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Tesis68 PDF
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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para obtener el ttulo de
BIOLOGA
DIRECTORA
CLAUDIA RAMIREZ SANDOVAL
Unidad de Biotecnologa Vegetal
Seores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Bogot
Estimados Seores:
Yo Ana Mara Afanador, identificada con C.C. No. 52.928.051 de Bogot, autor del trabajo de grado
titulado Propagacin in vitro a partir de meristemos de cinco variedades comerciales de Dianthus
caryophyllus l. (clavel), presentado como requisito para optar al ttulo de Biloga en el ao de 2005;
autoriz a la Universidad Javeriana a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrnico con el fin de ofrecerlo para la consulta en la
Biblioteca General. Si
b) Poner a disposicin para la consulta con fines acadmicos, en la pgina web de la Facultad, de
la Biblioteca General y en redes de informacin con las cuales tenga convenio la Universidad
Javeriana. Si
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar
en concursos de trabajos de grado. Si
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la
facultad tenga convenio de intercambio de informacin, para que este sea consultado en las
bibliotecas y centros de documentacin de las respectivas entidades. No
e) Todos los usos, que tengan finalidad acadmica. Si
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el
artculo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artculo 11 de la Decisin Andina 351 de 1993, los cuales son
irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que
se consulte la obra, mediante cita bibliogrfica se debe dar crdito al trabajo y a su(s) autor(es).
Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad
Acadmica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir
de la actividad acadmica.
___________________________
Ana Mara Afanador
C.C 52.928.051 de Bogot
NOTA DE ADVERTENCIA
alumnos en sus trabajos tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia
APROBADO
Ivn Cruz
Ingeniero Agrnomo
Jurado
Daniel Zapata
Ingeniero Industrial
Jurado
AGRADECIMIENTOS
JUNIO DE 2005
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN...16
ABSTRACT.17
1. INTRODUCCION ............................................................................................ 18
2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA ...................................... 20
2.1 Dianthus caryophyllus l. (Clavel) ............................................................... 20
2.1.1 CLASIFICACIN BOTNICA ......................................................................... 20
2.1.2 DESCRIPCIN BOTNICA ........................................................................... 20
2.1.3 ORIGEN E HISTORIA .................................................................................. 21
2.1.4 ZONAS DE PRODUCCIN ........................................................................... 22
2.1.5 VARIEDADES ............................................................................................ 22
2.1.6 CULTIVO Y PRODUCCIN ........................................................................... 23
2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la produccin ................. 24
2.1.6.1.1 Temperatura
24
2.1.6.1.2 Suelo
24
2.1.6.1.3 Riego
24
2.1.6.1.4. Nutrientes
24
2.1.7 PLAGAS Y ENFERMEDADES ....................................................................... 25
2.1.7.1 Plagas.............................................................................................. 25
2.1.7.1.1 caros
25
2.1.7.1.2 fidos
26
2.1.7.1.3 Trips
26
2.1.7.1.5 Nemtodos
26
2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias ........................... 27
2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular
27
2.1.7.2.2 Botritis
27
2.1.7.2.3 Roya del clavel
27
2.1.7.2.4 Mancha foliar
28
2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus .................................................. 28
2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM)
28
2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV)
29
2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV)
29
vii
viii
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 58
4.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................... 58
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................. 58
5. MATERIALES Y MTODOS.......................................................................... 59
5.1 DISEO DE LA INVESTIGACIN ...................................................................... 59
5.1.1 Diseo experimental del Componente I. Atenuacin del CarMV........ 60
5.1.2 Diseo Experimental del Componente II. Proceso de Micropropagacin
del Material Vegetal..................................................................................... 61
5.1.3 Poblacin de estudio y muestra ......................................................... 62
5.1.4 Variables del estudio. ......................................................................... 63
5.4.1.1 Componente I. Atenuacin del CarMV
63
5.4.1.2 Componente II. Proceso de Micropropagacin del Material Vegetal
64
5.2 MTODOS ................................................................................................... 66
5.2.2 Termoterapia ...................................................................................... 68
5.2.3 Deteccin de partculas virales........................................................... 69
5.2.3 Micropropagacin del Material Vegetal .............................................. 71
5.2.3.1 Establecimiento de meristemos in vitro
72
5.2.3.1.1 Desinfestacin ...................................................................... 72
5.2.3.1.2 Obtencin y siembra del explante ........................................ 72
5.2.3.1.3 Medio y condiciones fsicas del cultivo ................................. 73
5.2.3.2 Propagacin in vitro
73
5.2.3.3 Enraizamiento in vitro
74
5.3 RECOLECCIN DE LA INFORMACIN ............................................................. 74
5.4 ANLISIS DE LA INFORMACIN ...................................................................... 75
5.4.1. Componente I. Atenuacin del CarMV .............................................. 75
5.4.1.1Prueba no paramtrica de Kruskall Wallis
75
5.4.1.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan
76
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagacin ................................. 76
5.4.2.1 Anlisis de Varianza (ANOVA)
76
5.4.2.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan
77
ix
LISTA DE TABLAS
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquejes de Dianthus caryophyllus, durante la etapa de enraizamiento en
los invernaderos de la empresa floricultora...............................................................67
Figura 2. Esquejes de cinco variedades de clavel durante el mtodo de termoterapia
en una Cmara de crecimiento (fitotron) a temperatura constante de 38C.
Instalaciones de la Unidad de Biotecnologa Vegetal PUJ........................................68
Figura 3. Metodologa empleada para la atenuacin del CarMV .............................70
Figura 4. Esquema de las fases realizadas en condiciones in vitro. Establecimiento
de meristemos, multiplicacin y enraizamiento. Medio Murashige & Skoog (MS).
