen ambas especies bajo el subgénero Circumdati, por su incapacidad de crecer a 37ºC y sus extrolitos) (*La resoloción filogenética limitada de algunas especies y secciones aconseja el uso de más genes adicionales para determinar sus relaciones). mas de contaminación en productos vegetales ya sea en precosecha, cosecha, post cosecha y almacenamiento (A. niger, A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, A. carbonarius, A. alliaceus, entre otros)( Perrone et al., 2007). El mayor problema reside en la presencia de micotoxinas contaminantes en alimentos y piensos. donde varias de estas se han identificado y la más importante son las aflatoxinas y la ocratoxina A (Vargas et al., 2004). Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, por su poder carcinogénico son consideradas las más hepatotóxicas (Bennet & Klich, 2003), por el riesgo en 52 salud humana y animal, debido a la contaminación de productos en precosecha: maíz, algodón, soja, maní, nueces y por ciertos residuos que aparecen en la leche debido al consumo por los animales de piensos contaminados. La ocratoxina A es una potente nefrotoxina que además posee propiedades carcinogénicas, teratogénicas e inmunotóxicas en ratas y posiblemente en humanos. Puede contaminar alimentos, tales como granos, legumbres, café, frutas secas, cerveza, vino y carnes: las especies más productoras pertenecen a la sección Circumdati y Nigri (Ver Frisvald et al., 2007).

Circumdati Uni o biseriado, vesículas esféricas o piriformes

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

Tabla 2. Aspergillus productores de Aflatoxinas y sus extrolitos quelantes ( Frisvald et al., 2005)
Especies Aflatoxinas B1 G1 Acido Cyclopiazónico Acido Kojico
Acido Aspergílico

subgéneros y 22 secciones. Posteriormente Peterson (2008), agrega nuevos cambios en un análisis de secuencias de DNA desde 4 locus. La Tabla 1, mantiene la estructura clásica con algunas modificaciones.* h) Medios de cultivo para la identificación de las especies de Aspergillus. Se emplean por lo general 3 a 5 medios de cultivo 1.- CYA25, Agar Czapek extracto de levadura a 25ºC por 7 días. 2.- CYA37. Agar Czapek extracto de levadura a 37ºC por 7 días 3.-CY20S. Agar Czapek extracto de levadura más 20% de sacarosa a 25ºC por 7 días (para las especies xerofílicas (sección Aspergillus (Eurotium) y sección Restricti). 4. MEA. Agar extracto de malta a 25ºC por 7 días. 5. CZ. Agar Czapek a 25ºC por 7 días. Es un medio considerado viejo estandar que aún se emplea en muchos laboratorios y textos y al cual se le agregan trazas de metales como el Zn y Cu, cuando el medio no los posee en su fórmula. Para cada cultivo, se emplean por lo general 4 placas de Petri de 100 mm a las cuales se le agregan 25ml de cada medio de cultivo CYA25, CYA37 (o a más temperatura si es necesario), CYA20S y MEA25. Es importante la profundidad del medio, debido a que la menor o mayor profundidad puede llevar a ciertos cambios morfológicos (Okuda et al., 2000). Las placas con sus diferentes medios deben inocularse en 3 puntos equidistantes del centro mediante una solución de conidios disueltos en un medio con 0,2% de agar y 0,05 % de Twen 80 (Pitt & Hockin, 1997). Los conidios del cultivo a analizar, se mezclan en 1 o 2 cc del medio y mediante una micropipeta se depositan 2µL en 3 puntos equidistantes de las placas. I) Identificación rápida de las especies aflatoxigénicas de Aspergillus. Un medio especial para la identificación rápida de potenciales Aspergillus aflatoxigénicos (A. flavus y A.parasiticus) en 3 días, es el agar AFPA (Aspergillus Flavus y Parasiticus Agar) (Pitt et al.,1983). Existen otros medios para distinguir algunas especies de la sección Flavi (Ver Samson et al., 2004), pero la identificación en medios estandar es suficiente para el micólogo con experiencia. J) Medios de cultivo y fórmulas 1.- Concentrado de Czapek (con trazas de metales) NaNO3 30 g KCl 5g MgSO4.7H2O 5g FeSO4. TH2O 0, 1 g ZnSO4. TH2O 0, 1 g CuSO4. 5H2O 0, 1 g Agua destilada 100 ml 53

Aspergillus sección Flavi (Petromyces) A. bombycis A. flavus A. nomius A. parasiticus A. parvisclerotigenus A. pseudotamarii A. toxicarius + + + + + + + + − + + ± − + − + − − + + − + + + + + + + − + + + + — +

Aspergillus subgénero Nidulantes (Emericella) E. astellata E. sp. IBT 21903 E. venezuelensis + + + − − − − − − − − — − − —

Aspergillus sección Ochraceorosei A. ochraceoroseus A. rambellii + + − − − − − − − −

f) Presencia de extrolitos. La detección de la presencia de extrolitos (compuestos químicos), ha sido otro buen aporte en la determinación de las especies, demostrándose que cada aislamiento de Aspergillus presenta un específico perfil que agrega una importante información para la presencia de micotoxinas (Tabla 2). Los extrolitos se analizan mediante el método de HPLC (diode array detection) (Frisvald & Thrane,1993) modificado por Smedsgaard (1997), retenciones de índices de alquilfenona y detección de una matriz de diodo UV-VIS. g) Subgéneros y Secciones de Aspergillus. Enla Tabla 1, los nombres de los grupos según la antigua clasificación de Raper & Fennell (1965), están entre paréntesis. Como los grupos no tienen un estatus bajo el Código Internacional de Nomenclatura Botánica (ICBN), se han reemplazado por los nombres de subgéneros y Secciones (Gams et al., 1985). La posición de algunas especies y la existencia de otros subgéneros y secciones ha sido cuestionada y modificada por ciertos autores (Kozakievicz, 1989). Peterson (2000), propone eliminar 3 de los subgéneros establecidos por Gams et al. (1985), y retener 12 de las 18 secciones, modificar 3 y eliminar 3; Peterson et al. (2008), con nuevos datos moleculares proponen 8

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2.- Agar Czapek Levadura con 20% de Sucrosa (CY20S) K2HPO4 1g Concentrado de Czapek 10 ml Extracto de levadura 5g Sucrosa 200 g Agar 15 g Agua destilada 1L 3.- Agar Czapek Levadura (CYA25, CYA37) K2HPO4 1g Concentrado de Czapek 10 ml Extracto de levadura Sucrosa Agar Agua destilada 4.- Agar Czapec Dox (CZ) K2HPO4 Concentrado de Czapek Sucrosa Agar Agua destilada 5g 30 g 15 g 1L

1g 10 ml 30 g 17, 5 g 1L

5.- Agar extracto de Malta (MEA) Extracto de malta en polvo 20 g Peptona 1g Glucosa 20 g Agar 20 g Agua destilada 1L

K) Claves anexas y su manejo. Las claves que se detallan a continuación, pueden emplearse para determinar los más comunes aislamientos clínicos o ambientales; no son estrictamente dicotómicas y se han completado con la información más significativa y descriptiva de cada especie, para facilitar en cierta medida una mejor identificación para las personas que no poseen literatura taxonómica de las especies más comunes de Aspergillus, una situación que hemos observado en algunos laboratorios de nuestro país. La lectura de estas claves por su mayor información anexa, pueden alargar el tiempo de búsqueda de una especie, en especial si un aislamiento no corresponde plenamente con las descripciones, sin embargo, si ciertos aspectos son coincidentes, se recomienda buscar en las referencias las descripciones completas en la sección que corresponde. Las claves son siempre orientativas y es necesario hacer coincidir la descripción final con las monografías en la literatura. Antes de usar las claves, observe bien las colonias y haga preparaciones desde 2 medios diferentes porque pueden presentarse algunas características diferentes (ej. el color del conidióforo, tamaño de las vesículas, rugosidad de los conidios, etc.). El Lactofenol puede alterar los diámetros de los conidios y a veces es preferible medir las estructuras en agua. Si un aislamiento se presenta como biseriado y monoseriado, considere como válidas las estructuras dominantes. Si el aislamiento esporula pobremente expóngalo a la luz por varios días (Aspergillus es sensitivo a la luz) o cultívelo en medios pobres (papa zanahoria (PZ), o Agar avena (OA). L) Algunos textos a consultar : Raper & Fennel, 1965; Klich, 2002; Samson & Pitt, 2000; Samson et al., 2004; Samson & Vargas 2007 u otros trabajos citados en las referencias.

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

Clave general de las especies más comunes de Aspergillus en diferentes ambientes
(Modificada de Samson et al., 2004 y Klich, 2002) Dibujos no a escala.
Conidios y conidióforos

1

- Colonias blancas, negras, amarillas, café o de colores grises..........................2 - Colonias en algún tono de verde, verde amarillo o azul verdoso......……10 - Cabezas conidiales de color blanco a amarillo pálido a menudo húmedas; predominantemente biseriadas, cabezas reducidas a veces presentes; diámetro de las colonias en CYA25 13-20 mm, MEA25 8-15 mm, CYA37 sin crecimiento; vesículas predominantemente más grandes que 15 µm (1040); métulas que cubren toda la superficie de la vesícula; conidios globosos a ovoides lisos 2,5-4 µm. Esclerocios púrpura a negros a veces presentes…………………………………..............…...…. A.candidus Link
(Una especie similar como A. tritici Mehrotra & Basu, presenta colonias más amarillas, es capaz de crecer en CYA37, 7-21 mm; vesículas 5-11mm y conidios levemente rugosos. Seguramente por su capacidad de crecer a 37ºC se ha confundido con A.candidus en algunos tipos de micosis: ver Vargas et al., 2007c )

2.

- Cabezas conidiales de color blanco a amarillo pálido o crema; diámetro de las colonias en CYA25 20-38 mm, MEA25 20 (o menos)-38, CYA37 y CYA20S menores de 55mm; predominantemente biseriadas; vesículas mayoritariamente menores de 15 µm; métulas que cubren uno o dos tercios de la superficie de la vesícula; conidios globosos, lisos a finamente rugosos 2,5-3,5µm. Células Hülle a veces presentes; cleistotecios amarillos raramente presentes (Fennellia nivea)..................................…....A.niveus Blochwitz - Cabezas conidiales amarillas, con algún tono de café o negro ..…....…… 3 3. - Cabezas conidiales café oscuras a negras; biseriadas (uniseriadas), diámetro de las colonias en CYA37 50-70 mm; conidios globosos, irregularmente rugosos a finamente rugosos, con crestas y surcos 3,5-5 µm………… ……........................A. niger complex van Tieghem (ver Tabla.3 para la
diferencia con otras especies de la sección Nigri, Samson et al., 2007b)

- Cabezas conidiales no café oscuras a negras pero de colores oliva, amarillocafé, u otros tonos más pálidos del café ........…….……....….…….…….. 4 4 - Cabezas conidiales columnares, a menudo de color canela-café a café rosado; biseriados; diámetro de las colonias en CYA37 y CYA20S 60-70 mm; métulas angostas compactadas (2-2,5 µm) que cubren las 3/4 de la vesícula; conidios globosos a elipsóides, lisos 2 -2,5µm. Células globosas hialinas (aleuroconidios) adheridos lateralmente en las hifas sumergidas usualmente presentes…................................. A. terreus Thom aggregates
(Es un taxa con alta variabilidad genética con varias especies crípticas incluidas en los aislamientos considerados como A.terreus, Vargas et al., 2005; Lass- Flörl et al.2007 y otros estudios en preparación).

- Cabezas conidiales no columnares, de color amarillo o café...............…..…5
Aleuroconidio

5.

- Cabezas conidiales oliva a café claro; diámetro de las colonias en CYA 25 36-43 mm, MEA25 35-46 mm, CYA37 sin crecimiento; biseriadas; estipe café; células Hülle a menudo presentes en forma de salchicha; conidios esféricos, de paredes muy rugosas 3,2-4,5 µm. Reacción de Ehrlich (-). Buen crecimiento en CREA, con micelio amarillo tenue sin producción de ácido………..…………........................... A.ustus (Bainier) Thom & Church
(A . calidoustus Vargas et al., 2005, es una especie similar que se aisla en clínica y se ha confundido con A.ustus, crece bien en CYA37 entre 20-35mm; reacción de Ehrlich de color violeta, débil a moderado crecimiento en CREA con micelio hialino y sin producción de ácido. Ver la descripción de los 7 integrantes de la

Células Hül le

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sección Usti en Houbraken et al., 2007).

Conidios y conidióforos

- Cabezas conidiales no de color oliva, estipe hialino, amarillo o café pálido células de Hülle ausentes……….......... ........………………….6 6. - Cabezas conidiales en tonos amarillo, biseriadas; estipe rugoso; conidios lisos a finamente rugosos ….......….………….....…….....….7 - Cabezas conidiales en tonos ocráceos, crema o ante; biseriadas; estipe rugoso; conidios lisos a finamente rugosos …………………8 - Cabezas conidiales en tonos amarillo-café o color cobre oliváceo uni y biseriadas; estipe rugoso o liso; conidios rugosos o con tubérculos, pared interna y externa visible o no……......….…...….....…….9 - Cabezas conidiales en amarillo intenso; radiadas que se abren en columnas; colonias en CYA25 30-50 mm, MEA 25 40-60 mm, CYA37 0-25 mm, biseriados, estipe rugoso, abundantes esclerocios amarillos a naranja, conidios globosos a elipsóides, lisos a finamente rugosos 2,5-3(-4) µm …...............….…….......…..A. auricomus (Guegen) Saito - Cabezas conidiales en amarillo pastel intenso, radiadas, que se abren en columnas; colonias en CYA25 45-60 mm, MEA 25 45-56 mm, CYA37 20-30 mm, biseriados, estipe rugoso, abundantes esclerocios blancos a color ante; conidios esféricos, lisos a finamente rugosos 2,53(3,5)µm…….................................................... A. sclerotiorum Huber. - Estipes largos generalmente sobre los 1000 µm en MEA, rugosos, incoloros a amarillentos a café hacia el ápice; colonias en CYA25 3959 mm, MEA 44-55 mm, CYA37 0-35 mm; biseriados, métulas que cubren la vesícula entera; conidios globosos a ampliamente elipsóides lisos a finamente rugosos 2,5-3 (-4,5)µm. Esclerocios cuando están presentes, rosados a púrpura........................ A.ochraceus K.Wil. - Estipes más cortos, generalmente menores de 800 µm en MEA, rugosos, incoloros a amarillentos a café hacia el ápice; colonias en CYA25 3050 mm, MEA 33-60 mm, CYA37 20-37mm; biseriados, métulas que cubren casi la vesícula entera; conidios globosos a ampliamente elipsóides lisos a finamente rugosos 3-3,5 (4) µm. Esclerocios esféricos a elongados, de color amarillo, ante a colores café.......................................................................…. A.melleus Yukawa 9. - Cabezas conidiales radiadas que se separan en columnas, de color bronce a café con la edad; colonias en CYA25 55-70 mm, MEA 65-70 mm, CYA37 40-70 mm; uni o biseriadas; estipe largo 600-1500 o más x 12- 20µm, incoloro, rugoso; métulas o fiálides que cubren la vesícula entera; conidios en cadenas largas que se mantienen unidas, globosos, conspicuamente ornamentados y rugosos con pared externa e interna visible, 5,5- 8 µm..................……... A tamarii Kita
(A.caelatus Horn,1977, tiene un color amarillo más intenso en el reverso en CYA25 que A.tamarii y estipes más cortos en MEA (menores de 1000 µm). A.pseudotamarii Ito, produce aflatoxinas y en CZ 37ºC el diámetro de las colonias son menores de 33 mm, ver Ito et al., 2001).

7.

8.

- Cabezas conidiales radiadas que se separan en columnas, de color amarillo grisáceo a oliva café, biseriadas; diámetro de las colonias en CYA25 25-35 mm, MEA 25-35(40) mm, no crece en CYA37 ; estipe largo generalmente sobre los 1000 µm (hasta 3000) x 12- 25µm, incoloro, de pared lisa o a veces ligeramente rugosa hacia el ápice. Conidios

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

globosos, subglobosos a elipsóides, lisos a rugosos, con crestas, 45 (-6) µm, sin una doble pared visible.................... A.wentii Wehmer 10. - Colonias verde oscuro,crecimiento en CYA25 40-60 mm, MEA 53-65 mm,CYA37, de 50 mm o más; conidióforos cortos, café, biseriados con métulas que cubren la mitad superior de la vesícula; conidios esféricos, lisos a finamente rugosos 3-4 µm. Cleistotecios de Emericella a menudo presentes, globosos, de paredes de color rojo oscuras al madurar, recubiertas de células de Hülle de color amarillo a ante. Ascosporas (maduran a las 2 semanas), redondas a lenticulares en vista lateral, rojo púrpura, lisas, 4-6 x 3-4 µm con 2 rebordes finos longitudinales de cerca de 1 µm en vista lateral Emericella nidulans (Eidam) Vuill., anamorfo A. nidulans (Eidam) G.Winter
(La especie relacionada Emericella quadrilineata se diferencia sólo por tener ascosporas lisas con 4 rebordes longitudinales, mientras E. rugulosa, presenta ascosporas ampliamete lenticulares 5-6,5 x 3-4,5 µm, de paredes generalmente rugosas, pero a veces lisas en algunos aislamientos, con 2 rebordes finos longitudinales y crece más lentamente en CYA25 10-17 (33)mm y MEA25 12-20 (-42) mm,que las 2 anteriores.Ver Klich, 2002).

Células Hülle

- Colonias verde oscuro a gris verdoso amarillento, cleistotecios ausentes o presentes (excluyendo Emericella) ......................….........……… 11 11. - Colonias restringidas en CYA y MEA25 entre 15-25 mm, CYA20S 1430 y CYA37 0-17mm, cleistotecios presentes o ausentes.................…12 - Colonias muy restringidas en CYA y MEA25 (<15mm o < de 10 mm en 7 días), que crecen más rápido en CYA20S a los 7- 14 días, no crecen a 37ºC ; cleistotecios ausentes .......................................... ..…….…13 - Colonias no restringidas, mayores de 30 mm en CYA y MEA, cleistotecios ausentes ...................................................................... 15

Asco y ascosporas

12

- Colonias de color verde oscuro con tonos amarillentos variables, Células cabezas biseriadas, radiadas, estipe incoloro, amarillento a café claro; Hülle métulas que cubren la mitad superior hasta los 2/3 de la vesícula; conidios globosos a subglobosos, finamente a conspicuamente rugosos 2-3,5 (4,5) µm, células Hülle raramente presentes, cleistotecios ausentes............................. .A. versicolor (Vuill.) Tiraboschi - Colonias de color gris verdoso a verde oscuro, de crecimiento más rápido, generalmente > de 15mm en CYA y MEA25, gris verdosas a verde oscuro, cabezas conidiales uniseriadas estrictas, cleistotecios amarillos presentes, con ascos evanescentes de 8 ascosporas; células de Hülle ausentes ...................................................................14

13. - Colonias en colores pálidos, gris verdosas, cabezas radiadas al inicio, después variables; crecimiento en CYA y MEA25 raramente exceden los 8 mm, estipe incoloro, liso, vesículas uniseriadas subglobosas a espatuladas 9-25 µm; conidios semiesféricos a elipsoides, finamente a francamente rugosos, los conidios elipsoides miden 3-5,5(6) x 3-4 µm, los esféricos 3-5 µm.................................. A. penicillioides Speg. - Colonias grises a verde oscuro; cabezas conidiales columnares; crecimiento en CYA y MEA 25, raramente exceden los 13mm; estipe liso o finamente rugoso, incoloro con vesículas uniseriadas; fiálides que cubren solo la parte superior de la vesícula, conidios cilíndricos cuando nacen, posteriormente elipsoidales a piriformes, generalmente rugosos 4-7 x 3-4 (-5,5) µm. …........................….. A . restrictus G..Smith
(A. penicillioides y A. restrictus se aislan y cultivan mejor en medios de baja actividad de agua (DG18 , CYA20S, MA20-40G), permitiendo una mejor identificación).

