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14. Pruebos bioquimicas para Ia identificacién de bacterias La propiedad termorresistente es la base para la diferenciacion de algunas especies del género Pseudomonas. A) B) c) IV. REACTIVOS EMPLEADOS pnitrofenil fostato.? Preparar en concentracion del 0,1. % en agua destiladautilizando. un frasco volumé ico. 2. Guardar en un frasco de vidrio color caramelo. Evitar la exposicién ala luz 3. Rotular correctamente. Buffer Tris, 0,02 M, pH:8 1, Disolver 3.02 g (0,025 moles, peso mol, 121) detrissdlido (hidroximetil) aminometano (0 2-amino-2-hidro- ximetil-1.3-propandiol) en 100 ml aproximadamente de agua destila- da en un frasco volumétrico de un litvo. Hervir el agua destilada para que se desprenda el CO." 2. Agregar 25 ml de CH LN (0,025 moles de CIH) y cs.p. 1.000 ml con agua destilada hervida. 3. Controlar el pH; a 37° C debe ser 8. 4. Rotular correctamente. Método de utilizacién (de ambos reac- tivos).” 1. Con una torunda estévil retirar las células que se desarrollan en un medio de agar adecuado y preparar una suspension celular del organis- mo bajo sospecha, en buffer T (pH:8) con una densidad igual al N°3 del nefeloémetro de MeFar land. a) Estandarizar las densidades de células por ml b) Preparar diez tubos patron nu- merados desde el 1 hasta el 10. 1. Cada tubo contiene un multi- plo de 300.000.000 de orga- hismos por ml Numero del tubo patron por 300,000,000 es igual al mti- mero de organismos por ml (Tubo 3 = 9 x 10* cél/mb), oH Fosfatasa b—on OH paitrofenil fostato, Gncoloro) Colocar 0,5 ml de la suspensién de microorganismo en buffer en dos tubos, y rotularlos tubos 1 y 2. Colocar el Tubo 1 en un baito de agua a 70°C durante 20° min EI Tubo 2 es el control no calentado. Despueés de la incubacién del Tubo 1, agregar 0,5 ml de una solucién de-prnitrofenil fosfato al 01% (in- colora) a ambos tubos. Segunda incubacién, ambos _tubos, nun bafo de agua MG, b) Desde 1h hasta el dia siguiente. es negativa (no aparece color amarillo en ninguno de los tu- bos), incubar 24 h. 7. Registrar las reacciones de color D) Control de calidad. Antes de adoptarlos para su empleo general, deben contro- Larse los reactivos con cultivos positives y negativos conocidos. El Staphylococcus epidermidis y ka P. aeruginosa constituyen Duenos controles porque se obtiencn hacilmente y no crean problemas cuan- do se los conserva como cultivos madre, epidermidis: prueba de la fostatasa negativa, no se produce fosfatasa® P. aeruginosa: prucba de la fostatasa positi- va, resistente al calor. BE) Conservacion: Guardar ambos reacti- vos en un reftigerador (a 4° C) cuando no se los emplea. Su estabilidad es variable: por lo tanto, periddicamente habra que hacer un control de calidad. desechandolos si muestran una reac- cion negativa o débil con un organismo positive conocido. F) Quimica de la accion del reactivo: El Prnitrofenil fosfato es un reactivo ineo- loro que se desclobla para dar p-nitrofe- nol (un compuesto de color amarillo) y fosfato inorginico cuando sobre él acttia ‘la enzima fosfatasa.’ Las sales coloreadas de los p-nitrofenoles se for- man con bases (buffer Tris); probable- mente son sales de una estructura quinoide.” as sales de nitrofenol son de color amarillo intenso.” Fosfato inorginico pritvoenot i (amarillo) PRUEBAS BIOQUIMICAS INDIVIDUALES Prueba de la fosfatasa alcalina termorresistente I. PRINCIPIO Determinar la actividad enzimatica termo- labil de la fosfatasa alcalina de un organismo. Il. OBJETIVO (Véase también Ia Seccin III, cap. 33) EL organismo que se va a estudiar con respecto a la actividad de la fosfatasa alcalina debe ser identificado previamente como miem- bro del género Pseudomonas. Muchos miem- bros de las Enterobacteriaceae son resistentes al calor " y esta prueba no diferencia entre el género Psewlomonay y otros géneros entéricos. Diferenciacién de especies de Pseudomonas A) Termorresistentes *: 1) Pseudomonas aeruginosa; 2) Pseudomonas pseudomallei: 3) Pseudomonas boreopalis B) Termolabiles: todas las demas especies de Pseudomonas.? III. BASES BIOQUIMICAS La enzima fosfatasa es una fosfomonoeste- rasa ® que acttia sobre los sustratos monoéste- res fosfatos.2* La hidrélisis del esterfosfato produce fosfato inorganico (Pi) y alcohol (R-OH)* El enlace entre el oxigeno y el fosforo se rompe por hidrdlisis (C-O!P), liberando el fosfato inorginico del monoéster fosfato.* La enzima_ fosfatasa alcalina tiene su actividad catalitica éptima cuando existe un pH alcalino, de alli su nombre de fosfatasa alealina* Algunas enzimas fosfatasas alealinas son resistentes al calor, mientras que otras son destruidas cuando son sometidas a una temperatura cle 70° C durante cierto tiempo. ° Po ° Fostito inorginien H oH Fosfatasa alealina 5 Wonka + HO i (Hidrilisis) oO Ester de fosfate onginico Fosfato, inorgainico Alcohol V. RESULTADOS La fotografia en colores de | Ios resultados puede verse en la Figura 1-1 (Apéndice 1), “VI. INTERPRETACION A) Termorresistentes: P. aeruginosa, P. seu- domallei, P. boreopotis 1. Tubo calentado: marillo). 2. Tubo de control no calentado: posi- tiva (color amarillo). B) Termolibiles: Especies de Pseudomonas que no sean las mencionadas en A). 1. Tubo calentado: negativa (incolora). 2. Tubo de control no calentado: posi- tiva (color amarillo), ©) No se trata de una especie de Psewdo- monas. 1. Tubo calentado: negativa (incolora). 2. Tubo de control no calentado: ne- gativa (incolora). Una reaccién fuertemente positiva puede producirse a la hora de la incubacién; sin embargo, una rea cin débil puede requerir la incuba- cién durante 24 h (de un dia para el otro)." positiva (color VII. PRECAUCIONES A) EL organismo debe ser identificado como miembro del género Pseudomonas antes de probar su actividad de la fosfatasa alea- lina. Muchos miembros de las Enterobac- teriaceae producen Ia enzima fosfatasa Proteus, Providence, Salmonella, Shigella, Klebsiella y Escherichia coli; y muchas de estas fosfatasas son resistentes al calor." Esta prueba silo diferencia las especies dentro del género Pseudomonas.? Todas las especies de Pseudomonas tienen flagelos polares y la prueba de OF es oxidativa para la glucosa, lo que descarta posibles 1, Bailey, R. W., and Seott, E.G. Diagnos- tie Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 'Y. Mosby Company, 1966, p. $29. it 2. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio. chemistry, $rd ed., Philadelphia: W. B. ‘Saunders Company, 1962, p. 239. 3. Cowan, S. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacte- 6. Fosfatasa alcalina termorresistente 15 miembros de las Enterobacteriaceae. Asi- mismo las especies de Pseudomonas tienen requerimientos de temperatura variables para su crecimiento Gptimo, Muchas especies de Pseudomonas no se desarrollan a 37° C y, sin embargo, todas las especies de P. aeruginosa y P. pseudomallei crecen bien a 37°C7 B) Todas las especies dle Pyeudomonas produ cen la enzima fosfatasa, pero la mayoria son inactivadas cuando son calentadas a 70° C durante 20 min. Solamente la P. aeruginosa, P. pseudomallei y P. boreopolis son termorresistentes; otras especies de Pseudomonas son termolabiles (sensibles al calor).7 Hasta el momento no existe medio bioquimico para diferenciar la P. aeruginosa de la P. pseudomallei.? La dife- renclacién se hace seroldgicamente, util zando antigenos solubles especificos para la especie.’ ©) La enzima fosfatasa es producida por las especies de Pseudomonas y algunos miem- bros de las Enterobacteriaceae " sinica- ‘mente cuando son cultivadas en un medio que contenga una concentracién suma mente reducida de fosfato.” Por lo tanto, emplear un medio que no contenga fostato adicional, como el agar-extracto de glucosa-triptona 0 cualquier medio que no contenga mas de un 0.2 % de peptona y 0,05 % de extracto de leva- dura? D) La suspensién de células en buffer debe serincolora antes del agregado del reactivo p-nitrofenil fosfato.” Un caldo de cultivo no es conveniente como medio para la suspensin celular, ya que la peptona imparte a la suspensidn un color amarillo. Asimismo, muchas especies de Pseudoma- nas producen un pigmento amarillo yer- doso, fluoresceina, que puede ocultar una reaccién negativa.” Sin embargo, silo se forma fluoresceina cuando el cultivo se efectia en un medio que contiene fos- fato."* E) No se deben preparar suspensiones celu- lares utilizando un buffer fosfato ya que éste inhibe la actividad de la fosfatasa.? BIBLIOGRAFIA ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 35 and 162 Davidson, I., and Henry, J. B. Todd- Sanford Clinical Diagnosis by Labora- tory Methods, 14th ed., Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1969, p. 1259 Fioser, L. F., and Fieser, M. Organic 16 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias Chemistry, 3rd ed., New York: Reinhold Publishing Corporation, 1956, p. 461, Harrow, B., and Mazur, A., Textbook of Biochemistry, 9th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1966, pp. 111 and 144. Liu, P. V. (1966) Differentiation of patn. ogenic pseudomonads by heat resist- ance of alkaline phosphatase. Am. J. Clin, Pathol., 5, 689. Lynch, 8. S., Mellor, L. D., Spare, P. D., and Inwood, M. J. H. Medical Labo- ratory Technology and Clinical Pathot- ogy, 2nd ed., Philadelphia: W. B. Saun- ders Company, 1969, p. 307 .Noller, C. R: Chemistry of Organic Com- pounds, ard ed., Philadelphia: W. B. ‘Saunders Company, 1965, p. 555. 10, Rice, E. W. Principles and Methods of Clinicas Chemistry for Medical Technol- — ogists, Springfield, Ill: Charles C ‘homes, Publisher, 1960, pp. 38-89. 11, Torriani, A. (1960) Influence ot inor- ganic phosphate in the formation of phosphatases by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, $8, 460. 12, Whitmore, F. C. Organic Chemistry, New York: D. Van Nostrand Company, Inc., 1997, p. 782 18, Wilson, Sir G. S., and Miles, A. A. To- ley and Wilson's Principles of Bacteriol- ogy and Immunity, Vol. I, 5th ed., Balti- ‘more: The Williams & ‘Wilkins Com- pany, 1964, p. 639. 4 Prueba de la esculina en medio con bilis I. PRINCIPIO Determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucésido esculina en esculetina y glucosa, en presencia de bilis (10 a 40 %). Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, cap. 32) A) Ayudar a la diferenciacién de los estrep- tococos del grupo D de otros estreptoco- cos que no pertenecen a dicho grupo. B) Ayudar a la diferenciacién de la Listeria monocytogenes (+). H Deglucost. No hidracarbonauto (B-D-glucopiranosi) Ho, oJ HOH icles) a a 2 gd gt o 4 \ Acido Hidralisis HOH he Vn HOW Eseulina (CisHyeOs) 6 ,g-glucésido-7-hidroxicumarina HI. BASES BIOQUIMICAS La esculina es un glucdsido; un acetal derivado de monosacaridos simples. Cuando un elemento que no es un hidrato de carbono se une a un aziicar por medio de un enlace acetal, el acetal resultante se denomina glucésido y la mitad no hidrocarbonada aglucona.' La aglucona esti unida al azicar madre por medio de un atomo de oxigeno (enlace glucosidico LO- )2 Los acetales son répidamente hidrolizados por los icidos; ? la base de la prueba de la esculina es la hidrélisis de la esculina en esculetina, liberando la molécula de glucosa. La produccién de esculina puede ser HOA 09 any Hon LI Ko Axghtcona Non af) ON HE Enlace ghueosidien hon Fsculinsa Glucéside (derivado acetal) Ganon a) on ee vu A F a \\oH H/, Ho SS wo? yh HOH Esculetina (aglucona) B-D-glucosa 6.7-dihidroxieumarina 18 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias demostrada por cualquiera de los dos me- dios.* Método de rutina La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un complejo castano oscuro o negro. Elcitrato dehierro (FeCgH;O;) se incorpora al medio de esculina con bilis en una concentracién del 0,05 % como indicador de la hidrélisis de la esculina y de la formacién de esculetina resultant HO. : Eseuletina Complejo de hier Kendilico (colar negro: feastao oscuro) ones férricos Se desconoce el mecanismo exacto, pero se supone asi on eee ie oe u 9 Método alternativo La produccién de acido con formacién de gases (CO2 y Ha) 0 sin ella en la mitad ghucosa, puede indicar también la descomposicion de la esculina. IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE ESCULINA ‘CON BILIS (pH: 7) A) Ingredientes (medio general) 1, Peptona Bg 2. Extracto de ca 3g 3. Bilis de buey 40g 4 culina 1g 5. Citrato de hierro (FeCgH3O7) 05 ¢ Agar bg 6, 5g 7. Agua destilada 1.000 ml B) Productos que se encuentran en el comercio (véase Apéndice V). 1. Pfizer: medio selectivo para enteroco- cos (MSE). 2. Difco: dos variedades. c) G H) a) Medio de esculina y bilis (MEB) b) Medio de esculina y bilis modifi- cado (MEBM) (modificacién, sin agregado de sucro equino) 3. BioQuest (BBL): medio de esculina y bilis (MEB, agar selectivo para entero ‘cocos), Diferencias generales entre los medios comerciales 1. Goncentracién de bilis. a) 40 % (Difco). b) 10 % (Pfizer y BBL). 2. Azida sédica (NaNa), 0,25 gflitro. a) Presente en Jos medios de Pfizer y BBL. b) Ausente en los medios de Difco. Método de preparacién. 1. Medir exactamente la cantidad que indica el prospecto; los diferentes productos pueden variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o de: mineralizada 3, Calentar suavemente la solucion. 4. Colocar aproximadamente 5 ml en un tubo con tapa de rosea (16 x 125 mm), Método de esterilizacion. 1, Autoclave. 2 121°C, 15 libras, 15 min, Dejar enfiiar manteniendo el tubo énetli- nado (para obtener una gran superficie en pico de flauta. Refrigerar para su conservacién (4-10° ©). Método de inoculacién. 1. Inéculo de un caldo de Todd-Hewitt de 24 h, cultivo puro. Agregar 2 goras a la superficie del pico de flauta con na pipeta de Pasteur 0 un asa de inoculacién. Incubacién. 35° C. 48h. 1. Pueden controlarse periédicamente los tubos y si la reacts anotar el resultado. 9. Esperar hasta las 72 h antes de hacer un informe negativo. V. INTERPRETACIONES A) Prueba EB positiva (hidrélisis de la esculina): presencia de un color negro a castanio oscuro en el pico de flauta La mitad 0 mis de la superficie del medio aparece negra. i En cualquier intervalo de tiempo? B) Prueba EB negativa (hidrélisis de la esculina). 1._Nose ha producido el ennegrecimien- to del medio, 2. Ennegrecimiento de menos de la mitad del tubo después de 72 h de incuba- cion (reaccion +/-)* 3. Puede producirse crecimiento, pero esto no indica la descomposicién de la esculina; solamente indica que la con- centracién de bilis. no inhibio cl crecimiento normal de los organismos que no corresponden a los estrepto- cocos del grupo D. VI. PRUEBA RAPIDA: PRUEBA CON LA TIRA REACTIVA IMPREGNADA. CON ESCULINA Y BILIS. (PATHOTEC) A) Fabricante: General Diagnosties Division, Warner-Lambert Company B) Resultados: dentro de 1 a 4h de la cubacién. C) Método: seguir las indicaciones del fabri- cante. D) Correlacién con la prueba patron 1, 98 %* 75%! A veces, falsos positivos: * a) Excheri- chia; b) Citrobacter; ©) Proteus morganit \ veces, falsos negatives: * a) Klebsie- Ila; b) Enterobacter: 0) Serratia Esculina en medio con bilis 19 4. Dific de interpretar el color.! VII. PRECAUCIONES A) La prueba con esculina y bilis se utiliz6 originariamente para identificar a los enterococos; sin embargo, otros estrepto- cocos del grupo D y a veces que no son del grupo D y otros géneros, Arrororeus® y Listeria, pueden tolerar la concentracién de bilis y desdoblar la esculina. Las propiedades de crecimiento en medios con 40 % de bilis y acido de la esculina (hidrélisis) no son tinicas de los estrepto- cocos del grupo D, sino que son caracte risticas que comparten con la mayoria de las cepas del grupo D.! La prueba con esculina y bilis no puede ser usada para identificar a los entero- cocos, pero puede utilizarse una reaccién positiva eu enubinacivn eon otras pruchas para identificar presuutivameate a las espe- cies de Streptocorrus del grupo D. Véase la Seccién IIT, Capitulo 32, donde se halls un esquema de identificacién detallado para la diferenciacién del grupo D. Las reacciones serolégicas son el rinica medio para coufirmar ki identificacién de los estreptococos del grupo D.' No debe confiarse en una prueba aislada para identifica presunticamente a los es- treptococos del grupo D, sean entero- cocos no. Facklam ' y Facklam y col recomiendan una combina n de las pruebas con esculina ybilis y de tolerancia a la sal (crecimiento en cloruro de sodio al 65“). como puede verse en el cuadro 2-1 Las dilerencias de los medios de esculina y bilis que se encuentran en el comercio justifican las diversas reacciones de los organismos.* La azida sodica inhibe a los organismos gramnegativos, haciendo que el medio, resulte selective para los estrep- B) oi} Cuadro 2-1" MSE, MER o MEBM CING 65% + Creciniiento . No se observ No se obsersis ‘erp 1D No del gry D Crecimiento : Mentificacrin Enteracoce grape D No enteroroco, Neenteronorn Pasties Siey «#0 y. exp, Shiprocarens viridans Si son p-hemoliticas, verifiear vise trata det let grapes Si si pehemicicos, conti pare cl grupo B, Sison a oy controlar: la purer del call, con sil: volver a sislar en phe de ag sangre de earner nar la procter 20 Pruebas bioquimicas pora la identificacién de bacterias tococos; sin embargo, los medios de Difco no contienen azida y no son selectivos. Los medios de cultivo de Difco contie- nen cuatro veces mas de bilis (40 %) que los de Pfizer y BioQuest (10%), y la menor concentrac de bilis es menos inhibidora para los estreptococos que no pertenecen al grupo D.' Otros estrepto= cocos, como algunas especies viridans, son capaces de descomponer la esculina: S. sanguis, S, mutans y S. anginosus (Strepto- coccus MG de la_antigua clasificaciin), pero estas especies por lo general no pueden tolerar una mayor concentracién de bilis del 40 % ¢ hidrolizar la esculina en combinacidn. No obstante, con la baja concentracin de bilis de los medios de Pfizer y BioQuest. se puede producir el crecimiento y la hidrolisis* Los estudios BIBLIOGRAFIA de Sabbaj y col” demostraron que todas las cepas de S. mutans (grupo viridans) hidrolizaban la esculina. Algunas cepas poctian crecer en bilis al 40%. pero no ke hacian en el medio con 6.5 % de sal. Ota especie de estreptococos del grupo. viri- dans que a veces podia hidrolizar la esculina y crecer en un medio de mayor concentracién era el S, sanguin. Por lo tanto, ef medio que contiene azida es mejor como medio selectivo primavio, pero aquel con mavor concen- tracion de bilis (40%) y sin azida (Difco) €s mejor para la diferenciaciin, Los est dios de Facklam * demostraron que el medio MSE. (Pfizer) no es conveniente para diferenciar con precision los estrep- tococos del grupo D- de les que no pertenecen a dicho grupo. 1. Blazevie, D. J., Schrenckenberger, P. C. and Matsen. J, M. (1973) Evaluation of the PathoTec "Rapid I-D system.” Appl Microbiol, 26, 886. 