Kinetina (Kin), Acido indolactico (AIA).....................................................................71
Figura 5. Meristemo apical del esqueje de Dianthus caryophyllus. A. Meristemo
ubicado en el cono primordial del esqueje. B. Meristemo apical extraido del esqueje.
..................................................................................................................................73
Figura 6. Resultados de la prueba DAS ELISA, en las cinco variedades y con
cada mtodo de atenuacin de virus, a partir de los valores promedio de
absorbancia (nm). .....................................................................................................79
Figura 7. Efecto de los mtodos para la atenuacin del virus moteado de clavel
(CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel. ...............................................81
Figura 8. Porcentaje de supervivencia de los esquejes sometidos a termoterapia.83
Figura 9. Nmero de brotes desarrollados y perdidos para cada variedad en el
proceso de micropropagacin ...................................................................................85
Figura 10. Esquejes de la variedad Picote Vanesa luego de ser sometidos al
mtodo de termoterapia. A) Grupo I. B) Grupo II. .....................................................86
Figura 11. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de establecimiento
in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus...............................................87
Figura
12. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de
establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.....................88
Figura 13. Tasa de multiplicacin en el ciclo de propagacin 1, para las variedades
Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel. .................................90
Figura 14. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en el ciclo de multiplicacin 1
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................90
xii
xiii
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Composicin del medio nutritivo Murashige & Skoog (MS) (1962) .........127
Anexo 2. Resultados de la prueba ELISA (valores de absorbancia nm) en cada
mtodo de cada variedad ........................................................................................128
Anexo 3. Componente I Atenuacin del CarMV. Prueba de Normalidad de la prueba
ELISA para los 3 mtodos.......................................................................................128
Anexo 4. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba de Homoestacidad de la
prueba ELISA para los 3 mtodos...........................................................................129
Anexo 5. Tabla de los tratamientos (mtodo y variedad) para aplicar la prueba
Kruskall Wallis ......................................................................................................129
Anexo 6. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba Kruskall Wallis para las
variables mtodo y variedad ...................................................................................130
Anexo 7. Componente I. Atenuacin del CarMV . Prueba Duncan para las variables
mtodo y variedad...................................................................................................130
Anexo 8. Componente II. Proceso de micropropagacin Establecimiento in vitro.
Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Primera Fecha)........................131
Anexo 9. Componente II. Proceso de micropropagacin Establecimiento in vitro.
Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Primera Fecha). .......................132
Anexo 10. Componente II. Proceso de micropropagacin Establecimiento in vitro.
Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Segunda Fecha). .....................132
Anexo 11. Componente II. Proceso de micropropagacin Establecimiento in vitro.
Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Segunda Fecha). .....................133
Anexo 12. Componente II. Proceso de micropropagacin Propagacin in vitro.
Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicacin (Ciclo de
Multiplicacin 1).......................................................................................................133
Anexo 13. Componente II. Proceso de micropropagacin Propagacin in vitro.
Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicacin (Ciclo de
Multiplicacin 1).......................................................................................................134
Anexo 14. Componente II. Proceso de micropropagacin Propagacin in vitro.
Prueba ANOVA para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 1).........134
Anexo 15. Componente II. Proceso de micropropagacin Propagacin in vitro.
Prueba Duncan para la variable Tasa de prdida (Ciclo de Multiplicacin 1). .......135
14
15
RESUMEN
16
ABSTRACT
The main object of the following project was to develop a methodology for the
micropropagation
of
five
different
commercial
varieties
of
Dianthus
17
1. INTRODUCCION
Sin
embargo,
los
mtodos
18
de
propagacin
vegetativa
16 % en la produccin de flores
con
condiciones
fitosanitarias
adecuadas
para
19
CLASE: Dicotiledonea
SUBCLASE: Caryophyllidae
ORDEN: Caryophyllales
FAMILIA: Caryophyllaceae
SUBFAMILIA: Silenoideae
GENERO: Dianthus
ESPECIE: Dianthus caryophyllus L.
Nombre Cientfico: Dianthus caryophyllus L.
Nombres Comunes: Clavel, Clavel del poeta
20
El inters comercial por esta especie data de inicios del siglo XVI, poca en
la que se realizaron los primeros mejoramientos. Las variedades de claveles
de floracin permanente fueron desarrolladas en Francia en 1840 e
introducidas a Amrica en 1852 (Larson, 1992).
Los europeos son los ms fciles de cultivar, ya que se adaptan al aire libre
sin el uso de tecnologa. El Sim es el mejor remunerado, tiene mayor calidad
y es comercializado por el floricultor tecnificado. Durante el invierno es
21
2.1.5 Variedades
En la produccin comercial para flor cortada se cultivan tres tipos de clavel:
Americano o Sim, Europeo y Miniatura o Spray. Dentro de dichos tipos existe
un gran nmero de variedades que se diferencian por su color, textura del
ptalo, resistencia o susceptibilidad a enfermedades, adaptabilidad al aire
libre o invernadero y rendimiento. Basndose en estas caractersticas, el
floricultor selecciona las variedades de acuerdo con las condiciones
ambientales y demandas del mercado (Larson, 1992).
22
Las flores de los claveles Americanos o Sim se caracterizan por ser las ms
bellas debido a su diversidad de colores, tallos de gran porte y una
sobresaliente durabilidad. Entre los claveles europeos se destacan los tipos
Chabaud y Flamands, que producen flores de gran tamao, tallo largo
adecuado para el manejo en el cultivo y uso en floristeras (Ojeda 2004).