Conidios y conidióforos

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14.

- Cleistotecios amarillos de Eurotium con una sola capa de células angulares parenquimatosas, rodeados de hifas,especialmente en cultivos viejos y en CYA20S con diámetros de 30-45 (60) mm (como mínimo el doble que en CYA y MEA25), no crece a 37ºC; ascosporas que maduran en 14 días, lenticulares, lisas, a menudo con un surco central, 5-6,5 x 3-5 µm. Cabezas conidiales radiadas, estipe incoloro, de pared lisa o rugosa, fiálides que cubren las 3/4 partes de la vesícula; conidios espinosos, variables en tamaño, esféricos, elipsoides, o apiculados, finamente rugosos a espinosos, 5-8 (11) x 5-7µm ..............…Eurotium herbariorum Link,(anamorfo A.glaucus Link)
(E. repens y E. rubrum son 2 especies estrechamente relacionadas con E. herbariorum. La primera difiere por la formación de ascosporas sin surcos distintivos, mientras E. rubrum tiene surcos más notorios y sus hifas adquieren colores ladrillo a rojo con la edad. Domsch et al.,1980, consideran a estas 2 especies como sinónimos de E. herbariorum).

Asco y ascosporas

Pared del ascoma

- Cleistotecios amarillos de Eurotium con una sola capa de células angulares parenquimatosas, rodeados de hifas, especialmente en cultivos viejos en CYA20S, con diámetros de 34-60 mm (como mínimo el doble que en CYA y MEA25); ascosporas incoloras, de paredes rugosas que maduran en 14 y 21 días, lenticulares, con un surco central y 2 rebordes longitudinales, 4,5-6, x 3,5-4 µm. Cabezas conidiales radiadas a columnares, estipe incoloro a levemente café, liso, fiálides que cubren los 2/3 de la vesícula; conidios, esféricos a subglobosos, finamente rugosos a espinosos 4-5 (-7) µm ….Eurotium amstelodami Mangin (anamorfo A. vitis Novobr.) - Cleistotecios amarillos de Eurotium con una sola capa de células angulares parenquimatosas, rodeados de hifas, especialmente en cultivos viejos en CYA20S, con diámetros de 45-68 mm (como mínimo el doble que en CYA y MEA25); ascosporas incoloras, lisas, que maduran en 7-14 días, lenticulares, con 2 rebordes longitudinales salientes en forma de polea, 4,5-5,5 (7) x 3,5-4 µm. Cabezas conidiales radiadas, estipe incoloro a cafesoso, liso; fiálides que cubren los 2/3 de la vesícula; conidios, variables en tamaño, desde globosos, ovoides a piriformes, finamente rugosos a espinosos, 4-5 (-7) x 3-4µm ................... ..........Eurotium chevalieri L.Mangin (anamorfo: A. chevalieri Ibid.) 15. - Cabezas conidiales amarillo-verde a amarillo o verde oscuro.....…. 16 - Cabezas conidiales azules a azul verdoso oscuro a grisáceo............ 20 - Cabezas conidiales uni o biseradas, conidios lisos a finamente rugosos ...........................................................................................……17 - Cabeza conidiales predominantemente uniseriadas, conidios conspicuamente rugosos ……...................………….........………………….18 - Cabezas conidiales radiadas a columnares; que permanecen de color oliva verde a verde amarillento en el tiempo en CYA25; diámetro de las colonias en todos los medios y temperaturas mayores de 50 mm; estipe rugoso, incoloro, a veces en tonos café pálidos; vesículas biseriadas generalmente en un 20%, pero variable; en MEA a veces, enteramente uniseriadas; métulas/fiálides que cubren los ¾ de la vesícula; conidios globosos a elipsoides 3- 6 (-8) µm. Esclerocios generalmente presentes, redondos de colores café, violeta a negros ….........................................................................................A. flavus Link
(Las poblaciones de A flavus, presentan a menudo aislamientos con 2 tipos de tamaño de esclerocios, unas llamadas cepas L superiores a 400µm y otras llamadas cepas S inferiores a los 400 µm, estas últimas producen

Ascos y ascosporas

Pared del Asco ma Asco y ascosporas

16.

17.

Conidios y conidióforos

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

gran cantidad de aflatoxinas B. Las especies relacionadas como A.nomius, se distingue de A.flavus por producir aflatoxinas B, G y producir esclerocios alargados, mientras la rara especie A.bombycis crece lentamente en CYA37 (0-37 mm en 7 días) y presenta un estipe liso). - Cabezas conidiales radiadas a laxamente columnares, de color gris

amarillento que se tornan oliva café con el tiempo en CYA25;características de crecimiento similares a A.flavus, estipe rugoso, incoloro, vesículas predominantemente uniseriadas, pero a veces lo contrario (biseriadas); métulas/fiálides que cubren la mitad o más de la vesícula; conidios globosos a elipsoides 4-8,5 (-10) µm ................. ......................................................................A.oryzae (Ahlburg) Cohn.
(Se considera actualmente a A. oryzae no como una especie diferente, sino un ecotipo diferente de A.flavus).

18.

- Conidios globosos, usualmente entre 3,5-6 µm en diámetro (rugosos); colonias que mantienen un color amarillo verdoso oscuro o tonalidades verdes en el tiempo en CIA25; cabezas conidiales usualmente radiadas; estipe incoloro, finamente a muy rugoso………............. …….................................................................…A.parasiticus Speare - Conidios globosos, usualmente 5-8 µm en diámetro, colonias usualmente de color bronce a café en el tiempo en CYA 25......…. 19 - Cabezas conidiales radiadas a laxamente columnares, de color oliva a café en CYA25, predominantemente uniseriadas; estipe incoloro liso a rugoso; fiálides/métulas que cubren la mitad de la vesícula; conidios de paredes finas, rugosas pero sin tubérculos sobresalientes, de colores oscuros 5,5-7 µm ......... A. sojae Sakaguchi & Yamada ex Murak
(Esta especie se aísla prácticamente sólo de las fermentaciones del koji).

19.

Sin dibujo

- Cabezas conidiales radiadas que se abren en cortas columnas de color café verdoso intenso o amarillo café en CYA25, uni y biseriadas, con estipe rugoso incoloro; fiálides/métulas que cubren usualmente la vesícula entera; conidios rugosos, de paredes gruesas, con las 2 paredes visibles, ornamentados con tubérculos de colores oscuros, 5,5-8 µm …....…...................…….................................… A.tamarii Kita 20. - Colonias de crecimiento reducido en CYA37 (2-10) mm; cabezas conidiales radiadas predominantemente biseriadas, de un color azul verdoso, a turquesa; en CYA25 semejante a colonias de Penicillium; colonias menores de 35 mm en CYA25 y CYA20S; estipe incoloro a café pálido (menores de 500 µm de largo); en el micelio aéreo se presentan cabezas conidiales pequeñas, semejando penicillios; conidios esféricos rugosos a espinosos, 3-4 (4,5) µm…..................................….. ............................................A. sydowii (Bain. & Sart.) Tom & Church - Colonias de regular crecimiento en CYA37, menores de 30 mm; cabezas conidiales radiadas a clavadas, que se abren en columnas con la edad; estrictamente monoseriadas; colonias en CYA25 y CYA20S mayores de 35mm; estipes largos y anchos (con promedios mayores de 1000 x 10-30µm), de paredes lisas, incoloros a levemente café cerca del ápice; vesículas típicamente espatuladas con áreas fértiles de hasta 250 µm de largo; conidios lisos, mayoritariamente elipsoidales, a veces apiculados a cilíndricos, 3-6 x 2,5-4 µm .….. A.clavatus Desm.
(A.giganteus Wemer, tiene mayor crecimiento en MEA25 (43-65 mm), estipe de 2 tipos, 2-3 (-4) mm o varios cent. Vesículas más anchas, de 2 tipos; en conidióforos cortos 30-50µm y en largos de 120-180 µm. Para una revisión taxonómica de la sección Clavati ver Vargas et al, 2007b)

- Colonias de gran crecimiento en CYA37, mayores de 55 mm de diámetro….............................................................................................. 21

Conidios y conidiófo ros

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21.

- Cleistotecios presentes, tomentosos, hialinos a crema, con ascosporas hialinas, lenticulares a esféricas con borde sobresaliente 5-8 x 4-5 µm. Anamorfo semejante a A.fumigatus presente, con cabezas columnares, vesículas piriformes, monoseriadas; conidios esféricos a elipsoidales, lisos a finamente rugosos, 2,5-3,5 x 2-3 µm ….…… ............................. Neosartorya fischeri* (Wehmer) Malloch & Cain (anamorfo A . fischerianus Samson & W.Gams)
(Ver diferencias con otras especies del género en Clave Nº2)

Asco y ascosporas

Conidióforo y conidios

- Cleistotecios ausentes; cabezas conidiales columnares, con vesículas ampliamente clavadas, estipe incoloro a gris cerca del ápice; vesículas uniseriadas con fiálides que cubren la mitad o la tercera parte de la Ascospora vesícula, dispuestas en forma paralela con el eje del estipe; conidios al SEM globosos a ampliamente elipsoides, lisos a finamente rugosos o espinosos 2-3 µm en diámetro ........................ A. fumigatus Fresen.
(Es una de las especies de gran distribución en una amplia variedad de substratos y ambientes; es el más común oportunista patógeno en humanos y otros mamíferos, ver clave Nº2 para diferenciarla de otras especies semejantes del subgénero Fumigati).

Asc omata

Clave Nº2 morfofisiológica (tentativa) para la determinación de las especies del subgénero Fumigati con y sin producción de cleistotecios en cultivos (7 días de incubación).
(Para una descripción completa (polifásica) de las especies de importancia ya sea ecológica como clínica, debe consultarse Hong et al., 2005; Balajee et al., 2007 y Samson et al., 2007) 1. - Ausencia de cleistotecios en cultivos ……....................….……………2 - Presencia de cleistotecios en cultivos ........ ............................…...…. 12 - Conidios en MEA verde grises a azul verdosos, dispuestos en columnas…................................................................................................ 3 - Conidios en MEA rosados a púrpura rojo en masa, dispuestos en columnas cortas, crecimiento en CYA37 16-19 µm (máximo 42ºC); vesículas pequeñas en forma de pera y dispuestas en ángulo recto (al igual que A.viridinutans y A.duricaulis) 10-18 µm de ancho, conidios globosos, espinulosos 2,8-3,5µm ........................... Aspergillus brevipes Smith
(Se ha aislado en Australia y se asemeja a A. duricaulis)

2.

3.

- Cabezas conidiales predominantemente clavadas, colonias en CYA37ºC menores que 30 mm….. Vea Aspergillus clavatus Desm.(clave anterior) - Cabezas conidiales predominantemente piriformes, espatuladas, subglobosas a globosas; colonias en CYA 37ºC mayores o menores de 55 mm ......................................................................……………….………..….. 4 - Colonias que crecen a 50ºC …............................…….…..………….… 5 - Colonias que no crecen a 50ºC………….... ..............……..………………6 - Colonias en CYA37 60-75 mm; crecimiento a 50ºC pero no a 10ºC; cabeza conidial columnar, estipe 50-350 x 3,5-10 µm (generalmente entre 6-10 µm de ancho); vesícula piriforme a subclavada 10-26µm; conidios 2-3,5µm, globosos a elipsoides, lisos a finamente rugosos (Es la especie más patogénica en humanos) .....Aspergillus fumigatus Fresenius
(Especies similares: A. fumigatiaffinis, A. fumisinnematus, A. lentulus, A. novofumigatus, A. viridinutans).
Conidios y conidióforos

4.

5.

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

- Colonias en CYA37 50-70 µm o más; crecimiento a 50ºC y a 10ºC; cabeza conidial columnar corta, estipe 80-100 x 4-7 µm, vesícula globosa o en forma de matraz, 15-25 µm de ancho; fiálides que cubren los ¾ de la vesícula, conidios 2,5-3µm subglobosos, lisos (aislado en Corea del Sur) .…….....………….....…… Aspergillus turcosus Hong, Frisvald & Samson 6. - Colonias que crecen hasta 45ºC, crecimiento a 10ºC negativo o positivo ………….…........................................................................................................ 7 - Colonias que crecen hasta los 42ºC ……........….…. .......................….….. 10 - Crecimiento negativo a 10ºC; presencia de sinnema en el tiempo e hifas funiculosas aéreas; crecimiento en CYA 37 57-61 mm; estipe hasta 210 x 68,5 (-10) µm; vesícula hemiesférica 16-20 (-25) µm; conidios ampliamente elipsoidales, verruculosos, 2,8-2,3 x 2,4-2,8 µm (patogénico en humanos) ..............................................………Aspergillus fumisynnematus Horie et al.
(Distribución: Brasil, Venezuela, España. Especies similares: A. fumigatiaffinis, A. fumigatus, A. lentulus, A. novofumigatus)

7.

- Crecimiento positivo a 10ºC, ausencia de sinnema e hifas funiculosas en el tiempo ......................... .............................................................................….8 8. - Crecimiento lento en CREA (ver Tabla 3*), sin producción de ácido ......... 9 - Crecimiento lento en CREA con producción de ácido (las demás especies integrantes de la clave no producen ácido en CREA, salvo A.fumigatus, que a veces puede presentar una débil producción); crecimiento positivo a 10ºC; crecimiento en CYA37 65-70 mm; estipe, 6-8 µm diam.; vesículas globosas a subglobosas 18-24 µm; conidios 2-3µm globosos a subglobosos, lisos .…....... Aspergillus fumigatiaffinis Hong, Frisval & Samson
(Distribución: USA, España. Especies similares: A. fumigatus, A. lentulus, A. novofumigatus).

9.

- Crecimiento positivo a 10ºC; conidiación pobre pero abundante en algunos aislamientos; crecimiento en CYA37 54-70 mm, estipe 20-500 x 4-6 (-7) µm, a veces sinuoso y constreñido; vesícula 10-25 µm, globosa a piriforme, usualmente subglobosa; conidios globosos a ampliamente elipsoidales, lisos a finamente rugosos 2-3,2 µm (patogénico en humanos).................. ...………………………………..……. Aspergillus lentulus Balajee & Marr
(Distribución cosmopolita. Especies similares: A. fumigatiaffinis, A.fumigatus, A. fumisinnematus, A. novofumigatus, A. viridinutans).

- Crecimiento positivo a 10ºC; crecimiento en CYA37 49-52 mm; estipe 50500 x 4-7 mm, vesícula subglobosa a forma de matraz, relativamente ancha (13) 15-30 µm, Conidios 2,5-3 µm, elipsoidales, lisos………............................... ............................. Aspergillus novofumigatus Hong, Frisvald & Samson
(Se ha aislado solamente en las islas Galápagos y en Ecuador. Especies similares: A. fumigatiaffinis, A. fumigatus, A. fumisinnematus, A. lentulus )

10.

- Crecimiento en MEA 25, menor de 30 mm en 7 días ............................……11 - Crecimiento en MEA25 mayor que 30 mm en 14 días (60-70 mm); estipe corto 50-30 x 1,2-2,2 µm; vesículas pequeñas 4-8,5 µm; irregularmente globosas; conidios globosos, finamente rugosos 2,5-3,5 µm (Características distintivas: crecimiento lento, reverso negruzco en CYA y fiálides en racimo en un lado de la vesícula)…..…….…… Aspergillus unilateralis Thrower
(Distribución: Australia)

Conidios y conidióforos 61

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11.

- Crecimiento en MEA25 11-14 mm; estipe 20-35x 3,3-4,4 µm; vesícula subglobosa a forma de matraz, 7,5-12, que se desvía en ángulo recto; conidios globosos, finamente rugosos, 2-2,6µm....Aspergillus viridinutans Ducker & Thrower (patógeno en humanos).
(Distribución: Australia, Sri Lanka, Zambia, Rusia, Chile)

- Crecimiento en MEA25 20-22 mm; estipe 5-50 x 3,5-5,5 µm ; vesículas en forma de matraz 7-14 µm; conidios (2,8)3-3,2 (-3,3) µm, globosos, equinulados.........……..………. Aspergillus duricaulis Raper & Fennel
(Distribución: Argentina. Especie similar: A.brevipes)

12.

- Colonias en CYA25 mayores de 40 mm …… ..................................……….13 - Colonias en CYA25 menores de 40 mm …………………........…..…......…..15 a

13.

- Ascosporas lenticulares, con un patrón reticulado de crestas irregulares 7-8 x 3-4 µm; conidios subglobosos a elipsoides, finamente rugosos, 22,5 o hasta 3µm, cuando globosos. Colonias en CYA25 45-68 mm ........... b ...……...….. Neosartorya fischeri (Wehmer) Malloch & Cain (anamorfo: Aspergillus fischeranus Samson & W.Gams)
(Especie cosmopolita, patógena en el hombre y otros mamíferos. Especie similar: N.tatenoi) (Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vistas al SEM, c.Ascomata en cultivo, d. Conidióforo y conidios)

d

c a c

- Ascosporas lenticulares espinosas, verrucosas o tuberculadas …..… 14 14. - Colonias en CYA25 60-70 mm.Ascosporas sin un patrón reticulado de crestas irregulares, la ornamentación superficial corresponde a colgajos triangulares de tejido; conidios globosos a subglobosos lisos, 3-4 µm ......... ….........…Neosartorya pseudofischeri Peterson (anamorfo Aspergillus thermomutatus (Paden) Peterson. (Especie aparentemente cosmopolita, patógena en humanos) (Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vista al SEM, c. Conidióforo y conidios)

b

a b c

- Colonias en CYA25 41-70 mm. Ascosporas lenticulares, 4,5 µm, espinosas, con espinas de varios tamaños (<0,5 hasta 7 µm) o con proyecciones en la parte convexa, con 2 crestas ecuatoriales separadas y anchas; conidios globosos, finamente rugosos, 2-2,5 µm ……Neosartorya spinosa (Raper & Fennell) Kozakiewicz (anamorfo: Aspergillus spinosus Kozakiewicz)
(Aparentemente cosmopolita. Leyenda: a. Asco y ascosporas, b.Ascospora vista al SEM, c. Conidióforo y conidios)

15.

