PCR expresién de proteinas ‘A. Reacciénen cadena de la polimerasa (PCR) @ La PCR es un procedimiento importante de la tecnologia genética que permite que ciertos segmentos del DNA se multipliquen (se ampli- fiquen) sin necesidad de emplear enzimas de testriccién, vectores ni células huésped (véase pag. 258). in embargo, es necesatio conocer la Secuencia de nuclestides del segmento y para ello se requieren dos oligonuclestidos (pri- mers) que formen un hibride con cada una de las cadenas a ambos lados del segmento de DNA que se quiere amplificar, una cantidad su- ficiente de los cuatro desoxinucleésidos-tri- fosfatos y una DNA-polimerasa termoestable especial. Los iniciadores (primers) se sintet zan quimicamente y la polimerasa se afsla a partir de bacterias termoestables, En primer lugar se calienta la mezcla en 3 tudio a aproximadamente 90°C para separar la doble hélice de! DNA en dos cadenas indivi duales (véase a en el recuadro A de la pagina puesta y compirese con la pag. 84). Se la deja enftiar un poco para permitir la hibridacién del primer (b). A partir de este iniciador y por laacci6n de la polimerasa se sintetizan nuevas cadenas complementarias de DNA en ambas direcciones (c). Este ciclo (ciclo 1) se repite con la misma mezcla unas 20 a 30 veces (ciclo 2 y siguientes). El proceso de calentamiento y en- friamiento ciclico est’ a cargo de termostatos computarizados. Después del tercer ciclo se forman cadenas dobles cuya longitud corresponde a la del ini- ciador. Su proporcién se incrementa aproxima- damente al doble con cada ciclo hasta que casi todos los segmentos sintetizados alcanzan la longitud deseada. Electroforesis del DNAC La separacién de fragmentos de DNA por electroforesis es técnicamente més sencilla que Ia electroforesis de proteinas (véase pig. 78), La movilidad de las moléculas en un cam po eléctrico de cierta intensidad depende del tamafio y la forma de esas moléculas y de su carga. A diferencia de las proteinas, en las que estos tres factores varfan, en los dcidos nuclei- cos la telacién entre masa y carga es constante porque todas las unidades de nuclestidos tie- nen una masa similary cada una de ellas posee una carga negativa. Sila electroforesis se reali- za sobre un material de sonorte de malla am- pia que no separe de acuerdo con el tamafio y la forma, la movilidad depende solamente de Ja masa de la molécula, Como material de so- porte con estas propiedades en tecnologia ge- nética se utilizan geles del polisacérido agaro- sa (véase pig. 40). Los geles de agarosa no son demasiado estables y por esa razén se prepa- ran en una cubeta de plastico en la que adop- tan una disposicién horizontal y asi son ut zados para la separacion (véase la parte superior del recuadro B). Para poder visualizar los segmentos separa- dos después de la corrida se introducen los ge les en una solucién de bromuro de etidio. Este compuesto ¢5 un intercalador (véase pag. 254) ‘que iuego de la uni6n con el DNA muestra una fuerte fluorescencia bajo la luz ultravioleta mientras que en solucién acuosa apenas tiene Muorescencia, En la parte inferior de la figura se muestra el resultado de una separacién de dos segmentos amplificados por PCR (carriles 1 y 2). ‘Al comparar sus desplazamientos con el de po- linuclestidos de longitud conocida (cartil 3, pb = pares de bases) se comprueba que el fragmen- to I tiene una longitud aproximada de 800 pb, y ‘que la longitud del fragmento 2 es de 1800 pb. Después de la coloraciGn se pueden recortar las. bandas del gel para extraer de alliel DNA y utli- zatlo a posteriori en otros experimentes. €. Sobreexpresion delas proteinas 0 Para el tratamiento de ciertas enfermeda- des se requieren protefnas cuya cantidad en el organismo es tan pequefia que su aislamiento en grandes cantidades resultaria costoso, Estas proteinas se pueden obtener por sobreexpre- ‘si6na partir de bacterias 0 de células eucarié- ticas, Para ello se aisia el gen en cuestion del DNA y se lo clona como se describié en Ia pa- gina 258 para obtener un plismido de expre- sin. Ademas del gen este plismico debe con- tener segmentos de DNA que permitan su replicacin y la transcripcién del gen en la cé- Tula huésped. Después de la transformacién y la multiplicacién en células huésped adecua- das se desencadena por inducci6n una eficaz transcripci6n del gen. Luego la traduccién del RNAm formado en la célula huésped permite obtener la proteina deseada en grandes canti dades. De esta manera se producen la insulina humana (véase pig. 76), activadores del plas- mindgeno para la disolucién de coagulos san- uineos (véase pg. 292) y la hormona del cre- Cimiento somatotrofina, entre otras sustancias.[A Reacciénen cadena de a polimerasa (PCR) — 2 Calentar b Habriear ciclo _hidsioropime—— CI Sintesisde © nov (OMA, | poltnerasa) 9 2 Bt [— B. Electroforesis del DNA Cubeta de electroforesis, Muestra = Corriente pr Hac, Bro N= pom Sy 1 2 3 [— C.Sobreexpresién de las proteinas Sto de |, Genquesevaa cela) HBosomes _SxPresor Promotor Inaucible Puntode Genpara ls Origen dela Feststenia alos fepieacon ‘nuibiaticos Plsmido de expresion Proteine Purficackin sis sobre: dels dels expresada proteins SilaB. Diagnéstico dela anemia de cétulas, 0 Bak erate 9; $ 1. De lasalteraciones del metabolismo pp A Tpieacién det NA. [ falciformes mediante RFLP ‘STR, por ejemplo DNA TCIATCTGTCTG eit ett eee f 1200p fn el »_[eainccn} Poors, ( Gages cals a t 01 ph PF fltione ar secetalpaariptiad | gsc : ap uy cooee =] Mutacién ule — 2)—— 1 normal (AjA) = 2 heterocigota (WS) fob 12 3.) 3 homocigota (§/8) ‘Ampliicado |) frcgmeias C.ldentiicacionde virus RNA mediante RT-PCR (fecmncoumen INA Hie DNA DNA: | WWidoss ds" Ampliicado —tsténdares, pir Nielos vs ee a co SS a oct) V/V rr | _ Locus2 | | @) P3 -— 44___. le — ———— Locus 3 I Golde ara 35-—_——. mossy - eelteseeee THamciptoss ONKpelimersa [- 8 Terapingénica —— ag, Vector viralcon Receptor Vector vial Strroral especie conDna extrana Ja tumoral) DNA 2. Delos tumores