Resumen: E-060

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006

Preparacin de cultivos iniciadores.

Optimizacin del sustrato de crecimiento.
Rivas, Franco P. - Garro, Oscar
Facultad de Agroindustrias, UNNE.
Comandante Fernndez 755, Senz Pea 3700, Chaco, Argentina.
jianfranco@hotmail.com
Antecedentes
La principal caracterstica de las bacterias lcticas del yogurt Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus y
a la cual deben su gran importancia en la industria alimenticia es la acidificacin que producen en el medio debido a la
produccin de cido lctico (Becker ,1999; Tamime, 1991); propiedad que fue usada en este trabajo para seguir su
crecimiento.
En la bibliografa y pginas de Internet consultadas el medio de crecimiento mas comnmente usado es la leche
(Bourgeois, 1995; Ramos, 2002; Beltran; Garca Lpez; Valbuena, 2005).
Las temperaturas ptimas de crecimiento son de 37-42C y de 42-45C para S. thermophilus y L. bulgaricus
respectivamente.
Las bacterias S. thermophilus y L. bulgaricus se desarrollan en una verdadera simbiosis. En esta simbiosis es el S.
thermophilus el que inicia la fermentacin lctica y que se desarrolla muy intensamente hasta un pH de 5,5. La acidez,
el consumo de oxigeno y la liberacin de sustancias voltiles, por ejemplo cido frmico, que produce crea las
condiciones ideales para que se desarrolle L. bulgaricus. Normalmente se utilizan en una relacin cuantitativa de 1:1 a
1:3, aproximadamente.
La actividad proteoltica de los lactobacilos estimula, a su vez el crecimiento y la actividad acidificante de los
estreptococos. Los lactobacilos desarrollan aparte una actividad lipoltica, por lo que se liberan cidos grasos y
producen adems acetaldehdo, constituyndose as en los principales productores de aroma del yogurt.
Observados bajo el microscopio se ve que S. thermophilus crece formando pares o cadenas mediante clulas esfricas
o elipsoides. L. bulgaricus presenta forma de bastoncillo relativamente largo con tendencia a formar cintas (Cayr,
2000; Briceo, 2001; Holt, 2000).
A partir de estos datos se procedi al reconocimiento, aislamiento e investigacin sobre medios de cultivos ptimos
para el desarrollo de dichas bacterias.
Materiales y Mtodos
Aislamiento de las bacterias del yogurt: se procedi segn el mtodo de diluciones sucesivas en agua peptonada y
siembra en medio agarizado de LAPTg y MRS en placa, se utiliz yogures comerciales de varias marcas hasta lograr el
aislamiento de ambas bacterias. Al medio de cultivo se adicion sorbato de potasio (0.02%) para evitar el crecimiento
de hongos.
Seleccin de colonias: se seleccion segn la forma de la colonia en placa. S. thermophilus forma colonias tpicas
circulares o lenticulares, compactas y con bordes uniformes (1 a 3 mm. de dimetro) y L. bulgaricus forma colonias de
aspecto rugoso con bordes irregulares. Esto no fue comprobado en la prctica en su totalidad debido a las formas de las
colonias y sobre todo al tamao muy reducido (un mm. aproximadamente), lo cual dificult su extraccin, por lo cual se
precedi a su eleccin al azar eligiendo las colonias de mayor tamao.
Se realiz el pasaje individual a nuevas placas y luego a LAPTg y MRS caldos.
Comprobacin de la presencia de S. thermophilus y L. bulgaricus: se realiz la tincin de gram, prueba de la catalasa
y observacin de la morfologa en microscopio.
Comparacin de las medios de cultivos: a efectos de determinar que medio es ms ptimo para el crecimiento de
dichas bacterias procedimos a la construccin de curvas de crecimiento con sus correspondientes duplicados, cada
bacteria sola y combinadas para comprobar as tambin la simbiosis, para lo cual se extraan muestras cada dos horas a
las cuales se les realizaron las pruebas:

Acidez: mediante una titulacin con NaOH 0,1N con fenoftaleina como indicador. El volumen gastado en
ml (V) se reemplaza en la frmula para pasar a grados Dornic (D) y dividiendo por 100 obtenemos el
porcentaje de cido lctico formado durante la fermentacin:

% c.Lctico =

9 V
100

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pH: con peachmetro digital.