- Colonias en CYA25 12-14 mm, en CYA37 27-30 mm. Ascosporas lenticulares, finamente reticuladas 4,5-5 µm, con 2 crestas ecuatoriales poco separadas; conidios pequeños, globosos a subglobosos 2-2,5 µm, lisos a finamente rugosos ….......... Neosartorya hiratsukae Tsubouchi & Horié (anamorfo: A. hiratsukae Tsubouchi & Horié).(Distribución, Japón, Brasil,Corea del Sur. Especies similares: N. fischeri, N. tatenoi )
(Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vista al SEM, c. Conidióforo y conidios)

a

c

b

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

- Colonias en CYA25 33-36 mm, en CYA37 61-65 mm. Ascosporas lenticulares de superficie tuberculada, con 2 crestas ecuatoriales a menudo irregulares 5-5,5 x 4-5 µm; conidios subglobosos a ampliamente elipsoides, lisos 2,63,2 x 2,4-2,6 µm…. …….Neosartorya udagawae Horie, Miyaji & Nishim. (anamorfo: Aspergillus udagawae Horie, Miyaji & Nishim.)
(Distribución: Brasil USA, España, Japón.Especies similares: N. aureolata, A. viridinutans)

a c b

(Las especies de Neosartorya son más de 20, sólo se presentan en las claves las más comunes en distribución y las 5 encontradas como patógenas oportunistas en el hombre. Para la descripción de todas las especies ver Samson et al., 2007)
(Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vista al SEM, c. Conidióforo y conidios)

Tabla 3. Algunas características morfofisiológicas de utilidad para las diferentes especies de Aspergillus de la sección Nigri. Modificado de Samson et al., 2007. (Los datos de secuencias del gene calmodulina permiten distinguir todas las especies de la sección)

Especies Uniseriadas
A. aculeatinus A. aculeatus A. japonicus A. uvarum

Conidios µm

Superficie

Vesícula µm

Temp. maxºC

CREA* Reacción de prod.ac. Ehrlich crecimiento* 3 2 3 1 -3 -3 -1 -1 -

2,5-4,5 3,5-5 3,5-5 3-4

finam.rugosa finam.rugosa finam. rugosa espinosos

45-80 60-80 20-35 20-30

36 36 36 36

Especies Biseriadas
A. brasiliensis A. carbonarius A. costaricarensis A. ellipticus A. foetidus A. heteromorphus 3,5-4,5 7-9 3,1-4,5 3,5-5-5 3,5-4,5 3,5-5 espinosos espinosos finam. rugosa lisos-finam.rug. lisos-finam.rug. espinosos espinosos finam.espinosa lisos finam.rugosa finam.rugosa finam.espinosa finam.rugosa finam.espinosa lisos 30-45 40-80 40-90 75-100 50-80 15-30 50-65 50-60 40-65 45-80 40-55 45-90 30-50 40-80 25-35 40 36 40 30 40 33 36 40 40 40 40 33 36 40 40 4 3 5 2 4 2 2 3 3 5 5 0 4 1 5 -4 -3 -5 -2 -4 -2 -2 -3 -1 -5 -5 -0 -2 -1 -5 ++ amarillo ++++ azul ++ amarillo ++++ amarillo con halo púrpura idem anterior ++ amarillo ++ amarillo + violeta,esclerocios -

A. homomorphus 5-7 A. ibericus 5-7 A. lacticoffeatus 3,4-4,1 A. niger 3,5-5 A. piperis 2,8-3,6 A.sclerotiicarbonarius 4,8-9,5 A. sclerotioniger 4,5-6-4 A. tubingensis 3-5 A. vadensis 3-4

* El médio de cultivo agar creatina sucrosa (CREA) permite ver el crecimiento y la producción de ácido (es de color violeta púrpura y cambia al amarillo con la producción de ácido). Los números del 1 al 5 en forma gradual, indican el tamaño del halo o de la colonia, siendo el 1 el más pequeño; el cero indica que no hay crecimiento. La composición del medio es: Creatina (1H2O) 3 g; Sucrosa 30 g; KCL 0,5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; FeSO4.7H2O 0,01g; K2HPO4.3H2O 1,3 hasta 1,6 g; Púrpura de bromocresol 0,05 g; agar 15 g; Agua destilada 1000 mL. pH.final 8 ± 0,2, ajustarlo después de autoclavarlo.

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REFERENCIAS
Abliz, P.; Horie,Y.; Hui, Y.; Nishimura, K.; Li, R. (2001). New and interesting species of Eurotium from Chinese soil. Mycoscience 42: 289-294 Al-Musallan, A.(1980). A revision of the black Aspergillus species. Ph.D Thesis. Utrecht, Nederlands, Univ. Utrecht. . Balajee, S.A.; Gribskov, J.L.; Hanley, E.; Nickle, D.; Marr, K.A. (2005). Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryotic Cell 4:625-632 Balajee, S.A.; Nickle, Varga, J & Mar r, K.A (2 006 ). Molecular studies reveal frequent misidentification of Aspergillus fumigatus by morphotyping. Eukaryotic Cell 5:1705-1712 Balajee, S.A.; Houbraken, J.; Verweij, P.E.; Hong, S-B.; Varga, J.; Samson, R.A. (2007). Aspergillus species identification in the clinical setting. Studies in Mycology 59:39-46 Bennett, J.W.& Klic h, M.A. (2 003). Mycotoxins. Clinical Microbiology Review 16:497-516 Chu, K.H.; Li, C.P. & Qi, J. (2 006 ). Ribosoma l RNA as molecula r barcodes: a simple correla tion analysis without sequence alignment. Bioinformatics 22:1690-1701 Christense n, M.(198 1).A synoptic k ey and evalu ation of species in the Aspergillus flavus grup. Mycologia 73:1056-1084 Christensen, M.(1982). The Aspergillus ochraceous grup.:two new specie from western soils and synoptic key. Mycologia 74:210-225 De- Wei Li & Zhao, G. (2007). Goidanichiella cylindrospora sp. nov. from Connecticut USA. Mycotaxon 101:41-45 Dyer, P.S.& Paoletti, M. (2005). Reproduction in Aspergillus fumigatus: sexuality in a supposedly asexual species? Medical Mycology 43:S7-S14 Frisvald, J.C.& Thrane, U. (1993). Liquid Chromatography of mycotoxins. Journal Chromoatography Library 54:253-372 Frisvad, J.C.; Frank, J.M.; Houbraken, J.A.M.P.; Kuijpers, A.F.A.; Samson, R.A. (2004). New ochratoxin A producing species of Aspergillus section Cirumdati. Studies in Mycology 50 :2 3-43 Fr isvad, J.C.; Skouboe, P.& Samso n, R.A. (2005 ). Taxonomic comparison of three different groups of aflatoxin produ cers a nd a new efficient producer of Afla toxin B, strigmatocistin and 2-O mathylsterigmatocystin. Aspergillus rambelli sp. Nov. Systematic and Applied Microbiology 28:44245 3 Frisvad, J.C. & Samson, R.A. (2000). Neopetromyces gen. nov. and an overview of teleomorphs of Aspergillus subgenus Circumdati. Studies in Mycology 45:201-07 Frisvald, J.C.;Anderson, B.& Thrane, U. (2007). The use of secondary meta bolite profiling in chemotaxonomy of filamentous fungi. Mycological Reserch DOI 10/1016/j. mycres 0 8.01 8 Gams, W.; Christe nse n, M.; Onions, A.H.; Pitt, J.I.; Samson, R.A. (1985). Infrageneric taxa of Aspergillus. In: Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics. Samson RA, Pitt JI, eds.. New York: Plenum Press. pp. 55-62 Geiser, D.M. (2004). Practical molecular taxonomy of fungi. In: Advances in Fungal Biotechnology for Industry, Medicine and Agriculture. Lange, L. & Tkacz, J. eds.New York: Kluwer Academic Publishers. pp. 1-12 Hamari, Z.; Kevei, F.; Kovács, E.; Varga, J.; Kozakiewicz, Z.; Croft, J.H. (19 97). Molecular and phenotypic chara cterization of Aspergillus ja ponicus and Asperg illus aculeatus strain with special regard to their mitocondrial DNA polymorphisms. Antonie Van. Leeuwenhoek. 72:337-347 Hong, S-B.; Go, S-J.; Shin, H-D.; Frisvad.; J.C.; Samson, R,A. (2005). Polyhphasic taxonomy of Aspergillus fumigatus and related species. Mycologia 97:1316-1329 . Hong, S-B.; Cho, H-S.; Shin, H-D.; Frisvad, J.C.; Samson, R,A. (2006). Novel Neosartorya species isolated from soil in Korea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56:477-486 Hong,S-B.; Shin, H-D.; Hong, J-B.; Frisvad, J.C.; Nielsen, P.V.; Varga, J.; Samson, RA (2007).New taxa of Neosartorya and Aspergillus in Aspergillus section Fumigati.Antonie van Leeuwenhoek 93:87-98 Houbraken, J.; Varga, J.; Due, M.; Frisvad, J.C.; Samson, R.A. (2007). Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Usti. Studies in Mycology 59:107-128 Horn, B,W. (1997). Aspergillus caelatus a new species in section Flavi, Mycotaxon 61:185-191 Ito , Y.; Peter son, S.W.; Wicklow, DT.& Goto, T. (20 01). Aspergillus pseudotamarii, a new aflatoxin producing species in Aspergillus section Flavi. Mycological Research 105:233-239 Kevei, F.; Hamari, Z.; Varga, J.; Kozakiewicz, Z.; Croft, J.H. (1996). Molecular polymorphism and phenotypic variation in Aspergillus carbonarius. Antonie Van Leeuwenhoek 70:5966 Klich, M. (2002). Identification of common Aspergillus species CBS Biodiversity Series, Utrecht. Kozakievicz, Z. (1989). Aspergillus species in stored products. Mycological Papers 161. Lass-Flö rl, C.; Grif, K.& Kontoyiannis,D.P. (20 07 ). Molecular typing of Aspergillus terreus isolates collected in Houston, Texas, and Insbruck, Austria: Evidence of great genetic Diversity. J.Clin Microbiol. 45:2686-2690 McClenny, N. (2005).Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach. Medical Mycology Supplement 1, 43: S125-S128 Min, X. J. & Hickey, D.A. (20 07). Assessing the effect of varying sequence length on DNA barcoding of fungi. Molecular Ecology Notes 7:365-373 Okuda,T.; Klich, M.A.; Seifert, K.A. & Ando ,K. (20 00). Media and incubation effects on morphpological characteristics of Pe nic illium a nd Aspergillus. In: Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification (Eds. Samson, R.A. & Pitt, J.I.) Harwood Academic Plublishers, U.K. pp.83-99 Paoletti, M.; Rydholm, C.; Schwier, E.U.; Anderson, M.J.;

64

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

Szakács, G.; Lutzoni, F.;Debe aupuis, J .P.; Latg e, J.P.; Denning, D.W. Dyer, P.S. (2005). Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology 15:1242-1248 Perrone, G.; Susca, A.; Cozzi, G.; Ehrich, K.; Varga, J.; Fr isv ad, J.C.; Me ije r, M .; Noo nim, P.; Mahakamchanakul, W.; Samson, R.A. (2007). Biodiversity of Aspergillus species in some important agricultural products. Studies in Mycology 59:53-66 Perrone, G.; Varga, J.; Susca, A.; Frisvad, J.C.; Stea, G.; Ko csubé, S.; Tóth, B.; Kozakiewicz, Z.; Samson, R.A. (2008). Aspergillus uvarum sp. nov., an uniseriate black Aspergillus species isolated from grapes in Europe. International J. of Systematic and Evolutionary Microbiology 58:1032-1039 Pe ter son, S.W. (20 00). Phylogenetic relationships in Aspergillus based on rDNA sequence analysis. In: Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification, Samson RA, Pitt JI, eds. Amsterdam: Harwood Academic Publishers pp.323-356 Peterson, S.W. (2008). Phylogenetic analysis of in Aspergillus species using DNA sequencse from fpur loci. Mycologia 100:20522 6 Pe ter son, S.W.; Ito, Y.; Hor n, B.W.& Goto, T. (20 01 ). Aspergillus bombycis, a new aflatoxigenic species and genetic variation in its sibling species, A. nomius. Mycologia 93:68970 3 Pe ter son, S.W.; Varga, J .; Frisvald, J.C.; Samson, R.A. (2008). Phylogeny and subgeneric taxonomy of Aspergillus: In Varga, J.& Samson, R,A.(eds.. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, The Nederlands. pp.33-56 Pildain, M.B.; Frisvad, J .C.; Vaamo nde, G.; Cabral, D.; Varga, J.; Samson, R.A. (2008). Two new aflatoxin producing Aspergillus species from Argentinean peanuts. International J. of Systematic and Evolutionary Microbiology 58:725-735 Pitt, J.I.; Hocking, A.D. & Glenn, D.R. (1983).An improved medium for the detection of Aspergillus flavus and A.parasiticus. J.Appl.Bact. 54:109-114 Pitt, J.I. & Hocking, A.D.(1997). Fungi and food spoilage. Academic Press 2 nd ed. Pitt. J.I.; Samso n, R.A.& Fr isv ad, J.C. (20 00). List of accepted species and their teleomorphs in the family Trichocomaceae. In: Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus. Samson RA, Pitt JI, eds. Amsterdam: HarwoodAcademic Publishers, pp. 9-47 Powell, K.A.; Renwick, A.& Peberdy. J.F. (eds).(1994) The Genus Aspergillus: From taxonomy and genetics to industrial application, New York, Plenum Press, Pringle, A.; Baker, D.M.; Platt, J.L.; Wares, J.P.; Latge, J.P.; Taylo r, J.W. (200 5). Cryptic specia tion in the cosmopolitan and clonal human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. Evolution 59:1886-1899 Raper, K.B.& Fennell, D.I. (1965). The Genus Aspergillus. Baltimore: Williams & Wilkins. Samson, R.A. (1979). A compilation of the Aspergilli described since1965. Stud. Mycol.18:1-38 Samson, RA. & Gams, W. (1985). Typification of the species

of Asperg illus and a ssociated teleomorphs. In: Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics. Samson, R.A. & Pitt J.I., eds. New York: Plenum Press, pp. 143-154 Samson, R.A. (1992). Current taxonomic schemes of the genus Aspergillus and its teleomorphs. In: Bennett JW, Klich MA (eds).Aspergillus: Biology and Industrial Applications. Boston: Butterworth-Heinemann, pp. 355-390. Samso n, R.A.(199 3). Ta xonomy cu rrent concepts of Aspergillus systematics. In: Smith, J.E. (ed.). Asperg illus Biotechnology Handbooks,vol. 7. New York: Plenum Press, pp. 1 -2 2 Samso n, R.A. (20 00). List of names of Trichocomaceae published between 1992 and 1999. In: Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus. Samson, R.A. & Pitt J.I., eds. Amsterdam: Harwood Academic Publishers, pp. 7 3-79 Samson, R.A. & Pitt, J.I. (eds).(2000). Integration of Modern Ta xonomic Methods for Pe nic illium a nd Asperg illus Classification . Amsterdam:Harwood Academic Publishers. Samson, R.A.; Houbraken, J.A.M.; Kuijpers, A.F.A.; Frank, J.M.; Frisvald, J.C. (2004). New ochratoxin A on sclerotium producing species in Aspergillus section Nigri Studies in Mycology 50 :4 5-51 Samso n, R.A.; Hoe kstra, E. S. & Frisvad, J .C. (2 004 ). Introduction to food-and airborne fu ngi. CBS. Utrecht,T he Netherlands. Samson, R.A.; Hong, S-B.& Frisvad, J.C. (2006). Old and new concepts of species differentiation in Aspergillus. Medical Mycology 44:S133-S148 Samson, R.A.; Hong, S-B.; Peterson, S.W.; Frisvad, J.C.; Varga, J.(2007). Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomoorph Neosartorya. Studies in Mycology 59:147-207 Samso n, R.A.; Noo nim, P.;Me dijer, M.;Ho ubr ake n,J .; Frisvad, J.C.; Varga, J.(2007b). Diagnostic tools to identify black aspergilli. Studies in Mycology 59:129-145 Samson R.A. & Varga. J. (2007). Aspergillus systematics in the genomic era. Studies in Mycology 59:1-206 Seifert, K.A.; Samson, R.A.; Dewaard, J.R.; Houbraken, J.; Leve sque, C.A.; Moncalvo, J.M.; Lo uis-Se ize , G.; Hebert, P.D. (2007). Prospects for fungus identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium as a test case. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104:390139 06 Se púlveda, C. O. & Pio nte lli, E. (200 5). Poblaciones de Aspergillus en semillas de maíz y soja de importación argentina: Enfasis en la sección Flavi. Boletín Micológico 20:41-55 Se rra, R.;Cabanes, F.J.; Perrone , G.; Castella, G.; Venancio, A.; Mule, G.; Kozakiewicz, Z. (2006). Aspergillus ibericus: a new species of section Nigri isolated from grapes. Mycologia 98:295-306 Smedsgaard, J. (1997). Micro-scale extraction procedure for standarized screening of fungal metabolite production in culture. Journal Chromatography A 760:264-270 Takada, M.; Ho rie , Y. & Abliz, P. (20 01). Two new heterothallic Neosartorya from African soil. Mycoscience

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Boletín Micológico Vol. 23 : 49 - 66

2008

42:361-367 Taylo r, J.W.; Jac obson, D.J .; Kro ken, S.; Kasuga, T.; Ge ise r, D.M .; Hibbett, D.S.; Fishe r, M.C. (2000 ). Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi. Fungal Genetics and Biology 31:21-32 Thom, C. & Church, M.B. (1926). The aspergilli. Baltimore: Williams & Wilkins. Thom, C. & Raper, K.B. (1945). Manual of the aspergilli. Baltimore: Williams & Wilkins. Varga, J.; Juhász, A.; Kevei, F. & Kozakievicz, Z. (2004). Molecular diversity of agriculturally importa nt Asp ergillus species. Europ. J. Plant Pthol. 110:627-649 Varga, J.; Tóth, B.; Kocsubé, S.; Farkas ,B.; Szakács,G.; Téren, J.; Kozakiewicz, Z. (2005). Evolutionary relationships among Aspergillus terreus isolates and their relatives. Antonie Van Leeuwenhoek 88:141-150

Varga, J.; Kocsubé, S.; Tóth, B.; Frisvad, J.C.; Perrone, G.; Susca, A.; Meijer, M.; Samson, R.A. (2007). Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57:1925-1932 Varga, J.; Due, M.; Frisvad, J.C.; Samson, R.A. (2007b). Taxonomic revision of Aspergillus section Clavati based on molecular, morphological and physiological data. Studies in Mycology 59:89-106 Varga, J.; Frisvad, J.C.; Samson, R.A. (2007c).Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Candidi based on molecular, morphological and physiological data. Stud.in Mycol. 59:75-88

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AEROMICOTA DE AMBIENTES INTERNOS: COMPARACION DE METODOS DE MUESTREO
(Aeromycota in indoor environment:sampling methods comparison)
Rojas, T.I.(1), Martínez, E.(2), Aira, M.J. (3)& Almaguer, M.(1)
(1) Departamento de Microbiología y Virología. Facultad de Biología. Universidad de La Habana (Cuba) (2)Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal Centro Nacional de Sanidad Vegetal, La Habana (Cuba) (3)Departamento de Botánica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago (España) Palabras clave: Hongos, atmósfera, interiores, muestreo Key words: Fungi, atmosphere, indoor, sampling

RESUMEN
El procedimiento de muestreo utilizado para determinar el grado de contaminación fúngica en ambientes internos, difiere según los autores. Por ello, con el fin de conocer si el método utilizado por nuestro grupo de investigación, es comparable con otras metodologías, se ha realizado un estudio comparativo con varios sistemas de captación de esporas del aire, incluyendo equipos volumétricos (Aeroscope Chirana, System Air Sampler, Burkard Personal Culture) así como el método tradicional por sedimentación. Los resultados obtenidos muestran que apenas existen diferencias cuando se utilizan los sistemas volumétricos, sin embargo, el método por sedimentación ha sido menos eficaz, tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo. Mientras, el método directo por hisopado, resulta un buen complemento para determinar la fuente de contaminación. También se ha determinado la hora del día con mayor carga fúngica, que se localiza al mediodía y tras el análisis de varios medios de cultivo, se concluye que el Agar Glucosa de Sabouraud resulta adecuado para este tipo de investigaciones.

