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Medios de Cultivo y Tecnicas de Siembra... KvO!!!

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“UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES”

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE OBSTETRICIA

PRESENTADO A LA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA PRACTICA Nº 03 - 04 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA INTEGRANTES : PATILLA MACHA MILAGROS LOURDES QUINCHO MACHA YOLIZA KARINA CRISOSTOMO PAZ ISAMAR : Mblgo. Jaime Wester Campos : III TURNO : MAÑANA

DOCENTE DE PRÁCTICA SEMESTRE

HUANCAYO – PERÚ -2009-

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCION Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son realizados en el Laboratorio de Microbiología por lo que el control de su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproductibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida, sólida o semisólido. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. La práctica se desarrollo para adquirir conocimientos de cómo se prepara un medio de cultivo y aplicación de técnicas de siembra para la distribución de colonias de microorganismos.

MATERIALES Y MÉTODO A. MATERIAL ➢ Placa Petri ➢ Tubos de ensayo 13 x 100; es decir de 3.5 ml ➢ Matraz ➢ Estufa ➢ Varilla ➢ Balanza ➢ Pipeta ➢ Hornilla ➢ Probeta ➢ Pizeta ➢ Gradilla ➢ Espátula ➢ Asas bacteriológicas(en orquilla y punta) A. MEDIOS DE CULTIVO ➢ Agar BHI ➢ Caldo nutritivo A. OTROS ➢ ➢ ➢ Pabilo Papel Kraft Algodón

PROCEDIMIENTO Se ha de considerar el procedimiento dependiendo del estado en el que se encuentra el medio de cultivo, ya que es fundamental saber el estado SOLIDOS ( AGARES)

ACTIVIDAD
Esterilizar placas Pesar el medio de cultivo Medir el agua destilada Mezclar en... Calentar en hornilla Disolver al medio ambiente Repartir en tubos Auto clavar el medio de cultivo Servir cultivos Acondicionar medios

Placas / / / Matraz / / / -

Tubos / / Matraz / / / /

LIQUIDOS (CALDOS) Tubos / / Balón / / / -

para relacionar con que material a de trabajarse.

Para la preparación de medios de cultivo (AGAR BHI) Nos ubicaremos en la tabla que procedimientos seguir, para ello describimos a continuación:

Primero esterilizar las placas ya que necesita estar exento de microorganismos ambientales.

Calcular el peso del medio de cultivo, para ello hacemos la sgte operación: Formula de hidratación: Capacidad de la placa: 17 ml 37 gr/l

Para esta práctica utilizamos tres placas para ello se necesita exactamente: (Capacidad de la placa) (N° de placas) = ( 17 ml )( 3 )= 51 ml Para la elaboración del medio de cultivo se redondea a la decena más próxima, en este caso 50 ml. Calculo de la cantidad del AGAR a utilizar en las tres placas: 37 gr 3.7 gr 1.85gr 1000 ml 100 ml 50 ml Por lo tanto: necesitaremos 1.85gr de AGAR para 50 ml de agua destilada.

Medimos la cantidad a necesitar (1.85) de AGAR.

Medir el agua destilada. (50ml)

Mezclar en matraz. Calentar en hornilla, constantemente moviendo con la varilla.

Autoclavar

Servir los medios de cultivo en las placas esteriles y con la ayuda del mechero mantener su esterilidad.

Para la preparación de caldo nutritivo Calcular el peso del medio de cultivo, para ello hacemos la sgte operación: Formula de hidratación: Capacidad del tubo: 8 gr/l 8 ml

Para esta práctica utilizamos seis tubos de ensayo para ello se necesita exactamente: (Capacidad del tubo) (N° de tubos) = ( 8 ml )( 6 )= 48 ml Para la elaboración del medio de cultivo se redondea a la decena más próxima, en este caso 50 ml. Pesar el medio de cultivo para el cual realizamos la siguiente operación: 8 gr 0.8 gr 0.4gr 50 ml 1000 ml 100 ml Por lo tanto: necesitaremos 0.4 gr de CALDO NUTRITIVO para 50 ml de agua destilada.