2. Cantarow, A., and Schepartz, B. Bio chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B Saunders Company, 1962, pp. 10-11 3. Cowan, 8. T., and Steel, K. J. Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, p. 24 4, Facklam, R. (1972) Recognition of group D streptococcal species of human origin by biochemical and physiological test, Appl. Microhiol.,. 23, 1181, 5, Facklam, R. R. (1973) Comparison of sev- eral laboratory media for presumptive identification of enterococci and group D streptococei. Appl. Microbiol.,.26, 138. 6. Facklam, R. R., Padula, J. F., Thacker, L.G., Wortham, E. C., and Sconyers, B. J. (1974) Presumptive identification of group A, B, and D streptococci. Appl. Microbiol., 27, 107. 7. Norris, J. R., and Ribbons, D. W. Meth- ‘ods in Microbiology, Vol. 6A, New York: ‘Academie Press, 1971, p. 11 8. Rosner, R (1978) Evaluation of the Path ‘otec "Rapid I-D system” and two addi tional experimental reagent-impreg- nated paper strips. Appl. Microbiol., 26, 890. 8. Sabbaj. J., Sutter, V. L., and Finegold, S. M. (1971) Comparison of selective me- dia for isolation of presumptive group D streptococe! from human feces. Appl. Mie crobiol., 22, 1008 Prueba de solubilidad en la bilis I. PRINCIPIO Para controlar la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en un tiempo y con una temperatura especificos. Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, cap. 32) A) Se utiliza especificamente para difere! ciar entre el Streptococcus pneumoniae solu- ble en bilis y otras especies de Streptococcus alfa-hemoliticas no solubles en bil Puede ayudar a la diferenciacion del Haemophilus influenzae y el H. aegyptins solubles en bilis, de otras especies de Haemophilus insolubles en bilis, B) IIL. BASES BIOQUIMICAS Las sales biliares son sales sddicas de los cidos biliares sintetizadas de un compuesto comuin, el colesterol."" Downie y col."® sepa- raron los dciclos biliares en dos categorias: 1) Acidos no combinados cuyos diversos tipos solo difieren en su estructura quimica; 2) Jcidos coleicos, que son compuestos por adicion del acido desoxicélico y que varian de acuerdo con el tipo de agregados que se producen. Las sales biliares son dcidos biliares conju- gados con aminoacidos por medio de liga duras amidas (C=O) entre el grupo carboxi (COOH) del cido y el grupo amino (NH) de la_glicina_ (NH,CH,COOH) o Ia taurina (NH,CHsCH,SO3H).4 I aminoacido taurina deriva de otro aminoacido, la cist y su forma conju- gada con el Acido célico se denomina acido taurocélico. El acido célico conjugado con la glicina recibe el nombre de seido glicocélico, HOw coon eng oH Acide eslico chuig oo, Gomenason HO: . WW ‘ OH Acido taurncsitien 22 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias El dcido desoxicslico es un dihidroxiteido; el acido célico y el taurocélico son trihidroxi- Acids. Todos los acidos biliares tienen un nticleo biisico comin, el anillo ciclopentano: perhidrofenantreno.® Ania cclopentane: pethidrolenanteeno Las sales biliares que carecen de grupos oxhidrilos (OH) son inaetions, mientras que las sales del acido desoxicélico, un compuesto dihidyoxi con grupos oxhidrilos en los carbo- nos 3 y 12, son mis activos que los trihidroxi- Jos, colico_o wurocélico, que poscen grupos oxhidrilos en los carbonos 3,7 y 12 del nicleo basico." Downie y col." afirman que la lisis rapida del S. prenmoniae por los cidos biliares esta relacionada con el ntimero y posicién de los grupos oxhidrilo y su capacidad para formar compuestos de adi- Anicas. Las sales biliares utilizadas en las pruebas de solubilidad en bilis son, por lo general, desoxicolato de sodio 0 taurocolato de socio. ya que estos dos son los compuestos liticos mis activos entre los diversos dicidos.biliares. Estos se encuentian como aniones cuando estin en un pH alealino, y por ello se los denomina sales biliates." El desoxicolato es un dcido monobasico que tiene un pH. ligeramente alcalino cuando esta en soluciin acuosa tal como una sal sddica.' Las sales biliares hacen descender ka tensién superficial en ke interfase medio-membra- na!!! y también provocan una descompo- sicién de ka membrana celular." Sin embargo. este descenso de la tension superficial no es la linica causa de lisis del S. pneumoniae; inter- vienen otros mecanismos no aclarados.'"!1 ELS, pnewnoniae produce una enzima in lular autolitica (autolisina) que hace que el organismo sulra una autdlisis rapide (lisis) cuando es cultivado en un medio atifi- cial 1-821 Mair,"® Downie y col!” y Bus rrows y Moulder * afirman que el papel de las sales biliares es acelerar el proceso autolitico natural; los acidos biliares se combinan con as células neumocécieas y las alteran de manera que la enzima autolitica es activa- da." Downie y col.!® asevéran que las sales biliares aparentemente no lisan las células neumocicicas si esti ausente la autolisina natural; ambos procesos son similares." Goe- bel_y Avery ™ sefialan, no obstante, que la accién de las sales biliares es independiente de la enzima autolitica Burrows y Moulder,* Gowan y Steel? y Dubos v Hirsch " aseguran que si-un cultivo de S. pnewnoniae es destruido por el calor (65° C. 30 min) inactivando la enzima autoli- fica, no se produce la lisis ni naturalmente ni por aclicién de sales biliares. Dubos y Hirsch afirman que la activacién por las sales biliares, de la enzima autolitiea, que se_ produce naturalmente, se debe a la alteracion o a la extraccién de un inhibidor autolitico normal de las células neumocécicas. Goebel y Avery hallaron también que ka autdlisis normal por el S. pneumoniae puede ser inhibida si se emplea una alta concentracién de sales biliares para la prueba de solubilidad en bilis. También pueden emplearse aur de sodio, dodecilsulfato de sodio y otros detergentes que hacen descender la tensién superficial para lisar el 8. pneumoniae: 1 sin embargo, el laurilsulfato es menos especi- fico que el desoxicolato de sodio."* Leifson ® dice que en algunos experimen- tos preliminares hay indices de que otros organismos, adenuis del S. pnermoniae, son solubles en el desoxicolato de sodio. sulfate IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Desoxicolato de sodio 0 taurocolato de sodiv (10 %). 1. Productos que existen en el comercio. aw BBL: reactivo desoxicolato.* b) Difco, 1) Desoxicolato de sodio* 2) ‘Taurocolato de sodio* El extracto comercial de bilis de buey (BBL, Difco) es bilis deshidratada que puede ser reconstituida, pero se prefiere el desoxico- lato! 2. Método de preparaci6n. a) Pesar una cantidad de sal biliar, 10 g/100 ml (concentracién 10 %). y csp. 100 ml.con agua destilada. ‘Ambas sales biliares son Cicilmente solubles en agua destilada." 1) Desoxicolato de sodio: solucion incolora.® 2) Taurocolato de sodio: solucién color dimbar clavo* b) Las sales de bilis comerciales son. neutras (pH: 7) y no requieren ajuste del pH# Las sales biliares deshidratadas que se encuentran en el comer: son equivalentes a la bilis fresca y se las prefiere porque pueden ser esterilizadas y controlarse el por- centaje.® B) Rojo de fenol indicador del pH. 1. Alealino: color rojo rosado. 2. Acido: color amarillo. C) Hidréxido de sodio (NaOH), 10 N (40%). 1. Ingredientes. a) Hidréxido de sodio, libre de carbonato. RG. 40 g b) Agua destilada 100 ml 2. Método de preparacion. a) Pesar ripidamente el hidréxido de sodio y disolver en menos ce 100 ml de agua destilada en un vaso. Este reactivo es muy higroscépico. b) Colocar el vaso en un bao de agua circulante para controlar la temperanura ©) Enfriar y traspasar la solucién de hidréxido de sodio a un trasco volumétrico de 100 ml y agregar agua destilaca c.s.p. 100 ml d) Guardar en un frasco para reacti- vos de vidrio cubierte con para- fina 0 polietileno. e) Rotular correctamente. EL hidroxido de sodio es suma- mente ciustico y por eso debe evitarse el contacto con la piel para prevenir quemaduras D) Hidréxide de sodio, 0.1 N. 1. Ingredients a) Hidréxido de sodio, 10. N 1 ml b) Agua destilada, agregar hasta un total de 100 ml 2. Método de preparacién. a) Por medio de una pipeta. trasteriy 1 ml de una solucion de NaOH 10 N a un frasco volumétrico de 100 ml, y es.p. L00 ml con agua destilada b) Rotular correctamente. E) Solucién fisioligica estevil (CINa al 0,85 %), Solubilidad en la bilis 23 Control de calidad: Todos los reactivos deben ser controlados con ciltivos positives y negativos antes de ponerlos en uso. S. pneumoniae soluble en bilis. Otras especies dle Streptococcus: insolubles en bilis. Conservacion: Guardar todos los reac- tivos en un refrigerador (4° C) mientras no se emplean. Su estabilidad es variable; por lo tanto, periddicamente se hara un control de calidad, desechando los que muestran una reaccién negativa 0 débil con un organismo positive conocido. Vv. METODO Inéculo bacteriano-medios de crecimien- to: dos selecciones, 1. Pla ¢ de agar sangre (5 @ sangre de nero). a) Incubar a 35° C. b) Frasco bujia para aumentar el CO. Qa3s@, ©) Ra Wh. 2. Caldo de Todd-Hewitt®” a) Incubar a 35° ©, 18 a 24 bh. b) Centrifugar y desechar el sobre- nadante." Método de utilizacion. 1. Preparar una suspension eypesa de un cultivo pmo, en 1 ml de solucié fisiol6gica normal (CIN2). 2 Agregar 1 gota cle! indicador del pH rojo de fenol y aduptar el pH a7 (rosaclo) agregando algunas gotas de NaOH 0.1. Si es necesario. Dividir ka suspension de bacterias salina neutra en dos tubos (0.3 mr tubo). Rotukar uno como prucha, cl otro Como cautrol. 4. Agregar 0.5 ml de desoxicolato de sodio (0 taurecokato de sodio) al 10.% al tubo mareado prucha 5. Agregar 0.5 ml de solucién fisioligica normal estéril al tubo mareado contvel 6. Agitar suevemente los dos tubos para lograr Ia suspensién de las bact 7. Incubacic a) A 37° Cen incubador 0 bate de agua. b) 3h, controlande cada hora. 24 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 8. Observar cuando empieza a ackararse, lo que debe ocurrir dentro de las 3b En lugar de ka suspension en solucidn fisioligien puede usarse wn cultivo de organismos en crecimiento activo, pero dehr ser amortiguaclo 7 FI aldo de Todd-Hewitt contienc glucosa, vel aicido producide por los Organismos metabolizantes hace que el medio sea demasiado acide para detectar la solubilidad en ki bilis si se emplea sin amortiguar. Fl pil del medio no debe ser mais sicido de 6. VI. RESULTADOS \y La fotografia en colores de los resultados puede verse en la Figura 3-1 (Apéndice 1) VI. INTERPRETACION A) Soluble en bilis. 1. Soluci6n clara 0 ackaraindose (bilis — B) disuelta) 2. S. pneumoniae. B) Insoluble en bilis, 1. La solucién se mantiene turbia (nebu- losa). igual que el control 2. Especies e-Streptococcus tt otro orgas nismo, VIII, PRUEBA RAPIDA: TEGNICA EN PLACA A) Método de Hawn y Beebe." B) Resultados (a los 30 min). ©) Método. 1. 18a 24 h de crecimiento en placa de () agar con 5% de sangre de carnero. a) Sospecha de S. purwmoniae b) Colonias bien aisladas D) 2 Agregar, con un asa de inoculuci6n, una gota de desoxicolato al 2% (pH: 7) directamente sobre una colonia ais- lada, 3. Incubacién. No invertir la placa; de- jarla. descubierta. 35° C. 30 min, a) Soluble en bilis. i La colonia se desintegra, Deja un iirea parcialmente he- molisada en el medio de cultivo donde. se encontraba la colonia. Insoluble en bilis: ft colonia se mantiene intacta Antes del agregado de la sal biliar, marcar un circulo alrededor de la cole con tinta china sobre el fondo de la cipsula de Petri para ayudar a localizarla despues dela prucha b) IX. PRECAUCIONES Siempre deben usarse los tGrmines soluble © insoluble para la interpretacion de las pruebas de solubilidad en bilis, No usar positive (4) 0 negativo (—) para indicar los resultados. Una reaccion positiva no es stficientemente explicativa; puede significar que el organismo cs soluble en hilis o simplemente que muestra ereci- miento pero no tiene accién con las sales biliares. La prueba de solubilidad en bilis se utiliza tinicamente para diferenciar entre las especies de a-Streptococcusy 8. pneumoniae. Sin embargo, cuando hay duda en cuanto al modelo hemolitico que presenta wn posible especie de Streptococcus, efectuar la prueba de solubilidad en bilis, A menudo ¢s dificil diferenciar lay especies de a-Stieptororcus vy S. pretinoniae por su morfologia con kr coloracin de Gram 0, por la miorfologia de su colonia y. por lo tanto, reguieren pruebas adicionales para su dilerenciacién (pruebas de solubilidad en bilis y/o de sensibilidacl a la optoqui- na). Sin embargo, el S. pneumaniae y todas las especies de Streptococcus son catalasa negativos. y esta determinacion se hava antes de realizar la prueba de solubilidad en bilis. La Tiss por el taurocolato de sodio comercial resulta, a menudo, variable: la sal biliar de mayor actividad litica es el desoxicolato de sodie." reaccidn insoluble en bilis puede ser mada con el agregado de una gota de dileali diluido (NaOH 0,1 N)21 Wilson \ Miles °t afirman que existen dudas en cuanto a que la solubilidad en un pH alealine dependa completamente de las sales biliares puesto que el aleali solo, agregado a una suspension de S. pnewno- nie, ocasiona la lisis de los cultivos mas recientes E) Si se emplea para la prucha de solubili- dad en bilis un caldo de cultivo amorti- guado, evitar un cultivo demasiado den- so: los fragmentos celulares podrian impartirle una cierta turbiedid que ocul- laria una reaccién soluble. F) Downie y col." sostienen que las variacio- nes en la reacci6n de solubilidad en bilis del S. pneumoniae puede atribuirse, a veces, a pérdida del factor de virulencia la cipsula, que puede provocar una alteracién en ki susceptibilidad del orga- nismo a la lisis por las sales biliares. Downie y col." afirman que la tempera- Tura tiene efecto sobre la propiedad. autolitica natural del S. pnenmaniae ¥ la lisis efectuada por las’ sales iliares Goebel y Avery aseguran que la lisis se produce lentamente a 0% C, pero que ki velocidad aumenta a mavor temperatura La velocidad de Ia lisis aumenta has que ka temperatura Hega a 37° Cv luego disminuye a medida que la temperatura se eleva hasta 45°.” Wilson v Miles *! sostienen que la concen- tracién de sales de las suspensiones bacterianas afecta la solubilidad en bi- lis del S. pnewnoniae: el agregado de sulfato de magnesio favorece la lisis: por las sales biliares. Segin Falk y Yang." la concentracion de los cloruros: monova= lentes es importante: ka lisis es inhibida cuando se encuentran en alta concentra- o H) Solubilidad en la bilis 25 cién (2. a4 %). Sin embargo, Anderson y Hart" hallaron que existia una relacién reciproca entre la concentracion de las sales biliares requerida para la isis.» la concentracion del cloruro de sodio pre sente en. la suspension bacteriana, EL cloruro de sodio no daba muestras de inhibir la lisis, yal mismo tiempo. en ausencia de sal Se procucia la lisis.. No obstante, a medida que aumentaba la concentracion de sal) (hasta el van disminuia la concentracién de ka sal biliar necesaria para producir la lisis.! 1) Cuando se realiza la prueba de solubili- dad en bilis utilizando un caldo de cultivo metabolizante activo o solucién fisiold- gica. es esencial adaptar el pH aun punto neutro (7) antes det agregado cle kas sales biliares.* © EL desoxicolate de sodio, si se encuentra en una suspensidn dicicla, puede formar un precipitade o gel que dé por resultado una false reaccidn insoluble: *?" con un pH ce aproxina- damente 6.3. se forma un precipitado Acido. J) Si la solucién no se ackara al término de 3h de incubacién, el organismo es insoluble en bilis. Las especies de Haemophilus-e-hemoliticas tambien son solubles en bilis v Branson! recomienda que se ineuben los ttbos por lo menos 2h si en ellos se encuentran Harmophilis. K) BIBLIOGRAFIA Anderson, A. B., and Hart, PD. A (1934b) The lysis of pneumocacei by so- dium deoxycholate. 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Tox pley and Wilson's Principles of Bacteriol- ‘ogy and Immunity, Vol. I, th ed., Bal more: The Williams & Wilkins Com- pany, 1964, pp. 727-728, Pruebas de fermentacién de los hidratos de carbono I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono especifico incorporado a un medio basico, produciendo icido, 0 acido con gas visible. Il. OBJETIVO (Véase también Ia Seccién III, caps. 32 a 34) A) Las formas de fermentacién son general mente caracteristicas para grupos 0 espe- cies bacterianas especificas. 1. Que fermentan la glucosa: todos los miembros de las Enterobacteriaceae. 2. Que fermentan la glucosa y la lactosa Escherichia coli, Klebsiella’ y grupos Enterobacter. B) lar a la diferenciacién entre los géneros: Listeria monocytogenes (salicina A) de especies de Corynebacterium (saliei- na ~). ©) La forma de utilizacion de los hidratos de carbono puede ayudar a la diferenciacion de las especies 1. Aeromonas punctata (vafinosa A) de otras especies de Aeromonas (rafi- nosa —). 2. Neisseria lactamica (lactosa A) de-ouras especies dle Neisseria (lactosa ~) Proteus rettgeri (inositol A) del Proteus morganii (inositol —). 4. Providencia alcaligenes (adonitol A. inositol —) de ka Providencia stuartié {adonitol —, inositol A) Staphylococcus aureus (manitol A) del Stapntocacus chierids (anit =) 6. Streptococcus. salivarius w Streptococcus sanguis (inulina A) de las especies de Streptococcus del grupo D (inulina = 7. Yersinia enterocolitica (sacarosa A) de ouras especies de Yersinia (saearosa —) Ill, BASES BIOQUIMICAS Los hidratos de carbono se clasifican como: 1) monosaciiridos, aldehidos polihidroxilicos © cetonas: 2) polisacitridos w oligosaciiidos, productos de condensacion de-dos 0 mis monosacaridos (polimeros de los monosici- ridos), 0 3) alcoholes polihidricos v eiclitoles {inositoles), productos de la reduecisn cle los monosacaridos.® Un monosacarido © anicar simple esti compuesto generalmente por I a 6 carbonos: eritrosa, un azticar con 4 carbonos (tetrosst: C,HxO,): ribos bulosa, xilosa va INOS, aaiicares con 5 carbonos (pentosa: CH Os). glucosa (dextrosa), fructosa (levulosa), galac~ tosa. vo manosa, azticares con 6 carbonos (hexosa: Cab yOn).™ Entre las pentosas, ta xilosa, fa ribosa y ka arabinosa son aldosay mientras que kt ribulosa es una cetosa.!® Los compuestos hexosas, glucosa, galaetosay manosa, son aldosas vo la fructosa es una cetosa." Los disaciridos (CHO) son polisacsi- ridos. (oligosacaridos) compuestos por dos. 28 Pruebas bioquimicas para la idemtificacién de bacterias unidades de monosaciridos, glucosa, mas otro monosacarido. Sai sar glucosa + fructos Maltosa + 2 unicadles de glucosa Lactosa + glucosa + galactosa Glucésido es un término general que designa a un disacarido, sin tener en cuenta el anticar que contenga.”” EI trisactrido rafinosa (CHO) esta compuesto por tres monosaciridos: glucosa, fructosa y galactosa, Un ejemplo de polisacirido es la inulina que esti formada por muchos polimeros del monosacarido fructosa. Los alcoholes que colectivamente reciben el nombre de “azticares”* ® son el adonitol, dulcitol, manitol y sorbitol; todos son alco- holes polihidricos que son’ productos de la reduccién de un monosacirido.