ABSTRACT
The sampling method used to determine the degree of fungal contamination in indoor environment differs, according to some authors. Therefore, with the purpose of knowing if the method used by our research team is comparable to other methodologies, a comparative study with various systems used to capture air spores has been carried out which include volumetric equipment (Aeroscope Chirana, System Air Sampler, Burkard Personal Culture) as well as the traditional method by sedimentation. Results have revealed that there is fairly some difference when volumetric systems are used; as to the sedimentation method, it has proved to be less effective both in the quantitative and qualitative point of view. On the other hand, direct method through sprinkling becomes a suitable tool to establish the source of contamination. Moreover it has been recorded the time of day when the greatest fungal load occurs, this being at noon so after the analysis of several culture media it has been concluded that Sabouraud Agar Glucose is suitable for this kind of research estándares, con el fin de poder relacionar los resultados propios con los obtenidos por otros autores. En aquellos países en los que esta línea de investigación y en general, la aerobiología, está organizada en Redes de trabajo o network, son éstas las encargadas de la publicación de protocolos (Aira et al., 2005; Galán et al., 2007), lo que facilita el desarrollo de una metodología común. Sin embargo, este no siempre es el caso y los investigadores desarrollan su trabajo adaptándose a los medios disponibles, desconociendo si finalmente sus resultados 67

INTRODUCCION
Uno de los aspectos de interés para los investigadores que realizan estudios de aeromicología ambiental, y en concreto en el interior de edificios, es conocer si el procedimiento de trabajo se asemeja a los
Recibido el 20 Octubre 2008 Aceptado el 27 Noviembre 2008

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son comparables a otros, aunque hayan sido realizados en el mismo territorio. Los estudios sobre contaminación fúngica realizados en Cuba, en este tipo de ambientes, son cada vez más numerosos y abarcan una amplia variedad de locales (museos, oficinas, viviendas, etc.), según el objetivo particular de cada estudio (García, 1997; Fernández et al., 1998 ; Aira et al., 2002; Rojas et al., 1993, 2002; Acosta et al., 2003; Borrego et al., 2008). Por el contrario, no son muchos los trabajos que abordan el procedimiento metodológico (Rojas, 1998), por lo que en el presente estudio se incluye un análisis comparativo con diferentes métodos y equipos de muestreo, a diferentes horas del día y con varios medios de cultivo. Para colectar las esporas del ambiente, tradicionalmente se ha usado un método gravimétrico o de sedimentación, exponiendo al aire durante un cierto tiempo una placa de Petri con medio de cultivo, pero hoy en día se prefieren los equipos de captación volumétrica que hay en el mercado, ya que a su sencillo funcionamiento, se une la ventaja de su autonomía y fácil transporte. Así mismo resulta recomendable completar este tipo de estudios con el muestreo directo (por hisopado) ya que permite identificar, con mayor precisión, la fuente de contaminación más próxima. También la hora en que se realiza el muestreo, normalmente se acomoda a las condiciones específicas de cada estudio, sin embargo, consideramos importante determinar cuál es la más adecuada en cada caso, lo cuál estará relacionado con las condiciones climáticas (y microclimáticas) del lugar. En cuanto al medio de cultivo usado en el muestreo no hay un acuerdo unánime entre los distintos autores, por lo que se ha realizado también un estudio comparativo con los más recomendados para este tipo de investigación.

Muestreo en tres 3 2 1

Muestreo en cinco 1 3 4 5 2

Figura 1. Esquema del diseño utilizado en los muestreos contaminación fúngica. Por su parte, para el método gravimétrico se han seguido las recomendaciones de Omeliansky (OME) calculando el número de ufc/m3 según el método descrito en NRP-201 (1987). El diseño experimental para validar el método de muestreo, se enfocó para averiguar preferentemente la eficacia del equipo AERO, por ser el de uso más habitual en nuestro laboratorio. Para ello, se realizaron dos muestreos en dos locales diferentes, combinando el uso de dicho equipo con los demás. En todos los muestreos se siguió un diseño diagonal tomando 3 ó 5 puntos de acuerdo a la superficie de los mismos, según Norma FEDECAI-01 (2007), tal como se señala en la Figura 1, y realizando tres réplicas en cada punto. Además del muestreo ambiental realizado por captación de esporas del ambiente, se han tomado muestras por el método de hisopado (NRP-201, 1987) a los sustratos y/o objetos presentes en el interior de los locales. En ambos casos, y con el fin de valorar las posibles variaciones entre ambos métodos, se procedió al estudio de las colonias, identificando a nivel de género de acuerdo a Barnett & Hunter (1998). Para los géneros más abundantes se siguieron los criterios de identificación de Ellis (1971, 1976), Klich & Pitt (1994), Ho et al. (1999) y Pitt (2000). En cuanto a los medios de cultivo, se han valorado los cuatro siguientes, M1 (Agar Extracto de Malta suplementado con peptona y glucosa (ACGIH, 1989); M2 (Agar Extracto de Malta+7,5% NaCl); M3 (Agar Papa Dextrosa +7,5% NaCl) y M4 (Agar Glucosa de Sabouraud) y el estudio en el tiempo se realizó muestreando cada hora entre las 7 a.m. y las 4 p.m. Los resultados obtenidos se han valorado estadísticamente, aplicando el test de Students, la Prueba de Kruskall-Wallis y/o la prueba de Scheffé del paquete informático StatSoft, Inc. (2001).

MATERIALES Y METODOS
El estudio se llevó a cabo en varios locales (museos, bibliotecas, almacenes) de la ciudad de La Habana (Cuba), sin embargo, ya que no se trata de ofrecer los resultados específicos de los mismos, sino profundizar en los aspectos metodológicos, omitiéndose su descripción por resultar irrelevante para este trabajo. Los equipos de captación volumétrica que se han evaluado, han sido: un Aeroscope Chirana (AERO), un System Air Sampler (SAS) y un Burkard Personal Culture (BPC). Todos ellos permiten la incorporación de una placa de Petri con medio de cultivo y cada fabricante facilita instrucciones precisas, tanto en relación a su correcto manejo, como en la forma de recuento de las colonias y su transformación a unidades formadoras de colonias (ufc/ m3), que ha sido la expresión utilizada para cuantificar la 68

RESULTADOS Y DISCUSION
El sistema AERO se probó frente a los dos sistemas volumétricos (SAS y BPC) y el método gravimétrico (OME) en dos locales diferentes (L1 y L2). Los resultados

Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo - Rojas et al.

muestran que no existen diferencias significativas en cuanto a los niveles de contaminación fúngica, en el primer caso, mientras que al comparar AERO con OME, el sistema volumétrico se muestra mucho más eficaz, ya que recoge prácticamente el doble de unidades formadoras de colonias (Figura 2). Estos resultados coinciden con otros autores que señalan que el método por sedimentación en placas no permite comparar de forma favorable los resultados obtenidos por otros métodos de muestreo (Buttner & Stetzenbach, 1993; Caneva et al., 2004). Los equipos volumétricos SAS y BPC, son utilizados con frecuencia en estudios aerobiológicos (Bellin & Schillinger, 2001; Aira et al., 2007) debido, entre otras ventajas, a su poco peso en comparación con el equipo AERO. Pese a ello, dicho equipo es utilizado de manera frecuente, tanto en ambientes de interior (Blomquist et al., 1984; Klanova, 2000) como de exterior (Medrela- Kuder,
ufc/m 3 2000 1500 1000 500 0

AERO

SAS

a a
L1

a

a
L2

uf/cm 3 2000 1500 1000 500 0

AERO

OME

b
L1

a

b
L2

a

ufc/m 3 2000 1500 1000 500 0

AERO

BPC

a a
L1

a

a
L2

Leyenda.- AERO (Aeroscopio Chirana), SAS (Sistem Air Sampler), BPC (Burkard Personal Culture), OME (Omeliansky), L1 y L2 (locales de muestreo) Figura 2. Valores promedios de ufc/m3 obtenidos en la comparación de diferentes métodos de muestreo (letras no comunes indican diferencias significativas de p<0,05, según test de Students)

2003) y algunos autores le reconocen ciertas ventajas con respecto a otros modelos; a señalar la homogénea distribución de las esporas en la placa (debido a la rotación de ésta bajo la hendidura) y la posibilidad de poder usar diferente volumen de aire dependiendo de la anchura de la rejilla utilizada, lo cual facilita seleccionar la misma de acuerdo a los niveles esperados (Portnoy et al., 2004). Mas recientemente se han desarrollado nuevos modelos, basados en el mismo principio que el equipo AERO (STA-100, 203 y 204, entre otros), los cuales son utilizados con frecuencia en estudios ambientales de edificios, industria farmacéutica, hospitales, laboratorios de cosméticos y de alimentos (Horn, 2005). Para evaluar la eficacia del equipo AERO, esta vez desde el punto de vista cualitativo, se realizó un nuevo muestreo para compararlo con SAS y OME, identificando los aislamientos a nivel de género. Los resultados obtenidos (Figura 3) muestran que los géneros Aspergillus, Cladosporium y Penicillium fueron los más abundantes en cuanto a unidades formadoras de colonias, no presentándose tampoco diferencias significativas entre ambos sistemas volumétricos, pero sí entre el equipo AERO y el método OME, tanto para Aspergillus como para Penicillium. El hecho de que dichas diferencias no afecten al género Cladosporium, lo atribuimos a la dimensión de los conidios que son más grandes que los de Aspergillus y Penicillium y por tanto, tienen un mayor tamaño aerodinámico, ya que de acuerdo con Caneva et al. (2004), la micobiota del aire colectada dependerá, entre otros factores, del tamaño y forma de las partículas, del movimiento del aire circundante, mientras la sedimentación no favorece la representación de hongos con esporas pequeñas. En el mismo sentido, Pasanen et al. (1991), señalan que en la depositación de las esporas hay que tener en cuenta el tamaño aerodinámico, que aumentará con el incremento de la humedad relativa del aire, el que favorecerá la rápida caída de las partículas de mayor tamaño. Por lo tanto, teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el Aeroscope Chirana, coincidimos con lo señalado por Burge & Solomon (1987) en que este método es eficiente en la colecta de microorganismos ambientales. Al representar las especies más abundantes en los locales muestreados, a partir de las esporas del ambiente (con el equipo AERO) o de las recogidas por hisopado (Tabla 1), se observan diferencias considerables, tanto en el número de especies identificadas (28 ambiente vs. 22 por hisopado) como en su frecuencia relativa. Así especies como Aspergillus flavus, A.niger, Cladosporium cladosporioides, C. sphaerospermum y Penicillium citrinum, son ubicuas en todos los locales muestreados mientras en las muestras de hisopado su frecuencia relativa oscila 69

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Figura 3. Valores promedios de ufc/m3 de los géneros identificados con diferentes métodos de muestreo (letras no comunes indican diferencias significativas de p<0,05, según Prueba de Kruskall-Wallis para Cladosporium y prueba de Scheffé para Aspergillus y Penicillium entre un 17-50%. Por su parte, Aspergillus tamarii y Cladosporium herbarum tienen una mayor presencia en los sustratos muestreados que en el aire. Estos resultados pueden ser útiles para localizar la fuente de contaminación del local y valorar la influencia del aporte del aire exterior en aquellos que tengan comunicación con el exterior. La evaluación del medio de cultivo también se realizó desde un doble punto de vista, cuantitativo y cualitativo. En el primer aspecto, se observa que el medio M2 logró la mayor eficiencia aunque no muestra diferencia significativa desde el punto de vista estadístico con M3, pero sí con M1 y M4. El medio M3 no difiere con ninguno de los medios evaluados (Figura 4). Se debe señalar que M1 es el medio recomendado para este tipo de estudios según la ACGIH (1989), el cual presentó los valores más bajos de recuperación y ninguna diferencia significativa desde el punto de vista estadístico con M4. Para evaluar los resultados desde el punto de vista cualitativo, se identificaron los aislamientos realizados a nivel de género. En la Figura 5 se observa que
ufc/m 3 440 330 220 110 0 M1 M2 M3 M4

los géneros Aspergillus, Penicillium y Cladosporium fueron los más abundantes, independientemente del medio

a b

ab b

M1 (agar extracto de malta suplementado con peptona y glucosa), M2 (agar extracto de malta+7.5% NaCl), M3 (agar papa dextrosa+7.5% NaCl), M4 (agar glucosa de Sabouraud) Figura 4. Valores promedios de ufc/m3 obtenidas con Aeroscope Chirana en diferentes medios de cultivos (letras no comunes indican diferencias significativas, según Prueba de Scheffé para p<0,05) 70

Tabla 1. Comparación de la frecuencia relativa (F.R.%) de las especies identificadas en el ambiente y en los sustratos AERO Hisopado (F.R. %) (F.R%) 11 8 Aspergillus caespitosus 33 16 Aspergillus candidus 33 16 Aspergillus clavatus 100 50 Aspergillus flavus 55 25 Aspergillus fumigatus 100 42 Aspergillus niger 11 -Aspergillus ochraceus 44 25 Aspergillus oryzae 11 -Aspergillus parasiticus 11 -Aspergillus puniceus 22 -Aspergillus scleriotorum 33 25 Aspergillus sydowii 22 42 Aspergillus tamarii 67 33 Aspergillus terreus 22 -Aspergillus ustus 22 -Aspergillus wentii 55 25 Aspergillus versicolor 100 42 Cladosporium cladosporioides 14 17 Cladosporium herbarum 71 33 Cladosporium oxysporum 100 17 Cladosporium sphaerospermum 86 50 Penicillium chrysogenum 100 17 Penicillium citrinum 29 17 Penicillium corylophylum 71 33 Penicillium glabrum 14 8 Penicillium janthinellum 71 8 Penicillium purpurogenum 71 8 Penicillium simplicissimun

Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo - Rojas et al.

ufc/m 3 200 150 100 50 0 Aspergillus Cladosporium

M1

M2

M3

M4

a ab b b b ab a b b
Fusarium Levadura Nigrospora Paecilomyces

a ab b

Penicillium

Figura 5. Niveles promedios de ufc/m3 de hongos y levaduras en diferentes medios de cultivo (letras no comunes indican diferencias significativas, según Prueba de Scheffe para p<0,05) de cultivo, resultando más eficaz M2 para Aspergillus y Penicillium y M3 para Cladosporium. Ambos medios no presentaron diferencias en cuanto a la significación estadística para la colecta de los tres géneros evaluados. El resto de los medios (M1 y M4) no presentan diferencias entre sí y difieren de M2. Sin embargo, atendiendo a la diversidad que es capaz de recuperar cada uno de los medios, M1 y M4 son los más adecuados ya que en M2 no se representaron las levaduras ni los géneros Paecilomyces ni Nigrospora, y en M3 no se obtuvo Paecilomyces y se recuperan bajos niveles de Fusarium. Teniendo en cuenta los aspectos anteriores, podría recomendarse el uso de M4 (agar glucosa de Sabouraud), ya que aunque no es el medio donde se obtiene los mayores niveles, los valores obtenidos están en el mismo orden (10 2) que los de M2 y M3 y es el medio que conjuntamente con M1 detecta la mayor variabilidad fúngica del ambiente. Además su eficiencia en la recuperación y variabilidad obtenida no difieren de las de M1 (medio recomendado por la ACGIH, 1989). Al revisar la bibliografía relativa a este tema, se concluye que no hay un acuerdo, ya que para algunos autores el Agar Extracto de Malta +7,5% NaCl (M2), no es adecuado para promover la esporulación (Morring et al., 1983; Verhoeff et al., 1990), recomendándose suplementarlo con peptona y glucosa (Hunter et al., 1988; ACGIH, 1989) o usar Agar glucosa de Sabouraud (Medina et al., 1999; Pepeljnjak & Segvic, 2003). Finalmente para averiguar si pueden ocurrir variaciones significativas según el momento en que se recogen las muestras, se realizó un muestreo cada hora entre las 7a.m. y las 4 p.m. en los dos locales (L1 y L2). Los resultados obtenidos (Figura 6) señalan que las horas en las que se alcanza un mayor nivel de contaminación son las 7, las 12 y las 11h. (L1) y las 11, 12 y 14h (L2), aunque no se encontraron diferencias significativas entre ellas (Tabla 2). Muchos hongos liberan sus esporas durante la noche y primeras horas de la mañana favoreciendo a este proceso la elevada humedad un aspecto que justifica que encontremos picos de máxima concentración a las 7 de la mañana ya que las ventanas del Local (L1) permanecen abiertas durante la noche. De todas formas, al calcular los valores promedio de contaminación en ambos muestreos, la hora de mayor concentración fúngica resultó las 12h, con 3327 ufc/m 3, con valores muy próximos a los obtenidos a las 11h (3086 ufc/m3), por lo que esta franja horaria podría ser la más conveniente. Este comportamiento coincide con los resultados obtenidos por Shadzi et al. (1993), al estudiar zonas urbanas de Irán durante un año, en las cuales encontraron que la mayor concentración de hongos se presentó en el mediodía y al final de la mañana y con el patrón de periodicidad diurna descrito para Cladosporium, por Shenoi & Ramalingam (1975) quienes señalan que durante las horas del mediodía sus niveles son mayores.
u fc/m 3 6400 4800 3200 1600 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

