INTRODUCCIN

El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla
compleja de protenas. Estas existen en una combinacin con carbohidratos o
lpidos, que puede ser fsica o qumica. Actualmente todos los mtodos para
determinar el contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica.
Un mtodo absoluto es el aislamiento y pesado directo de la protena pero dicho
mtodo se utiliza slo a veces en investigaciones bioqumicas debido a que es
dificultoso y poco prctico
En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el mtodo ms usado en
la actualidad para el anlisis de protenas (mtodo Kjeldahl) mediante la
determinacin del nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y
otros componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico
en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total se convierte mediante
esta digestin en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una
base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solucin de cido
brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl (o
H2SO4) estandarizado para determinar el nitrgeno contenido en la muestra.
El resultado del anlisis es una buena aproximacin del contenido de protena
cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no
proteicos.
El mtodo Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utiliz
permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin (digestin),
sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo
se descart. En 1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la digestin
utilizando cido sulfrico y aadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso
aadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullicin del cido sulfrico
utilizado en la digestin para disminuir el tiempo de la reaccin.
En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado
CuSO4.5H2O como catalizador

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL

DIGESTIN
catalizadores

(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

protena

calor

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN
(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH

(3) NH3 + H3BO3 (cido brico)

2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

NH4 + H2BO3- (in borato)

TITULACIN
El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con HCl (o
H2SO4)estandarizado:
(4) H2BO3- + H+

H3BO3

Material

Bureta de 0.01
Balanza analtica de precisin
1 Unidad de digestin, 1 unidad scrubber, 1 bomba de circulacin de agua
(KJELDAHL)
1 aparato destilador KJELDAHL

Reactivos
Reactivos preparados:
Es aconsejable la utilizacin de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o
H2SO4) de valoracin. Cualquier error en su preparacin puede afectar
directamente al resultado de la determinacin.
Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas:

cido Brico (en polvo) 99.5%

Indicador mixto 4.8 ( 5) RV

(Rojo metilo + Verde de Bromocresol)

Indicador mixto 4.4 RV

(Rojo metilo + Azul de Metileno)

HCl 0.1N SV (acido clorhidricio)

HCl 0.25N SV
H2SO4 0.1N SV (acido sulfrico)
H2SO4 0.2N SV
Sodio Hidrxido 40% RE

(Para determinacin de N)

Acetanilida 99% (Patrn para validacin)

Amonio sulfato (Patrn para validacin)

Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8g

Preparacin de la solucin fijadora de amonaco

1.- Con indicador Mixto 4.8 ( 5)
Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora:

Pesar 10g de Acido Brico (en polvo)

Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
Aadir 15ml de Indicador mixto 5.

2.- Con indicador mixto 4.4

Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora:

Pesar 10g de cido Brico (en polvo)

Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
Aadir 10ml de Indicador mixto 4.4.

PROCEDIMIENTO
REPARACIN DE LA MUESTRA
1. Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.
2. Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.
3. En muestras con contenidos de nitrgeno muy pequeo, tomar la muestra
suficiente para que contenga como mnimo 5 mg de nitrgeno.
DIGESTIN
Aadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO4 (acido sulfrico)96-98% y 1
tableta (8 gm) de catalizador.
(Para el tubo micro, el mximo de H2SO4 es 5ml)
Montar un sistema para la extraccin de humos o scrubber con
Na2CO3(carbonato de sodio).
Realizar la digestin en tres pasos:
1. En funcin del contenido de agua de la muestra, empezar la digestin
evaporando agua a 150C entre 15 y 30 minutos.
2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300C entre 15 o 30 minutos para
reducir la produccin de humos blancos.
3. Continuar la digestin a 400C entre 60 y 90 minutos.

Algunos ejemplos:
Paso1: 150C / 30

Queso o carne:
Paso 2 : 270C / 30

Paso 3: 400C / 90

Paso1: 150C / 15

Cereales:
Paso 2 : 300C / 15

Paso 3: 400C / 60

Control Visual: El resultado es un lquido transparente ntido con coloracin

azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben
quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.
Nota: Durante la digestin debe controlarse la produccin de espuma en las
muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso n 1.

DILUCIN
Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a T ambiente.
(Puede forzarse sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua).
Aadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo.
Aadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es
necesario calentar ligeramente el tubo (por ej. introducindolo en el bloque
digestor todava caliente)
Dejar enfriar de nuevo hasta T ambiente.
Para evitar prdidas de nitrgeno y reacciones violentas no introducir el tubo
todava caliente al destilador.
DESTILACIN
Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de cido
Brico y unas gotas de indicador.
Programar una dosificacin de 50 a 75 ml de NaOH.
Introducir el tubo con la muestra en el destilador.
Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Brico + 200ml de
destilado).
Control Visual: Una vez se ha aadido el NaOH, la muestra debe tomar una
coloracin azulada, de no ser as, aadir ms NaOH.
VALORACIN Y CLCULO
Valorar el destilado con HCl H2SO4 hasta el cambio de color. (punto final: pH
4.65)
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra
Realizar el clculo:
mg N = N x V x 14
Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin
V = Volumen de cido consumido
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Para pasar a contenido de protenas corregir por el factor adecuado segn la
naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto)
Peridicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.
% Protenas = P2/P0 x 100 x F

Donde:
P2: Nitrgeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor protenico.
(6.25 por defecto)

Factor protico de algunos alimentos:

Almendras
Nueces
Nueces - cacahuetes
Gelatina
Soja 5
Cebada,avena,centeno
Trigo, harina entera
Harinas (no entera)
Arroz
Maz 6
Todos los otros alimentos
Salvado 6
Leche y lcteos

5.18
5.30
5.41
5.55
5.71
5.83
5.83
5.70
5.95
6.25
6.25
6.31
6.38

VERIFICACIN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA

Esta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del
proceso completo del anlisis del nitrgeno Kjeldahl que incluye las etapas de
digestin, destilacin y valoracin.
Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta
se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrgeno detectado.
El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denomina
recuperacin de Nitrgeno.
Para realizar sta verificacin se utiliza la Acetanilida.
Preparar la muestra:
Contenido de nitrgeno de una muestra de Acetanilida :
Frmula: C8H9NO
Peso molecular: 135.17
Factor: 14 / 135.17 = 0.1035
mg de Nitrgeno = 0.1035 * mg de Acetanilida
Pesar alrededor de 250mg de acetanilida. El peso exacto ser P0
La cantidad exacta de Nitrgeno es:
P1 (mg) = P0 x 0,1035
Digestin de la muestra:
Colocar la acetanilida en un tubo, aadir 10ml de cido sulfrico 98% y una
tableta de catalizador Kjeldahl.
Digerir a 400C durante 1h. (El resultado debe ser un lquido transparente con
coloracin azul.)
Dejar enfriar y aadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones
para evitar salpicaduras. La reaccin del agua sobre el cido sulfrico es
violenta.
Destilar:

 Destilar aadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N para la valoracin.

Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2
Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25).
V = Volumen de cido consumido.
14 = Peso atmico del nitrgeno.
P2 = N x V x 14
Calculamos la recuperacin:
R(%) = P2 / P1 *100
La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

Bibliografa
A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists.
Official Methods of Analysis. Washington, D.C.
Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of
Foods. Ed. Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212.
Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable
Products. Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.
Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and
Practice. 2. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.