® Chucosa reduecion sorbitol (alcohol hexahidrox’) El compuesto inositol es un sustrato orga- nico que no es un hidrato de carbono.* Los polisacaridos, trisacaridos y disaciridos son demasiado complejos para entrar en una célula bacteriana para su degradacion. Si uueden ser metabolizados por una especie acteriana determinada, primero son catabo- lizados en monosacaridos menos complejos por enzimas exocelulares (permeasas) de manera que puedan penetrar en la célula La fermentacion es un proceso metabdlico de oxidacin-reduccién anaerébico en el cual un sustrato orginico sirve como el aceptor de hidrégeno final (aceptor de electrones) en lugar del oxigeno2” La fermentacion de sustratos orginicos como los carbohidratos dan tanto productos finales reducidos como oxidados? El tipo de productos finales producides por la fermentaci6n de los hidratos de carbono depende de varios factores: 1) el tipo de organismo que lleva a cabo el proceso de fermentacién; 2) la naturaleza del sustrato que debe ser fermentado, y 3) a veces, los factores ambientales como la temperatura y la acidez.2" Los productos finales de la fermen- tacion de los hidratos de carbono y los alcoholes, denominados colectivamente “azti- cares”,** #1 son pocos: dos gases, hidrégeno y anhidrido carbénico; algunos pocos sicidos algunos alcoholes, y una cetona."* ‘Algunas bacterias pueden fermentar anae- robicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras, atin, son inca paces de utilizar la glucosa. No todos los monosacaridos son degradados por todas las especies bacterianas; sus formas de fermen- tacion difieren, ayudando a la identificacion del grupo, género 0 especie. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para la fermentacion del_mismo: sustrato,"” dando como resultado diferentes productos finales. La forma y el grado en que €s desasimilado un sustrato depende de la especie bacteriana y de las condiciones de cultivo, El ciclo de fermentacién que produce como roducto final el acido lactico es el proceso de jermentacién mas difundido. Sin embargo, se producen otros ciclos de fermentacion, que difieren con respecto al sustrato metaboli- zado o la naturaleza del producto final producicdo.” Gon la utilizaci6n de las pruebas con los hidratos de carbono podemos obtener mode- Jos de fermentacion de uma determinada especie bacteriana observando: 1) la ausencia’ de glucésidos, y/o 2) la ausencia de mone- sacaridos en disacaridos, trisacirides y polisa- Jridos mas complejos,” que muestran que tx glucosa ha sido metabolizada Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por lo general anaerobios facultativos.® Por medio del proceso de fermentacién, un hidrato de carbono es degradado (0 fermentado) y descompuesto en dos moléculas de carbono triosas ™ que son nuevamente degradadas en un ntimero de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos* Los productos finales varian con cada especie acteriana, y depende del sistema enzimatica existente en la especie y las condiciones det medio ambiente. Sin embargo, el criterio importante es que antes de la descomposicion del aziicar glucosa, ésta es fosforilada en un compuesto glucosa 6-fosfato® La fermen- tacion requiere un compuesto organico como aceptor de electrones terminal. EI mas importante ciclo fermentativo de la degradacién de la glucosa es el ciclo de Embden-Meyerhof, aun cuando también ella puede producirse por la derivacién pentosae el ciclo de Enmer-Doudoroff 0 en combina- cin con ellos. No obstante, los tres cicles requieren la fosforilacién de la glucosa como’ paso inicial antes de que pueda producirse bx degradacién, El acido pirtivico (CHs;CO.GOOH) es ef intermediario clave en la degradacion de bi glucosa, y la desasimilacion del acido pirtvico pee por se diferentes que forman una variedad de productos termi Jivido 6-fosfogucdnice Derivacion pentosa nah ribulos . CO: icido pinion nol 0; Fermentacién de los hidratos de carbono 29 ha glucers. ————__+ glucosa G:tosfia lo de Embden-Meyerhof 1 Fructos Gefostato fructoss LGedilostiae i 2 moles glieeraldlehide S-lostite, 2 moles divide pinivieo Ciclo de Entner-Doudoroff fiido 8 cota t-desoxi-6-fosfingluconico, gliceraldehide 3-fostiato a través del Ciclo de /Embden-Meyerhof 2 moles de sicido pirtivico Tres cielos de Jermentacién fasforitada nales caracteristicos de las fermentaciones bacterianas.* Como consecuencia de ki oxida- cidn los monosaciridos son catabolizacos en fcido pintivico a waves de una de procesos graduales, en cid uno de los cules Interviencn ensimas especificas, Una bueter puede utilizar diferentes cielos para format ‘icido pintivico. y ch el mismo organismo puede ocurrir simuliincamente mais de un cielo” serie Los productos finales caracteristicos de la fermentacion baeteriana son: 7 Ly steicto lictivo: 2) aicidos acético v formico: 3) deido lictico v alcohol etilico (etal; 4) alcohol ctilico (etanol): 5) acetilmetilearbinel (ace- toina)_y COs: 6) acide suceinico a acide propidnico v COz: 7) COs ¥ acetona a alcohol tsopropilice (isopropanol): 8) acido butirieo a alcohol butilico (butanol). (Véase grafico en vigina siguiente.) Existen distintas clases de fermentacion producida por las bacterias, y cada una depende de los productos finales caracteris- ticos formados. Segtin la mavoria de los autores. Jos grupos mis importantes. de bacterias muestran uno de los cinco tipos principales de formas de fermentacién Fermentacién alcohélica Chicos + 2 eranal + CO, En la lamada fermentacién alcohdli las bacterias alcohdli s degradan a la glu: cosa en Acido pinivico siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhol? Fermentacién del acido lact 0 Las bacterias que producen dicido lictico pueden ser divididas a su vez en dos subgrupos: fermentacoras homolicticas. y heterokicticas Tas hacterias homolicticas © simplemente licticas "degrada la glucosa por medio del ciclo de Embden-Meverhol, casi exciusiva- mente en el producto final, dicido le tic 1% con vestigios tinicamente de otros productos finales," Las fermentacoras heterokicticas, a las que a veces se denomina fermentadoras del dcido lictico mixtas© "pueden. catabolizar la glucosa por medio de uno a tres cielos de degradaciom (Embden-Meyerhof, derivacién pentosa, © proceso de. Entner-Doudoroff) * para dar productos finales caracteristicos: acido lictico mis dcido acético y acidos formicos, alcohol etilico, COs, "7 y a veces. glicerol." Una sola especie bacteriana puede mostrar fermentacién acida tanto homolactica como heterolactica. El factor de control es influido por el pH y el sustrato presente para la actividad bacteriana.? Fermentacién del acido prop nico El principal producto final del dcido pirtivico es el sicido propisnico (propionato) y 30 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Hidrato (isacirido, trisa de carbono \cirido, polisacarido) 4 CoH 20s Glucosa 4 CH,COCOOH éinterm clave} ‘Acido piriivico HOOCCH,CH,COOH ‘Acido succinico 1 CH,CH,COOH + CO, ‘Acido propisnico CH;COCHOHCH, + CO, -— ‘Acetilmetilcarbinol m CH,CHOHCHOHCH, 2,3-butilenglicol CH,CHOHCOOH Acido lactico CH,COOH + HCOOH Acido acético Acido formico ii H; + CO, CH;CHO + CO; —— “‘Atetaldehido cx,ch.on Alcohol etilico Acetileoenzima A a CH, C— CH,COOR Acido acético CH:COCH,COOH ‘Acido acetoacetion CH.COCH, | | | CH,CH.CH,COOH CO, + ier Acido butirico | CH,CHOHCH; CH,CHOHCH,COOH — CH,CH.CH.CH.OH Alcohol isopropilico Acido g-hidroxibutirico Alcohol butilico CO, a través del dcido succinico, aun cuando puede producirse acido acético.' 17 $ (> aceraldehido — acide acético Acido pirtivico L__. scio succinico — acido propis- ico + CO, La fermentacién propiénica es llevada a cabo por los organismos anaerdbicos.” Fermentaciones del grupo coliforme A_ menudo se hace referen coliforme como fermentadores tos," *” fermentadores del 4cido férmico,"* 0 bacterias_ colon-disenteria-tifoidea (grupo CDT). "La fermentacién acida mixta es, caracteristica de los miembros de las Entero- bacteriaceae y estos organismos degradan la glucosa con la formacion de una variedad de productos finales. El grupo coliforme puede ser subdividido en dos categorias: 1) las que producen diversos productos acidos mixtos, y 2) las que producen butilenglicol como prindpal pro- ducto final. El tipo o las combinaciones y cantidades* del producto final producido dependen del género o Ia especie en es- tudio."” Los microorganismos acidos mixtos pro- ducen los siguientes productos: dcidos {6r- mico, acético, lictico y succinico; etanol, y COs y Hei pero no butilenglicol, (butane- diol). % #°EL alcohol es formado por la fermentacién alcohdlica; el acido lictico, el 4cido acético y el CO; son formados por la fermentacién lactica a uavés de la dism: tacién del acido pirtvico.* En la dismutacién es reducida una molécula de acido pirtivico, dando Acido lactico, y la otra molécula es oxidada formando dcido acético y CO, Entre las Enterobacteriaceae, la E. coli mues- tra este tipo de fermentacién® 2 moléculas de acide pinivico = acide avético + “+ acido lictico + CO, EI segundo grupo est4 formado por los ismos cuyo principal producto final es el butilenglicol."""™ Entre las Enterobacte- riaceae, los gruposKlebsiella-Enterobacter mues- tran este tipo de fermentacién. Fermentacién del alcohol butilico La fermentacién del alcohol butilico es efectuada por bacterias anaerébicas como el Clostridium.’ Los diferentes productos finales formados son acido acético, acido formico, etanol, acido butirico, alcohol buti- hico, acetona, alcohol isopropilico, y una gran cantidad de COge Hz." La combinacién y cantidades de los productos finales for- mados dependen del género y la especie Bacterianos.”” Algunos organismos producen rimariamente acide butirico y acético, CO, y 2, mientras que otros producen butilen- glicol, acetona, y alcoholes butilico ¢ isopro- pilico."* Sin embargo, no hay formacién de Acido lactico. IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Caldo bisico rojo de fenol, pH: 7,45 # 1. Ingredientes. a) Peptona (proteosa 0 digesto pancreitico de caseina) Wg b) Extracto de carne (opcional) log ©) Cloruro de sodio (CINa) 5 og d) Rojo de fenol 0,018 g ©) Agua destilada 1.000 ml 2. Indicador del pH, rojo de_fenol. a) Acido: color amarillo, pH:6.8. b) Alcalino: color rojo rosado, pH:8.4. ©) Medio no inoculado: 1) pH1:7,4; 2) color anaranjado rojizo. Productos comercial a) Difco. b) BBL. 4. Método de preparacién, caldo basico rojo de fenol, a) Pesar exactamente las cantidades como se indica en el prospecto. Los productos de diferentes labo- Fermentacién de fos hidratos de carbono 31 ratorios pueden variarligera- mente. b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. ©) Calentar suavemente hasta diso- lucion. 5. Método de esteril rojo de fenol. a) Autoclave. b) 121°C, 15 libras, 15 min. 6. Enfriar a 45-50° C en baiio de agua, 7. Método de preparacidn, hidratos de carbono. a) Pueden utilizarse diversos hidratos de carbono. La baterfa usada de- pende de las dificultades que se presenten para identificar un or: ganismo determinado. b) Por lo general, utilizar de 8 a 10 auticares. Los que se emplean con mis frecuencia son: 1) glucose actosa; 3) sacarosa; 4) manitol; 5) dulcitol; 6) salicina; 7) adonitol: 8) inositol; 9) sorbitol; 10) arabino- sa; 11) rafinosa; 12) ramnosa; 13) xilosa; 14) trehalosa; 15) celobiosa; 16) galactosa; 17) inulina; 18) fructosa (azticar invertido); 19) melibiosa. c) Concentracién de azticares en el caldo basico. 1. Agregar a alicuotas de la base preparada, los hidratos de car- bono que se desee. a) Salicina, 0,5 % b) Todos los demas, 1 % 2. Preparacién de las concentra- ciones de azticar, dos métodos, a) Agregar directamente el aziicar ala base en la concen- tracién deseada, por ejemplo 10 g de aziicarflitro de base para una concentracién final del 1 %. b) Preparacién de soluciones de azticar. Preparar una concentracién del 5 0 10 % del aziicar desea- do en agua destilada. Solucién al 5 %: 5 g/100 ml. Solucién al 10 %: 10 g/100 nil. Agregar la solucion de azi car a la base para obtener una concentraci6n final deseada de 0501 %2 0,5 %/litro: Colocar_100-ml—__ de una solucion al5 %enun § frasco volumétrico de un ion, caldo basico 32 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias litro y agregar caldo basico ar su posible descomposicion. rojo de fenol c.s.p. 1.000 ml 9. Enfriar antes de su empleo y refrig Mezclar bien. ur para. su conservacion (4-108 C) 1 %/litro: Colocar 100 ml 10. Inoculacién. de una solucién al 10% en a) Crecimiento de un cultive pura de Métodos de est co de hidratos de carbone. a) Filtracion (recomendada como el un frasco volumétrico de un litro y agregar caldo_basico rojo de fenol cs.p. 1.000 ml Mezclar bien. rilizacion, medio baisi- método de cleccién). 1. Método del filtro de membrana (Millipore). 2. Membranas, poros de 45 ps de dliimetro. Asépricamente, tubo de aproxi- madamente 4 a 5 ml/tubo es- tivil. 4. Unicamente al uabo de glucosa, introducir un tubo de Durham estén. a) Posicién invertida. b) Detects la produccién de gas Autockive, dos métodos alterna- tivos 1, Método de preparacién. a) Agregar a alicuotas de la base de rojo de fenol prepara- da no esterilizada, los hidratos de carbono individuales cle- gidos. b) Tubo de hidrato de carbo- no (medio basico) no esteriliza- do, 45 mlftubo. ©) Unicamente a los tubos de Blucosa, agregar tubos de Dur- ram invertidos. 2, Método 1: 116-118° libras, 15 min.* a) Algunos hidratos de carbo- no soportan la autoclave sin descomponerse 0 con pocas alteraciones. b) No se aconseja someter a autoclave durante 15 min. a los siguientes hidratos de car- bono? ? 1) lactosa; 2) sacarosa; 8) salicina; 4) xilosa; 5) arabi- nosa; 6) trehalosa; 7) maltosa. 3. Método 2: 121°C, 15 libras, 3 min. a) Utilizado cuando el ele~ mento tiempoes fundamental b) Debenefectuarscloscontro- les antes de su utilizaci6n con. fines diagndsticos para contro- » 1a 12 18 a 24h (AHK 0 cualquier otro cultivo conveniente). b) Inéculo expeso 1. Puede inocularse una bateria de hidratos de carbono con un solo inéculo. 2. Métodos de inoculacién. a) Con hisopo, Pasar el hisopo sobre el cre- cimiento de un cultivoen AHK u otro conveniente. El hisopo se habra humedecido previa- mente con solucién fisiologica 0 caldo estéril si el cultivo se ha efectuadoen un medio solido. Asépticamente, pasar el hiso- po contra un costado de cada uno de los tubos con hidratos de carbono, por encima del nivel del liquide. Inclinar el tubo para que se incorpore el inéculo. Sacudir suauiemente cada tu- bo. No dear que el liquido salpique la tapadel tubo (cierre de metal. b) Con aguja o asa de inocu- lacién, Pasar la aguja 0 el asa sobre el crecimiento de un cultivo AHK u otro conveniente. Si se trata de un caldo de cultivo, utilizar un asa de inoculaci6n. Asépticamente, introducir la aguja o el asa en cada uno de los tubos de hidrato de car- bono. Agitar suavemente cada tubo. Nodejarqueel liquidosalpique la tapa del tubo (cierre de metal). ©) General, cualquier método de inoculacién. Por lo comin es suficiente un solo inéculo para inocular una bateria de 8 a 10 hidratos de carbono. ‘Cuando se inocula una bate- ria, no hay necesidad de pasar la llama entre cada inocu- acion. ‘Cuando se utiliza una aguja asa para inocular una bateria con un solo inéculo, el traspaso de aziicares de un tubo a otro es tan infimo que no hay problema de que un tubo contenga una mezcla de carbo- hidratos. Cuando se inocula una bate- ria no es necesario observar en forma apreciable el inéculo en cada uno de los tubos. Un solo indculo espeso tomado de un cultivo contiene millones de bacterias que son suficien- tes parainocular cadatubocon un nuimero apreciable de bac- terias necesarias para que se produzca el metabolismo. Sin embargo, cuando se prueba una gran bateria de hidratos de carbono, por ejemplo, 15 a 20 aziicares, puede ser necesario emplear 2 a 3 indculos separados. En este caso, se pasara siempre por Ia lama la aguja o el asa antes de volver a introducirla en el cultivo. Si se utiliza un hisopo, se emplearé uno nuevo para cada recoleccién del cultivo. Estas precaucio- hes evitan toda posibilidad de contaminacién del cultivo, que podria necesitarse para otras pruebas 0 para subcultivos. a) Incubadora a 35° C. b) 18a 24h. Puede ser necesaria una incu- bacién prolongada. Puede ser necesaria una incu- bacién de hasta 30 dias para considerar negativo un resul- tado. B) Indicador del pH alternativo: indicador de Andrade modificado, pH:7,1 a 7,2." Utilizar en lugar del rojo de fenol en el medio de caldo con rojo de fenol. Se recomienda cuando se somete a los hidratos de carbono a una incubacién rolongada. ucion al 1 % a) Ingredientes 1. Fucsina acida .... 05g 2 Aguadestilada ... 100° ml 3. Hidréxido de sodio (NaOH) EN ..... 15-18 ml a) Hidréxido de sodio (10 N 040%), Hidroxido de sodio, libre de carbonato, R.G., 40 g. Fermentacién de los hidratos de carbono 33 b) Método de prepara eo. Agua destilada, 100 ml. Método de preparacion. Pe- sar ripidamente el hidroxido de so disolver en menos de 100 ml de agua destilada en una probeta. Este reactivo es muy higroscépico. Colocar la probeta en un bario de agua frfa circulante para controlar la temperatura. Enfriar_y trasferir la solu- cién de NaOH a un frasco volumétrico de 100 ml y agre- er destilada csp. 100 mi, Guardar en un frasco para reactivos de vidrio recubierto de polietileno o parafin: Rotular correctamente. EI hidréxido de sodio es sumamente catistico y por eso hay que evitar el contact con la piel para impedir quema duras dolorosas. b) Hidréxido de sodio (1 N 04% Hidréxido de sodio, 10 N, 10 ml. Agua destilada hasta un total de 100 ml. Método de preparacion, Ut- lizando una pipeta (tipo Pro o de bulbo), trasferir 10 ml de NaOH 10'N a un frasco volu- métrico de 100 ml y agregar agua destilada c.s.p. 100 ml, ‘i6n* ida en agua Disolver fucsina destilada. Agregar 15 ml de NaQH 1N 4%. Mezclar y dejar descansar a ta temperatura del ambiente (25°C) durante 24 h, agitando frecuentemente. El color rojo deberé wasformarse en un color castano. a) Si no se produce una deco- loracién suticiente, agregar 1 ml de NaOH (4 %). b) Mezclar y dejar otras 24 h. ©) Puede ser necesario el agre- gado de més alcali hasta obte- ner el color amarillo pajizo requerido. Evitar la adicion excesiva de NaOH. Agregar gota a gota hasta alcanzar el Color deseado. 4. Método de empleo 34 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias a) Preparar 1 litro de medio basico de caldo de hidrato de carbone, pero omitir cl indicador de pH rojo de fenol. b) Agregar al anterior 10 ml de indi eador de pH de Andrade (en concentracién del 1%)" ©) Ajustar el pHa 7.1 a 7.2 con NaOH 1 NA d) Agregar el hidrato de carbone elegido (véase la Seccién 1V.A.7,¢ hasta A.9) ©) Continuar de la misma manera que si se utiliza un medio con rojo durante 20 min.