Pesando el medio de cultivo (CALDO) 0.4 gr

Medir el agua destilada a utilizar

Mezclar en balón y disolver al medio ambiente.

Repartir en tubos en forma equitativa.

Preparación para autoclavar.

NOTA: Para lo cual se utilizara una lata para su protección. Rotular, es decir poner datos para identificar nuestro medio de cultivo.

SIEMBRA DE CULTIVO

Preparar el área de trabajo, haciendo una desinfección con fenol.

Preparación del INOCULO: Para la preparación del inoculo (conjunto de microorganismo) utilizaremos los microbios de la tierra. En un vaso de precipitación (100ml) someter a ebullición a la muestra y 50ml de agua, ello se realiza con constantes movimientos con la varilla. Y así disminuir la sobrecarga de microorganismos.

Tipos de siembra: A. EN PLACAS Técnica: estría simple Es la ejecución de líneas, con la ayuda de una asa bacteriológica en orquilla introduciendo esta al inoculo preparado, en la superficie del medio de cultivo (AGAR) para obtener colonias aisladas.

a. Esterilizar la asa bacteriológica elevando a T ° haciendo un conteo mental hasta 15. b. Introducir la asa bacteriológica al inoculo preparado.

c. Hacer dos puntos al extremo del medio de cultivo y homogenizar esa zona y proceder a ejecutar las estrías. d. Mantener un mechero encendido al momento de realizar la técnica, para impedir la entrada de microorganismos ambientales.

A. En TUBOS: TECNICAS: Picadura profunda (aplicada con Asa B. en punta) Homogenización (aplicada con Asa B. en orquilla)

En los tubos con medio de cultivo SIM se aplico la técnica de picadura profunda para lo cual se realizo los mismos procedimientos anteriores(a-b-d) con asa bacteriológica en punta. La técnica se hace introduciendo el asa con firmeza hasta lo profundo del tubo de ensayo. En los tubos con CALDO NUTRITIVO se aplico la técnica de homogenización para lo cual se realizo los mismos procedimientos anteriores (a-b-d) con asa bacteriológica en orquilla.

Se introduce con firmeza la asa bacteriológica y se hace un leve agitamiento para que el inoculo quede en ella.

Seguidamente luego del sembrío en tubos se procede a tapar con un tapón de algodón. Agitar entre las manos con movimientos rotatorios.

Preparar para llevarlo a la estufa, para que los microorganismos se desarrollen; pero para evitar la confusión de intercambio inconciente de materiales se apuntara en ella:

Nombre del cultivo-carrera- semestrecátedra-fecha

una temperatura de

Introducir los cultivos a la estufa a temperatura de 37°C por 24 horas.

RESULTADOS ✔ Es de vital importancia realizar un pequeño calculo considerando la formula de hidratación del medio de cultivo y capacidad de los materiales a utilizar, para hallar medios propicios en la cual se sembrara. ✔ La esterilización de los materiales y manejo de ellos juega un papel importante, de ello depende el buen desarrollo de los microorganismos a cultivar. ✔ Al elevar la temperatura del inoculo preparado se hace con la finalidad de reducir la sobrecarga de microorganismos. ✔ La aplicación de una técnica de cultivo dependerá del medio de

cultivo. ✔ El objetivo de las técnicas de siembra es obtener colonias aisladas. COMENTARIOS ✔ Contar siempre con los medios de protección posible (guardapolvo, guantes, gorro, etc.). ✔ Mantener la limpieza del ambiente (uso de mechero) donde se realizar la técnica de siembra y también de nuestras manos para reducir la probabilidad de ingreso de microorganismos del ambiente. ✔ Poner en la posición correcta la placa cuando esta va a ingresar a la estufa. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Apuntes tomados en clase de práctica http://images.google.com.pe/imgres?imgurl http://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/practico/siembra.html ANEXOS Medios de cultivo Definición Son nutrientes que vienen en polvo, granulaciones para ser hidratados, cuya finalidad es hacer posible el crecimiento de microorganismos. Características A) Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. Como fuentes de energía tenemos: a. Fuente de carbono: otras azucares simples y complejos, otros gas carbónico, hidrocarburos o incluso hidrocarbonados diferentes. b. Fuente de nitrógeno: Esta fuente de energía la van a formar las proteínas, péptidos o aminoácidos. Otros requerimientos no energéticos de los m.o son: a. Fuentes de azufre: Lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos. b. Fuente de fósforo: En forma de fosfatos c. Iones metálicos: A concentraciones muy bajas (cinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno) d. Factores de crecimiento: Corresponden a algún tipo de aminoácido (cisteína), factores específicos (F. X o F. V) o incluso vitaminas o bases púricas, pirimídicas,…