L1

u fc/m 3 6400 4800 3200 1600 0 7 8 9

L2

10 11 12 13 14 15 16

Figura 6.- Niveles promedios de ufc/m3 (L1 y L2, locales de muestreo) 71

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Tabla 2. Comparación de ufc.m-3 en ambos locales (L1 y L2) a diferentes horas (letras no comunes indican diferencias significativas, según Prueba de Scheffé para p < 0,05)

three houses in Havana (Cuba). Grana 41:114-118 Aira, M.J.; Jato, V.; Iglesias; Rodríguez-Rajo, F.J.; Méndez, J.; Albelda, Y.; He rvés, M .; Piontelli, E. & Stc higel, A.M . (2005). Calidad del aire. Polen y esporas en la comunidad gallega. Xunta de Galicia. Aira, M.J.; Jato, V.; Stchigel, A.M.; Rodríguez-Rajo, F.J. & Piontelli, E. (2007). Aeromicological study in the Cathedral of Santiago de Compostela (Spain). International Biodeterioration & Biodegradation 60:231-237 Barnett, H. L. & Hunter, B. B. (1998). Illustrated Genera of Imperfect Fungi, Fou rth Edition APS Press. T he American Phytopathological Society, USA. Be llin, P. & Sc hillinger, J . (200 1). Compa rison of field performance of the Andersen N6 single stage and the SAS sampler for airborne fungal propagules. Indoor Air 11:65-68 Blomquist, G.; Ström, G.; Stromquist, L.H. (1984). Sampling of high concentrations of airborne fungi. Scand. J. Work Environ. Health. 10:109-113 Bo rre go, S.; Pons, V.; Per domo, I. (20 08). Estudio de la contaminación microbiana del aire en dos depósitos del Archivo Nacional de la República de Cuba. Revista CNIC Ciencias Biológicas Burge, H. A. & Solomon, W.R. (1987). Sampling and analysis of biological aerosols. Atmos. Environ. 21:451-456 Buttner, P.M. & Stetzenbach, L.D. (1993). Monitoring airborne fungal spores in an experimental indoor environment to evaluate sampling methods and the effects of human activity on air sampling. Appl. Environ. Microbiol. 59:219-226 Caneva, G.; Nugari, M.P.; Romolaccio , M.; Zuccarello, V. (2004). Aerobiology in museums comparison between sampling methods. Proceeding the XI International Palynological Congress, pp.87 -88 . Ellis, M.B. (1971). Dematiaceous hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Sourvey, England, CMI. Ellis, M.B. (1976). More Dematiaceous Hyphomycetes. Comm. Mycol. Inst. Kew. England. FEDECAI-0 1 (200 7). Programa de certificación de ca lidad ambiental en interiores. Calidad ambiental en interiores: Criterios de muestreo. pp 4-6. Federación Española de Empresas de Calidad Ambiental Interior (FEDECAI). Fernández, M.; Cabrera, E.; Rojas, T.I & Fernández, F. (1998). Estu dio de la microflora existente en almacenes textiles, bajo condiciones de clima tropical. Boletín INTEXTER 114:49-54 Galán, C.; Cariñanos, P.; Alcazar, P.; Domínguez, E.; Aira, M.J. et al. (2007). Manual de Calidad y Gestión de la Red Española de Aerobiología. Servicio de Publicaciones. Universidad de Córdoba. García, T. (199 7). Consideraciones sobre la micobiota de la mapoteca del Archivo Nacional. Trabajo de Diploma. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Ho, M.H.M.; Castañeda R.F.; Dugan F.M. & Jong S.C. (1999). Cladosporium and Cladophialophora in culture: Descriptions and an expanded key. Mycotaxon LXXII:115-157

Hora 7 12 11 8 9 10 13 15 14 16 Hora 11 14 12 10 9 15 13 8 7 16

L1 ufc/m3 6053 4428 3904 3445 2882 2538 2027 1314 1213 1102

Significación

a ab abc abcd bcd bcd bcd cd cd d
Significación

L2
ufc/m 2268 2250 2226 2115 2065 1679 1646 1531 1357 607
3

a a a a a ab ab ab ab b

Ricci et al. (1996), señalaron que las concentraciones de esporas fúngicas en ambientes de interior son influenciadas por parámetros ambientales (temperatura, humedad, corrientes de aire, etc), características del local (sustratos, ventilación, limpieza, etc.) siendo también una variable importante la micobiota predominante en el aire exterior (Shelton et al., 2002).

REFERENCIAS
ACGIH (1989). Guidelines for the assessment of bioaerosols in the indoor environment. Cincinna ti, American Conference of Governmental Industrial Hygienists, 110p. Acosta, S.; Rojas, T.I.; González, F.; Galán, I.; Benítez, M.; Llane s, N.; Sánche z, V.; He rnánde z, D. & Casadesús, L. (20 03). Caracteriza ción microbiológica del ambiente y de los materiales de un almacén soterrado. 2 da Jornada científica y de calidad. CEINPET Aira, M.J.; Rojas, T.I. & Jato, V. (2002). Fungi associated with

72

Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo - Rojas et al.

Ho rn, J . (200 5). Air samplers for environmental monitoring regarding ISO 14698. Newsletter No. 65 Hunter, C.A.; Grant, C.; Flannigan, B.; Bravery, A.F. (1988). Mould in buildings: the air spore of domestic dwellings. J. Int. Biodet. 24:81-101 Klanova, K. (2000). The concentrations of mixed populations of fungi in indoor air: rooms with and without mould problems and rooms with and without health complaints. Cent. Eur. J. Public. Health. 8:59-61 Klich, M.A. & Pitt, J.I. (1994). A Laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs. Comm. Sc. and Industrial R. Org. Medina, L.; Tuozzo, A.; Herrera, J.; Perozo, Y.; González, L. (1999). Estudio de hongos en bibliotecas de la Universidad de Carabobo-Valencia (Venezuela), Revista Universidad 3:5-20 Medrela-Kuder, E. (2003). Seasonal variations in the occurrence of culturable airborne fungi in outdoor and indoor air in Craców. International Biodeterioration & Biodegradation 52:203-205 Mo rring, K.L.; So renson, W.G. & Attfield, M.D. (1983 ). Sampling for airborne fungi: A statistical comparison of media. Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 44:662-664 NRP-201 (1987). Análisis Ambiental. Método de Omeliansky. Análisis higiénico sanitario y ambiental. Métodos de ensayos microbiológicos. Norma Ramal de la Pesca. Ministerio de la Industria Pesquera. Pasanen, A.L.; Pasanen, P.; Jantunen, M.J. & Kalliokoski, P. (1991). Significance of air humidity and air velocity for fungal spore release into the air. Atmospheric Enviroment 25:459-462 Pepeljnjak, S. & Segvic, M . (2003). Occurence of fungi in air and on plants in vegetation of different climatic regions in Croatia. Aerobiologia, 19:11-19 Pitt, J.I. (2000). A laboratory guide to common Penicillium species. Food Science Australia. Third Edition.

Portnoy, J.M.; Barnes, C.S. & Kennedy, K (2004). Sampling for indoor fungi. Current reviews of allergy and clinical immunology. Journal Allergy Clin Immunol 113:189-198 Ricci, S; Bruni, M; Mer ig gi, A & Corsico , R. (1996 ). Aerobiological monitoring for fungal spore in rehabilitation hospital in northem Italy. Aerobiología 12:233-237 Ro jas, T. I. (199 8). Micobiota conta minante en a mbientes interiores. Tesis de Maestría. Facultad de Biología, Universidad de la Habana. Rojas, T.I.; Cruz, I. & Alvarado, Y. (1993). Hongos filamentosos como contaminantes ambientales en locales de almacenamiento. IV Simposio de Botánica. I Simposio Latinoamericano de Micología. Palacio de las Convenciones. La Habana, 22-26 de junio Rojas T.I.; Martínez, E.; Gómez, Y. & Alvarado, Y. (2002). Airborne spore of Aspergillus in cultural institutions at Havana University. Grana 41:190-193 Shadzi, S.; Zahraee, M.H. & Chadeg anipour, M . (19 93 ). Incidence of airborne fungi in Isfahan, Iran. Mycoses 36:69-73 Shelton, B.G.; Kirland, K.H.; Flanders, W.D. & Morris, G.K. (2 002 ). Profiles of airborne fungi in buildings and ou tdoor environments in the United States. Applied a nd Environment Microbiology 68:1743-1753 Shenoi, M. M. & Ramalingam, A. (1975). Circadian periodicities of some spore components of air of Mysore Arogya. J. Health Sci. 1:1 54-1 56 StatSoft, Inc. (2001): Statistica (data analysis software system), version 6. www.statsoft.com. Verhoeff A.P.; van Wijnen, J.I.; Boleij, J.S.M. & Brunekreef, B. (1990). Enumeration and identification of airborne viable mould propagules in houses. Allergy 45:275-84

73

Boletín Micológico Vol. 23 : 75 - 85

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MICROHONGOS OPORTUNISTAS ASOCIADOS AL «MUSGO POMPON» DESECADO (Sphagnum magellanicum BRID.) EN CHILE
(Opportunistic microfungi associated to the desiccated «pompon moss» (Sphagnum magellanicum Brid.) in Chile)
Eduardo Piontelli, Rodrigo Cruz & Valia Vivar
Universidad de Valparaíso, Escuela de Medicina, Cátedra de Micología Casilla 92 VC, Valparaíso , Chile email <eduardo piontelli@uv.cl> Palabras claves: Sphagnum magellanicum, microhongos,Asperguillus fumigatus, Trichoderma longibrachiatum Key words: Sphagnum magellanicum, microfungi , Asperguillus fumigatus, Trichoderma longibrachiatum

RESUMEN
Se analizó la presencia de propágulos fúngicos en muestras secas del musgo Sphangnum magellanicum provenientes de 2 localidades de la zona Sur del país (39 y 41ºS), mediante cultivos en agar agua y agar Sabouraud a temperaturas de 25 y 35ºC con muestras recién colectadas (2007) y almacenadas un año a temperatura ambiente (2008). Nuestro objetivo fue determinar previo a la comercialización de este vegetal desecado, la presencia/ausencia del complejo Sporothrix schenckii u otras especies oportunistas consideradas como un riesgo en salud pública en la comunidad de microhongos filamentosos viables en el tiempo en este musgo. En la primera muestra (41ºS, 2007), a 25ºC, en ambos medios, se observó un total de 31 géneros y 36 especies. Los géneros con mayor frecuencia en orden decreciente y en ambos medios fueron: Penicillium, Cladosporium, Trichoderma y Mucor representando aproximadamente el 70% del total de presencia, mientras en las muestras sembradas un año después, fueron en orden decreciente: Aspergillus, Trichoderma, Penicillium y Gelasinospora, con un total de presencia del 75,4%. A 35ºC en ambas muestras la presencia de taxa se redujo a 4-5 géneros donde las principales especies fueron A. fumigatus complex y T. longibrachiatum con altos porcentajes, Penicillium spp. y Gelasinospora caulospora. Se destaca un raro aislamiento de Neosartorya quadricincta. Ningún integrante del complejo Ophiostoma stenoceras-Sporothrix schenckii se detectó en las
Recibido el 17 de Julio 2008 Aceptado el 23 de Septiembre 2008

muestras a 25º y 35º C, pero a pesar de su ausencia deben tomarse precauciones en el manejo y distribución comercial de este musgo en Chile, debido a la sobrevivencia en el tiempo de ciertos hongos oportunistas, como los integrantes del complejo A. fumigatus y T. longibrachiatum.

ABSTRACT
The presence of fungal propagules in desiccated samples of Sphangnum magellanicum moss collected from two southern zones of the country (39 and 41ºS) was analyzed by means of water agar and Sabouraud agar, at 25 and 35ºC temperatures using freshly gathered samples (2007) and stored for a year at room temperature (2008). Our aim was to determine, prior to the marketing of this desiccated vegetable, the presence/absence of the Sporothix schenckii complex or other opportunistic species which are considered to be a risk in public health, in the community of filamentous microfungi that are viable with time in this moss. The first sample (41ºS, 2007),at 25ºC, in both media revealed 31 genera and 36 species as a total. Genera most frequently found, in decreasing order, were: Penicillium, Cladosporium, Trichoderma and Mucor, which represented about 70% of the overall occurrence, whereas samples cultured one year later showed, in decreasing order, the presence of : Aspergillus, Trichoderma, Penicillium and Gelasinospora, meaning a 75.4% occurrence. At 35ºC, the presence of taxa became reduced in both samples to 4-5 genera, main species being A. fumigatus complex and T. longibrachiatum in high percentages, Penicillium spp. and Gelasinospora caulospora. Besides, it is remarkable a rare isolation of Neosartorya quadricincta. 75

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None component of the Ophiostoma stenocerasSporothrix schenkii complex was detected in samples at 25º and 35º C yet although its absence, caution must be made in handling and commercial distribution of this moss in Chile due to the survival in time of certain opportunistic fungi such as those found in the A. fumigatus complex and T.longibrachiatum.

INTRODUCCION
Las briófitas son consideradas como el segundo gran grupo de plantas terrestres y las únicas con fase gametofitica haploide dominante, presentan gran potencialidad de dispersión mediante esporas o propagación vegetativa. Son presumiblemente polifiléticas y por ende consideradas como un grupo no natural que incluye los musgos (Briophyta), hepáticas (Marchantiophyta) y las antocerotas (Anthocerotophyta). A pesar de ser muy diferentes entre ellas en estructura, son muy similares en sus ciclos de vida (Frahm, 2008). El género Sphagnum contiene una gran cantidad de especies de musgos de amplia distribución cosmopolita que ocupan 1/3 de la superficie de los suelos en el planeta (Turetsky et al.,2002). Las especies de Sphagnum, incluyendo S. magellanicum Brid. (Sphagnopsida, Sphangnales, Sphangaceae), se denominan comúnmente en la zona sur del país como: musgo pompón, musgo de turberas, musgo de pantano o esfagno, mientras en los países anglosajones generalmente como «Sphagnum moss». En la zona sur de Chile, sus poblaciones son integrantes de las turberas referidas también como «pomponales o ñadis», las cuales se forman después de la tala, raza o quema de bosques, en sitios anegados que rápidamente son colonizados por este vegetal, cubriendo un área geográfica aproximada de unas 500.000 hectáreas. Su distribución silvestre se presenta en extensas formaciones edáficas en franjas territoriales desde la novena a la duodécima región (Ramírez, 1990; Figueroa et al., 1999; Villaroel et al., 2002; Teneb & Dollenz, 2004). Las turberas, son ambientes naturales inundados característicos de regiones climáticas templadas y frías, las que se desarrollan sobre terrenos con restricción de drenaje, donde este musgo forma un sustrato esponjoso continuo, impregnado de agua, asociado a numerosas especies vasculares arbóreas y herbáceas adaptadas a este ambiente (Teneb & Dollenz, 2004). El empleo comercial de Sphagnum deshidratado es bastante amplio: en vendajes quirúrgicos, apósitos, empacado de plantas, así como también en forma de turba como combustible, como absorbente de aceites, derivados del petróleo y como descontaminante de metales pesados y pesticidas entre otros usos (Villaroel et al., 2002). El conjunto de microhongos filamentosos frecuentes que intervienen en la senescencia y descompo76

sición de las turberas en las poblaciones de Sphagnum, han sido estudiados solamente en algunas zonas geográficas (Thorman et al., 2001- 2003- 2004; Tsuneda et al., 2001; Hambleton et al., 2003; Markus et al., 2002 2004; Rice et al., 2006), sin embargo, la importancia ambiental de estos musgos tiene relevancia en la literatura micológica médica internacional y en especial en USA, por ser considerado uno de los hábitat comunes de un hongo dimórfico saprofítico y geofílico que integra el complex Sporothrix schenckii, causante de varios brotes endémicos de una micosis crónica subcutánea granulomatosa denominada esporotricosis (Powell et al., 1978; Dixon et al., 1991). Esta micosis se presenta generalmente en una forma linfocutánea limitada, que puede diseminarse a otros sistemas orgánicos en pacientes con graves deficiencias inmunes (Jaffar et al., 1998). En Chile, la esporotricosis es aparentemente una micosis rara, debido a que solo se ha detectado en la zona central del país en 2 casos clínicos autóctonos en 1950 y 1984 (en Piontelli, 1995), recientemente en lesiones nasales en un perro (Muñoz et al., 2006) y como saprófito en uñas de gato (Thomson & Cerda, 2008), pero no existen referencias sobre la distribución de su agente en un ambiente determinado. Frente a la ausencia de una información geográfica y epidemiológica de este patógeno primario y debido a que la gran cobertura del musgo S. magellanicum en la zona sur podría reunir condiciones favorables para su permanencia y distribución, nuestro objetivo fue: determinar previo a la comercialización de este vegetal desecado y en una localización geográfica particular, la presencia/ausencia del complejo S. schenckii u otras especies consideradas como un riesgo en salud pública en la comunidad de microhongos filamentosos que permanecen viables en el tiempo en este musgo.

MATERIALES Y METODOS
a) Localización geográfica de las muestras. La mayor parte de las muestras del musgo se obtuvieron el mes de febrero 2007, desde un distribuidor comercial (1ª. muestra) en el pueblo de Tegualda (Comuna de Fresia) en la Región de los lagos (app. 41º S) y en la zona de Valdivia (2ª muestra menor, app. 30ºS). Las muestras se refrigeraron a 4-6 grados hasta su procesamiento los primeros días de Marzo. La primera muestra correspondió a más de medio saco del substrato (aproximadamente unos 6 kilos) obtenido del lugar de secado de este musgo, representando un conjunto de diversas muestras provenientes de zonas precordilleranas y en un radio de 60 Km alrededor del pueblo de Tegualda. Mientras la segunda (250 g) obtenida en Marzo 2007, provino de una localidad cercana a Valdivia, procesándose ambas a fines del mes de Marzo, previa refrigeración por 5 días a 4º- 6º C.