Se estima que el clavel tiene un ciclo de vida til de dos aos bajo
condiciones como las colombianas. La produccin de flores comienza a partir
del sexto mes, aunque depende de la variedad. Se calcula que la
productividad promedio del clavel estndar (Europeo y Sim) se encuentra
entre 180 y 210 flores / m al ao (rendimiento bruto). Mientras que el clavel
miniatura tiene una productividad de 190 flores/m. Sin embargo, estos datos
23
2.1.6.1.2 Suelo
El clavel se adapta a un amplio rango de suelos, desde arenosos a francoarcillosos, pero requiere de una profundidad efectiva es de 30 a 40 cm. El
rango de pH debe estar entre 6,5 - 7. Es importante destacar que a mayor
restriccin de las caractersticas antes mencionadas, se pierde ms calidad
que produccin (Ojeda, 2004).
2.1.6.1.3 Riego
El sistema de riego ms indicado para la produccin de clavel es el goteo, ya
que dosifica de manera precisa la cantidad de agua aplicada y evita la
dispersin de algunas enfermedades y plagas del follaje y de las flores por
salpicadura (Pizano, 2000).
2.1.6.1.4. Nutrientes
A continuacin se presenta una tabla con las necesidades bsicas de
nutrientes.
24
Potasio
135
Nitrgeno
98
Calcio
52
Magnesio
20
Fsforo
20
Azufre
20
Zinc
0.44
Boro
0.35
Cobre
0.25
Nota: Los requerimientos nutricionales han sido calculados para camas de 30 m y una
densidad de siembra promedio de 1000 plantas por cama. Tomado de Pizano, 2000.
2.1.7.1.1 caros
El caro ms comn que afecta el cultivo de clavel es la araita roja
(Tetranychus cinnabarinus). Es un artrpodo de ocho patas en su estado
adulto, sin alas y con un aparato bucal que posee una articulacin prensil que
le permite perforar las hojas para succionar el contenido de sus clulas
(Gmez, 1992).
25
Los primeros signos manifestados en el haz del follaje son puntos blancos
que luego se tornan en manchas rojizas oscuras. En casos de grandes
poblaciones puede llegar a secar la planta por completo. Los daos ms
importantes se producen en los primeros estados vegetativos de la planta,
produciendo retraso en el crecimiento (Gmez, 1992).
2.1.7.1.2 fidos
Los fidos son una plaga muy frecuente en el clavel. Se alimentan de hojas y
flores, en donde succionan los azcares que se transportan por el floema.
(Lpez, 1989).
2.1.7.1.3 Trips
Las especies ms importantes que atacan al cultivo del clavel son Haplothrips
sp y Thrip tabaco.
2.1.7.1.5 Nemtodos
Los gneros Meloidogyne y Heterodera, son endoparsitos que se alimentan
de la parte area y radicular del clavel, produciendo decoloracin,
debilitamiento y enanismo. Adicionalmente, los nemtodos pueden actuar
como vectores de algunos virus. Igualmente pueden ser la causa de la
invasin por bacterias y hongos sobre las plantas. Para su control se debe
identificar los gneros y poblaciones presentes en el suelo, para determinar
una posible aplicacin de nematicidas granulares o esterilizantes de suelo,
previo a la siembra (Marroqun & Arbelez, 1992).
26
2.1.7.2.2 Botritis
Botrytis cinerea es un hongo que infecta inicialmente a las flores, luego se
transmite hacia las hojas, pecolos y tallos. Los signos en las flores se
manifiestan como necrosis del tejido; en las hojas se desarrollan lesiones
necrticas con forma de V que se cubren con moho gris y posteriormente se
marchita y muere la hoja. Su desarrollo se favorece por la alta humedad,
poca ventilacin y exceso de nitrgeno (Latorre et al., 1998).
27
los cultivos permanecen con su follaje mojado por causa del riego mal
realizado (Arbelez, 1987)
2.1.7.2.4 Mancha foliar
Producida por
28
caryophyllus,
Dianthus
barbatus.
Se
ha
logrado
inocular
29
2.1.7.3.5.3 Transmisin
El CarMV es transmitido mecnicamente y se propaga fcilmente de una
planta a otra por las heridas o injertacin (Pizano, 2000; Bchen Osmond,
2002). Generalmente sucede por la siembra de esquejes de plantas madres
contaminadas o infectadas(Cano & Snchez, 1994).
2.1.7.3.5.4 Citopatologa
El virus moteado del clavel infecta todas las estructuras de la planta,
causando alteraciones citopatolgicas en las clulas. Las ms comunes son
30
mltiples membranas,
31
2.1.7.4.2 Citopatologa
Se basa en el reconocimiento de un conjunto de modificaciones de las
clulas de los tejidos vegetales que son el resultado de un metabolismo
alterado por la infeccin viral, dando como resultado el desarrollo de cuerpos
de inclusin (protenas estructurales, no estructurales, y funcionales,
utilizadas en la replicacin viral). Estas estructuras son detectadas por el
microscopio ptico. Si se requiere una observacin detallada se puede usar
el microscopio electrnico. Sin embargo, su identificacin no es rpida ni
fcil y requiere de personal capacitado (Mattews, 1991).
2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrnico (ISEM)
Se utiliza para detectar virus en pequeas concentraciones o en mezclas con
otros virus. La muestra infectada se coloca sobre un retculo de microscopa
electrnica previamente sensibilizado con
un anticuerpo; el anticuerpo
32
33
34
Para que esta tcnica sea aplicada a virus con cadena RNA, es necesario
sintetizar una cadena de DNA complementario mediante transcripcin
inversa (RT-PCR) (Foster & Taylor, 1998).