* 1) El medio de carbohidrato de An- drade es rosado cuando esti ca- liente, pero con el enfriamiento desaparece el color.® Reacciones de color de Andrade. a) Las mismas del indicador del pH. rojo neutro, b) Acida: rojo rosado, pH:5.* ©) Alcalina: amarillo a incolore* ©) Medio bisico semisélide con rojo de fenol, pH:7.5. 1, Ingredientes. a) Medio de caldo de hidrato de carbono con rojo de fenol. b) Agregar 0.4 % de agar.? El conte- nido de agar puede aumentar hasta el 0,6 % 1. Colocar el frasco de la mezcla agar-base-hidrato de carbono en un agitador magnético que contenga un elemento caldrico, 2. Mantener la temperatura en punto bajo. Agregar un magneto al frasco y mantener el medio en cons- tante movimiento mientras se distribuye en tubos (4 a 5 ml/ tubo). 2. El medio basico semisélido con hidra- tos de carbono elimina el empleo de los tubos de Durham para la deteccién de gases. 3. Manipular de la misma manera que si se utilizara un caldo, con las siguientes excepciones a) Enfriar en posicién vertical antes de su uso. b) Inoculacié 1. Cuicamente con aguja de inocu- lacién, 2. Hacer la picadura hasta 0.6.cm del fondo de cada tubo. Evitar las picaduras cerea de las pare- des del tubo. 4. Para los estudios de fermentacion de especies de Neisseria, agregar asépti- camente liquide ascitic estéril para favorecer el crecimiento Utilizando un indicador del pH con un determinado hidrato de carbone puede de- terminarse si_una bacteria ha degradado el mismo en varios productos terminales, obser- vando un cambio de color visible en el medio Indieador de ph + CHO bit lucilis + H.CO,, aldehidos + cambio de color Pueden emplearse las pruebas de fermen- tacion de los hidratos. de carbone” para determinar qué productos terminales se han formado, pero no los cidos utilizados."! También el medio incorporado contiene otros componentes de crecimiento que pue- den ser degradados, para dar diversos pro- ductos terminales similares a los producidos por la descomposicién del hidrato de carbo- no, y al mismo tiempo el organismo estd utilizando parte del carbono formado por la degradacion del carbohidrato para producir nuevas células."* El indicador del pH que se utiliza mas comtinmente para demostrar que un hidrato de carbono ha sido fermentado es el rojo de fenol, ya que la mayoria de los productos nales del metabolismo de los carbohidratos son acidos organicos. Con el rojo de fenol el cambio de color se aproxima al pH original del medio (cido pH:6,8, medio pH.:7,4). La peptona que se encuentra en el medio también es degradada por la bacteria presen- te y da sustancias que son de pH alcalino. El ido producido por la fermentacién de un hidrato de carbono se observa por un cambio del pH solamente cuando el acido producido por la degradacién del carbohidrato es mayor jue las sustancias alcalinas producidas por ilcgradaciGebies Secor Larbiearean de un cambio de color que indica acidez esta influida por dos factores: 1) el indicador del pH utilizado, y 2) las propiedades amorti- guadoras del medio.* V. RESULTADOS Los fotografias en colores de los resultados pueden verse en las Figuras 4-1 y 4-2 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol. 1.” Positivo. a) Acido (A), pH:6,8. b) Color amarillo, ©) Produccién de gas, variable. 1. Positivo para gas (G). a) Aerogénico: se encuentra CO; + Hi. b) Se observan burbujas de gas en el tubo de Durham, 0 el medio se halla completa- mente desplazado por el gas que deja una parte sin colorear en el tubo incluido. ©) Una sola burbuja en el tubo de Durham basta para regis- trar produccién de gas 4d) Registrar produccién de sci- do y gas (AG). 2. Negativa para gas. a) Anaerogénica. b) No se observan burbujas de gas y el medio del tubo de Durham se mantiene amarillo. ©) Registrar produccién de aci- do solamente (A), 2. Retardada. a) Color anaranjado. Si no se tiene seguridad, comparar con el tubo no inoculado. b) Volver a incubar. 3 Negativa. a) Alcalina. b) Color rosa-rojizo. B) Medios semisdlidos de hidratos de carbo- no con rojo de fenol Positiva. 2) Acida (A), pH:6,8. b) Color amarillo. ©) Produccién de gas, variable. 1. Positiva para gas (G). a) Aerogénica: se encuentra CO; + Hy. b) Deteccién de gas (por una variedad de medios segin la cantidad de gas producido). Burbujas de gas en todo el medio. Fermentacién de los hidratos de carbono 35 Una ligera muesca en el me- dio separada de la pared del tubo. El gas puede elevar el medio desde el fondo del tube dejando un espacio en blanco, Sise pro- duce una gran cantidad de gas, cl medio puede llegar hasta la tapa del tubo. Desdoblamiento del medio. Una sola burbuja en el medio basta para registrar produc- cién de gas. Registrar como_produccién de Acido y gas (AG). 2. Negativa para gas. a) Anaerogénica. b) No hay burbujas de gas ni descomposicién del medio. ©) Se registra produccién de acido tinicamente (A). 2. Retardada. a) Color anaranjado. Si no hay segu- tidad, comparar con un tubo no inoculado. b) Volver a incubar. 3. Negativa. a) Alcalina. b) Color rosa rojizo, pH:8,4. G. Medio de caleo con hidratos de carbono con indicador del pH de Andrade. 1. Positiva.* a) Acido (A), pH:50. b) Rojo rosado. ©) Produccién de gas, variable. Véan- se las reacciones con el medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol. 2. Negativa® a) Alcalina. b) Amarillo a incoloro, VII. PRECAUCIONES A) Colectivamente los hidratos de carbono se denominan “azicares”. Sin embargo, muchos son en realidad alcoholes polih- dricos.* Cuando es un azticar propiamen- te dicho la terminacién es “osa” mientras que los'alcoholes terminan con “ol”. Por lo tanto, son ejemplos de azticares: lactosa, sacarosa, maltosa; mientras que dulcitol y manitel son alcoholes. Existen algunas excepciones, como en el caso del azticar salicina (glucésido) B) La concentracién de los hidratos de carbono incorporados en el caldo basico con rojo de fenol es comiinmente 1%; 86 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias oO b) E) F) G con excepeién de la salicina (0.5). Se pueden usar concentraciones: de 0.5." con fudos los hidratos de carbone, pero se recomienda cl L@ porque esta concen- tvacion reduce la posibilidad de rever- sion Orr y Vaylor ® han Hlegado a la coneh- sién de que algunos tipos de peptona son inconvenientes para ki preparacién del medio con hidratos de carbon. En sus estudios, hallaron que la Shigella flexneri tipo 6, Newcastle y los bietipos Manche; ter. no producian icicle ni gas en ciertos lotes de peptona.”* El componente basico es la peptona de br caseina que debe estar exemta de hidratos de carbon que podrian ser fermentados.* Si no se dispo- ne de un medio comercial deshidratade se harin controles con los lotes de pepto- na para determinar si son convenientes cuando se prepara inicialmente un medio con hidratos de carbon, Cook y Knox 7 recomiendan que el medio con hidratos de carbono esté exento de nitratos. porque su presencia interfere cn la produccion de gases. Hermann" recomienda evitar el agr gado de extracto de levadura, suero 0 Tiquido ascitico al medio con carbohidre- tos. Sin embargo, se ha recomendado la adicién de liquido ascitico. para demos- tar la capacidad de fermentacion de especies de Neiseria? EL agregado de extracto de levadura es optative: Difeo lo incorpora mientras que BBL no lo hace. y, sin embargo, ambos medios dan resultados idénticos. Cuando se utiliza el medio semisslide con hidratos de carbono, picar el medio con una aguja de inoculacion en el centro del tubo, hasta unos 0.6 cm del fondo, Hacer la picadura con suavidad ¥ no utilizar ef asa de inoculacion, Las maniobras brus- caso el empleo de este tiltimo elemento puede dar una false apariencia de pro: duccién de gases que se debe desintegracio’ mecinica del medio. Cuando se utiliza un medio de caldo con hidratos de carbono, se coloca por lo general un tubo de Durham en posicién invertida, en el tubo de glucosa tinieamente Si-un organismo es Capaz de producir gas en la glucosa, entonces también se producira gas en los otros hidratos de carbono utilizados. No obstante, si es sabido que el organismo en estudio no fermentala glucosa, esaconsejable agregar tubos de Durham a algunos otros de los hidratos de carbono puestos a prueba en la H) bateria. ‘Todos los miembros de las Entero- bacteriaceae son fermentadores dela glucosa por definicion y, por lo tanto, solo ser necesariocomprobar la produceion de gases en la glucosa por medio de un tubo, de Durham, Con frecuencia el microbidlogo, sobre todo cuando estudia un miembro de las Enterobacteriaceae. no observa produc cin de gases en un medio AHK 0 AHA, Pero esto no siempre significa que cl organisme no produzca gas. Cuando se emplean hidratos de carbono. siempre hay que hacer la prueba de pro- duccién de gas, Cualquier signo, au una pequeiia burbuja de gas aislada, ex prueba de produccién gaseosa. A menudo es tan grande cl volumen de gas que llega a reemplazar completamente el medio del tubo de Durham, dando de estar vacio, Antes de poner en autoclave los hidra- tos de cathono, colocar un ube de Durham en el tubo de glucosa yo en otros, en posicién invertida, pero no imten- tar que el medio se intwoduzca: por lo, general el tubo flotara en la superticie del medio, Con todo, durante el proceso, de autoclave, el mectio se introducira por fuerza en el tubo de Durham invertido. Si éste no estuviera invertido, nie seria posible determinar la produceién de gas. Si se utiliza un medio semisélide con hidratos de carbon no es necesaria la introduceién del tubo de Durham, va que la produccién de gas estara indicada por el resquebrajamiento del medio, la pr sencia de burbujas, 0 la separacién del medio de los costados © el fondo del tubo. Si se produce un gran volumen de gas, como en el caso de los grupos Klebsiella Enterobacter, el medio podra ser despl: zado basta la tapa (cierre) del tubo. Si esto ocurre. manipular el cultivo con cuidado cuando se hace un subeultivo para evitar la autocontaminacidn o la contaminacion del cultivo. E] medio con hidratos de carbono, cuan- do esta caliente o al ser retirado de la auto- claye, tiene un color anaranjado claro, que cambia a rojo anaranjado cuando se entria, Después de sometido a la autoclave, el medio semis6lido con hidratos de carbo- no debe ser enfriado en posicion vertical. Hay que ser muy cauto en la interpreta cién de las pruebas con hidratos de bono, ya que el color que indica la fermentacién varia segtin el indicador del PH utilizado en el medio (cuadro 4.1). Cuadro 4.1 Aida Alealing Indicaddor del pH (Rermentaciiny (Negativa) Rojo de fenol Andrede Amarillo Rojo rosado Rojo rosaclo Amarillo {incoloro) K) La incorpora L) M nde algunos hidratos de carbono en el medio basico puede dar una condicién dcida, Si asi ocurre, agre- gar NaOH 0,1.N gota a gota hasta obtener el color rojo anaranjado desea- do.’ Evitar el agregado excesivo de NaOH con lo que se obtendria un color rojo intenso.” $i se produce esta intensi cacién del color, el medio puede ser demasiado alcalino para que se produzca la fermentacién propiamente dicha en el periodo comtin de incubacién Cuando se efecttia la prueba de una gran bateria de hidratos de carbono, es decir, 15 a 20 anicares, sera necesario emplear 2a 3 indculos separados. En este caso, pasar siempre por la llama la aguja o el a de inoculacién antes de volver a intro- ducirla en el cultivo. Si se utiliza un hisopo, se empleara uno nuevo cada vez que se recoge cultivo. Estas precauciones evitan toda posibilidad de contaminacion del cultivo, que podria ser necesario para otras pruebas 0 para subcultivos. Todos los hidratos de carbono deben ser rotulados correcta ¢ inmediatumente des- pués de su preparacién. Todos tienen un aspecto semejante y habra que colo- carlos en una gradilla siguiendo un cierto. orden segtin el programa de trabajo del laboratorio. Por lo general, el microbidlogo no rotula cada hidrato de carbono, sino que sigue sistemdticumen- te un orden determinaclo. Sin embargo, si se tienen dudas en cuanto al orden 1, Andrade, E. (1906) Influence of glycerin in differentiating certain bacteria. J. Med. Res., 14, 551, 2. Bailey, R.'W., and Scott, E.G, Diagnos- fic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 5 V. Mosby Company, 1966, pp. 238 and 312, 8. BBL Manual of Products and Labortory Procedures, Sth ed., Cockeysville, Md: Division of BioQuest, Division of Bec 6: ton, Dickinson and Company, 1968, p. 131. N) )) Fermentacién de los hidratos de carbone 37 empleado, rotular cada tubo tal como se halla colocado en la gradilla y si al interpre tar los resultados hay dudas con respecto a la identidad de un azticar, repetir la prueba A menudo se registra la fermentacién de los hidratos de carbono como posit va (+) 0 negativa (—). Como registro de fermentacién se prefiere decir la acidez, indicindola con el simbolo A. A +/— significa generalmente reaccién. dada (color anaranjado) y debe incubarse de nuevo, Si también se observa gas visible, se registra la fermentacién con el simbolo AG para indicar acidez y produc- cion de gas. El medio con hidratos de carbono es lige- ramente alcalino (pH:7,4). Algunos car- bohidratos, cuando son sometidos al calor en un pH alcalino ? son degradados en aaticares mas simples. La glucosa, en presencia de fosfatos. es destruida gradualmente con la auto- clave." EI proceso de autoclave con una presion de 15 libras hidroliza la maltosa y la glucosa con la produccién de acider con la destruccion gradual de esta til tima."” McDade y Weaver ® recomiendan un medio de fosfato reducido (KH;PO, al 0.08 %) con indicador del pH rojo de fenol en una concentracién de 0,0072 % Jo que da un pH de 7,5 a 7.6. Aconsejan el empleo de estas concentraciones euan- do se realizan pruebas de los miembros de las Enterobacteriaceae, un medio mis rico cuando se estudian los Streptococcus y uno sin buffer y con un pH bajo (7. para las especies de Neisseria EI suero contiene una enzima capaz de hidrolizar la maltosa en glucosa.? Cuando para el enriquecimiento de un medio de maltosa se agrega suero, éste debera ser calentado antes de su adicién durante una hora a 60°C para inactivar la en- zima? ) BIBLIOGRAFIA 4: Blair, J. E., Lennette, E. H., and Truant, J, P. 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Bacillus (+) cel Clostridium (—), 3. Listeria monocytogenes (+) ylo Coryne bacterium (+) del Exysipelothrix (-) Excepciones: a) Connebacterium pyoge- nes (—); b) Corynebacterium haemolyt- cum (= B) Ayudar a la diferenciacién de especies: Moraxella bovis (¥) y Moraxella kingié (—) de otras especies de Moraxella (+). III. BASES BIOQUIMICAS La enzima catalasa se encuentra en la mayoria de las bacterias aerobias y anacrobias facultativas que contienen citocromo;*"" la excepcién principal es el Sireptecoccus. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen también de la enzima catalasa y por lo tanto no pueden descomponer el perdxido de hidrégeno.* La mayoria de las bacterias anaerobias (por ejemplo, especies de Clostridium) poseen ta enzima peroxidasa en lugar de la catalasa. Sin embargo, Doelle ? afirma que la prueba de la catalasa no es especifica y puede interferir en la accion de las enzimas peroxidasas. ‘Tanto las catalasas como las peroxidasas entran en la clasificaci6n enzimatica general de “hidroperoxidasas”.' La catalasa ¢s una hemoproteina; el grupo prostético esta for mado por cuatro atomos de hierto trivalente (Fe***-férrico) por molécula* que retiene su. estado oxidado durante la actividad enzimatica.? Burrows y Moulder* sostienen que hay pruebas de que algunas bacterias pueden poseer una catalasa que no contiene hierro. Los estudios efecttrados por Dacre y Sharpe * demuestran una actividad de la_catalasa fuerte y débil entre los lactobacilos. Whitten- bury ™ observé la presencia de dos tipos de catalasa entre las bacterias que producen dcido lictico: 1) la clisica catalasa que descompone el perdxiclo de hidrogeno y que no es sensible a las condiciones acidas, y 2) una seudocatalasa que carece del grupo prostético hem y es sensible a un pH acido, Whittembury ® sugiere que las bacterias que producen Acido lictico poseerian un sistema respiratorio rudimentario por el cual, si se les suministra, una fuente de ferroporfirinas, algunos organismos producirfan una hemo- proteina. Johnston y Delwich demostraron también la presencia de ambos tipos de catalasa entre los organismos Licticos. El perdxido de hidrogeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descompo- sicién aerdbica de los azicares. La flavopro- teina reducida reacciona directamente con el oxigeno gaseoso por medio de la reduccién 40. Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias de electrones, para formar perdxido de hidrdgeno,'"" y no por accibn directa entre el hidrégeno y el oxigeno molecular." FPH, + Op = FP + HO, Flavoproteina reducidat nt a Flavoproteina oxidada Fl perdxido de hidrogeno, si se_deja acumular, es t6xico para. las baeterias provoca su muerte. La catalasa descompone el peroxide de hidrégeno uw oxida los sustratos secundarios; + sin embargo, no tiene accidn contra otros perdxidos.” La descomposicidn del peroxido de hidré- geno se produce a través de la accién de dos envimas: 1) catalasa (oxidorreductasa del perdxido de hidrégeno), y 2) una peroxidasa, nicotinamida adenindinuclestico (NAD) re- ducido, nicotinamida adenindinuclestico fos fato (NADP) reducido, citocromo ¢, 0 gluta tidn,? En la descomposicién del peréxido de hidrégeno. una moléula actiia como. el sustrato y la otra como un dador; el sustrato reducido por los dtomos de hidrogeno cedidos por el dador, da como resultado un sustrato reducido y un dador oxidado.t H A #0, + H lg cals Sustrato Dador 2 moléculas de peroxide de hidigeno [ecieos > 2H:,0 + O, de agua Otros compuestos, aparte del perxido de hidrégeno, que pueden ser sustratos utiliza- dos por la catalasa, son: varios alcoholes (por ejemplo, etanol), formaldehido hidratado (H.C(OH),), acido nitroso (NOH), y acido formico (HCOOH) ambién pueden usarse sustratos inespecificos como las aminas aromaticas, fenoles y acidos aromaticos." La enzima catalasa puede emplear ¢} peroxido de hidrégeno para oxidar los alcoholes metilico (CH,OH) y etilice (C3H;OH), cedien- do sus correspondientes aldehidos."* El pH Sptimo para la actividad de la catalasa es 7." IV. REACTIVOS A) Perdxido de hidrdgeno, 30 % (Superoxal). 1. Conservar en frasco_ color caramelo. Evitar la innecesaria exposicion a Ta luz. 2. Mantener continuamente refrigerado, cuando no se usa. B) Buffer fosfato (M/15), pH:7. 1. Ingredientes. a) Fosfato. monopotisico (KH.PO) anhidro 2... 1361 g by Fosfato disédico (NasHPO,) anhidro . ©) Agua destilada 2. Método de preparacién. a) Agregar las sales a un pequetio volumen de agua destilada (hery da y enfriada antes de su uso) en un frasco volumétrico de un litro. b) Disolver por agitacion y agregar agua destilada hervida es.p. 1.000 nil Tween 80, 10% 1. Se obtiene el producto en el comercio: BBL-Tween 80 (polisorbato 80)? 