e. Factores de arranque: Son sustancias que van a permitir a la bacteria salir de su fase de latencia. Esto se consigue con glucosa o iones que estimulen su crecimiento. f. Factores inhibidores: Son componentes que van a impedir el crecimiento como la azida sódica (gran-), los antibióticos, la eosina azul de metileno (gram +) B) Condiciones físico-químicas apropiadas: a. Temperatura óptima: Hay tres tipos de bacterias dependiendo del grado de temperatura a las que crezcan: * Psicrófilas: < 20ºC * Mesófilas: 18-45ºC * Termófilas: > 45ºC b. Grado de humedad: La cantidad de agua que va a necesitar el m.o para su desarrollo. La liofilización o cualquier método de deshidratación es un buen medio de conservación. c. pH: Los buffers o tampones son los encargados de estabilizar el pH del medio a un pH cercano a la neutralidad que es el pH óptimo, aunque hay m.o que crecen mejor en pH ácidos (tiobacilos) o pH alcalinos (Proteus o Vibrio cholerae) d. Presión osmótica: En condiciones de isotonía (300 miliosmoles), aunque hay bacterias halófilas en las cuales su crecimiento se produce en concentraciones muy altas de cloruro sódico (10%) como el Género Staphylococcus; o en condiciones osmófilas en las que requieren un 70% de azúcar. e. Presencia o ausencia de oxígeno Composición de medios de cultivo utilizados *Agar nutritivo: Su composición es: extracto de carne 1 gr/l, extracto de levadura 2gr/l, peptonas 5gr/l, cloruro sódico 5gr/l y agar 15gr/l. *Caldo nutritivo: Su composición es: extracto de carne 1 gr/l, extracto de levadura 2gr/l, peptonas 5gr/l y cloruro de sódico 5gr/l. Condiciones generales Disponibilidad de nutrientes adecuados: debe de contener C-N-S-k y sales inorgánicos. También es necesario ciertas vitaminas y sustancias conductoras del crecimiento.y añadirotras sustancias dependiendo del microorganismo a cultivar.

Tipos * Por su estado: Solido.- Agar (1.5% agar) Este da solidez al medio de cultivo y a temperatura del ambiente es sólido; sus componentes son algas marinas, carbohidratos. Se prepara en placas petri o tubos de ensayo. Liquido.-Caldo (0% agar) No contiene agar es por eso que su estado es liquido. Se prepara en tubos de ensayo. Semi solido.- Medio o Agar (<0.5% agar) no son líquidos ni sólidos por la cantidad de agar presente .Se prepara en tubos de ensayo. *Por su composición: -Simples.-S u composición es simple, es decir están presentes los nutrientes básicos. -Enriquecidos.- Combinación compleja de nutrientes. -Selectivos.- Su composición restringe el crecimiento. -Diferenciables.- Distinguir a los microorganismos. -Bioquímica.- Analiza las capacidades bioquímicas y de metabolismo. -Antibiograma.- Permite el crecimiento de cualquier microorganismo

SIEMBRA Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril. AISLAR Es separar un tipo de microorganismo a partir de un población que los contiene de varios tipos. En habitats naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de m.o. presentes.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: a) Aislamiento por estrías
A: Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfría, se gira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

B: Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.

b) Aislamiento por dilución
Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede preparar las diluciones decimales en condiciones asépticas usando suero fisiológico o algún otro diluyente. También se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotación entre las manos y se vierte en placas de Petri estériles.

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