35
2.1.7.5.1 Quimioterapia
En la actualidad no se ha desarrollado ninguna sustancia qumica capaz de
erradicar los virus de plantas infectadas. Hasta el momento se han realizado
trabajos con el fin de suprimir virus de tejidos vegetales y protoplastos con la
adicin de sustancias qumicas (antimetablicos) en el medio. Sin embargo,
no se han obtenido resultados exitosos, ya que en algunos casos el virus se
suprime y en otros se estimula su produccin. Se ha reportado que el uso de
ribavirin (anlogos nucleosdicos) tiene efectos positivos en la eliminacin del
virus PVX en plantas de papa (Razdan, 2003). No obstante, la quimioterapia
presenta ciertos problemas de orden tcnico, ya que las sustancias con
propiedades viricidas han producido toxicidad en los tejidos vegetales
tratados (Media & Daz, 1981).
2.1.7.5.2 Termoterapia
Consiste en colocar plantas completas o estructuras de stas, en cmaras de
crecimiento a temperatura de 35 a 40C. El tiempo de exposicin al calor es
variable y depende de la especie. Con esto se pretende reducir la
concentracin de virus en la planta (Razdan, 2003).
muestran que la
Por otro lado, Quak (1977), report que la reduccin en la concentracin del
virus, se puede dar por la competencia entre las clulas del husped que se
36
diferenciacin (se refiere a los cambios cualitativos) (Azcn Bieto & Taln,
2000)
El crecimiento se explica como un incremento irreversible en tamao y
volumen, que esta dado por la combinacin de expansin y divisin celular.
La expansin celular ocurre por una mayor extensibilidad de la pared, con
intervencin de expansinas (protenas que promueven la prdida de rigidez),
37
38
Generalmente una
39
las
A su vez
40
2.2.2.2 Citoquininas
41
42
Los factores que se deben tener en cuenta para obtener una respuesta
adecuada del explante incluyen: la posicin en la planta donadora, edad
ontogentica y estado fisiolgico de la misma. Adicionalmente se debe
considerar la especie con la que se est trabajando y los objetivos que se
buscan. Uno de estos, es el uso de meristemos apicales para la produccin
de plantas libres de virus (Razdan, 2003).
43
44
Con respecto al pH del medio, el rango entre el cual se debe ajustar previo a
autoclavar es de 5.6 a 5.8. En general la respuesta de las plantas no es muy
sensible a los cambios de pH en rangos pequeos. Es importante recalcar
que el crecimiento del material vegetal en un perodo de tiempo puede
generar cambios en el pH, hacindose necesaria la transferencia a medios
frescos (Smith, 1992).
45
acetaldehdo.
Los
efectos
producidos
por
estos
gases
afectan
la
con
productos
qumicos
que
sean
txicos
para
los
46
47
48
estril,
ya
que
es
probable
que
se
presenten
de
fenoles
va
producir
una
serie
de
reacciones
de
49
Otros mtodos que han dado buen resultado cuando la sntesis de fenoles no
puede evitarse son: la dispersin, adsorcin o lavado, con sustancias como
el carbn activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificacin del
potencial redox (disminuyendo los agentes redox), o la disponibilidad de
oxgeno; la inactivacin de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros
sistemas como la incubacin en condiciones de oscuridad, bajo pH,
incubacin a temperaturas ms bajas, entre otros. En general lo que se
busca al proporcionar stas condiciones es reducir la actividad fenolasa y la
disponibilidad de sustratos para esta enzima (Debergh & Zimmerman, 1991;
Thomas & Ravindra, 1997).
50
estn
ligados a las
51
2.3.3.2.3 Signos
Los primeros signos de hiperhidratacin en los explantes se manifiestan
durante las primeras semanas, y se van incrementando con el tiempo de
cultivo. Inicialmente parte del explante de una o dos hojas, generalmente
las que estn en contacto con el medio. El crecimiento de los brotes es ms
rpido de lo normal y puede mostrar tamaos anormales en la formacin de
brotes axilares. Las hojas presentan una apariencia frgil y translcida y su
longitud es menor comparada con la de las hojas normales (Ziv et al., 1987;
Ziv, 1991; Kevers et al., 2004; Saher et al., 2004).
Las caractersticas morfolgicas y anatmicas de las hojas hiperhidratadas
incluyen cambios estructurales y qumicos. La capa cuticular y la epidermis
se vuelven ms delgadas, los estomas son anormales, aumenta la cantidad
de tejido parenquimatoso, y se presentan clulas del mesfilo con pocos
cloroplastos mal desarrollados y con cantidades bajas de clorofila y
protenas. Todas estas anormalidades interfieren en la aclimatacin y el
transplante, causando supervivencias bajas e incluso la muerte (Debergh et
al., 1992; Olmos & Hallin, 1998; Majada et al 2002).
52
un
protocolo
para
la
micropropagacin
del
53
54
55
56
riego
automatizado,
fertilizacin
lquida
constante,
57
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
caryophyllus.
58
5. MATERIALES Y MTODOS
Mtodo
Termoterapia
Cultivo in vitro de meristemos
Termoterapia + Cultivo in vitro de meristemos
59
Fase
Fase 1
Fase 2
Propagacin in vitro
Sub fase 1
Ciclo de Multiplicacin 1
Sub - fase 2
Ciclo de Multiplicacin 2
Fase 3
Enraizamiento in vitro
Nivel
Factor 1 (Mtodo)
Nivel 1
Termoterapia
Nivel 2
Nivel 3
60
Nivel
Factor 2 (Variedad)
Nivel 1
Marfil
Nivel 2
Mercedes
Nivel 3
Orange Bri
Nivel 4
Picote Vanesa
Nivel 5
White Sim
Nivel 6
Control Positivo
Nivel 7
Control Negativo
II.
