METODOS DE ANLISIS EN QUIMICA CLINICA

ANLISIS DE SANGRE
1. Anlisis en suero
1.1. Evaluacin de la funcin renal.
ACIDO URICO:

Es el producto resultante del metabolismo de las nucleoprotenas. La insuficiencia

renal crnica avanzada produce un incremento progresivo del nivel de cido rico en el plasma. Se
deposita en los tejidos en forma de uratos dando lugar a la enfermedad conocida como gota.
Intervalos de referencia: 36-77 mg/L en Hombres
25-68 mg/L en Mujeres
Mtodos de anlisis:
Mtodo espectrofotomtrico: el cido rico acta como un agente reductor del cido
fonsfotungstico. Previamente hay que eliminar las protenas por precipitacin.
cido rico + H3PW12O40 + O2 Alantona + CO2 + AZUL DE TUNGSTENO ( = 700 nm)

Mtodo enzimtico:
URICASA

cido rico + O2

Alantona + H2O2 + CO2

Se acopla a una reaccin indicadora

Mtodo polarogrfico:
Se emplea un sensor polarogrfico de O2. En la reaccin anterior, se mide el consumo de O2 siendo
proporcional a la concentracin de cido rico.
HPLC
Se usa fase inversa y deteccin espectrofotomtrica a = 280 235 nm nm
Tambin se puede usar intercambio inico y deteccin electroqumica (amperomtrica: se mide la
intensidad de corriente a un potencial constante).
1.2. Evaluacin de existencia de hiperlipidemia y de riesgo de enfermedades cardiovasculares.
COLESTEROL:

Se encuentra presente en todas las lipoprotenas plasmticas. Cuando un exceso de

lpidos no se elimina o utiliza, se deposita en tejidos y paredes arteriales, obstruyendo el flujo de
sangre a rganos vitales. Se obstruye la circulacin dando lugar, por ejemplo, al infarto de
miocardio.
Intervalos de referencia: 1.20-2.20 g/L
Colesterol HDL: 0.40-1.10 g/L Hombres
0.50-1.20 g/L Mujeres
Mtodos de anlisis:
La determinacin de colesterol total incluye las formas libre y esterificada del mismo. Los mtodos
de anlisis se dividen en:

 Mtodos en 1 etapa: son ensayos directos, sin preparacin previa de la muestra de suero.
Suelen ser medidas espectrofotomtricas o fluorimtricas. Exhiben a menudo errores debido a
interferencias y a diferencias del color desarrollado por el colesterol libre y el esterificado.
Mtodos en 2 etapas: se introduce una etapa previa de extraccin orgnica eliminando muchas
interferencias. Sin embargo, no se elimina el efecto de la respuesta de color diferencial entre el
colesterol libre y esterificado. Pero se acepta para el trabajo clnico de rutina usando factores de
correccin.
Mtodos en 3 etapas: adems de la extraccin del colesterol, incluye una etapa de
saponificacin que hidroliza la porcin acido graso de los esteres del colesterol. Se determina el
colesterol libre total
EXTRACCIN

SAPONIFICACIN

COLESTEROL LIBRE TOTAL

CUANTIFICACIN

DESARROLLO COLOR

Colesterol LIBRE
+
Colesterol ESTERIFICADO

Mtodos en 4 etapas: adems de la extraccin, saponificacin y desarrollo del color, incluye

una cuarta etapa en la cual se precipita el colesterol libre con digitonina (saponina que esterifica el
grupo hidroxilo)
Colesterol LIBRE
EXTRACCIN

DIGITONINA

COLESTEROL ESTERIFICADO

SAPONIFICACIN

COLESTEROL LIBRE

Se cuantifica

4
CUANTIFICACIN

Colesterol LIBRE
+
Colesterol ESTERIFICADO

DESARROLLO COLOR

La cuantificacin final del colesterol se hace por la medida del color desarrollado y no se distingue
entre colesterol libre y esterificado. El reactivo reacciona con el colesterol que encuentran y ya
sabemos que el desarrollo del color es distinto para el colesterol libre y para el esterificado.
Esta cuantificacin final puede hacerse:
Reaccin con una sal de Fe3+ : se emplea cido actico + cido sulfrico y se aade una sal de Fe3+
Como producto de reaccin se obtiene el catin tetraenlico que se mide a = 563 nm.
Reaccin con el cido p-toluensulfnico:
Anhdrido actico

Colesterol + cido p-toluensulfnico

cromforo ( = 550 nm)

ac. Actico glacial
ac. Sulfrico

Reacciones enzimticas: incluyen la etapa de saponificacin mediante el uso de una enzima:

Colesterol esterasa

Esteres del colesterol + H2O

Colesterol + cidos grasos libres

Colesterol oxidasa

Colesterol + O2

colest-4-eno-3-ona + H2O2

Se sigue el consumo de O2 con un electrodo de oxgeno o bien se acopla el H2O2 a una reaccin
indicadora, por ejemplo:
Peroxidasa

2 H2O2 + Fenol + 4-aminofenazona

quinonimina + 4 H2O

Se determina la quinonimina formada a = 500 nm

COLESTEROL UNIDO A LIPOPROTENAS DE ALTA DENSIDAD-

HDL : High Density Lipoproteins

LDL: Low Density Lipoproteins
VLDL: Very Low Density Lipoprotein.
La HDL desempean un papel importante para transportar el colesterol lejos de los tejidos y
proporciona proteccin contra las enfermedades de la arteria coronaria. Estn compuestas por un
50% de protenas y un 50% de lpidos. De estos ltimos, el 28% son fosfolpidos, el 18%
colesterol (libre y esterificado, ms cantidad del segundo) y el 4% restante son triglicridos.
Los pasos a seguir para determinar el colesterol unido a las HDL sera:
Aislar las HDL
Cuantificar el colesterol (ya visto)
Para aislar las HDL se puede seguir cualquiera de los siguientes mtodos:

Ultracentrifugacin: el suero se ajusta a una densidad de 1.063 g/ml por adicin de KBr
(415 mg/5 mL). Se centrfuga: la disolucin sobrenadante contiene VLDL y LDL y la
inferior HDL
Cromatografa en columna por intercambio inico o exclusin molecular.
Electroforesis
Precipitacin: precipitacin selectiva de
lipoprotenas con diversas soluciones
polianinicas. Las HDL quedan en el sobrenadante, no precipitan.

1.3. Evaluacin de la funcin heptica

Para evaluar la funcin heptica se determinan las siguientes enzimas:
Alanina aminotransferasa (ALT)
Fosfatasa alcalina (ALP)
Aspartato aminotransferasa (AST)
Gamma glutamiltransferasa (GGT)
Como ejemplo, veremos la determinacin de la ALT:
ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT):

Diagnostica enfermedades hepticas agudas y crnicas, la

presencia de hepatitis aumenta su concentracin en suero.
Intervalo de referencia: 0-55 U/L

Mtodos de anlisis: Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino segn la reaccin:
CO2H

CO2H
H - C NH2

C=O
CH2

CH3

L-Alanina

CO2H

CO2H

ALT

C=O

H- C = NH2

CH2

CH3

CH2

CH2

CO2H

CO2H

-Cetoglutarato

PIRUVATO

L-Glutamato

El suero a analizar (donde se encuentra la ALT) se incuba en L-alanina + -cetoglutarato de

manera que el PIRUVATO formado se evala de una de las dos maneras siguientes:
a) Se sigue la candidad de Dinitrofenilhidrazona del piruvato formada a = 505 nm:

CO2H
C=O

CO2H

N=C

CH3
PIRUVATO

CH3
Dinitrofenilhidrazina (DNPH)

Dinitrofenilhidrazona del
PIRUVATO (azul)

b) Se sigue espectrofotomtricamente a = 340 nm la desaparicin del NADH (Nicotinamidaadenin-dinucleotido reducido):

PIRUVATO

+ NADH + H+

LD (lactato
deshidrogenada)

CO2H
H - C OH +

NAD+

CH3
Lactato

2. Medidas de la coagulacin sangunea

Los cogulos de sangre se forman por la interaccin de aproximadamente una docena de protenas
llamadas factores de coagulacin, los cuales funcionan simultneamente para convertir la protena
PROTROMBINA en un enzima proteoltico llamado TROMBINA
La TROMBINA a su vez acta sobre una protena circulante denominada FIBRINOGENO,
convirtiendo dicho fibringeno en FIBRINA. Los monmeros de fibrina se polimerizan para formar
unas macromolculas denominadas REDES DE FIBRINA.