2. Método de preparacié a) Agregar Iml de Tween 80 con- centrado a un pequeno yolumen de agua destilada en un frasco volu- métrico de 10 ml b) Disolver por agitacién y agregar agua destilada cs.p. 10 ml El ‘Tween 80 es un_polioxietileno derivado del monooleato de sorbitan, compuesto de actividad en superficie? Control de calidad: E} peroxido de hidré geno debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su uso general. El Staphylococcus aureus y cualquier espe- cie de Streptococcus son buenos controles, ya que se obtienen ficilmente y su conser- vaciénven cultivos madre no crea proble- mas. S. aureus: prueba fuertemente posi- tiva; especies de Streptococcus, prueba negativa, Si sobre una placa de agar sangre se coloca una gota de peréxido de hidré- geno se observa una enérgica produccién, de burbujas y espuma, debida a la presencia de catalasa en los eritrocitos. Puede utilizarse una placa de agar choco- latado como control negativo, ya que en ella se han destruido los globulos san- guineos.” El peréxido de hidrégeno (Superoxal) es muy inestable y debe pasar por un 1,420 g 1.000 ml Cc) Prueba del citrato 1. PRINCIPIO Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como tinica fuente de carbono para el metabolismo, provocando alealinidad. WI. OBJETIVO (Véase también la Seccién IIT, Capitulos 32 a 34) A) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros. 1. Edwardsiella (=) de Salmonella (por to feneral +), 2. Serratia liquefaciens (+) de Yersinia pseudotuberculosis {por lo general ~) y Y. enterocolitica (~). 3. Klebsiella (+) de Actinobacillus equui ©. 4. Grupos Klebsiella general +) de nterobacter (por lo Excherichia coli (—). B) Ayudar a la diferenciacién de las especies. 1. Aeromonas hydrophilia (por lo general +) de la Aeromonas salmonicida (=), 2 Bordetella pertussis (—) de otvas especies de Bordetella (+). Moraxella osloensis (+) y Moraxella phenylpyronvica (©) de otras especies de Moraxella (—). 4. Proteus rettgeri (+) del Protens morganii (-). 5. Psendomonas cepacia (+) de la Psendo- monas maltophitia (—) III. BASES BIOQUIMICAS Algunas bacterias pueden suministrar ener- gia en ausencia de fermentacion 0 produc- ci6n de acido Lietico "™ empleando el citrato como tinica fuente de carbono. Normalmen- te, el metabolismo del citrato comprende una condensacién de acetilo con la coenzima Ay oxalacetato " para entrar en el ciclo de Krebs. EI metabolismo del citrato por la mayoria de las bacterias es ripido a través del ciclo del icido tricarboxilico o el ciclo de fermentacién del citrato.” En las bacterias, el desdobla- miento del citrato comprende un. sistema enzimitico sin la intervenci6n de la coenzima A, Esta enzima se denomina citritasa (citrato oxalacetato-liasa) ™ 0 citrato desmolasa." La enzima requiere un catién bivalente para su actividad, que es suministrado por el mag- nesio 0 el manganeso.” Originariamente se pensé que la descom- pos ial del citrato daba oxalacetato (la sal del acid oxalacético) y acetato (la sal del dcido acético)." Sin embargo, se considera actualmente que el oxalacetato y el acetato son intermediarios en cl metabolismo del ato." piruvato + COs Los productos obtenidos del metabolisme del citrato dependen del pH del medio." " $i el pH aumenta (alcalino), se producen mis acetato y formato, con una disminucién de ka produccién de lactato y COz."* Por encima de pH 7 no hay produccién de lactato y los productos son: 5 46 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias Gitrato + CO. + acide finmiien + 2 tcido accion Con un pH acido, el acetilmetilcarbinol (acetoina) y el lactato son los. principales productos ‘de utilizacién del. citrato,! Independientemente de los productos ter- minales producides, el primer paso dela fermentacion del citrato da por resultado ke produccin de piruvato. La degradacion del piruvato depende, entonces, del pH del medio." Cinaio > oxilacerate + acetate, Osalacetato — pinwate + CO, pit alvatine Piruyato — acetate + formate, PH sicido 2 Pinuvate — acetate + CO, + lactate 2 Piraata > acotwinta + 2.CO, El medio utilizado para a fermentacion del citrato contiene también sales de amonio inorganicas, Un organismo que es capaz de utilizar citrato como su tinica fuente de carbono utiliza también las sales de amonio como sur inica fuemte de nitrégeno, Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NHs) con la consiguiente alcalinidad. Deffner v Franke * * han postulado que la utilizacion “de citrato_ por. el Enterobacter acrogenes (Aerobacter) originaba los siguientes productos: 1 Citrate + 7 acetate + 5 CO, + formate + succinate La_utilizacion de acidos orginicos y sus sales como fuente de carbono produce carbonatosy bicarbonatos alcalinos en la nueva degradacion.” IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Medio de citrato de Simmons, pH 6on%m 1, Ingrediemtes. a) Sulfato de magnesio (MgSO,) 02 g b) Monofosfato de amonio o fosfato de amonio dihi- drogenado (NH)H.PO, 1g ©) Fosfato dipotasico (KyHPO,) ees 4) Citrato de sodio (2.77 g de citrato de sodio, 5 1/2 de HO) 28 ©) Clorure de sodio 5 og Agar aw ¢ g) Azul de bromotimol (solucion alcoholica al 15%) 0.08 g hy Agua destilada 1000 mt Indicador del pH: azul de bromo- timol a) Acido: color amarillo (no se obser- va). pH: 6. b) Alealino: color azul de intenso. pH: 7.6. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 6.9: 2) color verde Prusia Existen productos comerciales a) Difco. b) BBL, Método de preparacion a) Pesar exactamente la cantidad de acuerdo con las indicaciones del prospect. b) Rehidratar con. desmineralizada. ©) Calentar swavemente hasta su diso- lucion. ) Colocar aproximadamente 4a 5 ml en cada tubo (pico de flanta largo, con poca profundidad). gua cestilada 0 Método de esterilizacion. a) Autoclave, b) 121° C, 15 libras, 15 min, Dejar que el medio solidifique en posicién inclinada. Enfriar antes de su empleo y refr gerar para su conservacion (4-10° C Tnoculacion, a) Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h (cultivo en AHK u otro medio adecuado) b) Inéculo fiviano.» ©) Unicamente en cola de pescado sobre un medio en pico de flauta, Incubacién. a) 35°C, b) 24.48 h, A veces es necesari una incubacién mas prolongada (hasta 4 dias)." El medio de citrato de Simmons es una modificacién del medio original de Koser con el agregado de 1.5 % de agar, y un indicador del pH, azul de bromotimoi."* Puede incorporarse en el medio como fuente de carbono citrato de sodio 0 citrato de potasio."* B) Medio de citrato sulfuro de Christensen, pH: 67.552 1. Ingredientes. a) Citrato de sodio g b) Glucosa g ©) Extracto de levadura g ) Monoclorhidrato de cisteina ol og ©) Citrato férrico de monio o4 g f) Fosfato monopotisico 1 g ) Cloruro de socio 5g h) Tiosulfato de sodio 0,08 g i) Rojo de fenol O01 g g p Agar 15 ) Agua destilada 1000 ml 2. El medio de citrato sulfuro de Chris- tensen permite poner a prueba la utilizacion del citrato en presencia de nitrégeno orginico, monodorhi- drato de cisteina."" Sino se quiere determinar la produccién de sulfuro de hidrdgeno se_podra climinar del medio el citrato férrico de amonio y el tiosulfato de sodio, ya que ellos no imerfieren en la utilizacion del ci- trato.® " Indicador del pH: rojo de fenol. a) Acido: color amarillo, pH: 6.8. b) Alcalino: color rojo rosado, pH 8.4. ©) Medio no inoculado: 1) pH 2) color crema a cobrizo (ante) 4. Existen productos comerciales. a) Difco. b) BBL. Proceder de la misma manera que cuando se emplea medio de citrato de nmons en cuanto a la preparacién, esterilizaci6n, almacenamiento, inocu- laci6n e incubacién Citrato 47 V. RESULTADOS Los resultados pueden verse en las fotogrofias en colores de la figura 6-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES A) Medio de citrato de Simmons. 1. Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de fauta 2. Prueba negativa: no se observa creci- miento ni cambio de color (verde) B) Medio de citrato de Christensen. 1, Prueba positiva el pico de Mauta 2 Prueba negativa: no se observa cam- bio de color (ante) color rojo rosado en VII. PRUEBAS RAPIDAS A) Prueba de la sangre citratada.” 1, Método de Cordaro y Sellers.* 2. Principio: demostrar la fxcultad de un organismo de utilizar el citrato que se encuentra en la sangre citratada para formar un coagulo, 3. Medios. a) Diluyente del indculo. 1. Ingredientes a) Caldo de infusién de cere- bro deshidratado (CIC), 12.5 gilitro. b) Cloruro de calcio (ClCa), > 100 mg. 6) Clorure de sodio (CINa), ae 2. Preparacién. » a) Distribuir en frascos con tapa a rosca (volumen 120 ml) 85 ml caldo/frasco. b) Poner en autoclave a 121° C, 15 libras, 15 min. 3. Refrigerar pai cién (4-108 ©). su conserva b) Medio de prueba. 48 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias 1. A un frasco de CIC agregar ) Seguir las indicaciones del fabri- asépticamente 15 ml desangre de ante. baneo citratada vencida. b) Es esencial un inéculo. espeso.%® 2. Merclar y empleando técnicas asépticas distribuir con una pie 4. Correlacion con los métodos de pru peta I mlen pequenos tubos de ba standard. nsayo estériles. Preparar sola mente el mimero de tubos nece- a) 96,8 %? sarios para un lote de pruebas. b) Escasa correlacién con la prueba 3. EL resto de la mezcla caldo- del citrato de sangre se mantendri refrige- reproductibi vada 1 a 2 meses. ©) Falsos_ positives y_ falsos_nega- tivos."* 4, Inéculo. d) Falsos positives con el Proteus morganii.® a) Crecimiento de un cultivo puro de e) Es dificil interpretar una tira débil- 18 h, en AHTA. b) Indculo espeso, la cantidad que alcanza a recoger el asa de inocu- lacién, 5. Incubacién. 35° C. 1 a 3,5 h. a) Puede ser necesaria una incuba- cién més prolongada, hasta 6,5 h. b) Examinar los tubos cada hora. 6. Interpretacién. a) Prueba positiva: presencia de un coagulo firme. b) Prueba negativa: no hay forma- cion de coagulo; el. medio se mantiene homogéneo. La presencia de codgulo en la prueba de la sangre citratada es indice de utilizacién del citrato.* Segiin Cordaro y Sellers,’ es esencial un medio de inéculo nutritivo, pero no usar solucién fisioldgica ni uno que contenga glucosa (que retarda el tiempo de coagu- facion). Se incorpora al medio una pequeia cantidad de cloruro de sodio (2,5 g) para impedir la lisis de los eritrocitos." Se prefiere la sangre entera y no el plasma porque tiene un tiempo de coagulacién mas ripido y ofrece la ventaja de que no necesita centri- fugacién. B) Tiras para la prueba del citrato impreg- nadas con reactivo (Pathotec). 1. Fabricante: General Diagnostics Divi- sion, Warner-Lambert Company. 2. La identificacién rapida de las Entero- bacteriaceae se obtiene en el término de 4h. 3. Método, A) D) mente positiva por el color produ- cido por una reaccién negativa.™ VIII. PRECAUCIONES Puede haber variaciones en la inten: del color producido en una prueba de citrato positiva, debido a las diferencias en los lotes de indicadores del pH que se encuentran en el comercio. Si se usa un inéculo grande para estriar el cultivo en pico de flauta, puede obtenerse en éste un color amarillo claro a cobrizo, sin afectar el medio de mas abajo." Sin embargo, este color no indica una reaccién positiva. También un inécu- lo demasiado espeso puede dar un faiso resultado positivo.* Cuando se inocula una baterfa de sustan- cias bioquimicas con el mismo cultivo, pasar por la llama la aguja o el asa de joculacién antes. de estriar el_medio citratado, 0 inocularlo primero. El tras- paso de glucosa u otro nutriente al medio de citrato puede producir una falsa reacci6n positiva. Vaughn y col! demos- traron que si se introduce en el pico de flauta de citrato una sustancia facilmente metabolizada como la peptona, glucosa 0 acetato, el citrato resultara metabolizado. Matsen y Sherris ® y Branson * recomien- dan diluir el indculo en solucién fisiolé- gica antes de inocular el citrato para evitar el traspaso de otras fuentes de carbono. Después de 24 h de incubacién, un organismo citrato positive puede mostrar una ligera alcalinidad, apenas visible en cl pico de flauta. Si se tienen dudas en cuanto a la interpretacion, compararlo con un tubo de citrato no inoculado. Algunos organismos citrato positivos ne- cesitan la incubacion durante 48 h o mas para que se produzca un cambio en el pH. FE) Weaver y col recomiendan que cuando se utiliza la tra de citrato impregnada con reactivo, para dar validez a los resultados habra que tener en cuenta lo siguiente: 1) usar un inéculo espeso; 2) tomarlo de un cultivo en pico de flauta de Citrato 49 agar hierro triple azucarado (AHTA) en vez de agar con tripticasa de soja (ATS), que muestra tendencia a dar resultados débilmente positivos o falsos negativos, y 3) aumentar el tiempo de incubacion de 4a 6 bh si las reacciones son dudosas. BIBLIOGRAFIA BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, 5th ed., Cockeysville, Md.: Division of BioQuest, Division of Becton, Dickinson and Company, 1968, p. 99) Borchardt, K. A. (1968) Scheme for screening and identifying enteric and other gram negative bacteria using re- agent-impregnated strips. Am. J. Clin. Pathol., 50, 129. Branson, D. Methods in Clinical Bacteri- ology, Springfield, Il.; Charles C ‘Thomas, Publisher, 1972, pp. 15-16. Campbell, J.J. R., Bellamy, W. D., and Gunsalus, I. 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PRINCIPIO Comprobar la facultad de un organismo de coagular el plasma por accién de la enzima coagulasa. I. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulo 32.) A) La prueba de la coagulasa se utiliza de manera especifica en la diferenciacién de especies perteneciemtes al género Sta- phylococcus: S. aureus (que por lo comin tiene reaccién +) del S. epidermidis (-) B) Por lo general una prueba de la coagulasa positiva ¢s cl criterio diagnéstico’ final para la identificacién del Staphylococcus. Frecuentemente esta prueba es utilizada ‘como indice de virulencia o patogeni- cidad. Ill. BASES BIOQUIMICAS La coagulasa, enzima producida por el S. aureus, es relativamente-termoestable, ya que resiste a temperaturas de hasta 60° C durante 30 min.*" Probablemente es de naturaleza proteica,"* y es facilmente inactivada por las enzimas proteoliticas.” Se desconoce el mecanismo exacto estructura quimica de la coagulasa.®"" Si embargo, se sabe que esta enzima desemperia Gierto papel en la coagulacién. Actiia sobre algtin componente que se encuentra en el suero para producir un coagulo 0 tombo. In vitro, la coagulasa aumenta la velocidad de coagulacién del plasma; el resultado final es la formacién de un coigulo de fibrina.® la Plasma 2°". eosigulo de fibrina coagulasa Puede demostrarse el mecanismo normal de la coagulacién con el siguiente esquema abreviadc protrombina , $$ enzima romboaui ombina Fibrinégeno > fibrina (coigulo o trombo) Oginsky y Umbreit® afirman que hay pruebas de que la coagulasa induciria un mecanismo activador alternado, ya sea como una enzima o como un activador de un componente plasmético, para convertir cl fibrindgeno en fibrina. Smith y col. sugieren que la coagulasa es una sustancia semejante a la protrombina que reacciona con los factores plasmaticos normales para formar una sus- tancia semejante a la trombina que, a st vez, activa al fibrinégeno para formar fibri Burrows y Moulder? sostienen que la coagulacién del plasma se produce en dos etapas: 1) hay una reaccidn entre la enzima producida por las bacterias, una procoagulasa, con un factor 0 activador presente en el plasma para formar coagulasa, y 23 la propia coagulacién del plasma activada por la coagulasa. Segtin Burrows y Moulder,” factor bacteriano verdadero es la procoagu- lasa, y el factor plasmatico es una fraccién globulinica similar, pero no idéntica, a la protrombina. Duthrie" ofrece pruebas de que la enzima coagulasa, que Burrows y Moulder? dicen que es en realidad procoa- ulasa, esta presente en cos formas: coagu- lasa ligada (ligada a la célula) y coagulasa libre. La coagulasa ligada se detecta con el método del portaohjetos, la reaccién de aglutinacién del plasma,’ y'no ésta presente en filtrados de cultivo."* La coagulasa ligada 0 factor de aglutinacién convierte al fibriné- eno en fibrina directamente sin intervencién eee plasmaticos, y no es inhibida por los anticuerpos de la coagulasa libre.* El método de la prueba de la coagulasa en tubo detecta tanto la coagulasa libre como la ligada, con la tinica distincion de su antige- nicidad."* Dubos y Hirsch “ y Drummond y Tager ® denominan al factor plasmatico tactor reac- tivo de la coagulasa 0 FRC, y la coagulasa libre, extracelular, reacciona con el FRC para formar una sustancia similar pero no idéntica ala trombina, actuando de tal modo indirec- tamente para convertir el fibrinégeno en fibrina. Durante la coagulacion, péptidos similares son liberados del fibrindgeno y del principio coagulasa-FRC." La diferencia principal es que el factor reactive de la coagulasa no necesita iones de calcio. para formar un coagulo y es insensible a la heparina.”” La concentracién de estafilocoagul fluye sobre la velocidad de coagulacién del plasma: cuanto mis alta la concentracién, mas rapidamente se formar el coagulo. Una concentracién elevada provoca la instantanea coagulacién del plasma2* Coagulasa 51 La tuncién real de la coagulasa in vivo no ha sido atin aclarada, Durante muchos atios se crey6 que la enzima coagulasa provocaba la formaci6n de una capa de fibrina alrededor de una lesién bacteriana, formando asi una barrera contra la accién fagocitica de los leucocitos "*" y las drogas antimicrobianas. Rogers y Tompsett® efectuaron estudios sobre la accién de la estafilocoagulasa, que no llegan a apoyar la teorfa de que los fagocitos son incapaces de englobar a los organismos S. aureus cuando hay una barrera de fibrina. Seguin Dubos y Hirsch la barrera de fibrina localiza las lesiones estafilocécicas. Ekstedt,"* Ekstedt y Nungester,” y Yotis y Ekstedt * demostraron que la produccin de coagulasa neutraliza 0 inhibe la actividad antibacteriana del suero normal contra el S. aureus; normalmente, la actividad del sucro bactericida contra el Staphylococeus."* Esto queda demostrado por el hecho de que los organismos S. aureus que producen coagulasa pueden desarrollarse en el suero normal; no asi los Staphylococcus coagulasa negativos."® Ehrenkranz y col.” hallaron que el suero humano puede ejercer una actividad bacte- riostitica. contra. algunas. cepas coagulasa negativas 0 coagulasa positivas. El mecanismo ¢s incierto, pero segin Yotis y Ekstedt,* no tiene relacion con el mecanismo respiratorio bacteriano. La actividad de la coagulasa es indepen- diente de otras toxinas estafilocécicas que pueden ser producidas por el S. aureus.7 No obstante, Cowan “asegura que todaslas cepas de S. aureus coagulasa positivas producen a 0 B hemolisinas, oambas. Burrows y Moulder 7 afirman que las @ 0 4 hemolisinas, también indice de cepas virulemtas, estan relacionadas con la actividad de la coagulasa. Young y Leitner” no hallaron correlacion entre la produccién de hemolisina y coagulasa en sus estudios. Weckman y Catlin “correlacionaron la produccién de coagulasa con la formacién de desoxirribonucleasa. La enzima estafilocoagulasa es antigéni- ca; Rammelkamp y col..