TCNICA HISTOLGICA

FIJACIN: Entrecruzamiento proteico

1. Conservar la estructura del tejido.
2. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparacin de finas pelculas
de ste.
3. Destruir bacterias y grmenes que pudieran encontrarse en ellos.
4. Inactivar enzimas para evitar procesos autoliticos de la clula.
Formaldehdo al 5%,
Formol al 10% o Formalina (Solucin de Formaldehdo especial)
- Reacciona con los grupos aminos de las protenas, formando enlaces
transversales y conservando las estructuras de la clula.
*Glutaraldehdo al 2.5%, Tetrxido de Osmio, Lquido de Helly y Fijador de Bouin
Bouin: 75 ml de solucin acuosa saturada de cido pcrico + 25 ml de formol
+ 5 ml de cido actico glacial.
Lquido de Helly: 2.5 g de bicromato de potasio + 5 g de cloruro de mercurio
+ 100 ml de agua + 5 ml de formol.
Cloruro de Mercurio y cido Picrico: precipitan las protenas.
Para Microscopia Electrnica se usan:
Glutaraldehdo al 2.5%, Paraformaldehdo, Tetrxido de Osmio y Permanganato
de Potasio
* Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores
como el formaldehdo, son muy enrgicos en su accin con las protenas.
* Actan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con
el haz de electrones.
* Una solucin de Glutaraldehdo al 2.5% en un tampn a pH 7.4, evita la
violenta desnaturalizacin de las protenas guardando detalles finos de la
clula. Es el ms usado en Microscopia Electrnica.
Regla de Oro para la Fijacin
* Mejor fijacin: menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijacin.
* Tamao de la Muestra (2-3 cm).
DESHIDRATACIN
Se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente
deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etlico o Acetona.
Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solucin de 60%, 70%, 80%, 90%,
96% y 100 % para eliminar el agua. Esto se hace por que si se colocara el
tejido en una solucin al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldra muy
rpido del tejido y se deformara.
ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de una sustancia que es
miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusin a utilizar (en la

mayora de los casos se utiliza como medio de inclusin Parafina lquida). La

sustancia comnmente utilizada es el Xileno o Xilol.
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el
xileno, esto se debe a que cambia su ndice de refraccin. Tambin se
pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lpidos de la clula y por lo cual al
extraerse tambin se extraen las grasas y los lpidos de la clula.
INCLUSIN O IMPREGNACIN
Gelatina y parafina.
Objetivo:
- Distinguir entre s las clulas superpuestas en un tejido y la matriz
extracelular.
- Tener un objeto duro para manejo y corte.
Inclusin infiltrar parafina liquida o cualquier medio de inclusin en estado
lquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.
60 C estufa (30 minutos a 6 horas ).
Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente
ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina.
Formacin del taco.
Los medios de inclusin para Microscopia Electrnica comnmente utilizados
son resinas polimerizadas o epoxi como:
* Epon
* Mikropal
* Araldit
SECCIN O CORTE
grosor entre 3 a 10 micrmetros.
Metodo por congelacin: Cristato.
Para Microscopia Electrnica se requieren cortes ms delgados (denominados
ultrafinos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado
medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE.
Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un dimetro de
3mm.
MONTAJE Y TINCIN
La parafina se elimina en un solvente orgnico, de nuevo se incluyen en Xilol, y
la muestra se rehidrata hacindola pasar por una serie de graduaciones
decrecientes de alcohol etlico hasta llegar a una solucin 100% de agua.
H/E
Los medios de montaje pueden ser miscibles (No deshidratar) o no miscibles en
agua

Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:

* Colorantes que diferencian los componentes cidos y bsicos de la clula.
* Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la
matriz extracelular.
* Sales metlicas que se precipitan en los tejidos y forman depsitos de
metales con ellos.
FUNDAMENTOS QUMICOS DE LA COLORACIN
EOSINA: Colorante cido (accin de anilinas cidas).
HEMATOXILINA: Aunque no es un colorante bsico, posee propiedades muy
semejantes a las anilinas bsicas.
Un COLORANTE BSICO es una molcula de anilina que tiene una o ms
cargas positivas en su porcin coloreadas y su frmula general se
representa: ANILINA+ ClReaccionan con GRUPOS ANINICOS de los componentes texturales, que son
los grupos fosfato de los cidos nucleicos (ADN y RNA), los
grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y los GRUPOS
CARBOXILO de las protenas.
La reaccin de estos grupos vara segn el pH.
Se utiliza un mordiente (Intermediario), entre el componente textural y la
anilina, y es debido a este que la coloracin con hematoxilina se asemeja a la
tincin que produce un colorante bsico. La unin en el complejo TEJIDO
MORDIENTE HEMATOXILINA, no consiste en un simple enlace, y cuando la
Hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece
firmemente adherida. A causa de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos
procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes
cidos.
Los colorantes bsicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el
colorante bsico es seguido por uno cido, porque la anilina bsica tiende a
disociarse del tejido durante los lavados posteriores en soluciones acuosas.
Un COLORANTE CIDO lleva una carga negativa en la porcin coloreada
de la molcula y su frmula general se representa: Na+ ANILINALos colorantes cidos se unen primariamente a los componentes texturales por
medio de enlaces electrostticos de manera similar pero opuesta a la de los
colorantes bsicos. Las anilinas cidas reaccionan con grupos catinicos, como
los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las protenas.
BASFILO: componente del tejido que reaccione con un colorante bsico (o
hematoxilina).
1) Heterocromatina y los Nucleolos del Ncleo por los grupos Fosfato
ionizados.
2) Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.
3) Matriz del Cartlago por grupos Sulfato ionizados.

ACIDFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Son acidofilos:

1) La mayor parte del citoplasma no especializado.
2) Filamentos Citoplasmticos.
3) Fibras extracelulares.
Todos estos debidos a grupos Amino ionizados.
METACROMASIA
Es el fenmeno por el cual un colorante (por ejemplo Azul de Toluidina o la
tionina) cambia de color tras reaccionar con un componente textural.
Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la
molcula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorcin
son diferentes de las propiedades de las molculas individuales. Se interpreta
que la metacromasia refleja gran cantidad de cargas aninicas muy cercanas
unas a otras en el tejido, una situacin prevalerte en la sustancia fundamental
del cartlago y en los grnulos de los mastocitos, el Azul de Toluidina tie a
estos de color prpura.
Los componentes titulares que pueden colorearse metacromticamente,
denominados Cromotropos, son principalmente los glucosaminoglucanos
sulfatados y las nucleoprotenas.
MTODOS BASADOS EN LA REACCIN DE SCHIFF PARA GRUPOS ALDEHDO
El Reactivo de Schiff es la leucofucsina o bisulfato de fucsina. Es incoloro, pero
puede formar un color rojo estable producto de adicin con grupos aldehdo.
Este compuesto se utiliza en combinacin con otros productos qumicos como:
El Mtodo del cido perydico-Schiff (PAS) se emplea para determinar la
presencia de molculas como el glucgeno, glucoprotenas y
glucosaminoglucanos.
Lo que hace es romper la unin de los anillos de las hexosas formando grupos
aldehdo o rompen los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos,
tambin formando grupos aldehdo y hacindolos reaccionar a estos grupos
con el reactivo de Schiff. Tambin sirve para identificar membranas basales y
fibras reticulares.
El Mtodo de Feulgen este es un mtodo especifico para la determinacin
histoqumica del DNA, donde la hidrlisis cido dbil con cloruro de hidrgeno
(HCl) se separan los grupos pricos del DNA. De este modo se abre el anillo de
desoxirribosa, y se forma un grupo aldehdo que reacciona con el reactivo de
Schiff. Se obtiene un color magenta o rojo. No se tie el RNA.
DETERMINACIN HISTOQUIMICA DE LIPIDOS
Luego de la fijacin con formalina se realizan cortes por congelacin, por lo que
se evita extraer los lpidos con los solventes orgnicos.
Para la determinacin histoqumica se emplean muy a menudo los
denominados COLORANTES SUDN. Estos son casi insolubles en agua. El
colorante Sudn se emplea disuelto en un solvente orgnico en el cual los
lpidos sean relativamente insolubles, y en el que tambin el colorante sea slo
parcialmente soluble. Adems, el colorante debe ser ms soluble en lpidos que

en el solvente, puesto que la coloracin tiene lugar porque las molculas del
colorante se distribuyen entre los lpidos y el solvente en relacin con su
solubilidad en ambos. Para evitar la extraccin del colorante y los lpidos, luego
de la coloracin se montan los cortes en medio acuoso.
Los colorantes Sudn tien fuertemente los TRIGLICRIDOS, como por ejemplo:
* ROJO DE SUDN O SUDN III, EN LA COLORACIN DE CLULAS ADIPOSAS.
* EL NEGRO DE SUDN O SUDN IV, SE EMPLEA EN LA COLORACIN DE LAS
VAINAS MIELNICAS DE LAS FIBRAS NERVIOSAS COMPUESTAS POR
LIPOPROTENAS.
Finalmente hay mtodos que utilizan varios colorantes y que colorean
diferentes estructuras tisulares y que desconociendo las bases qumicas en
como se unen con los componentes se denominan Mtodos no especficos,
como el Tricrmico de Mallory.
Tambin puede emplearse una modificacin de la reaccin de PAS
(ocasionalmente denominada Mtodo PA-plata) para la microscopia electrnica.
Luego de la oxidacin con cido perydico se emplea por lo general como
reactivo la metenamina-plata. El producto final de reaccin ser electrodenso.