Densidad ptica: en el caso de que la transparencia del medio lo permita con el espectrofotmetro a 560
nm.
Los resultados fueron colocados en las tablas y representados grficamente.
Dicho procedimiento fue repetido con leche y con LAPTg como medios de cultivo.
Medios de cultivo (Cayre, 2004):
LAPTg: composicin en g/litro: extracto de levadura, 10g; peptona, 15g; triptona, 10g; glucosa, 10g; tween 80, 1ml;
agar, 12g; agua destilada, 1 litro. pH final 6,8. Disolver completamente y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos.
MRS: composicin en g/litro: polipeptona, 10g; extracto de carne, 10g; extracto de levadura, 5g; glucosa, 20g; tween
80, 1.08ml; fosfato de potasio, 2g; acetato de sodio, 5g; citrato de amonio, 2g; sulfato de magnesio, 0.2g; sulfato de
manganeso, 0.05g. El pH del medio a una temperatura de 25C es de 6.4 0.2
Leche: se utiliz leche comercial larga vida. Para la preparacin de los inculos, se dosific en los tubos y esteriliz
en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Discusin de los resultados
Cuando se realiz el aislamiento de las bacterias S. thermophilus y L. bulgaricus se encontr que no se encontraban
ambas en todos los yogures, o lo hacan en muy bajas concentraciones, y dependa de la marca. Se logr aislar ambos
microorganismos de uno de ellos. Se recurri al medio MRS para favorecer el crecimiento de los bacilos frente al de
los cocos, facilitando la distincin y aislamiento de cada especie.
Las bacterias aisladas resultaron gram positivas y en la prueba de catalasa, todas catalasa negativas.
Cuando las colonias se cultivaron en los tubos de ensayo se observ que los cocos sedimentaban en forma compacta,
mientras que los bacilos lo hacan en forma esponjosa y en mayor cantidad.
En los ensayos realizados se observ mayor crecimiento en las muestras que contenan ambas bacterias y en segundo
lugar el desarrollo varia de acuerdo al medio de cultivo utilizado.
Las mediciones de densidad ptica no pudieron realizarse en la leche; y en el medio LAPTg luego de 12 h de cultivo
se detuvo el crecimiento de las bacterias, pero si continua la acidificacin del medio con la generacin de cido lctico.
Tambin fue analizado el efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano realizndose ensayos a las
temperaturas de 37C y luego a 40C. A la temperatura de 37C el pH del medio bajo a 4.4 en un perodo de 49 horas,
mientras que a 40C se lleg al mismo pH en slo 14 horas, usando LAPTg como medio de cultivo.
Se puede observar en las grficas que no se presenta la fase lag o de retraso, esto se debi a que el inculo creca ya
bajo las mismas condiciones y el mismo medio en el que se realiz el ensayo, el crecimiento contina a la misma
velocidad. Sin embargo, si el inculo se toma de un cultivo viejo se presenta una fase lag,
La fase de crecimiento exponencial se dio en horas de la noche, momentos en los que las mediciones no fueron
tomadas, a esto se debe la forma tomada por el recorrido de la curva en las horas comprendidas entre 0 y 12
aproximadamente.
Luego de las 12 horas observamos la fase estacionaria en la cual el crecimiento exponencial se detiene, por la
presencia del cido lctico que es una sustancia txica para los microorganismos. La produccin de cido contina hasta
las 20 horas de cultivo, a partir de all se observ una disminucin de la viabilidad de las clulas. El % de cido lctico
continu aumentando hasta las 48 horas pero en muy baja proporcin.
Fig 1: Curvas de Crecimiento correspondientes a cada bacteria en los diferentes medios de cultivo a 40C:
Crecimiento de Bacilos
7
6
5

pH en Leche

4
3

%c. Lctico en Leche

2
1

%c. Lctico en LAPTg

0
0:00:00

pH en LAPTg

12:00:00

24:00:00
Tiempo (h)