Proceso
de
61
Nivel
Factor 1 (Variedad)
Nivel 1
Marfil
Nivel 2
Mercedes
Nivel 3
Orange Bri
Nivel 4
Picote Vanesa
Nivel 5
White Sim
62
Poblacin
Termoterapia
Esquejes
% de Supervivencia
Prueba ELISA
Hojas
Absorbancia (nm)
Establecimiento in vitro
Meristemos
Multiplicacin in vitro
Brotes
Tasa
de
velocidad
de
hiperhidratados
brotes no hiperhidtrados.
Enraizamiento in vitro
Brotes
Presencia/
Ausencia
races
63
de
TP en cada variedad =
Sin respuesta
Aquellos explantes que no desarrollaron brotes.
64
65
5.2 Mtodos
5.2.1 Enraizamiento
El material vegetal fue obtenido de esquejes de cinco variedades comerciales
de clavel: Marfil, Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim. Los
esquejes fueron seleccionados de plantas madres, por la empresa
floricultora, de acuerdo con los siguientes criterios:
Entrenudos cortos
Carcter vegetativo
66
67
5.2.2 Termoterapia
68
69
l de 3M de
ENRAIZAMIENTO
72 esquejes/ bandeja
por variedad
21 das
CULTIVO in vitro DE
MERISTEMOS
70
ESTABLECIMIENTO DE
MERISTEMOS in vitro
Desinfectacin
Etanol (50 %) 30 s
Hipoclorito de sodio (0.5 %) 3 min
4 Lavados de agua destilada
MS 7 y 8% agar
25 das
MULTIPLICACIN in vitro
Brotes con 2 nudos
Ciclo 1 y Ciclo 2
Control: MS
T1: MS/2 Sacarosa 1.5 %
ENRAIZAMIENTO in vitro
Brotes
71
72
5.2.3.2
Propagacin in vitro
73
MS
Tratamiento 1
MS / 2
Tratamiento 2
MS / 2 1ppm AIA
74
Excel y
75
y ijk = + i + j + ( ) ij + ijk
Donde
general;
experimental.
5.4.1.2 Prueba de Rango Mltiple Duncan
Para determinar diferencias entre los 21 tratamientos (combinacin de los 3
mtodos de atenuacin del CarMV, las 5 variedades, el control positivo y
negativo), se utiliz la prueba de comparacin de medias (Prueba de Rango
Mltiple Duncan), a partir de los valores de absorbancia calculados para cada
muestra sometida a los mtodo de atenuacin del CarMV (Anexo 7).
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagacin
5.4.2.1 Anlisis de Varianza (ANOVA)
76
estadsticas
entre
las
diferentes
variedades
en
cada
fase
de
la
En este caso se tiene un solo factor de inters por lo cual el modelo a ajustar
esta dado por la siguiente ecuacin:
y ij = + i + ij
Donde
con
i = 1,2,...,5
es el efecto de la
Para utilizar este anlisis, fue necesario probar los supuestos de normalidad
y homocedasticidad. En este caso, al probar estas hiptesis se encontr que
los
datos
no
son
normales,
por
lo
que
se
aplicaron
diferentes
77
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Componente I. Atenuacin del CarMV
La prueba inmunoenzinmtica ELISA detect la presencia del virus moteado
del clavel en los tejidos foliares de las 5 variedades analizadas en este
trabajo. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de la presencia de otros
virus en las mismas. Pizano & Salazar (1992), reportan que adicional a la
incidencia del CarMV, el virus de la mancha anillada del clavel se encuentra
en las variedades sembradas en la Sabana de Bogot.
Los resultados de las pruebas ELISA para detectar la presencia del CarMV
indican que las diferencias de los mtodos de termoterapia, el cultivo de
meristemos, solos y en combinacin, en cada variedad, mostraron
diferencias estadsticas entre s. Estas diferencias pueden estar relacionadas
con caractersticas genticas de cada variedad y su resistencia al virus.
Estos resultados son similares a los reportados por Caldern & Arbelez
(1999).
En la Figura 6 se observa el comportamiento de las muestras de cada
variedad sometidas a cada mtodo de atenuacin del virus. En general, las
cinco variedades actan de manera similar respecto a cada mtodo. La
variedad Marfil en la combinacin de ambos mtodos presenta valores de
78
absorbancia.
1,600
1,400
1,200
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
C.
C. Positivo
Negativo
COMBINADO
Marfil
Mercedes
Oranbri
Picote
Vanesa
White Sim
TERMOTERAPIA
79
80
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Control
Negativo
Combinado
Cultivo in vitro
de meristemos
Termoterapia
Control Positivo
Figura 7. Efecto de los mtodos para la atenuacin del virus moteado de clavel
(CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel.
81
(1,279 nm) pero mayores que el que combina ambos mtodos (0,459 nm).
Adicionalmente la diferencia con el control negativo es significativa (0,130
nm). Esto indica que el material sometido nicamente a cultivo in vitro
tambin presenta el CarMV.
dirigidos
la
limpieza
y/o
eliminacin
del
virus.
Hollings et al., (1972) reportan que el CarMV es el virus del clavel que
presenta mayor dificultad de ser eliminado por termoterapia y cultivo in vitro
de meristemos, razn por la cual es un excelente indicador de la calidad
sanitaria de las plantas madres de clavel.
82
se propone la
realizacin de controles desde el inicio del cultivo del clavel (Gonzalez et al.,
1990). En la seleccin de las plantas madres se debe realizar un control
activo de los virus, definido por Hammond & Rosner (1994) como la
deteccin, identificacin y eliminacin de las plantas infectadas por virus.