Microhongos oportunistas asociados al «musgo pompom» desecado Sphagunum magellanicus Brid. en Chile

- E. Piontelli et al.

b) Metodología de siembra de la 1ª muestra. Con pinzas que se esterilizaban a la llama, se tomaron trozos del musgo al azar desde la muestra principal, los cuales se depositaron en bolsas de plástico estériles hasta confeccionar 19 muestras de aproximadamente 100g c/u, luego con tijera esterilizada a la llama se trozó el substrato en cada muestra en partes de no más de 2-3 cm de largo, para permitir una buena siembra directa en la superficie de 2 medios de cultivo en placas de Petri de 10 cm (en duplicado): uno con agar agua y otro en agar Sabouraud, ambos con Cloramfenicol 250 mg /L. Para detectar la viabilidad de las esporas o micelios presentes en el substrato, los trozos del musgo seco (8-10 trozos), se distribuyeron de manera equidistante directamente sobre la superficie de las placas en ambos medios y se incubaron a 25ºC durante 10 días en oscuridad, manteniéndose los cultivos hasta 30 días a temperatura ambiente (17-22ºC) con el régimen alterno de luz y oscuridad diaria, esto último para detectar el posible crecimiento de hongos de lento desarrollo, en especial en agar agua. Paralelamente se sembró solo en agar Sabourad con Cloramfenicol con la misma técnica descrita un set en duplicado de otras 19 placas que se incubaron por 10 días a una temperatura de 35ºC ( ±1ºC), para observar la posible presencia de hongos mesófilos, termotolerantes o termófilos, capaces de crecer a esa temperatura. El sobrante de la primera muestra se mantuvo protegido en su contenedor a temperatura ambiente durante 1 año, para luego separar (nuevamente en el mes de Marzo) 9 muestras de unos 100 g tomadas al azar (con el mismo procedimiento descrito anteriormente) las cuales se sembraron en duplicado en placas de agar Sabouraud con Cloramfenicol, incubándose a 25 ºC durante 10 días en oscuridad, y manteniéndose los cultivos hasta 30 días a temperatura ambiente (17-22ºC) con el régimen alterno de luz y oscuridad diaria. c) Métodos de siembra de la segunda muestra. Debido a la poca cantidad de muestra obtenida desde la zona de Valdivia, ésta no pudo subdividirse en submuestras, sembrándose con la misma técnica anterior solo en 9 placas de agar Sabouraud con Caf. a temperatura de 35ºC ( ±1ºC), durante 7-10 días en oscuridad, para detectar la presencia de hongos mesófilos, termotolerantes o termófilos. d) Observación de los cultivos y análisis de presencia fúngica. Los hongos que se desarrollaron en las diferentes muestras, medios de cultivo, temperaturas y tiempos, fueron enumerados bajo la lupa estereoscópica mediante su frecuencia de aparición, asignándole un «Puntaje de presencia de género o especie (PP)»: 3 puntos = Dominante (mas de 7 colonias dentro de una placa; 2 puntos = Frecuente (de 3 a 6 colonias dentro de una placa)

y 1 punto = Esporádico (1 a 2 colonias en la misma placa). Para las placas duplicadas que proporcionaron valores diferentes, se consideró como valor de PP a la que presentaba mayor frecuencia. Estas categorías pretenden proporcionar un valor estimativo que represente en el total la frecuencia de cada taxa. Las observaciones macroscópicas de los cultivos a temperaturas de 25º y 35ºC se efectuaron bajo lupa estereoscópica a los 7-10-20 y 30 días mientras los a temperaturas de 35ºC a los 5 y 15 días. Las observaciones microscópicas se hicieron con preparaciones en lactofenol en un microscopio ZEISS con óptica DIC. Cuando fue necesario el empleo de cultivos adicionales, se efectúaron los especificados en las monografías de cada género, en especial Aspergillus (subgénero Fumigati), Trichoderma y algunos Penicillium (Domsh et al., 1980; Klich, 2002; Samson et al., 2007; Gams & Bisset, 1998; Samuels et al., 1998; Pitt, 2000). No todos los integrantes de algunos géneros se determinaron al nivel de especie, principalmente se clasificaron los considerados como oportunistas y los más frecuentes.

RESULTADOS
a) Muestra 1, a 25ºC - año 2007. En las 19 muestras analizadas en los 2 medios de cultivo la micota presente en agar agua, fue mayor que en agar Sabouraud con un total de 21 géneros y 28 especies y 18 y 20 respectivamente, obteniéndose un total de 31 géneros y 36 especies en ambos medios (Tabla 1). Ocho taxa que no se detectaron en agar agua se presentaron en agar Sabouraud, mientras 13 que se presentaron en agar agua no lo hicieron en agar Sabouraud y 18 taxa estuvieron presentes en ambos medios. Los integrantes de los géneros con una frecuencia mayor del 10% fueron en agar agua: Penicillium (36,8%), Cladosporium (14,7%) Trichoderma (13%) y Mucor (12,3%). Estos, representaron el 76,8% del total de presencia. Los mismos géneros se obtuvieron en agar Sabouraud con porcentajes semejantes, salvo en Cladosporium con un porcentaje menor (10,9%) (Figura 1, Tabla 1) representando sus integrantes un 69,1% del total de presencia (Tabla 1). Las especies con mayor número de frecuencia de presencia (sobre el 5%) en agar agua fueron: Penicillium glabrum (14,4%), Cladosporium cladosporioides (12%), Trichoderma harzianum complex (10%), Penicillium brevicompactum (7%), Mucor racemosus (6%) y Absidia glauca (5,4%). En agar Sabouraud, hubo semejanzas en la presencia de Penicillium glabrum, Trichoderma harzianum complex y Mucor racemosus, mientras C.cladosporioides y P. brevicompactum disminuyeron. Aumentaron su presencia A.glauca (9,3%) y Mortierella ramanniana (6,1%) (Tabla 1). 77

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%

40
P e n ic illiu m s p p .

35 30 25 20 15 10 5 0 Ag ar a gu a 20 07 Agar S ab. 2007 Ag ar S ab . 2008
C la d o s p o r iu m s p p . T r ic h o d e r m a s p p . M u co r sp p . A s p e r g illu s s p p . G e la s in o s p o r a s p .

Figura 1. Frecuencia de integrantes de géneros comunes aislados en dos medios de cultivo a 25ºC en los años 2007 y 2008 desde Sphagnum magellanicum desecado. No se observó la presencia de Sporothrix schenckii ni otro representante de las Ophiostomataceae en el seguimiento de las muestras en el tiempo (30 días). b) Muestra 1, a 25ºC sembrada un año después (2008) sólo en agar Sabouraud. En las 9 muestras en duplicado el número de géneros (13) y especies (16) disminuyó en referencia a las del año 2007 y los integrantes de los géneros con una frecuencia mayor del 10% fueron: Aspergillus (23,6%), Trichoderma (20%), Penicillium, 18,2%) y Gelasinospora (13,6%), con un total de presencia del 75,4%. Se observaron diferencias en la presencia de todos los géneros más frecuentes con respecto al año 2007, destacándose la ausencia de los integrantes de Cladosporium (Figura 1, Tabla 1). Las especies con mayor número de frecuencia de presencia (sobre el 5%) fueron: A . fumigatus complex (21,8%), T. harzianum complex
25 %

(16,4%), G.caulospora (13,6%), P. glabrum (9,1%) Penicillium spp. (8,2%)(mayoritariamente integrantes del subgénero Penicillium) y M. racemosus (5,7%) ( Figura 2, Tabla 1). La frecuencia de presencia de los integrantes de los géneros en las muestras sembradas en los 2 medios en el año 2007 comparadas con las sembradas en A.S. en el 2008 (Tabla 1), permiten observar que A. fumigatus complex, G. caulospora y T. longibrachiatum aumentaron notoriamente su presencia; disminuyeron M. racemosus, P. glabrum, Penicillium spp. y T harzianum y no se presentaron A. glauca, P. brevicompactum y ningún Cladosporium (Tabla 1, Fig. 2). No se detectó la presencia de Sporothrix schenckii ni otro representante de las Ophiostomataceae en las muestras en el tiempo (30 días).

2 11

1 Abs. glauca 2 A. fum igatus com p. 3 C. cladosporioides 4 G. caulospora 5 M ort. ram anniana 6 M ucor racem osus 7 P. brevicom pactum 8 P. glabrum 9 Penicillium spp. 10 T. harzianum 11 T. longibrachiatum

20

8
15

9 3 10 5 6 7 1 4 11 2007

4 8 9 6

10

5

2

10

0

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Figura 1. Frecuencia de especies comunes aisladas en dos medios de cultivo a 25ºC en los años 2007 y 2008 desde Sphagnum magellanicum desecado. 78

Microhongos oportunistas asociados al «musgo pompom» desecado Sphagunum magellanicus Brid. en Chile

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Tabla 1. Frecuencia de hongos aislados en S. magellanicum desecado, en dos medios de cultivo; Agar Agua (A.A.) y Agar Sabouraud (A.S.) a 25 y 35ºC, en los años 2007 y 2008
TAXA FUNGICOS Absidia glauca Hagem Acremonium strictum W. Gams complex Acremonium sp. Alternaria alternata (Fr.) Keissler complex Amphobotrys ricini (N.F. Buchw.) Hennebert Aspergillus fumigatus Fr. complex Aspergillus sclerotiorum G.A. Huber Aureobasidium pullulans (De Bary) Arnaud var. pullulans A. pullulans (De Bary) Arnaud var. melanigenum Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. Bipolaris sp. Botrytis cinerea Pers. Chalara sp. Chaetomium sp. Cladosporium cladosporioides (Fr.) de Vries Cladosporium sphaerospermum Penzing Cladosporium sp. Clonostachys rosea f. rosea Schroers et al. Curvularia clavata B.L. Jain Curvularia sp. Epicoccum nigrum Link Fusarium oxysporum Schlech.:Fr. Gelasinospora calospora (Mouton) C. Moreau & Moreau Geomyces pannorum (Lin.) Sigler & Carmich. Malbranchea sp. Mortierella ramanniana (Möller) Linnem. Mucor hiemalis Wehmer Mucor racemosus Fres. Mucor plumbeus Bon. Neosartorya quadricincta (J.L. Yuill) Malloch & Cain Nodulisporum sp. Oidiodendrum griseum Robak Penicillium brevicompactum Dierckx Penicillium decumbens Thom Penicillium glabrum (Wehmer) Westling Penicillium purpurogenum Stoll Penicillium spp. Phoma sp. Piptocephalis sp. Rhizopus stolonifer (Ehrenb:) Lind. Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings Stemphylium botriosum Sacc. Thamnidium elegans Link Trichoderma harzianum Rifai complex Trichoderma longibrachiatum Rifai Trichoderma viride Pers. Trichoderma spp. Ulocladium consotiale (Thüm.) E.G. Simmons Micelio sin fructificar Fresia 2007 A.A. 25ºC A.S. 25ºC fr. % fr. % 16 1 2 2 3 2 2 2 1 3 5,4 0,3 0,7 0,7 1,0 0,7 0,7 0,7 0,3 1,0 23 9,3 1 2 7 0,8 2,8 2 1,8 24 21,8 2 1,8 3 2,7 46 41,8 Fresia 2008 Vald. 2007 A.S. 25ºC A.S. 35ºC A.S. 35ºC fr. % fr. % fr. %

15 29,4

1 2

0,4 0,8 2 1 1,8 0,9

36 12,0 8 2,7

20 5 2 3

8,1 2,0 0,8 1,2

2 1 2 9 3 1 12 13 19 5

0,7 0,3 0,7 3,0 1,0 0,3 4,0 4,3 6,4 1,7 4 7 15 9 14 5 1,6 2,8 6,1 3,6 5,7 2,0 2 1,8 15 13,6 3 2,7 7 6,4

2 3 3

1,8 2,7 2,7 1 0,2

21 7,0 10 3,3 43 14,4 1 0,3 36 12,0 1 0,3

1 0,4 3 1,2 12 4,9 4 1,6 39 15,8 31 12,6 2 0,8 1 0,4

4 10 1 9 9,1 0,9 8,2

3,6

18 16,4

9 17,6

2 3 1 0,3 3 1,2 26 10,5 2 0,8 2 2 0,8

1,8 2,7

30 10,0 3 1,0 2 0,7 4 1,3 2

18 16,4 2 1,8 1 0,9 1 0,9 2 1,8 1 0,9

22 20,0 2 8 1,8 7,3

21 41,2

5

9,8

Total del Puntaje de presencia (PP) Taxa fúngicos aislados

299 33

247 27

110 22

110 9

51 4
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c) Muestra 1 a 35ºC en agar Sabouraud. En las 9 muestras en duplicado, la presencia de géneros y especies se redujo a 5 y 5 respectivamente, siendo los taxa dominantes: A. fumigatus complex (41,8%), T. longibrachiatum (20%), Penicillium spp.(16,4%) (integrantes principalmente de 2 subgéneros Penicillium y Aspergilloides ) y G. caulospora (6,4%) (Tabla 1). No se observó la presencia de Sporothrix schenckii en las muestras en el tiempo (15 días). d) Muestra 2 a 35ºC en agar Sabouraud. En las 9 muestras, la presencia de géneros y especies se redujo a 4 y 3 respectivamente, siendo los taxa dominantes: T. longibrachiatum (41,2%), A. fumigatus complex (29,4%), Penicillium spp. (integrantes principalmente de los subgéneros Penicillium y Aspergilloides)(17,6%). Neosartorya quadricincta se presentó una sola vez en una muestra (Tabla 1). No se observó la presencia de S. schenckii en las muestras en el tiempo (15 días). La alta presencia de A.fumigatus complex en las 2 muestras a 35ºC permitió un estudio morfofisiológico adicional de 10 cepas seleccionadas al azar, las cuales se compararon entre si y con 2 cepas aisladas de pacientes con aspergilosis pulmonar. Las 12 cepas crecieron a 5051ºC y solo 1(de la muestra 1) lo hizo a 9-10ºC. A pesar de la variación morfológica observada en algunas de las cepas ambientales, en especial en la forma de sus vesículas (Fig. 1A), la extensión de las fiálides sobre estas y el largo de sus cabezas columnares (2 cepas con cabezas columnares muy cortas), estos datos no permitieron su inclusión en especies diferentes y se prefirió determinarlas a todas como integrantes de A. fumigatus complex. Descripción de Neosarorya quadricincta: Diámetro de las colonias a los 7 días en CYA 33-40 mm, MEA25:55-61mm, OA (agar avena) 50-52 mm, CYA37 5663 mm. Color en CYA ante claro, con leves tonos verdes, flocosas, reverso blanco a crema. En agar Malta y agar avena colonias flocosas, similares en colores, ante en el centro con tonalidades verde oscuras en la periferia por el crecimiento del anamorfo (más notorio en OA), reverso crema. En OA,Cabezas columnares cortas y laxas. Anamorfo; estipe 350-450 x 3-8µm, diámetro de las vesículas 13-24(promedio 19), conidios elípticos a globosos, microtuberculados 2-3µm. Teleomorfo: Cleistotecios de color ante claro, 240-285µm, pseudoparenqimatosos, de paredes delgadas de color café oscuro, ascos subglobosos a ovoides, 11-15 x 10-11,5 µm, ascosporas elípticas en visión lateral y redondas en visión frontal, con 4 crestas ecuatoriales, 2 prominentes en el centro y 2 menos prominentes lateralmente, reticuladas, 5,5 - 6,5 x 4 - 5 µm (Figura 2). 80

DISCUSION
La decomposición de las briófitas en la naturaleza es lenta, debido a los compuestos secundarios que ellas producen (Asakawa,1990), especialmente compuestos fenólicos con funciones desconocidas, pero con capacidad de inhibir la herbivoría de micro y macrofauna, la germinación de las esporas de los hongos y el crecimiento bacteriano cuando la superficie de la hoja se humedece (Tadesse, 2002). Esta situación, no se debe exclusivamente a los compuestos secundarios sino en especial en el género Sphagnum, a las bajas concentraciones de nutrientes en sus hojas, como nitrógeno y fósforo (Aert, et al., 1999; Turetsky, 2003). La fuente de agua y nutrientes para los turbales proviene sólo de las precipìtaciones, y el esfagno, que posee una alta capacidad para su retención (8 a 10 veces su peso), contribuye a formar un sistema cerrado ombrotrófico (Damman, 1978). Si bien es cierto, que las condiciones climáticas de alta humedad y el agua son importantes en la distribución de esta especie, sus rangos de pH entre 4 y 6, considerados moderados con respecto a las demás especies del género (Andrus, 1986), resultan adecuados para la mayoría de una micota asociada al terreno, de gran importancia en sus procesos de senescencia y descomposición. Una variedad de hongos parasíticos y saprofíticos se han registrado en las briófitas vivas y en descomposición, incluyendo representantes del género Sphagnum, en orden decreciente desde los Ascomycota y sus anamorfos a los Zygo y Basidiomycota (Frankland, 1974; Redhead, 1981; Moreau, 2002; Thormann, 2003). Incluso trabajos recientes en las turberas empleando sólo técnicas moleculares con aislamientos directos de micelios o esporas capaces de germinar, siguen demostrando una dominancia de ascomicetos (Artz et al., 2007) y generalmente con presencia de taxa de rápido crecimiento y gran producción de esporas, como las especies de Penicillium, Cladosporium, Verticillium, Mortierella y Mucor, reportadas en cultivos estandar; prevalencia que se explica por su fácil desarrollo en estos medios (Thormann, 2006). El caso contrario sucede con los basidiomicetos, los cuales no se detectan prácticamente en los estudios basados en cultivos, a pesar de la ocurrencia de sus fructificaciones en los ecosistemas de turberas (Felix, 1988; Thorman, 2004). Sin embargo, a pesar que los musgos son aún un hábitat poco analizado en relación a los hongos, en algunas especies de Sphagnum vivas y en descomposición (en especial en S. fuscum), se ha encontrado una amplia comunidad fúngica mayoritariamente saprotrofa con escasos patógenos, probablemente debido a su habilidad de utilizar un amplio rango de fuentes carbonadas, tales como la celulosa, los ácidos tánicos y la pectina

Microhongos oportunistas asociados al «musgo pompom» desecado Sphagunum magellanicus Brid. en Chile

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(Thorman et al., 2001, 2003, 2004; Tsuneda et al., 2001; Hambleton et al., 2003; Markus et al., 2002 -2004; Rice et al., 2006). El conjunto de hongos en S. fuscum, en gradientes de descomposición en el tiempo, ha sido estudiado en Canadá por Thorman et al. (2001), los cuales encontraron una mayor frecuencia de hongos comunes del suelo (Penicillium tomii, Trichoderma viride, T. harzianum, Mortierella ramanniana y Mucor hiemalis), una situación muy similar a la nuestra y la de otros estudios sobre turberas (referencias en Thorman et al., 2001). Pero debemos aclarar que a pesar de que geográficamente nuestras muestras fueron tomadas en latitudes hemisféricas con ciertas semilitudes, la metodología que empleamos no se refirió a las etapas de descomposición de S. magellanicum, sino a la sobrevivencia y presencia en el tiempo de los diferentes propágulos de dispersión despues de su secado al sol sobre mallas levantadas del suelo, en un proceso previo a su comercialización. Si a pesar de la metodología, comparamos los géneros encontrados con los de Thormann et al., 2001 observamos una buena coincidencia en la presencia de algunos de ellos, pero con una mayor diversidad en nuestros aislamientos (31 géneros), con un buen porcentaje de taxa que se han aislado consistentemente en tierras de turberas en el mundo por su tolerancia a bajos pH y temperaturas, condiciones de suelos inundados y capacidades enzimáticas (grupos funcionales) de utilizar fuentes carbonadas, pectinas, celulosa, gelatina y almidón pero con escasa capacidad de utilizar ácido tánico ( Thorman et al., 2001, 2003; Swift, 2005). Las especies aisladas a temperaturas de incubación de 25ºC (año 2007), que representaron casi un tercio de la comunidad especialmente en agar Sabouraud, fueron las integrantes de los Mucorales, siguiendole en importancia las especies de Penicillium, Trichoderma y Cladosporium, todos habitantes comunes del suelo o material vegetal senescente (Domsch et al., 1980). La presencia esporádica de Geomyces pannorum (Onygenales), Gelasinospora caulospora (Sordariales), Aspergillus fumigatus (Eurotiales) y Botrytis cinerea (Leotiales), también se asocia a los diversos hábitat del suelo y los 3 primeros no parecen ser comunes en Sphagnum (Thormann et al., 2001, 2003, 2004), así como otros que deben su presencia posiblemente a cambios vegetacionales en la turbera (Artz et al., 2007) o al manejo de este musgo para su traslado comercial a otras zonas ecológicas. En la micota obtenida un año después (2008), se observó una disminución en el número de géneros y especies, pero con notables aumentos del porcentaje de A. fumigatus complex, G. caulospora y T. harzianum

complex (Tabla.1). Esta situación, puede asociarse a los efectos inhibitorios sobre la esporulación fúngica de los componentes de este musgo en el tiempo en parte de la micota presente (Tadesse, 2002) y a la mayor capacidad de sobrevivencia de sus mito y meiosporas durante el almacenaje, lo que podría ser una desventaja para las especies de Mucorales y Penicillium que disminuyeron su presencia y la ausencia de Cladosporium. Sin embargo, Rhizopus stolonifer y R.oryzae, sólo se presentaron después del almacenaje en el tiempo. La clara disminución de taxa en el substrato cultivado a 35ºC, en las 2 muestras (año 2007), favoreció solo el crecimiento de pocas especies mesófilas y termotolerantes, con notable aumento de A. fumigatus, T. longibrachiatum y algunos integrantes del género Penicillium (mayoritariamente del subgénero Penicillium). A. fumigatus es un reconocido termotolerante que crece a una temperatura optima de 45º con máxima de 53º y una mínima 11ºC (Samson et al., 2007) y T. longibrachiatum (sección Longibrachiatum), crece y produce la mayor cantidad de conidios entre los 30-40ºC (Samuels et al., 1998). De estas 2 últimas especies oportunistas A. fumigatus principalmente, es el causante común de varias infecciones en el hombre y los animales y T .longibrachiatum se considera entre los hongos emergentes que presentan manifestaciones clínicas diversas, en especial peritonitis debido a dialisis peritoneal (De Hoog et al., 2000; Kredics et al., 2003). Los aislamientos de A. fumigatus fueron variables en su macro y micromorfología, lo que dificulta su diferenciación solamente en base a datos fenético de las otras especies estrechamente relacionadas, situación que es comentada por Samsom et al. (2006, 2007). Sin embargo, A. fumigatus se caracteriza por sus vesículas subclavadas, mientras A. lentulus, A. fumigatiaffinis, A. novofumigatus y A. turcosus tienen usualmente vesículas globosas. A. fumigatus crece a 50ºC pero no a 10ºC. y A. turcosus lo hace a 10ºC y también a 50ºC. Al comparar las cepas aisladas, varias presentaron una mezcla de vesículas clavadas a esféricas (Fig. 1A) y los rangos de sus diámetros junto con los conidióforos (datos no incluidos) fueron variables, pero no permitieron una clara diferenciación de los integrantes del complex A. fumigatus. Geneticamente A. fumigatus parece ser una especie muy homogénea claramente separada de otras relacionadas cuando se emplean secuencias de genes que incluyen b-tubulina, actina y calmodulina. Es por esto que el empleo de las secuencia de multigenes es una determinante crítica para la delineación del complex A. fumigatus (Samsom et al., 2006, 2007). Se destaca la capacidad de sobrevivencia de Amphobotrys ricini, anamofo de Botryotinia ricini 81