** Duthrie,'® y Zen-Yoii y col.,>” reconocen siete estafilocoa- gulasas antigénicas diferentes. Sin embargo, Miale y cole sdlo reconocen cuatro tipos amtigénicos:' A, B, G y D, denominadas colectivamente isocoagulasas. Smith y col. admiten que hay dos tipos diferentes, I y IL. y que algunos S. aureus producen uno u otro Upo, y algunos ambos, La reaccion coagulasa positiva en portaobjetos se asemeja a la aglutinacién especifica y por eso se la ha denominado, a menudo, aglutinacién no especifica.* 52 Pruebos bioquimicas para la identificacién de bacterios El mecanismo in vitw de la coagulacion del plasma por el S. aureus se debe ala producci6n de una enzima vineulada con el mecanismo normal de ka coagulacion, Otros géneros pueden coagular el plasma. no enzinxiticamente, sino por la destvuceion del anticoagulante plasmatica.2825 IV. REACTIVOS EMPLEADOS A) Plasma o fibrindgeno, dos selecciones. 1. Plasma. a) Recomendado: nejo }) Alternativas: de caballo, earner o bovino. Estéril. ‘esco 0 liofilizado (deshidratado). humano © de co- ° dy 2. Fibrindgeno. a) Estevil, by Fresca. B) Productos que se encuentran en el co- metcio. 1. Difeo.® a) Bacto-coagulasa plasma. b) Bacto-coagulasa plasmacon EDTA. 2. BBL! a) Coagulasa, plasma de conejo b) Coagulasa, plasma de conejo con EDTA, ©) Coagulasa, plasma de caballo con EDTA C) Métodos de preparacién. 1. Plasma comercial. a) Reconstituir solamente la cantidad necesaria para el uso diario. No se recomienda guardar frascos de plasma rehidratado.* b) Utilizando una pipeta exerilizada, rehidratar con agua destilada de acuerdo con las indicaciones del prospecto. 1. Los productos de diferentes laboratorios pueden variar i geramente. 2. Existen ampollas preparads con diferentes alicuotas: 1, 3,15 y 25 ml. 2 Plasma fresco de sangre entera." a) Dejar que los globulos rojos sedi- menten o centrifugar | emtera b) Asépticamente, quitar el sobrena- dante (plasma) que contiene el anticoagulante en un recipiente asterilizado, Exitar recoger hemati sangre Fibrindgeno fresco." a) Asépticamente, retirar el plasma que contiene anticoagulante de la san gre entera b) Precipitacion de fibrinégeno de plasma fresco citratado, 1, Mezclar voltimenes iguales de plasma y una solucion saturada de clorure de sodio. 2. Dejar que se precipite el fibri- nogeno. 3. Centrifugar. c) Reconstituir el fibrinégeno preci- pitado hasta 5 veces su volumen con agua destilada, estéril d) Guardar en un recipiente esteri- lizado. ©) El fibrindgeno resulta efectivo tan- to para el método del portaobjetos como el del tubo, aun diluido hasta 1:160. D) Antes de emplear plasma citratado 0 fi brinégeno citratado, se recomienda agre- gar heparina para eliminar una reaccién de la coagulasa retardada falsamente po- sitiva por organismos capaces de utilizar el citrato, haciendo de tal modo que el plasma coagule.4##**247.46 Wood " sugie- re el agregado de 5 unidades de heparina por ml de plasma citratado para inhibir fa coagulacion por los organismos que utilizan citrato, lo que hace que la prueba resulte mas especifica para los Staphy- lococcus. E) Control de calidad: Tanto el plasma como el fibrinégeno, cuando se utiliza éste, deben ser controlados con cultivos positivos y negatives conocidos antes de su empleo general. S. aureus: reaccion dela ce heee positiva; S. epidermidis: reac de fa coagulasa negativa.. F) Asimismo, puede controlarse la coagu- labilidacl clel plasma por su recaleifiea- Gon. Agregar uma gota de solucin de cloruro de calcio (CLCa) al 5% a una alicuota de 0 ml de plasma (dilucion 2) con lo que se formari un codgulo.2® Conservacién: Guardar las ampollas de plasma deshidratado que sc obticnen en el comercio, cerradas, en un refrigerador °C) micnuas ne se empleen para preservar sur estabilidad."! No se_reco- mienda conservar el plasma reconstituide pasado el dia de su uso; sin embargo, Cuando sea necesario, se podri refrigerat durante algunos dias utilizindolo sino hay muestras de contaminacién, "$i debe guardarse plasma reconstituide, se preferira la temperatura de congelacion 20° C) a la de refrigeracion.! EL plasma o el fibrindgeno frescos deben serconservadosen un refrigerador (4°C)o en estado congelado (—20° C). Muchos recomiendan no congelar el plasma que se va a usar para la prueba de la coag asa; sin embargo, se ha observado que la coagulabilidad’ del plasma no se ve afectada por la congelacién y que puede usurse, siempre que se realice un control de calidad antes de su empleo. La estabi- lidad de todos los reactivos, plasma (fresco, deshidratado o congelado) y fibri- négeno, varia y se hard con cada lote un control de calidad, desechandolo cuando dé una reaccin negativa 0 debil con un organismo positive conocido, Si el plasma comercial no reaceiona convenientemente en el control de cali- dad, todo el lote debera ser devuelto al fabricante. EL factor_plasmitico varia entre las especies animales, provocando diferen- cias en la conducta de coagulacién. La mayoria de las enzimas coagulasa coag- lan el plasma humano, de cerdo, conejo y caballo, pero no el de la rata, polio, cobayo, bovine 0 de carnero.* Los estudios Hevados a cabo por Orth y col. muestran que la concentracién del FRC nuixima en el plasma humano, dismina- vendo en el cerdo, conejo y caballo, con las cifras mas bajas en el plasma bovino, de pollo y de carnero. En cuanto al plasma que se utiliza en la prueba de la coagulasa debe adaptarse a los siguientes criterios: 1) debe contener concentraciones suficientes de FRC y fibrindgeno. 2) debe estar exento de actividad fibrinolitica, y 3) debe estar Coagulasa 53 libre de inhibidores.*" La fibrindlisis se produce cuando ef sistema plesmindgeno-plasmina es activa- do por la estafiloquinas. ($1) y el factor estafilocdcico de Mueller (MF), que pro- voea la formacién de plasma que ocasiona isis del coigulo de fibrina."* Orth y coL™ observaron fibrindlisis cuando se utilizaba plasma de conejo, humano, de camnero ¥ de ctballo para el método de 1 asst en agar. Lat actividad de ta ha erst mis imtensa con el plasma de conejo y disminuia con el humano, de carnero y el de caballo. Los de bovine de pollo y de cerdo tenfan ka actividad mas débil! La presencia de un coagulo, de fibrina indica la ausencia o debilidad de ta actividad de la plasmina, Cowan y Steel " informaron que el plasma de carnero 0 bovine es coagulade per ka coagulisa, pero que da menos restiltados positivos. Chapman ® afirma que se prefiere el plasma de conejo al humano porque su coaigulo es mis firme y mayor la velocidad de coagulacién, Morton y Cohn recomiendan no usar plasma humano sise inocula un tubo de ensayo de un medio solide, pero se acepta plasma de conejo o humano cuando se prueba un cultivs efectuado en caldo. Need- ham y col. recomiendan solamente el empleo de plasma de conejo, sin tener en cuenta el tipo de medio en el que ha desarvollado el inéculo. Needham y col explican su preferencia por el plasm de conejo por la posbilidad ce que el S. aueus pierda su capacidad de producir coagulasa cuando es inoculado a parur de un medio sélido, debido a que los anticuerpos del plasma humano causan inhi- bicién. Streifield y col. demostraron el crecimiento del , aureus, pero con inhibicién de la coagulasa debida a la gammaglobulina, y Ehrenkranz y col"? comprobaron una accién_ bacteriostitica. en sueros” humanos contra cepas de Staphylococcus que pueden ser climinadas con el empleo de plasma humano diluido inoculado de un calde de cultiv posiblemente estafilocécico. Yearsly y Carter” demostraron un ligero aumento de,la actividad de la coagulasa én el plasma diabético sobre el plasma humano hormal, mientras el diabético no estuviera bajo conwol insulinico. Puede utilizarse plasma de muestras de sangre utilizacas en amilisis biequimicos, siempre que 10 se haya empleado fluoruro de sodio como anticoagulante."" “También Go- wan y Steel recomiendan no usar muestras de plasma que contengan el anticoagu razonablemente 54 Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterias etilendiaminotetracetato (EDTA 0 secuestra ne). Sin embargo, los laboratories Difco " y BBL * recomiendan el EDTA, dado que el mismo no es utilizado por las bacterias. y elimina resultados falsamente positivos de coagulacién del plasma por bacterias que utilizan el citrato, La enzima estafilocoagulasa coagulard el plasma cualquiera que sea el anticoagulante que se encuentre en el mismo, oxalato, citrato 0 hepar También se produce la coaguluci6n hasta con una dil Gidn plasmmitica de 15100, limitada principal. mente por ka cantidad de librindgeno presen: te2* EF plasma oxalatado 0 citratado. puede ser empleado para la deteccién de la estafilo- coagulasa, va que el calcio no constituye un factor? Vv. METODOS A) Prueba en portaobjetoss coagulasa ligada. 1. Colocar una gota estéril de agua desti- lada o solucion fisiolégica (CINa al 0,85 %) en un portaobjetos de vidrio limpio. 2 Emulsificar suavemente una suspen bn espesa de Staphylococcus (de an cultivo en caldo puro de 18 a 24 h, 0 la cantidad recogida con un asa de’ una colonia aiskidat pura de un cultivo en placa) en la gota de solucién fisioligica (0 agua). 3. Mezclar suavemente la cantidad reco- gida con un asa de plasma prev mente controlado, en la suspension de estafilococos: 4. Colocar en el mismo portaobjeto organismos de control positivos y ni tives, para hacer la prueba simul- tinea. Observar la inmediata formacion de un precipitado macroscépico en forma de agiutinados blancos. a) Una especie coagulasa positiva da por lo general una reaccién a los 5 a 20 seg. b) Se considera negativa la prueba en portaobjeto sino se produce la coagulacién a los 3 a 4 min La prueba de la coagulasa en portaobjeto es un método tinica mente presuntive™ y todos los resultados negativos 0 retardados (mas de 20 seg) deben ser confirma- dos con la prueba en tubo de ensayo * ya que los resultados de la prueba en portaobjetos no B) Prueba en tubo de ensayo," pueden compararse con precisién con los del tubo.74> A veces se menciona la prueba del portaobjeto con la denomina- cion de prueba de aglutinacion plasmatica, y detecta la coagulasa Figacla, sins Este método se utiliza para el estudio de un gran ntimero de cultivos de posibles S. anrens, pero sélo es confiable cuando lo realiza un microbidlogo experimentado que reconozca el hecho de que debe usar un indculo espeso del organismo junto con un pequerio indculo de plasma. La velocidad de coagulacién (aglutinacién) de- pende de la relacion en las con- centraciones del organisme y_ el plasma; si el plasma es diluido ntes de su empleo disminuye lt velocidad de una reaccién positi- va.* Una concentracién igual de plasma (no diluido) y del organi mo resulta por lo general en la inmediata aglutinacién (a los 5 a 6 seg) de los estalilococos.* Es necesario mezelar ka colonia sospechosa en agua destilada 0 so lucidn fisiolégica antes del agrega- do de plasma. Si-en la mezcla agua-organismo se produce una precipitacién 0 aglutinacién, ello se debe a autoaglutinacién del organismo y no por la coagulasa.* coagulasa ligada y libre 1. Tubo de en: esterilizado, yo de vidrio (13 x 100) a) Agregar 0,5 ml de plasma humano oede conejo, no diluido y previa- mente controlado, b) Agregar 0,5 ml de un cultivo en caldo puro de 18 a 24 h, 0 recoger con el asa una buena cantidad de una colonia pura de una placa de agar. 2. Hacer girar ef tubo suavemente para lograr la suspensién del organismo. No agitar 3. Incubacién, a) En bano de agua a 37°C. b) 4 h, observar cada 30 min si se produce la coagulacién. Coagulasa 55 1. Mientras se efeettia el control, © granulacién después de los 20 no agitar ni sacudir el tubo. Incli- seg y hasta 1 min, narlo con cnidado para observar b) So aureus, cep virulenta. si hay coagulo. 2. Sialcabo de 4 hno hay coigue 3. Prueba dudosa.# lo visible, dejar en el baiio de agua o colocar en incubadora a) Granulacién después de 1 win a 35°C hasta el dia siguiente b) Repetir, y si el resultado es idéntico, 4h). confirmar por medio de ta reacciin 3. Gillespie y Cowan ™ reco- rr tubo antes de hacer el informe miendan efectuar la incuba- del resultado. cién de un dia para el otro (24h) a la temperatura del 4, Prueba negativa ambie) (22°C). Bailey y Scott! aconsejan a) No se observa cambio: la suspen- emplear una dilucion de plas- sién se mantiene homogénea ma de l:4 cuando se ust_un b) Confirmar por medio de la prucha en cultive en caldo, o de 1:5 si se tubo de ensayo ames de intormar el agrega al plasma una colonia resultado, aislada. Cowan ™ sugiere util ©) S. epidermidis w otro organismo. zav plasma sin diluir con el cultivo en ealdo, pero diluirlo BY Método del tubo de ensayo. en la proporcion de 1:2 cuan- dose hace una suspensio: 1. Prueba positiva. con una sola colonia. Harper ¥ Conway ** recomiendan una a) Se forma coigulo o filamentos de dilucién 1:2 y Gillespie 4 una fibrina definidos. dilucion de 1:10 del_ plasma, 1, Completa; el coagulo abarca Fisk y Williams y Harper * todo el tubo. informan que la formacion de 2. Parcial; el corigulo no se ex- coagulo se produce mejor cuan- tiende por toda la columna de do se merclan el cultivo ¥ el liquido. Cualquier grado de plasma en proporciones igua- coagulacién se considera posi- les, con el plasma sin diluin tivo. No obstante, en un plasma diluido hasta 1:100 la estafilo- b) 8. aureus, cepa virulenta. coagulasa produce coagulo2* 2. Prueba negativa. VI. RESULTADOS a) No hay formacién de coagulo, ka suspensin se mantiene homoge- nea (igual que en el tubo no Los fotografias en colores de inoculado). los resultados pueden verse b) S. epidermidis u ovr r en la Figura 7-1 (Apéndice 1). ne ‘ ea VII. INTERPRETACION VIII. PRUEBAS ALTERNATIVAS A) Método del portaobjeto. A) Prueba de la coagulasa en placa fraccio- nada. 1. Prueba positiva.® 1, Método de Parisi, Baldwin y Sottile.* a) Acentuada aghutinacién dentro de los 5 a 20 seg. a) Detecta la produccién de coagu- b) 8. aurens, cepa virulenta Tasa b) Ingredientes primarios 2. Prueba positiva retardada.* 1, Agar con infusién de corazén a) Cualquier grado de aghutinacién y cerebro (ACC), 0 agar YETS 56 Pruevas bioquimicas para la identiticacion de bacterias (caldo de tripticasa de soja 2. Manitol al 1%. [BBL] y 0,3 % de extracto de levadura). 2. 2. Plasma. De preferencia, de cerdo.#** Alternativa, de co- nejo. Correlacin con las pruebas estindar: demasiados resultados falsamente po. sitivos.2528 2. Gorrelacién con ta prueba en tubo estindar, excelente.® Parisi y col.!® recomiendan no usa plasma humano para la técnica de la placa fraccionada, IX. PRECAUCIONES A) Cultivo: Una actividad débil de la coagu- lasa puede pasar inadvertida si el cultivo en caldo del organismo sospechoso es demasiado viejo (debe ser un cultivo de 18 a 24 h) 0 si cl crecimiento es escaso.! B) Plasma. B) Prueba en tubo de la coagulasa-termo- nucleasa. 1, Método de Barry, Lachica y Atchisor a) Detecta. 1. Coagulasa libre. 2) Termonucleasa (nucleasa ter moestable) b) Ingredientes primarios. 1, Caldo de infusién de cerebro EI plasma fresco es inestable y puede coagularse y formar particulas que producen una turbiedad 0 depésito que hace dificil interpretar una reac- cién de coagulasa débilmente posi- tiva."! El plasma utilizado para la prueba de la coagulasa no debe ser file ello extrae los agentes de coagulacién de la sangre. lo. "stl wearin (CG), 3. Si se usa plasma de sangre de banc ) humana vencida y recién extraida de 3) Diluyenie dé indcuilo, pacientes hospitalizados, tener en th Mate cn pretnentacitis, Cuenta que puede tener inhibidores pein Por lo tanto se hari la prueba con organismos normales para el control i Phent paw eels emt de calidad (uno intensamente positive do ctilendiant ovaracedco ¥ uno negative) ademas de un organis- (EDTA) Wifeo)." mo débilmente positivo.'#” Si sola- 3. Técnica del agar con acido mente se dispone de este tipo de deosintibonucttice’ (ADN) sangre, el problema se atenuars dilu azul toluidina (ADT). yendo el plasma y tomando el inéculo de un caldo de cultivo.® Correlacién con la prueba en tubo 4 Todos los dias que se utilice plasma se standard: Barry y col? recomiendan realizar ambas pruebas simultinea- mente como control de calidad, C) Prueba de la placa de agar con coagulasa- manitol. Método de Esber y Faulconer.2" a) Detecta. Tanto la coagulasa ligacia co- mo la libr Fermentacion del manitol b) Ingredientes primarios. 1. Plasma hun 7% sanguineo nO. hari un control positivo y negativo. C) Prueba en portaobjeto. 1 En ‘el método del portaobjeto, la granulacién 0 aglutinacion que se observe en la suspensién del organis- mo en agua destilada (o solucién lisio- logica) antes del agregado de plasma, se debera muy probablemente a auto- aglutinacion del organismo v no a la actividad de la coagulasa.* Cadness- Graves y col" hallaron wes cepas autoaglutinables en sus estucios, Dede observarse si hay autoaglutinacién, en la suspension, porque de lo con- trario puede obtenerse un resultado falsamente positive en la prucha del portaobjeto. Cadness-Graves y col." recomiendan que se confirme por medio de una coloracion de Gram el resultado posi- tivo de una prueba de la coagulasa en portobjeto; se controlari la tipica morlologia gram del Staphylococcus (cocos grampositivos en racimos). Branson’ recomienda el control de la morfologia por medio de la colora- cidn del portaobjetos positive con vio: leta evistal D) Prueba en tubo de ensayo. 1 2. Cuando se realiza la prucba en tube de ensayo, no sacudir ni agitar ef tubo al controlar la formacién del coagulo, Puede producirse un resultado dudo- soo Lalsamente negativo por la rotura del co”gulo en a primera etapa de la coagulacién ® que no se recompone continuando Ia incubacién. Sie plas on Sect coal ae grega una soluci6n de 1:10.000 de Me Ihoclaic, habe’ inusefoscects oie prueba en tubo pero nv en el método del portaobjeto.? Algunas cepas de 8. aureus producen una gran concentracién de fibrinoli- sina que provoca la ausencia de coigulo por lisis precoz, 0 solamente la presencia de un pequeno co’gulo en los primeros momentos de la incu- bacion que pronto es lisado " y da por resultado falsas reacciones negativas. Esto es posible, sobre todo cuando, se utiliza plasma de conejo." Pe ‘or lo tanto, es fundamental observar el tubo cada 30 min para ver si se forma coiigulo, sobre todo durante la prime- ra hora de incubaciér. Algunas cepas cle S. aavens producen tan’ poca estafilocoagulasa que sola- mente se observa ka actividad coagu- ante después de 24h de incubacion.'" Se acepta en general que la actividad, de la coagulasa es especifica del S. au- rus. Sin embargo, otros organismos son capaces de coagular el plasma citratado, La coagulacion del plasma citratado tiene una amplia distribucion entre las bacterias. Bayliss y Hall * y Frede- ric ® observaron dicha actividad en la Serratia marcescens. Krech ™ ha in- formado acerca de un filtrado de Escherichia cali libre de células capaz de coagular el plasma, y_ Billaudelle * ha observado la facultad de coagula- Gion en algunas cepas de Bordetella Coagulasa 57 pertussis. Otros organismos gramnega tivos, que resultaron capaces de coa- gular el plasma, son Actinomyces,®* Klebsiella Enterobacter y Pseudomonas aeruginosa? ® Se acepta en general s7ehe6enaretie que estos organismos no producen la enzima coagulasa, pero que descom- ponen el anticoagulante citrato, libe- rando iones de calcio que a su vez activan los mecanismos normales de la coagulacién de la sangre; la protrom- bina en trombina.