(%) Supervivencia
70
60
50
40
30
20
10
0
Jun
Marfil
Orange Bri
Picote Vanesa
White Sim
83
84
180
160
140
Nmero
120
100
Perdidos
Brotes
80
60
40
20
0
Jun
Marfil
Orange bri
Picote
Vanesa
White Sim
85
86
Valores totales TP
80%
70%
60%
50%
40%
30%
A
B
AB
20%
10%
0%
Marfil
Mercedes
Orange Bri
Picote
Vanesa
White Sim
A los 20 das se volvi a calcular la tasa de prdida para cada una de las
variedades y se encontraron diferencias estadsticas entre stas. Las
variedades Mercedes (17.6 %), Orange Bri (17.2 %), Picote Vanesa (10 %) y
White Sim (9.8 %) fueron agrupadas por la prueba Duncan, presentando una
tasa de prdida similar mientras que la variedad Marfil present la mayor tasa
de prdida con un valor de 66.2 % significativamente superior respecto a las
dems variedades (Figura 12).
87
Valores totales TP
70%
60%
50%
40%
30%
B
20%
10%
0%
Marfil
Mercedes
Orange Bri
Picote
Vanesa
White Sim
Figura
12. Valores totales de la Tasa de Prdida (TP) en la fase de
establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.
88
Se podra sugerir que cada variedad tiene una respuesta a las condiciones in
vitro, razn por la cual el establecimiento del material no solo debe estar
basado en las condiciones in vitro sino en el genotipo de la variedad.
89
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Mercedes
Orange Bri
Picote Vanesa
White Sim
Valores totales TP
40%
35%
30%
25%
AB
AB
20%
15%
10%
5%
0%
BC
C
Marfil
Mercedes
Orange Bri
Picote
Vanesa
White Sim
90
Es
probable
que
por
estas
razones,
los
tejidos
que
presentan
Desde otra perspectiva la tasa de prdida pudo estar condicionada por las
caractersticas de las plantas donadoras, ya que stas se encontraban bajo
condiciones que afectaban su fisiologa; dicho factor se refiere al cambio de
temperatura durante la termoterapia. Read & Economou (1987) afirman que
el desempeo del explante en condiciones in vitro puede estar influenciado
por las caractersticas fisiolgicas de la planta donadora.
91
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Mercedes
Picote Vanesa
White Sim
utilizando
explantes
provenientes
de
plantas
intactas
(no
Durante este ciclo para las 3 variedades aumentaron los valores de la tasa
de multiplicacin con relacin al resultado anterior (ciclo de multiplicacin 1).
92
Este
resultado
puede
estar
asociado
con
la
revigorizacin
93
94
Valores totales TP
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
B
C
Marfil
Mercedes
Orange Bri
Picote
Vanesa
CB
White Sim
95
100
90
80
Brotes (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
T1
Control
Mercedes
T1
Control
T1
Picote Vanesa
Hiperhidratados
Control
White Sim
No Hiperhidratados
96
97
98
90,0%
80,0%
70,0%
% Brotes
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
Presente
Ausente
Presente
Control
Ausente
T1
Mercedes
Picote Vanesa
Presente
Ausente
T2
White Sim
Figura 18. Efecto de la concentracin del medio de cultivo y del AIA sobre el
desarrollo de races (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.
99
% Brotes
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Mercedes
Picote Vanesa
Control
T1
White Sim
T2
Figura 19. Comparacin del efecto de los tratamientos aplicados para la induccin
de races in vitro para cada variedad.
de
contraer
enfermedades
durante
el
transplante
conexiones limitadas del sistema vascular entre el tallo y la raz. (Debergh &
100
White Sim es
Valores totales TP
100%
80%
60%
40%
20%
0%
T1
T2
T3
T4
Tiempo
Marfil
Mercedes
Orange Bri
Picote Vanesa
101
White Sim
102
2
1,5
1
0,5
0
Ciclo de propagacin 1
Ciclo de propagacin 2
Tiem po
Mercedes
Orange Bri
Picote Vanesa
White Sim
103
Nmero de brotes no
hiperhidratados
30
25
20
15
10
5
0
T1
Marfil
T2
Mercedes
T3
OrangeTiempo
Bri
Picote Vanesa
T4
White Sim
Figura 22. Nmero de brotes exitosos en cada variedad a travs del tiempo
desorden
104
con un rango de 13 a 3.
70
60
50
40
30
20
10
0
T1
Marfil
Mercedes
T2
T3
OrangeTiempo
Bri
Picote Vanesa
T4
White Sim
Figura 24. Nmero de brotes hiperhidratados por variedad a travs del tiempo.
105
el
comportamiento
ms
eficiente
en
el
proceso
de
Establecimiento
Meristemos obtenidos * Da (D) * 1 propagadora = 100 meristemos.
No. Das laborales * Mes (M) = 24
Meristemos trabajados * (M) * 1 propagadora = 2400 meristemos.
No. de meses de trabajo = 4 = 9750 meristemos
Multiplicacin
Plantas propagadas * (D) * 1 propagadora = 210 plantas
No. Das laborales * (M) = 24
106
Enraizamiento
Plantas propagadas * (D) * 1 propagadora = 210 plantas
No. Das laborales * (M) = 24
Plantas propagadas * (M) * 1 propagadora = 5000 plantas
107
108
7. CONCLUSIONES
sobre
el
establecimiento,
multiplicacin
109
110
8. RECOMENDACIONES
111
9. LITERATURA CITADA
112
CALDERON, O.L & G, ARBELAEZ. 1999. Effect of the Carnation mottle virus
on the rooting of cuttings and on flower production. Acta Horticulture 482: 179
185.
CARVER, C.E., D, PITT & D.J, RHODES. 1996. Aetiology and biological
control of Fusarium wilt pinks (Dianthus caryophyllus) using Trichoderma
aureoviride. Plant Pathology. 45: 618 630.