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A

B

Figura 1. A. -Forma de las vesículas de algunos de los integrantes del complejo Fumigatus aisladas en S. magellanicum y recubrimiento por las fíalides de las 2/3 de éstas. B.- Conidios simpodiales hialinos y aleuroconidios dematiáceos de S. schenckii complex, aislado en Eucalyptus. (Godfrey)Whetzel (Sclerotinaceae), el moho gris agente causal del daño de inflorecencias y semillas de la oleaginosa llamada higuerilla (Ricinus communis L.) y la presencia en la muestra 2 de un aislamiento de Neosartorya quadricincta (anamorfo A. quadricingens. Kozak.) Esta última especie no parece haberse aislado en el cono sur de Sudamérica (Samson et al., 2007) y se describe su morfología en resultados, destacando que este ecotipo presentó ascosporas levemente mayores a las señaladas en la bibliografía (Fig. 2). La ausencia de miembros de las Ophiostomatales, en especial de los integrantes del complex Ophiostoma stenoceras-Sporothrix schenckii (de Meyer, 2008), es una situación que debe considerarse con cautela debido a que se han analizado solo partes del área de crecimiento de S. magellanicum, por lo que no podemos aseverar su total ausencia. En Chile, sólo en la zona central, se han detectado 2 casos autóctonos de esporotricosis en el hombre, entre los años 1950 y1984 (en Piontelli, 1995), recientemente se ha detectado un caso en un agricultor en Santiago (M.C Díaz, comunicación personal) y otro caso desde lesiones nasales en un canino (Muñoz et al. 2006), asi como su aislamiento como agente saprófito en uñas de gato (Thomson & Cerda, 2008). Sin embargo, en todos ellos se desconocen las fuentes de infección. Otra posible evidencia de la presencia de este complejo en esta última zona, fué detectada en especies de Eucalyptus y asociada a un coleóptero (Ectinogoniua buquetti Spin.), sin poder obtenerse la cepa pura por estar mezclada con O. stenoceras. Sin embargo, por el tamaño y la abundante producción de sus conidios sésiles oscuros (Fig 1B), puede ser sugerente 82 de S.brasiliensis (Piontelli et al.,2006 ; Marimón et al., 2007). En la actualidad la esporotricosis se ha detectado en muchos países y algunas de sus regiones son consideradas endémicas para este agente infeccioso, principalmente en USA, Canadá, Japón, Sudáfrica, India, Australia, México, Uruguay, Brasil, Argentina, Colombia, Perú y Guatemala. La adquisición del agente causal según la literatura, proviene desde varios ambientes naturales, tales como: el suelo, restos de plantas, musgos (Sphagnum), plantas exóticas, espinas, tallos de rosas, madera, heno, aire, agua, insectos y otras fuentes. Incluso varios animales domésticos y roedores son portadores de este hongo, entre ellos gatos y perros, pero no se consideran como reservorios naturales; por esta razón, la esporotricosis se asocian con actividades en ambientes externos relacionadas con: floristas, agricultores, jardineros, trabajadores de viveros de plantas, leñadores, etc., donde al parecer, el sustrato muerto de Sphagnum (Zhanf & Andrews, 1993), se considera entre los hábitat más comunes y por ende una fuente de contagio humana y animal para este hongo dimórfico (Powell et al., 1978; Travassos & LLoyd, 1980 Dixon et al., 1991; Vismer & Hull, 1997; Jaffar et al., 1998; Lopes-Bezerra, 2006; Mehta et al., 2007) Mediantes estudios moleculares se ha demostrado que la estructura de la población de S. schenckii,está integrada filogenéticamente por un conjunto de varias especies (más de 5 especies putativas) prevalentes en distintas áreas geográficas, que pueden incluso identificarse sólo con tecnicas morfofisiológicas ( Marimon et al., 2006-2007; O’Reilly & Atman, 2006). De Meyer et al.(2008), mediante estudios taxonómicos y filogénicos,

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- E. Piontelli et al.

Figura 2. Neosartorya quadricincta. 2,1-2, 2-2,3.- Holomorfo en cultivo en OA, CYA, MA. 2,4.- Conidióforos, vesículas, fiálides, conidios y un asco en OA. 2,5.- Ascoma, ascos y anamorfo en OA. 2,6 -2,7 -2,8 -2,9.- Asco y ascosporas mostrando las 2 crestas prominentes y las 2 bandas laterales. En 2,8.- Se aprecia al mismo tiempo la rugosidad de la ascospora en vista lateral. 2,10.- Conidióforos, vesículas, fiálides, conidios en MA. Barra = 10 µm 83

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describieron 3 nuevas especies en el complex O.stenocerasS.schenckii, desde la madera y el suelo, confirmando al mismo tiempo que las cepas patógenas en humanos forman un conjunto de varias especies crípticas. La ausencia de patógenos primarios en S. magellanicus del complejo S.schenkii en las zonas muestreadas, es una situación favorable desde el punto de vista de un substrato considerado una fuente de infección en varias partes del mundo. A pesar de lo limitado de nuestro muestreo, aporta nueva información sobre la riqueza de sus propágulos como remanentes de posibles grupos funcionales fúngicos asociados a este musgo. Con referencia a su importancia en salud pública y debido a las particulares propiedades físicas que exhibe este substrato deben tomarse precauciones en su manejo y distribución comercial en Chile, debido a la sobrevivencia en el tiempo de ciertos hongos oportunistas, en especial los integrantes del complejo A. fumigatus. Agradecimientos. Se agradece al Sr. Oscar Castro de la ciudad de Tegualda (Comuna de Fresia) la gentileza de haber proporcionado toda la muestra 1.

de Hoog, G.S.; Guarro,J.; Gené, J & Figueras, M.J. (2000). Atlas of clinical fungi, 2º Edition, CBS & Universitat Rovira i Virgili de Me yer, E.M.; Summerbel, R.C.; M oharram, A.M .; de Hoog, G.S.; Vismer, H.F.; Wingfield, M.J.(2008). Taxonomy and phylogeny of new wood-and soil-inhabititing Sporothrix species in the Op hio sto ma ste noc era s-Spo rothrix sche nck ii complex. Mycologia 100:647-661 Do lle nz, O. (198 2). Fitosociología de la Reserva Nacional Magallanes. I. Relevamientos en el área del Cerro Mirador-Río de las Minas. Anales Inst. Patagonia (Chile) 13:171-181 Do msc h, K.H.; Gams, W. & Ander son T-H . (1980 ). Compendium of soil fungi. Vol I. Academia Press, London. Felix, H. (1988). Fungi on briophytes, a review. Botanica Helvetica 98:239-269 Figueroa, H.; San Martín, C. & Ramírez, C. (1999). Análisis multivariable de la vegetación de un complejo turberas en Cordillera Pelada (Valdivia, Chile). Lazaroa 20:95-106 Frank, J-P. (2 008). Diversity, dispersal and biogeography of bryophytes (mosses). Biodivers. Conserv. 17:277-284 Frankland, J.C. (1974 ). Decomposition of coger plants. In: Dikinson, C.H. & Pugh, G.J.F. (eds.) Biology of plant litter decomposition Vol 1. Academic Press, N.Y. pp.3-36 Gams, W. & Bisset, J. (1998). Morphology and identification of Trichod erm a. In: Ku bicek, C.P. & Harman , G.E. (Eds.), Trichoderma and Gliocladium Vol. 1. Basic Biology, Taxonomy and Genetic. Taylor & Francis Ltd. London. pp 3-34 Hambleton, S.; Tsuneda, A . & Currah, R.S. (2003). Comparative morphology and phylogenetic placement of two microsclerotial black fungi from Sphagnum. Mycologya 95: 959-975 Jaffar, A.; Al-Tawfig. & Wools, K.K. (199 8). Dissemina te sporotrichosis and Sporothrix schenckii fungemia as the initial presentation of human inmmunodeficiency virus infections. Clin. Inf. Dis. 26:1403-1406 Klich, M. (2002) .Identificatiob of common Aspergillus species CBS Biodiversity Series, Utrecht. Kredics L.; Antal, Z.; Dóczi, I.; Manczinger, L.; Kevei, F.; Nagy, E. (2003).Clinical importance of the genus Trichoderma. A review.Acta Microbiol. Immunol. Hung. 50:105-17 Lopes-Bezerra, L.M.; Schubach, A. & Costa , R .O. (2006). Sporothrix schenckii and sporotrichosis. Anais Acad. Brasil. Cienc. 78:293-308 Marimon, R.J.; Gene,J.; Cano,J.;Trilles, L.; Dos Santos M.L.; Guar ro, J. (2 006 ). Molecu lar phylogeny of Sp oro thrix schenckii. J. Clin. Microbiol. 44:3251-3256 Marimon, R.J.;Cano ,J.;Ge ne,J.; Sutto n, D.A.; Kawasaki, M.; Guarro, J. (2007). Sporothrix brasiliensis, S.globosa and S. mexicana, Three new Sporothrix species of clinical interest.J. Clin. Microbiol. 45:3198-3206 Markus, N.; Currah, R.S. & Bayley, S.E. (2002). The relative

REFERENCIAS
Aerts, R.; Verhoeven, J.T.A. & Whigham, D. F. (1999). Plantmediated controls on nutrient cycling in temperate fens and bog. Ecology 80:2170-2181 Andrus, R. E. (1986). Some Aspects of Sphagnum ecology. Can. J. Bot. 64:416-426 Ar tz, R. R.; Ande rso n, I. C.; Chapman, S. J.; Hang , A.; Schloter, M.; Potts, J.M.; Campbel, C.D. (2007). Changes in fu nga l community composition in response to vegetation succession during the natural regeneration of cutover peatland. Microbial ecology 54:508-522 Asakawa, Y. (1990). Biologically active substances from bryophytes. In: Chopra, R.N. & Bha tla , S.C. (eds.) Bryophyte development: Physiology and biochemistry, CRC Press, Ann. Arbor. pp. 259-287 Damman, A. (1978). Distribution and movement of elements in ombrotrophic peat bogs. Oikos 30:480-495 Diaz, M. F. & Armesto, J. (2007).Limitantes físicos y bióticos de la regeneración arbórea en matorrales sucesionales de la Isla Grande de Chiloé, Chile. Rev. Chil. Hist. Nat., 80:13-26. Dixon, D.M.; Salkin, I.F.; Dunca, A,; Hurd, N.J.; Haine s, J.H.; Kemna, M.E.; Coles, F.B. (1991). Isolation and characterization of Sporothrix schenckii from clinical and environmental sources associated with the largest US epidemic of sporotrichosis. J. Clin. Microbiol. 29:1106-1113 de Be er, W.W.; Har ringto n, T.C.; Vismer,H.; Wingfield, B.D.; Wingfie ld, M.J . (2003 ).Phylogeny of the Op hio sto ma stenoceras-Sporothrix schenckii complex. Mycologia 95:434-441

84

Microhongos oportunistas asociados al «musgo pompom» desecado Sphagunum magellanicus Brid. en Chile

- E. Piontelli et al.

ability of fungi fron Sphagnum fuscum to descompose selected carbon substrates. Can.J. Microbiol 48:204-211 Markus, N.; Currah, R.S. & Bayley, S.E. (2004). Patterns of distribution of microfungi in decomposing bog and fen plants. Can. J. Bot.82: 710-720 Matteri, C.M. (1998). La diversidad biológica (o sobre como y por qué proteger los musgos). Revista Ciencia Hoy. 46:14-19 Mehta, K.I.S.; Sharma, N.L.; Kanga, A.K.; Mahajan, V.K.; Ranjan, N. (2007). Isolation of Sporothrix schenckii from environmental surces of cutaneous sporotrichosis patient in Himachal Pradesh, India: resuls of a pilot study. Mycoses 50:495-501 Moreau, P-A. (2002). Analyse écologique et patrimoniale des champignon sepérieur dans les tourbières des Alpes du Nord. These pour Diplome de Doctorat, Université de Savoir, France Multistate outbreak of sporotrichosis in seedling handlers (1988). MMWR Morb. Mortal Wkly. Rep.37:652-653 Muñoz,L.; Anticev ic, S.; Silva,V. & Tho mpson, P. (2 006 ). Primer caso de esporotricosis nasal en un canino en Santiago. XX Congr. Panamericano de Ciencias Veterinarias. Santiago 13-16 Nov. O’Reilly, L.C.& Altman, S.A. (2006). Macrorestriction analysis of clinical and environmental isolates of Sporothrix schenckii. J. Clin. Microbiol. 44:2547-2552 Piontelli, E. (199 5). Historia de la micología chilena. Rev. Iberoam. Micol. 12:86-89 Piontelli , E.; Palma , M.A. & Torelli, L. (2006 ). Ectinogonia buquetti Spinola (Coleoptera) vector de Ophiostoma stenoceras (Robak) Malin & Nannf. En bosques de Eucalyptus de la V Región. Boletín Micológico 21:63-60 Pitt, J.I. (2000). A laboratory guide to common Penicillium species. Food Sciences.Australia, Third edition. Po well, K. E.; Taylor, A.; Phillips, B. J .; Blakey, D. L.; Campbell, G. D.; Kaufman, L. Kaplan, W. (1978). Cutaneous sporotrichosis in forestry workers. Epidemic due to contaminated Sphagnum moss Jama 240:232-235 Ramírez, G.C. (1990). El musgo Sphagnum magellanicum en Chile y su comparación con una muestra neozelandesa. Informe técnico. Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. 1990. Redhead, S.A. (1981). Parasitism of bryophytes by agarics. Can. J. Bot. 59:63-67 Rice,A.V.; Tsuneda,A. & Currah, R.S. (200 6). In vitro decomposition of Sphagnum by some fungi resembles white rot of wood. FEMS Microbio. Ecol. 56: 372-382 Samue ls, G.J.; Petrini, O.; Kuhls, K.; Liec kfe ldt, E.; Kubicek, C.P.(1998). The Hypocrea schweiniitzzii complex and Trichoderma sect. Longibrachiatum. Stud. Mycol 41 Samson, R.A.; Hong, S-B. & Frisvad, J.C. (2006). Old and new concepts of species differentiation in Aspergillus. Medical Mycology (Supplement I) 44:S133-S148

Samso n, R.A.; Hong, S-B.; Pete rso n, S.W.; Frisvad, J.C.; Varga, J.(2007 ). Polyphasic taxonomy of Asperg illus section Fumigati and its teleomoorph Neosartorya. Studies in Mycology 59:14 7–207 Swifts, M. (2005). human impacts on biodiversity and ecosystem servic:An overview. In:The fungal community Its Organization and role in the ecosystem.Dighton,J, White, J.F., Oudemans, P. (eds.) Taylor & Francis, Third edition. pp.627-641 Tadesse, M. (2002). Characterization and mode of action of natural plant product against fungal pathogens. Schaller, Aechen. Teneb. E. & Dollenz, O. (2004).Distribución espacial de la flora, la humedad y el pH en un turbal de esfagno (Sphagnum magellanicum Brid.) en Magallanes, Chile. An. Inst. Patag. (Chile) 32:5-12 Thomson, E. P. & Cerda, K. L. (2008). Lo gatos como vectores de Sporothrix schenckii. en congreso de AVEACA, Buenos aires 14 y 15 de agosto. Thorman, M.N.; Currah, R.S.& Bayley, S.E. (2001). Microfungi isolated from Sphagnum fuscum from a southern boreal bog in Alberta, Canada. Bryologist 104:548-559 Thormann, M .N.; & Currah, R.S. & Bayle y, S.E. (2003 ). Succession of microfungal assemblages in decomposing peatland plants. Plant and Soil 250:323-333 Thormann, M .N.; Bayle y, S.E. & Currah, R.S. (2 004 ). Microcosm tests of the effects of temperature and microbial species number on the decomposition of Carex aquatilis and Sphagnum fuscum litter from southern boreal peatlands. Canadian Journal of Microbiology 250:793-802 Thormann, M.N. (2006). Diversity and function of fungi in peatlands: A carbon cycling perspective. Can. J. Soil Sci. 86:281-293 Travassos, L.R. & Lloyd, O. (1980). Sporothrix schenckii and related species of Ceratocystis. Microbiol. Rev. 44:683-721 Tsune da, A.; Chen, H.M . & Currah, R.S. (2001 ). Chara cteristics of a disease of Sp hag num fu scu m caused by Scleroconidioma sphagnicola. Can.J. Bot. 79:1217-1224 Turetsky, M .R.; Wiede r, R.K.& Vitt, D.H. (200 2). Boreal peatland C fluxes under varying permafros regimes. Soil Biol. Biochem. 34:907-9012 Turetsky, M.R. (2003). The role of bryophytes in carbon and nitrogen cycling. Bryologist 106:395-409 Vismer, H.F. & Hull, P.R. (19 97). Preva lence, epidemiology and geographical distribution of Sporothrix schenckii infections in Gauteng, South Africa. Mycopathologia 137:137-143 Villaroel, M.; Biolley, E. & Yañez, E. (2002) Caracterización químico nutricional del musgo Sphagnum magellanicum. ALAN 52:393-399 Zhang, X. & Andrews, J.H. (1993 ). Evidence for growth of Sporothrix schenc kii on dead bat not living sphagnum moss. Mycopathologia 123:87-94

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NOTAS SOBRE EL GENERO Geastrum PERS. EN CHILE CENTRAL
(Notes on the genus Geastrum Pers. in Central Chile)
Hugo Madrid L.
Unitat de Microbiologia, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, Sant Llorenç 21, 43201 Reus (Tarragona), España. Tel: 34-977759350, E-mail: hugo.madrid@urv.cat Palabras clave: Geastrales, Geastrum, Distribución Key words: Geastrales, Geastrum, Distribution

RESUMEN
Se reporta el hallazgo de Geastrum campestre, G. fornicatum y G. pectinatum en la zona central de Chile. Junto a la descripción e ilustraciones de estas especies, se comentan aspectos de su ecología, taxonomía y distribución. G. campestre es nuevo para el catálogo micológico chileno.