36:00:00

48:00:00

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Crecimiento de Cocos+Bacilos
7
6
5

pH en Leche

%c. Lctico en Leche

pH en LAPTg

2
1

%c. Lctico en LAPTg

0
0:00:00

12:00:00

24:00:00

36:00:00

48:00:00

Tiempo (h)

Crecimiento de Cocos
7
6
5

pH en Leche

%c. Lctico en Leche

pH en LAPTg

2
1

%c. Lctico en LAPTg

0
0:00:00

12:00:00

24:00:00

36:00:00

48:00:00

Tiempo (h)

Conclusiones
A travs de las sucesivas mediciones se iba confirmando el hecho de un elevado crecimiento relativo del ensayo que
contiene ambas bacterias respecto a los que contenan una sola especie, comprobndose as la simbiosis que se produce
entre el Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus; y dependiendo del medio, las bacterias por separado
lograban un desarrollo ms rpido, en leche la mayor y ms rpida acidificacin la produjeron los cocos, mientras que
en el medio LAPTg los bacilos se desarrollaron ms rpido.
El descenso de pH no se correlaciona linealmente con el cido producido esto es debido a la capacidad buffer de los
medios de cultivo por lo que es importante seguir los dos parmetros durante el desarrollo del ensayo.
Se confirm tambin que el medio leche fue el mejor debido a varias cualidades como ser su accesibilidad, economa,
ser prctico, ser el medio natural de crecimiento y tener todos los nutrientes que las bacterias necesitan para su
desarrollo, esto se observa claramente en los grficos . As tambin ha de destacarse las cualidades del medio LAPTg,
como ser la fcil manipulacin debido al no solidificarse al momento de la acidificacin, mayor visibilidad de los
procesos de crecimiento, como as tambin permite realizar mediciones de la densidad ptica del cultivo.
La temperatura fue tambin una variable muy importante, debido que un pequeo aumento en la temperatura desde
37C a 40C produjo una gran reduccin en el tiempo de crecimiento,
Bibliografa:
Jeffrey M. Becker, Guy A. Caldwell y Eve Ann Zachgo. (1999) Biotecnologa: Curso de prcticas de laboratorio.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza (Espaa).
C.M. Bourgeois y J.P. Larpent. (1995). MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA. VOLUMEN 2: FERMENTACIONES
ALIMENTARIAS. Acribia.
Ana Graciela Briceo, Ral Martnez y Karely Garca (2001) Tecnologa de Alimentos. Viabilidad y Actividad de la
Flora Lactica (Streptococcus salivarius ssp thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus) del yogurt en
Venezuela. Acta Cientfica Venezolana, 52:4654

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Mara E Cayr,.Graciela Vignolo,. Oscar Garro. (2004).- Modelo dinmico para el crecimiento de bacterias lcticas
sobre emulsiones crnicas. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE. Comunicaciones Cientficas y
Tecnolgicas
Mara Dolores Garca Lpez y Federico Uruburu Fernndez. LA CONSERVACIN DE CEPAS
MICROBIANAS.Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de Valncia. 46100 Burjassot (Valencia).
John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter M. A. Sneath, James T. Staley, Stanley T. Williams. (2000) Bergey`s Manual of
DETERMINATIVE BACTERIOLOGY Ninth Edition. Lippincott WILLIAMS & WILKINS. Philadelphia.
Y. Tamime y R. K. Robinson. (1991) YOGUR- Ciencia y Tecnologa. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
Emiro Valbuena, Jos Barreiro, Egar Sanchez, (2005) Modelos cinticos aplicados al crecimiento de lactococcus lactis
subsp. lactis en leche. rc, dic. 2005, vol.15, no.5, p.464-475.ISSN0798-2259.Revista Cientfica
Maria E Cayr, Oscar A Garro. (2000). Gua de Trabajos Prcticos de Laboratorio de la ctedra Microbiologa de los
Alimentos. Facultad de Agroindustrias. UNNE.
Roberto Ramos, (2002). http://www.geocities.com/roberto_raul/crecimiento.html
Daniel Beltran. http://www.freewebs.com/biotecvida9/lactica.htm