113
CLARK, M.F. & A.N, ADAMS. 1977. Characteristic of the microplates method
of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus.
Journal General Virology. 34: 475-483.
COL, J.B., G.N, RODRIGO., B.S, GARCA., & R.S, TOMES. 1988. Fisiologa
vegetal. EN: CUZZUOL, G.R.F., L.A, GALLO & O.J, CROCOMO. 1996.
Enraizamento de cravo (Dianthus caryophyllus L.) in vitro e ex vitro. Scientia
Agricola. 53:60-66.
CORREL, M.J. & P.J, WEATHERS. 2001. Effects of light, CO2 and humidity
on carnation growth, hyperhidration and cuticular wax development in a mist
reactor. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 307: 405 413.
114
DEBERGH,
P.C.
&
P.E.
READ.
1991.
Micropropagation.
En:
DIXON,
R.A
&
N.L,
PAIVA.
1995.
Stress-induced
phenylpropanoid
FOSTER, G.D & S.C, TAYLOR (Eds). 1998. Plant virology protocols: from
virus isolation to transgenic resistance. Totowa. New Jersey, U.S.A. 571 p.
115
FOSTER, T.M., T.J, LOUGH., S.J. ENERSON., R.H, LEE., J.L. BOWMAN.,
R.L.S. FOSTER. & W.J, LUCAS. 2002. A surveillance system regulates
selective entry of RNA into the soot apex. The Plant Cell. 14: 1497 1508.
GEORGE, E.F. 1996. Plant propagation by tissue culture. Parte II. Exegetic
Limited. Inglaterra. 799 p.
GONZALEZ, M., L DI FEO & S.F NOME. 1990. Identificacin de virus del
clavel (Dianthus caryophyllus) en la Argentina. Fitopatologa. Bras. 15 (4):
291 293.
HARTMANN, H., D.E. KESTER, F.T., DAVIES & R. GENEVE., 1997. Plant
propagation principles and practices. 6 ed. Prentice Hall Inc. New Jersey,
U.S.A. 747 p.
116
HEYWOOD, V.H & D.M. MOORE. 1998. Flowering plants of the world.
Oxford University. New York, U.S.A. 335 p.
HOLLINGS, M., O.M, STONE & D.R. SMITH. 1972. Productivity of virustested carnation clones and the rate of reinfection with virus. Journal of
Horticultural Science. 47: 147 149.
HUANG, L.-C., J-H, WENG., C-H, WANG., C-I, KUO, & Y-J, SHIEH. 2003.
Photosynthetic potentials of in vitro-grown juvenile, adult, and rejuvenated
Sequoia sempervirens (D. Don) Endl. Shoots. Bot. Bull. Acad. Sin. 44: 31-35.
117
118
KIM, K.W., M.S, BYUN & M.S, KANG. 1988. Effect of ABA and agar in
preventing vitrification of carnation plantlets. Journal Korean Society
Horticulture Science. 29: 208 215.
Trabajo de grado.
LI, Y., L, WANG., M, YE. & D, SHEN. 1997. The factors influencing
vitrification
of
tissue-cultured
carnation
plantlets.
Plant.
Physiology.
119
MATTEWS, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic. San Diego. U.S.A. 835 p.
MIRKOVA, E. 1998. Spread of Fusarium sp. in greenhouse carnation by
irrigation water. Bulgarian Journal of Agricultural Science. 4: 299 - 302.
MURASHIGE, T. & F.C SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth
and bioessays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473497.
OCHOA, J.M. 1996. Control biolgico del marchitamiento vascular del clavel
ocasiando por Fusarium oxysporum f.sp. dianthi mediante el uso de los
microorganismos potencialmente antagonistas. Trabajo de grado. Pontificia
Universidad Javeriana. Departamento de Biologa. Bogot.
120
V.Z.,
M.
A,
GUTIRREZ-ESPINOSA.,
J.
A,
PAEK, K.Y., B.H, HAN & S.L, CHOI. 1991. Physiological, biochemical and
morphological characteristics of vitrified shoots regenerated in vitro. Korean
Journal Plant Tissue culture. 3: 151 162.
PALUDAN, N. 1985. Inactivation of viroids in Chrysanthemum by lowtemperature treatment and meristem-tip culture. Acta Horticulture. 164:181186
121
Trabajo
de
grado.
Pontificia
Universidad
Javeriana.
PIZANO, M. & M, SALAZAR. 1992. Distribucin del virus moteado del clavel
y del virus de la mancha anillada del clavel en la Sabana de Bogot. Cuarto
Simposio Internacional del clavel. (28): 15.
QUAK, F. 1977. Meristem culture and virus-free plants. In: J. Reinert and
Y.P.S. Bajaj (eds.). Applied and fundamental aspects of plant cells, tissue,
and organ culture. Springer, Berlin. p. 598615.
RAVEN, P.H., R.F., EVERT & S.E., EICHHORN. 1999. Biology of plants. 6
ed. W.H. Freeman and Company Worth Publishers. New York. U.S.A. 944 p.
122
RAZDAN, M.K. 2003. Introduction to plant tissue culture. 2 ed. Enfield. New
Hampshire, U.S.A. 375 p.
123
plantas adultas de avellano europeo (Corylus avellana l.) cv. negretta sobre
el cultivo in vitro. Agricultura Tcnica (Chile). 64(4):338-346.
SCHUMANN, G.L. 1998. Plant diseases: their biology and social impact. 3
ed. APS PRESS. U.S.A. 397 p.
124
YADAV M.K., A.K. GAUR & G.K. GARG. 2003. Development of suitable
protocol to overcome hyperhydricity in carnation during micropropagation.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 72: 153-156.