* Los estudios de cromatografia sobre papel efectuados por Bayliss y Hall* muestran que las pruebas de coagulasapositiva_con otros organismos que no son el S. reus coinciden en la ausencia de citrato en la prueba con plasma citratado, No se produce Ia coagulacin si el plasma ha sido filtrado 0 inactivado por la heparina.?* Tampoco ocurre la formacion de coiigulo si_hay una clevada concentracion de citrato 0 si los iones calcio estin unidos por el anticoagulante_oxalato (una sal no metabolizable)." El anticoagulante EDTA tampoco es desdoblado por las bacterias que utilizan el citrato."® Si se diluye el plasma citratado en una proporcién de mis de 1:8, no se lormara coigulo porque los elemen- tos de la coagulacion se encuentran demasiado diluidos como para hacer- lo2* La mayoria de los organismos gramnegativos que destruyen el citra- to requieren generalmente 18 ho mis para formar un codgulo; el catabolis- mo depende de la concentracion de citrato y de la velocidad de crecimien- to del organismo2* La estafilocoagulasa coagula el plas- ma, cualquiera que sea el anticoagu- lante empleado: oxalato, citrato, EDTA o heparina Evans y col informaron que las especies de Streptococcus del grupo D. (enterococos) son eapaces de coagular el plasma citratado, casi siempre como reaccion retardada (24 h), pero no el plastha que contenga otros anticoagu- lintes, Baples ¥ Hal MUGiienM Hone mann. y Young y Leitner * informa- ron también sobre la actividad de coagulacion del Streptococcus faecalis. Esta formacién de coagulo, segtin Evans y col.?! se debe a la utilizacion del citato y' no a la produceién de la enzima coagulasa; solo los estreptoco- cos del grupo D citratopositivos den formar un coigulo en el pl de conejo. Sin embargo, Wood * afirma que la coagulacién del plasma de conejo por losestreptococos del gru- po D se debe no a la utilizaci6n del Gitrato, sino a un agemte liberado por el organismo que es probablemente una enzima, Segtin Wood,* esta actividad enzimatica es la misma que la de la enzima estafilocoagulasa; sin embargo, su accién sobre el plasma humano © equino no tiene paralelo con su actividad sobre el plasma de conejo. Esta accién podria deberse a variaciones en la activacio inhibidora de los plasmas de difere tes especies.” Wood afirma también que la capacidad de coagulaci6n de las especies de Streptococcus del grupo D ¢s caracteristica de las cepas y no de la especie, y que si se agrega al plasma citratado 5 unidades de heparina por ml, se inhibe la coagulacién provoca- da por los estreptococos. A menudo se confunden las espe- Ges de Streptococcus del grupo. D (enterococos) con Staphylococcus, por- que pueden tolerar una elevada concentradén de sales. Algunas pue- den fermentar el manitol, y muestran posiblemente crecimiento y fermenta- Gin en medio de agar manitol salado, que en general se considera selectivo. para la identificacién de especies de Staphylococcus. Sin embargo, las colo- nias de las especies de Staphylococcus en el medio de agar manitol salado, 58 Pruebas bioquimicas para la identitcacion de bacterias son grandes en comparacién con los enterococos (colonias pequefias 0 en cabeza de alfiler con ligera fermenta- cién de manitol). Cuando hay dudas, antes de hacer la prueba de la actividad de la coagulasa realizar la prueba de la catalasa; las especies de Staphylococcus son catalasa positivas, y todas las espe- cies de Streptococcus, catalasa negat vas. Evans y col! recomiendan que si el resultado de la coagulasa en plasma Gitratado es retardado (mas de 3 y hasta 24h para la formacion de coa- gulo), habra que sospechar que el Organismo no. es un Staphylococcus aureus. También aconsejan usar un anticoagulante que no. sea citrato. Burrows y Moulder,’ Smith y col.,"* y Bayliss y Hall? han_ presentado informes respecto a que el Bacillus subtilis, un bacilo grampositivo, es capaz de coagular el plasma citratado u oxalatado, humano 0 de conejo, gracias a_un producto metabdlico. Rammell informs que el citrato inhibe el crecimiento del S. aureus El uso de plasma heparinizado impide las reacciones_ falsamente por los organismos que ut Gitrato. E) General: Las cepas mas virulentas de S. aureus poseen enzimas coagulasa. Ehren- kranz y col.!” y Morton y Cohn ® reco- miendan que no se use la presencia 0 ausencia de coagulasa como criterio de virulencia; los sintomas clinicos son de importancia mucho mayor para deter- minar la patogenicidad. BIBLIOGRAFIA 1. Bailey, R. W., and Scott, B. G. Diagnos- sis. Acta Pathol. Microbiol. Seand., 37, tic Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. 5. 'V. Mosby Company, 1968, p. 106. 2. Barry, A. L., Lachiea, R. V. F., and Atchigon, F. W. (1978) Identification of 6, Branson, D. 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PRINCIPIO Medir la capacidad enzimatica. de un organismo para decarboxilar un aminoacide para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad I. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 32 a 34,) A) Las pruebas de las decarboxilasas se emplean fundamentalmente para deter- minar grupos bacterianos entre las Ente- robacteriaceae. B) Los aminoiicides decarboxilados son la lisina, la ornitina y la arginina. 1. Lisina-decarboxilasa a) Ayudar a la diferenciacion entre los géneros: Edwardsiella (+), Sal- monella (por lo general +), y Arizo- na (+) del Citrobacter (—). b) Ayudar a la diferenciacién de las especies: Enterobacter aerogenes (+) y Enterobacter hafniae (+) del Ente- robacter cloacae (~ ‘nterobacter agglomerans (~). 2. Ornitina-decarboxilasa, a) Ayudar a la diferenciacién entre los géneros: Enterobacter (por lo general +) del Klebsiella (—) b) Ayudar a la diferenciacién de las especies. 1. Enterobacter agglomerans (=) de otras especies: de Enterobar- ter (+). 2. Proteus mirabilis (+) del Proteus vulgaris (—). 3. Proteus morganii (+) del Proteus vettgen (=), 4. Yersinia enterocolitica (+) de la Yersinia pestis (=) y Yersinia preu- dotuberculosis (—) Arginina-deshidrolasa, a) Ayudar a la diferenciacién de las especies: Enterobacter cloacae (+) de otras especies de Enterobacter (generalmente —). b) Ayudar a la identificacién de las Pseudomonas. TH. BASES BIOQUIMICAS La decarboxilacién es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas decarboxila- sas especificas son capaces de ra los aminodcidos en su grupo carboxilo(~COOH), dando una amina 0 una diamina y anhidrido carb6nico.* Las enzimas decarboxilasas son numerosas y cada una es especifica para un sustrato R—CH—NH;—COOH—> R—CH.—NH, +CO, Anninoacidte Amins Anbidride carbonic 62 Pruebos bioquimicas para la identificacién de bocterias determinado. En un laboratorio de bacterio- logia clinica, las tres decarboxilasas impor tantes utilizadas para la identificacién bacte- riana son la lisina, la ornitina y la arginina Estas decarboxilasas son enzimas adapiativas 0 inducidas; son formadas por un organismo solamente cultivadas en un medio acido en presencia de un sustrato especifico, y los productos de la decarboxilacién provocan una desviacién del pH hacia la alcalinidad.* La decarboxilaci6n esta limitada a aquellos aminodcidos que poseen por lo menos un grupo quimicamente activo que no sea una amina (-NH,) 0 un grupo carboxilo (=COOH),” y la descomposicién de los aminodcidos se produce anaerdbicamente. EI proceso de decarboxilacién es irreversible. no oxidativo, y requiere una coenzima co- mun, el fosfato de piridoxal.® El aminoacido L-lisina sufre la decarboxila- cién para dar cadaverina (una diamina) y anhidrido carbonico por accion de especifica lisina-decarboxilasa. + CO, By Ta enzima ornitina-decarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhidrido carbonico.” OHNE; Ae CH, CO: oo | bail CH,—NH, coon L-Ornit Putrescina (diamina) ‘Tanto la cadaverina como la putrescina son estables cuando son producidas en condicio- nes anaerdbicas® Se cultiva la_bacteria estudiada en anaerobiosis recubriendo la superficie del medio con parafina o vaselina. Con el sellado de los tubos, todo el oxigeno no combinado es consumido por el or mo presente durante la fase de crecimiento inicial y durante la decarboxilacién el pH del medio aumenta (hacia la alcalinidad) a medida que se produce anhidrido carboni- co Como el pH puede ser controlado, es posible incorporar un indicador del pH, ya sea ptirpura de bromocresol y/o rojo. de cresol, en el medio que contiene el amino- icido. E] aminoacid L-arginina es catabolizado a través de dos sistemas que pueden ocurrir simultinea o separadamente®, Estos. dos caminos son el sistema de la arginina-dehi- drolasa y el sistema de la arginina-decar- boxilasa. En el sistema de la decarboxilasa, la L-arginina sufre la decarboxilacién para dar agmatina, una molécula mas grande que la putrescina, que no puede ser considerada el producto final en el catabolismo de la arginina por las bacterias vivas.? Una nueva descomposicién de la agmatina se produce por una de dos vias. La accién catalitica de la enzima agmatinasa desdobla la agmatina en dos compuestos, putrescina y urea. Si se encuentra ia enzima ureasi, la urea es también catabolizada para dar dos moléculas de amoniaco (NH) y anhidrido carbonico (CO.). Mller ® hallé que la putrescina no sufre una nueva descomposicién de grado demostrable Este mismo autor comprobé también que todas las cepas de las Enterobacteriaceae producen la enzima agmatinasa y por lo tanto muestran un enérgico catabolism de la agmatina, dando putrescina y urea, 0 putres- cina y 2 NH y COs si también se encuentra presente la enzima ureasi La agmatina es catabolizada por la enzima agmatina-deshidrolasa en putrescina, CO» y NH, por medio de un compuesto intermedia rio, monocarbamil putrescma, que se encuen- tra en los organismos Streptococcus faecalis. En el sistema dehidrolasa, la descomposi- cién de la L-arginina, segtin lo han demostra- do Knivett," Slade y Samp? v Oginsky’ Gehring 2! se produce en un proceso de dos tapas: primero una descomposicién de la L-arginina en L Prevorsek 7 y col2® recomiendan usar sola- VII. INTERPRETACION mente_la tira de lisina para la identificacion presuntiva de espe- Cualquier aminoacido da los mismos resul- cies de Salmonella, tados en color: ejemplo, la lisina-decarbo- xilasa. 2. Prueba de la placa en mancha. A) Prueba positiva: purpura turbio a un a) Semimicrométodo de Geilach y purpura amarillento apagado (producido, col.5 por la cadaverina). b) Resultados: a las 6 a 24 h de B) Prueba negativa: color amarillo claro y incubacion. brillante (solamente fermentado por la ©) Solucién de sustrato aminodcido, glucosa). yolumen total 100 ml. 68 Pruebos bioquimicas para la identificacién de bacterios d) 1. Lisina, 1% en buffer ftalato dcido de potasio 0,004 M (pH: 5,7). 2. Fosfato de piridoxal, 1 a 2 mg. 3. Indicador rojo de bromofenol, concentracién 0,0016 %. 4. Cloroformo (conservador) va- rias gotas. Guardar en reftigerador (4- 10° C) (se mantiene bien durante varios meses). Método. 1, Cépsula de control tinicamente a) Buffer. b) Indicador. 2. Capsulas de prueba. a) 4 gotas de solucién de ami- noacido. b) Una sola gota (pipeta capi- lar) de suspensién celular. Grecimiento de un agar en pico de flauta de 6 h. Hisopo estéril del crecimien- to en 0,5 ml de buffer fialato acido de potasio 0,004 M (pH ajustado a 5,7). 3. Cubrir la placa con gasa. 4, Incubacién a 35° C durante 24h; leer alas 6h y alas 24h. 5, Imerpretacion, a) Positiva: color rojo rosado. b) Negativa: no hay cambio de color, se mantiene amarillo. 3. Método de Brooker y col.> a) b) Resultados: a las 4 h de la incu- bacién Medio y preparacion. 1. Peptona (Difco) 05 ¢ 2. Extracto de levadura Wifco) 03 g 3. Agua destilada o deionizada 100 mi 4. Calentar suavemente para disol- °) d) e) 5. Ajustar el pH de 5 a 5,2. Distribucién y esterilizacién, dos opciones 1. Distribuir alicuotas de 1 ml en tubos de borosilicato y tapar. Colocar en autoclave, a 121°C, 15 libras, 15 min 2. Filtracién. Filtre Millipore Asépticamente distribuir alicwo- tas de I ml en tubos de boro- silicato y tapar. Método. 1. Inoeulacién: un inéculo espeso recogido con el asa. 2. Cubrir con 1 ml de yaselina 0 parafina fundida estéril. 3. Incubacion. Dos elecciones. 4) Se recomienda un baiio de agua a 37° C.> Mejor inter- cambio del calor. Se obtie- nen resultados positivos en un periodo mais breve. ncubador de aire seco a 35°C. ‘b) Leer a las 1, 2,3 y 4h Interpretacion. 1. Positive: color verde o azul (pH: 6,1). 2. Negativo: color amarillo. Es fundamental un inéculo es- peso (10° 0 mas); si se usa un inéculo demasiado liviano de pla- cas de agar sangre de carnero (ASC) o agar de MacConkey (MAC), pueden producirse falsos resultados negativos al cabo de 4h de incubacion.* Los resultados se interpretan dentro de un limite de 4h; la inoculacién puede exten- derse sin peligro hasta un maximo de 8h pero no mis. A las 24h, Jas cepas de Citrobacter pueden resultar falsamente positivas.” c B) Ornitina-decarboxilasa: Método de Fay ver, luego agregar. y Barry. a) Monoclorhidrato de LAisina (1%) i) 1. Result dentro de las 2.a 4h de b) Azul de bromotimol incubaci alcohélico 0,5 g 2. Medio. a) Medio de decarboxilasa _modifi- cado. 1. Sin glucosa. 2 Con’ pH disminuido a 5.5. b) Ingredientes y preparacién 1. Peptona (Difco) 5g 2. Extracto de levadura (Witeo) 3g 3. Purpura de bromo- cresol al 0.2 % (alv) en alcohol etilico al 50 % (viv) 5 4. Agua destilada 0 deionizada cs.p. 1000 ml 5. Calentar suavemente hasta diso- lucién, después agregar 10 g de dlorhidrato de L-ornitina (Dif- co). 6. Ajustar el pH a 5,5, con acido clorhidrico (HCI concentrado 0 hidréxido de sodio (NaOH). ° 1 erilizacién. Autoclave. 121° ©, libras, 15 min, d) Método, 1 Eldia de la prueba. a) Distribuir asépticamente ali- cuotas de 1 ml, b) Tubos esterilizadas (12 x 75 mm), 2. Inoculacién, a) Crecimiento de un cultivo de 18 a 24h (ASC 0 MAC), b) Colonia aislada. Recubrir los tubos con 0,5 ml por lo menos de vaselina estéril 4. Incubacién. Calentador a 37° Qadh ©) Interpretacion. 1. Positiva: color purpura oscuro. 2. Negativa: color amarillo. £) Correlacién con la prueba es dar de Méller; 100 %. A veces la Escherichia coli puede reducir el indicador a un color gris claro; si esto ocurre agregar una gota c) B) Co D) Decarboxilasas 69 de indicador bromocresol directa- mente al tubo y volver a interpretar Asimismo algunas cepas ornitina posi- tivas de E. coli_y Protew pueden mostrar s6lo un ligero color piirpura al término de 4h; confirmar el resultado positivo reincubando owos 30 a 6O min.® Lisina y ornitina-decarboxilasas, 1. Método de cromatografia de gas de Lambert y Moss.2” Anillisis por cromatografia de gas liquido para la deteccién de: a) Putrescina, decarboxilacién de la ornitina, b) Cadaverina, decarboxilacién de la lisina, 3. Resultados: dentro de las 3 a 5 h. 4. Método: véase la referencia 20, IX. PRECAUCIONES Después de reposar durante la incuba- cién una prueba de decarboxilasa debe presentar dos capas de diferentes colores, amarillo y purpura. Agitar suavemente el tubo antes de hacer la. interpretacién. Con frecuencia es dificil leer una prueba de decarboxilasa positiva debido a la resencia de un color piirpura amari- lento indefinido. En este caso, comparar siempre con un tubo no inoculado. Todo vestigio de color purpura indica una prueba positiva si ha sido incubada por lo menos 24h. En algunos casos, el color indefinido 0 la desaparicién del mismo después de una incubacién prolongada durante varios dias, se debe a la destruc- cin del indicador del pH La adicién de purpura de bromocresol al tubo demuestra que ésta era la causa. Esta decoloracién 0 resultado indefinido se produce frecuentemente con el Proteus mirabilis y el Proteus vulgaris Rotular todos los tubos de decarboxilasa antes de la inoculacién. La mezcla de diversos tubos de aminoacidos dara resul- tados sin validez para la identificacion bacteriana. Se acepta como conveniente: C, control; A, arginina; L, lisina; O, ornitina. El tubo de control que no contiene aminodcido debe mantener su color amarillo después de 18 a 24 h de 70 Pruebas bioquimicas para Ia identiticacién de bacterias incubacién, lo que indica que tinicamente ha sido fermentada la glucosa. Un control positive (pirpura) invalida todas. las pruebas de decarboxilasa y no puede hacerse ninguna interpretacién. En el cuadro 8-1 se presenta la lista de los organismos de control que pueden some- terse a prueba para obtener resultados precisos en cuanto a la actividad de decarboxilasa de la lisina, la arginina y Ia ornitina* Cuadro 8.1 H) por lo menos 18 a 24 h, Las interpreta- Giones prematuras pueden dar un resul- ado, fasammente nedatyeaD ROTEL 10 a 12 h de incubacion es fermentada la glucosa, lo que da como resultado un color amarillo (pH acido). Sélo después que la glucosa es fermentada se observara la actividad de la decarboxilasa. La actividad de la lisina decarboxilasa de Falkow produce un definido desvio del pH a un color purpura en 24h. La actividad de la lisina-decarboxilasa en la Salmonella se_usa para diferenciar este grupo del Citrobacter freundii. Sin em- bargo, la Salmonella paratyphi A da una ion negativa (amarillo) en 24 hh y representa una excepci6n. La Salmonella gallinarum da una reaccién de la ornitina-decarboxilasa positiva re- tardada, que necesita de 5 a 6 dias de incubacién. Esta reaccion retardada se debe a una ligera permeabilidad de la bacteria viva para la ornitina, y es una rara excepcién. Muchas cepas de Escherichia coli, inclu yendo aquellas que fermentan el adonitel, muestran una reacci6n retardada para la actividad de la ornitina-decarboxilasa medio de decarboxilasa de Moller requiere un pH bajo, condiciones anaeré- bicas y estrictos controles. El medio de decarboxilasa de Falkow depende simple- mente de un cambio en el indicador del Organiomas Avginina Omitina ‘te control Proteus vulgaris = q = mea Klebsiella z + = Proteus morganii a eZ . i Sabronella sphi + + < Enterobacter cloacae Bs - + Enterobacter aerogenes - + " Salmonella ‘pkimarinm tf + ‘ 7 = i D E) Las bacterias metabolizantes pueden cata- bolizar los aminoacidos de otra manera, y las aminas formadas pueden ser degra- dadas nuevamente. Estas posibilidades se K) El producen sobre todo en la descompo- sicién de la L-arginina. El catabolismo de la L-arginina puede ocurrir simulta- neamente por diferentes ciclos: el sistema de la decarboxilasa y/o el sistema de la HIT dehidrolasa.” L) F) El indicador del pH, piirpura de bromo- cresol, cuando se incorpora al medio, da cambios mas definidos en las reacciones del pH, pero al mismo tiempo la desvia- cién del pH en los controles aparece antes que en el sistema de prueba de la decarboxilasa* Cuando se usan las pruebas de la decarboxilasa de Falkow 0 Mdller, no tratar de interpretar los resultados hasta tanto los tubos no hayan sido incubados G) El medio de Falkow no es conveniente para determinar la actividad de la lisin; decarboxilasa con los dos géneros Kleb- siella_y Enterobacter.» *° En la Klebsiella el pH disminuye a medida que aumenta el perfodo de incubacién debido funda- mentalmente a la formacién de acetil- metilcarbinol (VP_positivo).