I.

INTRODUCCION

Los callos de plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y

de rpido crecimiento que pueden ser producidas en todas las especies de plantas
en respuesta a un suplemento de hormonas endgenas o externas. Los cultivos
de callos de plantas (Callos que crecen aspticamente en medios semislidos con
agar y hormonas vegetales) y cultivos de suspensin de callos (callos que crecen
aspticamente en medio liquidos en matraces o bioreactores) han incrementado
su uso en biotecnologa como una herramienta para la manipulacin gentica de
plantas, micropropagacion, estudios del metabolismo y de desarrollo celular de
plantas, asi como para produccion comercial de productos naturales (Metabolitos
primarios y secundarios).
En la presente prctica se trabajar con segmentos de hojas de caf, para
inducir la formacin de callos.

OBJETIVO

Familiarizar al estudiante con las tcnicas de cultivo de vegetales in vitro

y establecer cultivos de callos.

II.
2.1.

Materiales

2.2.

2.3.

MATERIALES Y MTODOS

Hojas de caf del tercer par.

3 vasos precipitado de 250 ml.
2 pipetas de 1 ml.
1 piceta de 250 ml.
2 placas Petri
Hojas de papel blanco o papel Kraft (esteril)
Algodn
Bistur, navajas de bistur y pinzas de diseccion

Equipos

Campana de flujo laminar

Autoclave
Potencimetro
Balanza analtica

Hotplate stirrer.

Reactivos

Medio Murashige & skoog (1962)

Etanol al 70%
Solucin de hipoclorito de sodio: blanqueador comercial (5.5% de cloro

libre) al 1%.
Hormona vegetal: 2,4D
HCL 1.0 N
NaOH 1.0 N
litro de agua destilada estril.

2.4. Metodologia

Preparar medio de cultivo MS semislido en placas peri,

completamentado con 2,4-D 10.0 mg/L, sacarosa 30 g/L y agar-agar 8.0

g/L y vitaminas.
Utilizar hojas de caf del tercer par en la rama.
Lavar cuidadosamente las hojas con agua corriente y detergente dentro

de un recipiente agitado manualmente.

Sumergir las hojas hojas por 15 minutos en solucin de fungicida al

0.2%.
Sumergir las hojas por 1 minuto en solucin de alcohol al 70%.
A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar.
Sumergir las hojas en una solucin de hipoclorito de sodio al 1%,

durante 10 minutos.
Enjuagar el material vegetal tres veces con agua destilaa y esteril, con

agitacin dentro de un beaker, durante 3 minutos cada uno.

Del beaker, tomar cada hoja y sobre una placa Petri, seleccionarla

segmento cuadrados de 1 centimetro del medio de cultivo.

Selle las placas con una cinta plstica y colquelas en un cuarto de
cultivo en fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 de oscuridad a una

temperatura de 24 26 C.
Observar cada tres das el desarrollo de los cultivos, anotar las
apariencias y cambios

que van sufriendo lo explantes. Separar los

frascos con explantes necrosados y contaminados y describir si se trata

de contaminacin bacteriana o fngica.

Es de particular importancia determinar el tiempo de aparicin de callos.

III.

RESULTADOS

Figura 1.

Fungicida agrcola utilizado para la desinfeccin de las hojas del

caf.

Figura 2.

Preparacin del fungicida para luego sumergir en ella las hojas del
caf.

Figura 3.

Figura 4.

Sumergimiento de las hojas de caf en la solucin de fungicida.

Hojas de caf sumergidas por 1 minutos en solucin de alcohol al

70%.

Figura 5.

Cmara de flujo laminar donde se enjuagara con agua destilada las

hojas de caf.

Figura 6. Una vez enjuagado las hojas de caf, se procede a extraer segmentos
de ella para posteriormente cultivarlas en placa Petri.

Figura 7.

Siembra de los segmentos de las hojas de caf en las placas petris.

Figura 8.

Placa Petri sellada y etiquetada.

IV.

DISCUSIN

Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o

100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solucin madre se pueden mezclar
varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de precipitacin.
Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para mantener su
disponibilidad durante el cultivo.
Cuadro 1.

Composicin del medio de cultivo de murashigue & skoog (1962) a

media concentracin (1/2 MS)

Hormonas
Macronutrientes
Micronutrientes
Fe-EDTA
Mioinositol
Gilicina
cido nicotnico
Piridoxina-HCl
Tiamina-HCl
2,4 D
Azcar
pH
Agar

Stock
10X
100X
100X
100X
100X
100X
100X
100X
2000 mg/l
--5.5
---

V.

Conc. Final
0.5X
0.5X
0.5X
1X
1X
1X
1X
1X
10 mg/l
30 g/l
5.5
8 g/l

1000 ml
50 ml
5 ml
5 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
1 ml
30 g
5.5
8g

CONCLUSIN

La presente practica se realiz segn el mtodo descrito el cual es eficiente para

inducir callos in vitro en hojas, de Coffea arabica, siendo los explantes de hojas los
ms idneos para la obtencin de callos. Este mtodo tambin establece una
fuente constante de material para la conservacin ex situ, el cual puede ayudar
para muchos futuros trabajos de investigacin.
VI.

BIBLIGRAFA

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15: 473-497.
REY, H.Y.; MROGINSKI, L. A.; SCOCCHI, A.M. 1995. Embriognesis somtica en
especies ctricas por cultivo de nucelas. Hort. Arg., 14 (36): 54-64.

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE AGRONOMA

PRACTICA N 5

ESTABLECIMIENTO DE SEGMENTOS DE HOJAS DE CAF

(coffea arabica), PARA LA INDUCCION DE CALLOS

CURSO

BIOTECNOLOGIA VEGETAL

PROFESOR :

M. Sc. CHIA WONG, JULIO ALFONSO

ALUMNA

GUEVARA TERRONES, LUIS ENRIQUE

SEMESTRE :

2016 I

TINGO MARA PERU

2016