Las redes de fibrina en conjuncin con las plaquetas agregadas y los glbulos rojos de la sangre
forman un cogulo que generalmente puede prevenir la prdida excesiva de sangre.
Los ANALIZADORES DE COAGULACIN son instrumentos que se utilizan para estudiar el estado
funcional del sistema de coagulacin. Evalan la capacidad del sistema de coagulacin, midiendo
la cantidad de tiempo necesario para que ocurra la formacin de redes de fibrina bajo condiciones
cuidadosamente controladas.
Los medidores del tiempo de coagulacin ms utilizados son:
1. Medidores pticos del tiempo de coagulacin (ver fotocopia correspondiente)
Los ensayos que se realizan ms comnmente son los del tiempo de protrombina y tiempo de
tromboplastina parcial activada. En ambos casos, los reactivos apropiados se mezclan con la
muestra y cuando se aade el ltimo reactivo se pone en marcha el cronmetro. Cuando el
instrumento detecta la formacin de redes de fibrina se para el cronmetro. Los medidores pticos
se basan en la turbidimetra y en l las redes de fibrina formadas son los suficientemente grandes
para dispersar o bloquear la transmisin de energa radiante.
Cuando se va a medir el tiempo de coagulacin, la muestra de plasma se mezcla con todos los
reactivos excepto uno. Al aadir el ltimo reactivo, es cuando se pone en marcha el cronmetro.
Cuando el detector capta una disminucin brusca de la luz transmitida, el cronmetro se para
automticamente.
Las medidas de coagulacin son dependientes de la temperatura, la mayora de los instrumentos
estn preparados para mantener la muestra problema a 37 0.5C
2. Medidores conductimtricos del tiempo de coagulacin (ver fotocopia correspondiente)
Se determina la conductividad elctrica sumergiendo dos electrodos en la mezcla de reaccin.
Cuando se aade el ltimo reactivo a la cubeta de ensayo se pone en marcha el cronmetro y uno
de los electrodos se mueve rpidamente a travs de la solucin. Con su movimiento se acerca al
electrodo fijo sin llegar a tocarlo, volviendo despus a la posicin original. Este ciclo se repite
aproximadamente cada medio segundo, manteniendo la disolucin bien mezclada. Cuando
comienzan a formarse las redes de fibrina, se conectan los dos electrodos entre s, causando un
cambio en la conductividad elctrica que provoca la parada del cronmetro.
3. Contadores de clulas sanguneas
Los ms sencillos pueden identificar y contar eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Entre los ms
complejos estn los citmetros de flujo que pueden identificar y contar distintos subtipos de
leucocitos.
En los laboratorios no orientados a la investigacin, se pueden encontrar dos mtodos de
identificacin y recuento de clulas: uno basado en la medida de la resistencia elctrica y otro
basado en una medida ptica.
1. Contadores de clulas basados en la medida de la resistencia elctrica: (ver fotocopia)
Se diluye la sangre con un disolvente de alta conductividad (baja resistencia) y se la hace pasar por
una cmara de flujo que presenta un pequeo orificio o abertura que provoca que la mayora de la
clulas pasen alineadas. Posee unos electrodos de platino que permiten medir la resistencia
elctrica durante el perodo en que un volumen conocido de sangre pasa a travs de la abertura.

Cuando una clula sangunea pasa a travs del orificio, se incrementa la resistencia elctrica en
dicho orificio ( las resistencia de las clulas es mucho mayor que las del electrolito que las
desplaza).
La resistencia medida es la suma de la resistencia de la clula sangunea y del disolvente no
desplazado. Una vez que la clula ha pasado a travs de la abertura, sta se llena con disolvente
altamente conductor y la resistencia vuelve a su valor inicial.
Se cuenta cada impulso de resistencia que tiene lugar cuando la sangre diluida pasa a travs de la
abertura. El recuento real viene dado por un contador electrnico. El recuento celular, expresado
en n de clulas / L se calcula a partir del volumen de sangre diluida medida, el n de impulsos
registrados y el factor de dilucin empleado en la preparacin de la muestra.
Para optimizar los resultados, hay que tener en cuenta que, a veces, pasan dos o ms clulas a
travs del orificio simultneamente. La frecuencia con la que esto ocurre est relacionada con el n
de clulas presentes y el tamao del orificio. El factor de correccin es predecible y calculable a
partir de consideraciones estadsticas.
En estos equipos, se pueden distinguir clulas de diferentes tamaos; ya que al tener volmenes
celulares diferentes generan distintos cambios en la resistencia elctrica: clulas pequeas como
las plaquetas generan pequeos cambios en la resistencia, mientras que clulas ms grandes como
los glbulos blancos producen un incremento de resistencia ms grande.
Se emplean circuitos electrnicos discriminatorios que clasifican los impulsos por tamaos y los
integra para responder slo a clulas de un determinado tipo.
2. Contadores celulares basados en medidas pticas. (ver fotocopias)
Se basan en la capacidad de dispersin de la radiacin electromagntica: la energa radiante sufre
una dispersin de bajo ngulo considerable al chocar con las clulas; lo que se utiliza para realizar
recuentos celulares. Se necesita un fotmetro de dispersin de bajo ngulo y una vasija de flujo
que obligue a las clulas sanguneas a pasar a travs de un rayo de luz, una por una.
Es necesario conocer el volumen de sangre analizada con el fin de expresar los resultados en n de
clulas / L sangre.
La intensidad y duracin de la seal de salida del fotomultiplicador es caracterstica de la clula
que pasa a travs del volumen activo. Es posible hacer un recuento de clulas y, en algunos casos,
identificarlas. Es tambin posible estimar el volumen medio de la clula.