%? Como los resultados pueden ser equivocos, no se recomienda el método de Falkow para la identificacién de los grupos Klebsiella y Enterobacter." BIBLIOGRAFIA 1. Barile, M. F., Schimke, R. T., and Riggs, D. B. (1368) Presence of arginine dihydrolase pathway in Mycoplasma. J. Bacteriol., 91, 189, 2. BBL Manual of Products and Labora- tory Procedures, 5th ed.,, Cockeysville, ‘Maryland: Division of BioQuest, Divi- sion of Beeton, Dickinson and Com: pany, 1968, p. 108. 3, Blazevic, D. J., Schreckenberger, P. C., ‘and Matsen, J. M. (1973) Evaluation of the PathoTee "Rapid I-D” system. Appl. “Microbiol., 26, 886. 4, Borchardt, K. A. (1968) Simplified method for identification of enteric and other gram-negative bacteria using re- agent-impregnated strips. Am. J. Clin. Pathol., 49, 748, 8. Brooker, D. C., Lund, M. B., and Bla- zevie, D. J. (1972) Rapid test for lysine decarboxylase activity in Enterobacteri aceae. Appl. Microbiol.,.26, 622. 6. Burrows, W., and Moulder, J. W. 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PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de crecer en un medio inhibidor y fermentar un carbohidrato(s) producendo un cambio de color relacionado con el pH I. OBJETIVO (Véase también Ia Sec Capitulo 32) nm IH, A) El caldo FK para diferenciar todas las especies de Streptococcus pertenecientes al grupo D, de otras especies de Streptococcus que no pertenezcan al grupo mencio- nado. 1. Especies de Streptococcus del grupo D (enterococos y no enterococos) 2. Otras especies de Streptococcus, que no son del grupo D (=) B) El caldo SF para diferenciar los entero- cocos del grupo D (estreptococos) de los no enterococos del grupo D y otras especies de Streptococcus que no son del grupo D. 1. Especies de Streptococcus enterocdcicos del grupo D (+). 2. Especies de Streptococcus no enterocs- cicos del grupo D (-). 3. Otras especies de Streptococcus, que no son del grupo D (—). Il. BASES BIOQUIMICAS Todas las bacterias aerdbicas obtienen su energia de la respiracién, proceso respon sable de la oxidacion de diversos sustratos. El oxigeno molecular oxida un sustrato con la intervencién del sistema de trasporte de electrones.’ Cuando existen condiciones aerd- bicas, el oxigeno es el aceptor de hidrégeno final, produciendo con él agua 0 perdxido de hidrégeno, segiin la especie bacteriana y su sistema enzimatico.”? Por lo general el sistema citocromo sélo se encuentra presente en organismos aerdbi- cos," lo que los hace capaces de_ utilizar oxigeno como un aceptor de hidrdgeno final para reducir el oxigeno molecular en per- Oxido de hidrégeno, el tiltimo enlace de la cadena de la respiracion aerébica.» Castor y Chance ® demostraron por medié de métodos fotoquimicos que existen cuatro pigmentos bacterunos que se sabe que acttian como enzimas. respiratoriascitocromoox dasas terminales: citocromo a, citocromo a: citocromo ag, y un pigmento que se une al monoxido de carbono (CO-ligadura) deno- minado citocromo o. Los diversos citocromos son pigmentos respiratorios que contienen compuestos de ferroporfirina.* Los caldos fecales, FK y SF, contienen un inhibidor, la arida sddiea. La azida quimica, en altas concentraciones, inhibe ka enzima citocromooxidasa en la cadena de trasporte de electrones, donde el trasporte se une a la sintesis del ATP (oxidaciones biolégicas). Sin embargo, o hay inhibicién celular cuss do el sistema de trasporte de electrones no se une a la fosforilacion."* La inhibicién azidica se produce cuando el citocromo a3 de la cadena respiratoria se combina en su forma férrica (Fe***) con la azida, enlazando el metal del grupo prosté- tico ¢ impidiendo la reaccién del metal con el oxigeno molecular.‘ Harrow y Mazur " afir- man que la combinacién con la azida puede hacerse a través de la porcién prostética hem del citocromo as, 0 el cobre que se encuentra en az, 0 ambos a la vez. Este enlace del oxigeno molecular inhibe la enzima citocro- mooxidasa dando como resultado la pérdida de la trasmisién de electrones a través de la cadena oxidativa del sistema respiratorio al oxigeno.' La distribucién de los diversos citocromos varia con cada especie bacteriana; algunos organismos poseen sélo una oxidasa mientras que otros pueden producir dos ‘o tres La arida s6dica ejerce un efecto bacterios- tatico sobre los organismos gramnegativos,**!® aunque permite el crecimiento de bacterias grampositivas."* Los enterococos (especies de Streptococcus del grupo D) son bacterias grampositivas, que carecen de un sistema citocromo y del ciclo del acido tricarboxilico; de alli que sean capaces de crecer en presencia de la azida sddica inhibidora.’ La degradacién del hidrato de carbono. se produce a través del ciclo de la hexosa difosfato, dando una reaccién acida en el medio SF o FK con azida sédica e hidratos de carbono. IV. MEDIOS EMPLEADOS A) Dos opciones. 1. Caldo de Streptococcus faecalis, pH:6,9 (caldo SF) 3414 a) Ingredientes. Triptona...... 200 g Dextrosa (glucosa) ..... 5 og 3. Fosfato dipotasico (KeHPO,) ..... 4 g 4. Fosfato monopotdsico (KH;PO)) ... 1b g 5. Azida sédica NaN;) 05 g 6. Cloruro de sodio (CINa) wn, 5g 7. Ptirpura de bromocresol ... 0,082 g 8. Aguadestilada . 1.000 ml Caldos fecales pare enteracocos 73 b) Indicador del pH: ptirpura de bromocresol. 1. Acido: color amarillo, pH:5,2. 2. Alcalino: color purpura, pH: 68. 3. Medio no inoculado: a) pH, 6,9; 6) color parpura. ©) Existen productos comerciales 1. Difco. 2 BBL. d) Método de preparacion. 1. Pesar con precision las cantida- des, como se indica en el pres- pecto. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar suavemente hasta diso- Jucién. 4, Distribuir aproximadamente 4 a 5 ml por tubo. €) Método de esterilizacién. 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 libras, 15. min. £) Enfriar antes de su empleo y ref gerar para su conservaci 10°C). 8) Inoculacién: crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h. h) Incubacién. Minimo absoluto: 48h 2. Recomendada: " 45° ¢ 48 h. 35°C. 24a 24a El medio SF se prepara de acuerdo con la formula de Hajna y Perr organismos coliformes y gramnegativos son inhibidos por la azida que se encuentra en el caldo SF, pero las especies de Streptococcus del grupo D son detectadas por la presencia de crecimiento junto con la fermentacién de la glucosa, lo que da un pH Acido y un cambio de color. Segin Hajna y Perry" el caldo SF es selectivo para el crecimiento de Streptococcus del grupo D tinicamente, cuando es incubado a 45,5°C; otras especies de Streptococcus son inhibidas. Facklan y Moody" hallaron que con la incubacién a 35° C algunas cepas del grupo D crecian en el caldo SF, lo que no se 74 Pruebas bioquimicas para Ia identificacién de bacterias hubiera producido a 45,5° C como lo sugie- ren Hajna y Perry." Sin embargo, la incuba- cién a 45° C no és factible en un laboratorio comin, ya que la mayoria de las incubadoras tienen una temperatura entre 35 y 37° C. Por lo tanto, la presencia de una reaccidn acida y un cambio de color en el caldo SF es prueba presuntiva "para la identificacién de las espe- cies de Streptococcus del grupo D. La prueba SF no es por si sola suficiente para determi- nar presuntivamente la presencia de todos los estreptococos del grupo D y junto con ella se deberan efectuar otras (crecimi cINa al 65 %, crecimiento en bilis 40%, crec miento en caldo FK, crecimiento a 10 y 45° C, ¥ producckin de cide a parti de la esculina). ‘Algunas especies del grupo D se desarrollan en caldo SE, mientras que todas las especies de Streptococcus del grupo D muestran creci miento en caldo KF 2. Caldo estreptocdcico fecal de Kenner, pH:7,2 (caldo FK) 28" a) Ingredicntes, 1. Peptona (proteosa 3.0 polipeptona) 10 2. Extracto de levadura 7 0 ¢ 3. Cloruro de sodio (CINa) .. . 5 8 4. Glicerofosfato desodio .... Wg 5. Carhonato de sodio (opcional) (NaHCO)) « 0,636 ¢ 6. Maltosa 2g 7. Lactosa s+. 1 8 8. Azida s6dica (NaNs) - o4 g 9. Rojodefenol .. 0,018g o Purpura de bromocresol... 0,015 g. 10, Aguadestilada . 1.000 ml b) Indicadores del pH. 1. Rojo de fenol a) Addo: coloramarillo, pH:6. b) Alcalino: color rojo rosado, pH:7.6. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 7.2; 2) color castatio rojizo. 2, Purpura de bromocresol. a) Acido: color amarillo, pH: 32 b) Alcalino: pH:6.8. ©) Medio no inoculado: 1) pH: 7,2; 2) color purpura. color piirpura, ©. Existen productos en el comercio. Difco. a) Gontiene purpura de bro- mocresol_ como indicador del pH. b) No contiene carbonato de sodio. 2. BBL. a) Contiene rojo de fenol co- mo indicador del pH. b) Contiene carbonato de so- dio. d) Método de preparacion. 1. Pesar las cantidades con exac- titud como se indica en el pros- pecto. Los productos de distin- tos laboratorios pueden var ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada 0 desmineralizada. lentar suavemente hasta diso- lucién 4. Distribuir en tubos, aproxima- damente 4 a 5 ml por tubo. e) Método de esterilizacion 2"? 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 Wi . 15 min. f) Dejar enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservacion (4-10° C), g) Inoculacién: crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24h. h) Incubacién. 5° C, 24 a 48 bh. El caldo estreptocécico FK se prepara de acuerdo éon la férmula de Kenner y col.,!” quienes recomiendian queel pH del medio esté entre 7,2 y 7,3 y que contenga como ingrediente carbonato de sodio. En oposicidn al caldo SF que incorpora un solo hidrato de carbono, glucosa (dextrosa), cl caldo FK emplea dos, maltosa y lactosa, para detectar la capacidad de fermentacion de un organismo. La reaccién_positiva con prueba presuntiva de contaminacién fecal del agua.!7 V. RESULTADOS Las fotografias en colores de los resultados pueden verse en la Figura 9-1 (Apéndice 1). VI. INTERPRETACIONES Caldo SE. 1. Positiva. a) Color castafio amarillento. 1. Crecimiento (turbiedad). 2. Fermentacién del hidrato de carbono. b) Especies de Streptococcus del gru- po D (enterococos). S. faecalis S. faecalis var. zymogens. S. faecalis var. liquefaciens S. faecium. S. faecium var. casselifavus. S.durans (S. faecium var. du- rans.). Ook eNe 2. Negativa. a) Color ptirpura 1, No se observa crecimiento, 2. El hidrato de carbono no es fermentado. b) Especies de Streptococcus del grupo D, no enterococos. 1. Streptococcus bovis. 2. Streptococcus equinus. 3. Streptococcus avium. ©) Especies de Streptococcus que no pertenecen al grupo D. d) Otras bacterias. B) Caldo FK. 1, Positiva: indicador del pH rojo de fenol o purpura de bromocresol. Caldos fecales para enterococos. 75 a) Color amarillo. 1. Crecimiento (turbiedad). 2. Hidrato de carbono fermen- tado. b) Especies de Streptococcus del grupo D, enterococos. S. faecalis, S faecalis var. zymogens S! faecalis var. liquefaciens. S. faecium. S. faecium var. casselifavus. S. durans (S. faecium var. du- rans). oe eee ©) Especies de Streptococcus del grupo D, no enterococes. 1. 8, bois, 2. S. equinus. 3. S. avium, Negativa, a) Indicador del pH rojo de fenol: color castano rojizo. b) Indicador del pH pérpura de bromocresol: color puirpura 1. Crecimiento (turbiedad) 0 no se observa crecimiento. 2. El hidrato de carbono no es fermentado. ©). Especies de Streptococcus que no son del grupo D. d) Owas bacterias, VII. PRECAUCIONES A) Generales. 1 Antes de inocular un caldo SF 0 FK habra que asegurarse que el organis- mo es un Streptococcus. Todas las espe- cies de Streptococcus son catalasa nega- tivos y son cocos grampositivos di puestos en cadenas, pares o aislada- mente. Las especies de Streptococcus del grupo D pueden mostrar hemolisis a, Bo y, en agar sangre de carnero al 5 %. A menudo resulta dificil diferenciar los a-Streptococcus del S$, pneumoniae por su morfologia de colonia o su morfologia gram. Si el organismo es catalasa negativo, tiene cocos grampo- sitivos dispuestos en cadenas, pares 0 aisladamente, y es insoluble en bilis y/o resistente a la optoquina, es casi Seguro que se trata de una especie de Streptococcus que no es el S. pmeu- moniae. Kenner y col.!7 consideran que los estreptococos fecales incluyen alos enterococos del grupo D (especies de Streptococcus) asi como al S. bovis, S. mits, S. salivarius, y S. equinus; todos ellos dan una reaccién positiva en el medio FK; una reaccién acida con cambio de color del indicador del PH incorporado al medio. Se han utilizado indistintamente los términos “estreptococos fecales”, “en terococos” y estreptococos del grupo D, pero es evidente ahora que no son sindnimos." Los estreptococos del grupo D incluyen especies que son enterococos como otras que no lo son; ambos grupos poseen el antigeno de Lancefield grupo D. Facklam ® recomienda eliminar el término “fecal”, ya que el S. bovis ha causado infecciones humanas y el tér- mino no tiene significado. De las cuatro especies a las que en general se denomina “estreptococos fecales” se conoce actualmente que dos de ellas poseen el antigeno D; de alli que se las clasifique como estreptoco- cos del grupo D (S. bovis y S. equinus). Segiin muchos autores, los entero cocos del grupo D sélo agrupan a cuatro especies 0 biotipos: S. faecalis, S. faecalis var. zymogens, S. faecalis var liquefaciens, y S. durans. Los estudios realizados por Deibel* demuestran que el S. faeculis agrupa a clos especies diferentes: S. faecalis y una nueva especie, S. faecium y el biotipo S. fae- cium var. casselifavns EI S. bovis y el S. equinus poseen el antigeno D pero son clasificados como. especies no enteracécicas.*s!%619202 EI crecimiento en caldo SF, 6,5 % CINa, 40 % bilis, cido de ta esculina, y el aislamiento a 10 y 45°C son los 1, Bailey, R. W., and Seott, B.G Diagnos- tie Microbiology, 2nd ed., St. Louis: C. V. Mosby Company, 1966, pp. 115-116 3. and 311-312 2. BBL Manual of Products and Labora- . Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Divi- tory Procedures, 5th e 76 Pruebas bioquimicas para ia identiticacién de bacterias 0, criterios que se emplean para identifi- car a los enterococos del grupo D (crecimiento) de los estreptococos no enterocécicos (no hay crecimien- to).00n3 20 Puede determinarse presuntivamente la presencia del antigeno del grupo D con la prueba de la esculina biliar; para su confirmacion debe efectuarse Iatipificacién serolégica (Lancefield).” Una ver determinada la presencia del antigeno D, se haran una serie de pruebas para diferenciar entre las especies de Streptococcus enterocécicas y No enterocécicas. B) Caldo FK. El pH del caldo FK debe estar entre 7,2. y 7,3, y no debe usarse si esti por debajo de 7. El periodo de autoclave es de 10 min; evitar el recalentamien- to, ya que ello hace descender el pH, con lo que disminuye también la productividad del medio. Facklam y Moody # observaron en sus estudios que el caldo FK no era un medio conveniente para diferenciar entre los estreptococos del grupo D, dado que otros estreptococos a-hemo- liticos daban una reaccién dcida (posi- ‘a). Asimismo, hallaron que muchas especies de Streptococcus podian desa- rrollarse en el medio FK, pero eran incapaces de producir el ‘icido nece- sario para que se produzca un cambio en el pH. Kenner y col." afirman que otras bacterias son capaces de crecimiento en caldo FK, produciendo turbiedad, aunque se mostraron incapaces de producir acido en proporciones sufi- Gentes como para dar un cambio de color, El medio FK fue elaborado para detectar la contaminacion fecal del agua y no como medio especifico para la’ identificacién presuntiva de. las especies de Streptococcus del grupo D. Junto con la prueba FK deben reali- Zarse otr0s tests. BIBLIOGRAFIA sion of Becton, Dickinson and Com- pany, 1968, pp. 115 and 138, Burrows, W., and Moulder, J. W. Test- book of Microbiology, Vol. I, 19th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Com: pany, 1968, pp, 110-111 4. Cantarow, A.. and Schepartz, B. Bio- 10. nL. 12, 13, 4 chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1962, pp. 263 and 387. . Castor, L. N., and Chance, B. (1959) Photochemical determinations of the ox- idases of bacteria. J. Biol. Chem. 234, 1587. Deibel, R. H. (1964) The group D strepto- cocci, Bacteriol. Rev., 28, 330. Difeo Manual, 9th ed., Detroit, Michi- gan: Difeo Laboratories, 1953, pp. 46- 48 Difco Supplementary Literature, De- troit, Michigan: Difeo Laboratories, 1968, pp. 100 and 229, Dubos, R. J., and Hirsch, J. G. Bacterial and Mycotic Infections of Man, 4th ed., Philadelphia: J. B. Lippincott Com: pany, 1965, pp. 98-94 Facklam, R, R. 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Una enzima adap- tativa o inducida es aquella producida por una bacteria sélo cuando se encuentra. stt sustrato especifico, mientras que una enzima constitutiva se produce tanto en ausencia 0 en presencia del sustrato” La B-galactosidasa es una enzima inducible; su accién es especifica contras las galactosidasas simples.* La forma- cion de una enzima inducida es controlada genéticamente; sin embargo, la presencia de una enzima inducida puede disminuir en las células después de varias generaciones si se suprime el inductor (sustrato).’ También la mutacién de un gene puede hacer que una enzima inducida’ se convierta en enzima constitutiva; el mecanismo de formacién es el mismo.? Cohen y Monod han informado que en los mutantes, la B-galactosa inhibe la formacién de B-galactosidasa_constitutiva. Un. glucdsido €s un compuesto. acetal (RCH < QR" ) formado a partir de un hidrato, de carbono que existe en alguna de sus dos formas: a0 B. En la forma 8 el grupo oxhidrilo (OH) en el carbono mimero I esti por arriba del plano del anillo o a la izquierda en la formula estructural en cadena recta de un hidrato de carbono, mientras que en la forma @ esti debajo del plano oa la derecha en la cadena recta. “CH.OH ¢ HOH Forma a Forma g