ZIV, M., G, MEIR. & A.M, HALEVY. 1983. Factors influencing the production
of hardened glaucous carnation plantlets in vitro. Plant Cell Tissue Organ
Culture. 2: 55 65.
Recursos electrnicos
125
Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th August 1996.'
URL http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/.
EMBAJADA
DE
COLOMBIA
www.colombiaembassy.org
126
EN
TOKIO.
En
lnea
ANEXOS
Referencia (SIGMA)
A3795
P8291
P8416
C2536
M7774
Micronutrientes
B9645
M7634
Z1001
C2911
M1651
C3036
Vitaminas
T3902
P8666
N0765
Yoduro de
Potasio
Glicina
G6143
EDTA
E6635
F8263
Mio - inositol
I3011
Reactivo
Nitrato de Amonio
Nitrato de Potasio
Fosfato de Potasio
monobsico
Cloruro de Calcio
Dihidrato
Sulfato de Magnesio
Heptahidrato
mg/L
1650
1900
170
cido Brico
Sulfato de
Manganeso
Monohidrato
Sulfato de Zinc
Heptahidrato
Cloruro de Cobalto
Hexahidrato
Molibdato de Sodio
Dihidrato
Sulfato Cuprico
Pentahidrato
6,2
440
370
15,5
8,6
0,025
0,25
0,025
Tiamina-HCl
Piridoxina-HCl
cido Nicotnico
0,1
0,5
0,5
KI
0,83
2
EDTA
Sulfato de Hierro
Heptahidrato
37,3
27,8
100
127
Esqueje
1
2
3
4
Picote
White
Control
Control positivo Vanesa
Oranbri Mercedes Marfil Sim
negativo
1,27
1,3
1,326
1,101 0,889
1,131
0,104
1,131
1,272
1,416
1,344 1,121
1,472
0,117
1,129
1,235
1,438
1,208 1,312
1,348
0,18
1,126
1,258
1,312
1,37 1,345
1,399
0,122
Test
Shapiro-Wilk
Prueba de Normalidad
Statistic
W
p Value
0.858396 Pr < W
128
<0.0001
Prueba de Normalidad
Statistic
Test
Kolmogorov-Smirnov
p Value
0.171259 Pr > D
<0.0100
Homocedasticidad
Prueba
Levene
Pr > F
0.8008
Variedad
Control +
P. Vanessa
Orange Bri
Marfil
Mercedes
Control W. Sim
Control +
P. Vanesa
Orange Bri
Marfil
Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
129
Mtodo
Termoterapia
Termoterapia
Termoterapia
Combinado
Combinado
Combinado
Combinado
Combinado
Combinado
Combinado
Variedad
Mercedes
Control W. Sim
Control +
P.Vanessa
Orange Bri
Marfil
Mercedes
Control W. Sim
Tratamiento
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Anexo 6. Componente I. Atenuacin del CarMV. Prueba Kruskall Wallis para las
variables mtodo y variedad
Kruskal-Wallis Test
Chi-Square
61.4789
DF
20
Pr > Chi-Square
<.0001
Anexo 7. Componente I. Atenuacin del CarMV . Prueba Duncan para las variables
mtodo y variedad
Media
TR
1.3730
10
1.3375
14
1.2663
1.2558
12
1.1867
1.1668
11
1.1640
1.1130
1.0820
1.0820
15
1.0093
0.9547
B
D
130
Media
TR
0.7233
19
0.6753
0.6617
21
0.4517
16
0.3047
17
0.1580
18
0.1308
13
0.1303
0.1303
20
Fuente
g.l
Suma Cuadrados
Cuadrado medio
F-valor
Pr > F
Modelo
0.06221913
0.01555478
4.10
0.0138
Error
20
0.07593129
0.00379656
Total
24
0.13815042
131
Mean
variedad
0.82700
ORANBRI
0.79297
PICOTE
0.75371
WHITE
0.70158
MERCEDES
0.70057
MARFIL
Fuente
g.l
Suma Cuadrados
Cuadrado medio
F-valor
Pr > F
Model
1.12258713
0.28064678
11.11
<.0001
Error
20
0.50512795
0.02525640
Corrected Total
24
1.62771508
132
Mean
variedad
0.8063
MARFIL
0.4037
MERCEDES
0.3206
WHITE
0.2462
PICOTE
0.2282
ORANBRI
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
0.02160494
0.00720165
1.09
0.3803
Error
16
0.10534979
0.00658436
Corrected Total
19
0.12695473
133
Mean
Variedad
0.13333
WHITE
0.07407
MERCEDES
0.06667
PICOTE
0.04444
ORANBRI
Fuente
g.l
Suma Cuadrados
Cuadrado medio
F-valor
Pr > F
Model
0.83866536
0.20966634
4.34
0.0110
Error
20
0.96715700
0.04835785
Corrected Total
24
1.80582236
134
Mean
variedad
0.5311
ORANBRI
0.4098
MERCEDES
0.3689
PICOTE
0.2127
WHITE
0.0000
MARFIL
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
0.08125000
0.04062500
1.24
0.3245
Error
12
0.39375000
0.03281250
Corrected Total
14
0.47500000
135
Mean
variedad
0.3125
WHITE
0.1875
PICOTE
0.1375
MERCEDES
Fuente
g.l
Suma Cuadrados
Cuadrado medio
F-valor
Pr > F
Model
1.93154882
0.48288721
21.32
<.0001
Error
20
0.45295820
0.02264791
Corrected Total
24
2.38450702
Mean
variedad
0.95161
ORANBRI
136
C
C
Mean
variedad
0.90063
MARFIL
0.50847
MERCEDES
0.37745
WHITE
0.26177
PICOTE
137