ABSTRACT
Geastrum campestre, G. fornicatum, and G. pectinatum are reported from Central Chile. Descriptions and illustrations of these species are provided with comments on their ecology, taxonomy and distribution. G. campestre is new to Chile.

INTRODUCCION
Geastrum Pers. (Geastrales) es un género cosmopolita de basidiomicetos gasteroides que crecen en suelo o madera, y que según Hawksworth et al. (1995) incluiría unas 50 especies. Las fructificaciones de este género son inicialmente globoides o con forma de bulbo, y su peridio consta de dos capas, denominadas exo- y endoperidio. En la madurez el exoperidio se rasga desde el ápice en forma estrellada, dejando ver el endoperidio, que libera los propágulos a través de un ostíolo apical rodeado de un peristoma (Calonge, 1996, 1998). Pese al llamativo aspecto de sus carpóforos, por el cual son conocidos en otros países como «estrellas de tierra» o «earthstars» (Gerhardt et al., 2000; Bates, 2004), y a ser hongos relativamente frecuentes en el centro y sur de Chile, las especies de Geastrum han sido aún poco estudiadas en el país (Montagne, 1850; Espinosa, 1917; Lazo, 1972, 2001). El estudio taxonómico de basidiocarpos recolectados en Chile Central permitió identificar tres especies de Geastrum, Geastrum campestre Morgan, Geastrum fornicatum (Huds.) Hook y Geastrum pectinatum Pers. En el presente trabajo, junto a la descripción e ilustraciones de estas especies, se comentan aspectos sobre su ecología, taxonomía y distribución.
Recibido el 12 Mayo 2008 Aceptado el 23 Agosto 2008

MATERIAL Y METODOS
Los carpóforos fueron recolectados desde suelo, en las localidades de Santiago (Región Metropolitana) y Guacarhue (VI Región). Para la observación de estructuras microscópicas de las especies estudiadas, se realizaron preparaciones de la gleba en KOH 3% y lactofenol. Las medidas de las esporas incluyen la ornamentación. Las colecciones se conservan en el herbario de la Sección Botánica del Museo Nacional de Historia Natural de Chile y en el herbario particular del autor.

RESULTADOS Y DISCUSION Geastrum campestre Morgan, Amer. Naturalist 21:
1027. 1887 (Figuras 1 A-B) Material estudiado: En suelo de un cerro, bajo Acacia caven (Mol.) Mol. Guacarhue, VI Región, Provincia de Cachapoal, Chile. 26-junio-2006. SGO153511. Macroscopía: Carpóforos de 34-41 mm de diámetro x 14-16 mm de altura. Exoperidio rasgado en 7-9 rayos higroscópicos. La capa micelial adhiere abundantes restos vegetales y tierra. Capa carnosa de color café, persistente, agrietada. Capa fibrosa blanquecina. Endoperidio de color blanco sucio, globoide, sobre un corto pedicelo, áspero al tacto, de superficie verrugosa al examinarlo bajo la lupa. Peristoma fuertemente surcado. 87

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Microscopía: Esporas globosas de 6-8 m de diámetro, verrugosas. Capilicio liso de 5-6 m de diámetro, amarillento pálido. Observaciones: G. campestre se diferencia fácilmente del resto de las especies de Geastrum citadas de Chile por su endoperidio fuertemente verrugoso (Calonge, 1998; Lazo, 2001). En el material estudiado, el endoperidio se mostraba muy áspero en estado fresco, cuando los basidiomas aún estaban bien hidratados por la humedad del suelo y por gotas de rocío. Sin embargo, tras secar los basidiomas esta cualidad se hacía menos evidente al tacto. La literatura consultada menciona un hongo muy parecido a G. campestre, llamado G.. pouzarii V.J. Staněk, conocido de Europa y Asia. Esta especie también posee rayos higroscópicos, peristoma surcado, endoperidio verrugoso y esporas fuertemente ornamentadas (Moreno & Ladó, 1984; Calonge, 1996; Esqueda et al., 2003). Calonge (1998) señaló que, por su similitud con G. campestre, G. pouzarii debería considerarse como una variedad de dicha especie, para la cual propuso el nombre G. campestre var. pouzarii (V.J. Staněk) Calonge, caracterizada por sus esporas algo menores (5-7 m diam.) y por la presencia de fisuras radiales en la cara externa de la capa fibrosa. Otras especies (aún no reportadas de Chile), con las cuales G. campestre podría confundirse son G. berkeleyi Massee y G. kotlabae V.J. Staněk. A nivel macroscópico, G. berkeleyi es muy similar a G. campestre, con endoperidio verrugoso y peristoma surcado, pero posee rayos no higroscópicos. Además sus esporas no superan los 7 m de diámetro (Calonge 1996; Bates, 2004). G. kotlabae tiene rayos higroscópicos y peristoma surcado, pero el endoperidio es farinoso y sus esporas tampoco exceden los 7 m de diámetro (Calonge, 1998). G. campestre se ha reportado previamente de Estados Unidos, México, Australia, Europa, Sudáfrica y Bolivia (Bates, 2004; Rocabado et al., 2007). Esta especie crece en el suelo, en áreas despejadas, en pastizales o entre la hojarasca, bajo especies de Acacia Mill., Juniperus L., Pinus L., Prosopis L. y Quercus L. (Smith, 1951; Jeppson, 1987; Calonge et al., 1992; Moyersoen & Demoulin, 1996; Calonge, 1998; Bates, 2004). El material estudiado, recolectado de suelo bajo Acacia caven («espino»), un árbol autóctono de la zona central de Chile, constituye un nuevo registro para el catálogo micológico nacional.

39-54 mm de diámetro x 45-65 mm de altura. Exoperidio rasgado en 4 rayos no higroscópicos. La capa micelial forma en el suelo una estructura gruesa y resistente, similar a una copa, que adhiere restos vegetales, tierra y piedrecillas, sobre la cual se apoyan las puntas de los rayos de la capa fibrosa. Capa fibrosa de color café, con restos secos de la capa carnosa adheridos a su superficie. Endoperidio de 13-18 mm de diámetro x 9-12 mm de altura, globoide, de color gris a café oscuro, sobre un pedicelo de hasta 3 mm de longitud. Peristoma fimbriado, no delimitado. Microscopía: Esporas de 4,3-5,8 m de diámetro, globosas, verrugosas, de color café. Capilicio de 4-11 m de diámetro, de color café, con paredes gruesas. Observaciones: G. fornicatum se caracteriza por poseer carpóforos abovedados, peristoma fimbriado, mal delimitado o sin delimitar, capa micelial ciatiforme hipogea y esporas verrugosas (Calonge, 1984; Ochoa, 1993; Bates, 2004; Leite et al., 2007). Es un hongo frecuente en el Cerro San Cristóbal, Santiago, donde fue observado en varias oportunidades entre los años 2005 y 2006. En Chile se han reportado 2 especies de Geastrum con fructificaciones abovedadas, G. fornicatum y G. jurei Lazo, muy similares entre sí. De acuerdo a Lazo (1972, 2001), estos hongos pueden diferenciarse si se observan el endoperidio y el peristoma, siendo ambas estructuras concoloras en Geastrum fornicatum, mientras que en G. jurei el peristoma es de color café grisáceo pálido y el endoperidio es café oscuro con tintes violáceos. Calonge (1998), en su monografía de hongos gasteroides ibéricos, menciona 2 especies adicionales, hasta el momento no reportadas de Chile, con las que podría confundirse G. fornicatum, éstas son G. welwitschii Mont. y G. quadrifidum Pers.:Pers. A diferencia de G. fornicatum, G. welwitschii posee una capa micelial ciatiforme epigea, que no adhiere restos del sustrato y tiene un rizomorfo bién desarrollado. Por otra parte, G. quadrifidum se distingue de G. fornicatum por poseer un peristoma bien delimitado. G. fornicatum es un taxón humícola que fructifica bajo planifolios, tales como Quercus, Acacia y Prosopis (Ochoa, 1993; Calonge, 1998; Bates, 2004). En Chile, este hongo se distribuye por las zonas central y austral (Lazo, 2001). G. fornicatum también se ha reportado de Estados Unidos, México, Europa, Sudáfrica, Australia, Brasil y Argentina (Ochoa, 1993; Calonge, 1998; Bates, 2004; Leite et al., 2007).

Geastrum fornicatum (Huds.) Hook., Fl. Londinensis
4: 575. 1821 (Figura 1 C) Material estudiado: En suelo, entre la hojarasca de planifolio no determinado. Santiago, Cerro San Cristóbal, Región Metropolitana, 4-octubre-2005. SGO153512. Macroscopía: Carpóforos inicialmente globoidedeprimidos. En la madurez, los carpóforos abiertos alcanzan 88

Geastrum pectinatum Pers. ex Pers., Syn. Meth. Fung.: 132.1801 (Figura 1 D-E) Material estudiado: En suelo. Santiago, Cerro San Cristóbal, Región Metropolitana, 11-junio-2006. SGO 153513. Macroscopía: Carpóforos de 28-38 mm de diámetro x 14-32 mm de altura. Exoperidio abierto en 10-12 rayos no

Notas sobre el género Geastrum Pers. en Chile Central - H. Madrid .

Figura 1. Basidiocarpos de: A, B. Geastrum campestre; C. G. fornicatum, en distintas etapas de maduración; D, E. G. pectinatum. La flecha en E señala las típicas estrías en la apófisis que caracterizan a esta especie. higroscópicos, recurvados. La capa micelial adhiere abundantes restos vegetales y tierra. Capa fibrosa de color café, con la superficie interna parcialmente cubierta por restos secos de la capa carnosa. Endoperidio globoide, de color gris a beige, algo farinoso, de 10-13 mm de diámetro x 7-12 mm de altura, sobre un pedicelo de 1-2 mm de altura. Peristoma cónico, surcado. Apófisis estriada. Microscopía: Esporas de 7- 8 m de diámetro, 89

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globosas, de color café, fuertemente verrugosas. Capilicio de 5–6 m de diámetro, de color café claro, con paredes gruesas. Observaciones: G. pectinatum es un hongo fácil de reconocer en el campo, caracterizado por sus rayos no higroscópicos, peristoma surcado y apófisis estriada (Breitenbach & Kränzlin, 1986; Martín, 1988; Castro et al., 1993; Baseia et al., 2003; Calonge et al., 2005). La presencia de estrías radiales en la apófisis permite diferenciar a G. pectinatum de especies similares, tales como G. striatum DC. y G. nanum Pers. (no reportadas de Chile) (Calonge, 1998). Las dimensiones de las esporas muestran gran variabilidad en G. pectinatum. A modo de ejemplo se puede mencionar que Baseia et al. (2003) encontraron, en material colectado en Brasil, medidas esporales de 4-4,5 m, incluyendo la ornamentación, mientras que Breitenbach & Kränzlin (1986), en su monografía de hongos de Suiza, describen esporas de 4-6 m de diámetro, sin considerar la ornamentación, compuesta por verrugas de hasta 1 m de longitud. El material chileno estudiado se acerca más a la descripción dada por estos últimos autores. G. pectinatum crece en suelo. Según Baseia et al. (2003), la distribución de esta especie abarca Estados Unidos, México, Argentina, Brasil, Bélgica, Francia, España, Inglaterra, Noruega, Suecia, Islas Aland, Australia, Sudáfrica, El Congo y China. En Chile, Espinosa (1917) cita esta especie como Geaster pectinatus, sin precisar la localidad. AGRADECIMIENTOS A las señoras Elizabeth Barrera, Mélica Muñoz e Inés Meza, de la Sección Botánica del Museo Nacional de Historia Natural de Chile, por las facilidades otorgadas para el trabajo de laboratorio. Al Dr. Eduardo Piontelli, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valparaíso, por facilitar información sobre la distribución de especies estudiadas. A la señorita Laura Clavijo, por su colaboración técnica. A los expertos que han revisado el manuscrito original, por sus valiosos comentarios.

Calonge, F.D. (1984). Adiciones y correcciones al catálogo del género Geastrum en España. Bol. Soc. Micol. Castellana 8:83-92 Calonge, F.D. (199 6). Claves de identifica ción de los Gasteromycetes epigeos ibéricos. Bol. Soc. Micol. Madrid 21:35937 3 Calonge, F.D. (199 8). Ga steromycetes I. Lycoperdales, Nidulariales, Phallales, Sclerodermatales, Tulostomatales. Flora Mycologica Iberica 3:1-271 Calonge, F.D.; Caballero , A. & Palac ios, J . (1992 ). Contribución al conocimiento de los hongos de La Rioja (Logroño, España). Gasteromycetes. Bol. Soc. Micol. Madrid 16:115-140 Calonge, F.D.; Mata, M. & Carranza, J. (2005). Contribución al catálogo de los Gasteromycetes (Basidiomycotina, Fungi) de Costa Rica. An. Jard. Bot. Madrid 62:23-45 Castro, M.L.; Fre ire, L. & Calo nge, F.D. (1 993). Catálogo provisional de los Gasteromycetes de Galicia (España). Bol. Soc. Micol. Madrid 18:87-104 Esque da, M.; Herrera, T.; Perez-Silva, E. & Sanche z, A. (20 03). Distribution of Gea strum species from some priority regions for conserva tion of biodiversity of Sonora, Mexico. Mycotaxon 87 :445-456 Espinosa, B.M. (1917 ). Informe del encargado de la sección plantas criptógamas. Bol. Mus. Nac. Chile 10:186-187 Gerhardt, E., Vila, J. & Llimona, X. (2000). Hongos de España y de Europa. Manual de identificación. Ediciones Omega. Barcelona. Hawksworth, D.L.; Kirk, P.M.; Sutton, B.C. & Pegler, D.N. (1995). Ainsworth & Bisby‘s dictionary of the fungi. 8 ed. CAB international, Wallingford. Jeppson, M. (1987). Notes on some Spanish Gasteromycetes. Bol. Soc. Micol. Madrid 11:267-282 Lazo, W. (1972). Fungi from Chile I. Some Gasteromycetes and Agaricales. Mycologia 64:786-798 Lazo, W. (2001). Hongos de Chile. Atlas Micológico. Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile. Santiago. Leite, A.G.; Calonge, F.D. & Baseia, I.G. (2007). Additional studies on Ge astrum from northeastern Bra zil. Mycotaxon 101 :103-112 Martín, M.P. (198 8). Aportación al conocimiento de las higroforáceas y los gasteromicetes de Cataluña. Vol. 2. Ediciones especiales de la Societat Catalana de Micología. Barcelona. Montagne, C. En : Gay, C. (1850). Historia Física y Política de Chile. Botánica. Tomo 7. Museo de Historia Natural de Santiago; E. Thunot y Ca. París. Moreno, G. & Ladó, C. (1984). Estudios sobre el género Tulostoma y Geastrum (Gasteromycetes). Lazaroa 6:217-225 Moyersoen, B. & Demoulin, V. (1996). Les Gasteromycetes de Corse : Taxonomie, ecologie et chorologie. Lejeunia n.s. 152:112 8

REFERENCIAS
Baseia, I.G.; Cav alc anti, M .A. & Milane z, A.I. (2003 ). Additions to our knowledge of the genus Geastrum (Phallales: Geastraceae) in Brazil. Mycotaxon 85:409-416. Bates, S. (200 4). Arizona members of the Ge astrac eae and Lycoperdaceae (Basidiomycota, Fungi). Tesis para optar al grado de Master of Science. Arizona State University, Tempe. Breitenbach, J. & Kränzlin, F. (1986). Fungi of Switzerland. Vol. 2, Heterobasidiomycetes, Aphyllophorales and Gasteromycetes. Mycological Society of Lucerne. Lucerne.

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Notas sobre el género Geastrum Pers. en Chile Central - H. Madrid .
Ochoa, C. (1993). Contribución al estudio taxonómico, ecológico y corológico de la clase Ga steromycetes se nsu lato en Ba ja California, México. Tesis de doctorado. Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. Ro cabado , D.; Wright, J .; M aillar d, O. & M uchenik, N. (2007). Catálogo de los Gasteromycetes (Fungi: Basidiomycotina) de Bolivia. Kempffiana 3:3-13 Smith, A.H. (195 1). Pu ffballs a nd their allies in Michiga n. University of Michigan Press, Ann Arbor. USA.

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CURSO
HONGOS EN ALIMENTOS Y AMBIENTES INTERNOS Universidad de Valparaíso, Escuela de Medicina, Cátedra de Micología. Valparaíso. Chile 3-7 Agosto 2009 Curso intensivo teórico práctico (41 horas), orientado a profesionales que se desempeñan en el area de la microbiología, para capacitar a profesionales (Ingenieros en alimentos, tecnólogos, biológos, químicos farmaceúticos u otros) en el manejo básico de la taxonomía fúngica a nivel de géneros y especies en hongos filamentosos. Contenidos del curso: Generalidades de los hongos, morfología, fisiología y ecología. Sistemas reproductivos, tipos de propágulos de

dispersión, nociones de sistemática. Grupos taxonómicos a incluir: representates de los Mucorales, Eurotiales, Hypocreales, Sordariales y sus anamorfos asociados. Patrones de conidiogénesis, sistemática actual de los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Métodos de cultivo. Laboratorio: Manejo de lupa estereoscópica para la observación de colonias fúngicas en diferentes medios de cultivo y ambientes (aire, vegetación, alimentos, suelo, etc.). Preparaciones microscópicas para la identificación a nivel de género y especie en los medios específicos correspondientes. El laboratorio abarca el 80% de las horas del curso. Cupo: 20 personas. Inscripciones e informaciones: Fono 32-2507370, Fax 322507375, @mail: anamaria.carreno@uv.cl

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