Aislamiento Thiobacillus ferrooxidans por método directo e influencia del pH en los cultivos y lixiviacion bacterial PERG Seo Galen re) FREDDY BELTRAN ROBLES RESUMEN La Biohidrometalurgia hace uso de bacterias, en procesos de pretratamiento de minerales, extraccion dé metales, y Fe(OH), + H,As0, Mecanismos de las reacciones: Bacterias 2FoASS + 61/2 0, + 3H,0___, 2H,As0, + 2FeSO, Bacterias 2FeSO, + H,SO, + 1/20, >. Fe, (SO), + H,0 ‘FASS + Fe (60), + AHO) +60, ‘> BHAS0 + 4F0S0, + H,50, 2H,ASO, + Fe, (S0,), --t» BFeAsO, + 3H,SO, Eletecto cataltico de las bacteriasesté basadoen|a oxidacién del Fe* por el Th. Th, Fe 4Fo + 0, + 4H . sy» AF + 2H,0 Laoxidacién del Fe" es una reaccién que consume dcido, yes sucedida por la hidrélisis del Fe"? Fo"? +H,0........p FOOH"? + Ht FoOH'? + HO > Fe(OH), +H Fe (OH),, +H,0 ___». Fe (OH), + H* Los precipitados de Fe (Il), obstaculizan elcontacto entrela ‘superficie del mineral y la solucion lixiviante, estos precipitados también retienen a las bacteria, de esta manera se reduce ol ‘ndmero de bacterias que pueden activamente tomar parte en la lxiviacién. La formacién de insolubles puede ser efectivamente ‘revenidos manteniando bajo el pH de la solucion. El minimo valor de pH en el que tiene un desarrollo activo el Th. Fe. es aun valor {de 1.2, pero su periodo de adaptacién es de varios meses". Los precipitados del Fe", inicialmente son amortos y de ‘composicién indefnida. La adiccion de iones férricos a soluciones. ‘4cidas sulforicas forman complejos solubles como, FeSO4+, FeOHSO¢", FeHSO4*, y también productos insolubles como: 3Fe*+K+ 2H,SO, + 6H, yp KF, (SO,), (OH), + 8H* LLajarositade la anteriorférmulageneralmentese encuentra €en los residues lxiviados, es insoluble en dcido sulfrico ©. PARTE EXPERIMENTAL Para la parte experimental, se utiizaron aguas écidas de mina del Cerro Rico de Potosi, sector Unificada, delas siguientes caracteristicas fisico quimicas: Color: Naranja ler: Inodoro pH: 22t Potencial : 285 mv. Sélidos en suspension: No aprociables Temperatura enorigen : 22°C TemperaturaLaPaz : 17°C Conteo bacterial: 90 baciml (NMP) Andiss quimico : Ag Pr 2530 mgr Gu: 295.20 grit Fe: 138 git Asi <0.001 — Imgrft 0.001 mgr cuLTivos Se tomé como inécua inicial las aguas cides de la mina Uniicada del Cerro Fico de Potos. Estas aguas dcidastianen come promadio 90 bactorias/l; on la finalidad de obtener un mayor numero de, ismos para poder indentiicaros,y seleccionarios de acuerdo al medio de tculivo a utilzarse, se procedis a realizar dos culivos on medio, liquido, en medio Touvinen (TK) y en medio Sillverman (8K), que ‘contienion un medio nutrients y una fuente de energia, sal basicas para el dosarrolo do la bactarias forruginosas, prosartes ‘en las aguas écidas de mina y on aguas de drenajo. MEDIOS LiquIDOS ‘Se esterlizé ol materia de virio asicomolatuente nutriente ‘en un Autoclave a 10 atmyy a 120°C de temperatura por ellapso de 15 minutos, la fuente de energia se esteriiz6 mediante fitracién ‘amicrébica en membrana Milipore de 0.20 um. Se mezelan ambas soluciones a una temperatura de 50°C. Las pruebas se realizaron en frascos Erlenmeyer de 250cc cconteniendo 200cc de culvo, Se inoculs en relacion 100:1 de la pact Los Erlenmeyers fueron incubados en bafo Maria a 28°C, luzrefleladayunceudalde airehimedode de oxigeno al cutvo y proporcionar agitacién), Las pérdidas de agua por evaporacién fueron determinadas mediante peso de los Erlenmeyers antes de cada control. El ‘evaporada fue reemplazada por la adiccién de agua destilada yacidulada. Los volmenes de las muestras tomadas para la determinacién de Fe y pH, fueron compensados con el mismo volumen del medio correspondiente. Durante el periodo de adaptacién de los cultivos, se observe {ue existia mayor actividad bacterial (observacion visual mediante ‘microscopio), menor tiempo de oxidacién del Fe"? a Fe" y mayor incremento del pH, en el medio TK que en el medio 9K. Por estas razones s6 opté por trabajar on lo sucesivo s6io con medio TK. ‘A pattic de este primer cultivo se realizaron seis cultivos ‘sucesivos para poder aislar el género Th. Fe., para esto es hicieron ‘traspasos de un cultivo a otro en una dilucién 100:1 obteniéndoso unadliuciénde 10%, loquesegin iblogati asogura.lalsiamierto fal género en estu ‘MEDIOS SOLIDOS Pararealizarelcutivo en medio sélido setomé comainéculo para las siembras, el sexto cuttivo en medio liquide durante la fase de desarrollo (fase log). Se esteriliz6 las cajas Petri, l medio nutriente, y ol soporte sblido en autociave, la fuente de energia se esteriiz6 mediante fitracién amicrébica, las tres soluciones se mazclan a 50°C, se plaquean las cajas Petr, y se refrigeran durante 24 horas antes de 84 Uso. Las siembras se realizaron de la siguiente forma, tres en estrias (SE) y tres en hexagonal (SH), se incubaron a36°C. Se hizo tun control visual diario, de la formacién y el crecimiento de las colonias. ‘los 21 dias de la siembra, se obtuvioron gran cantidad de ‘colonias aglomeradas, que dificult la identificacion de las colonias aisladas, razén por lo que se realizaron repiques on solucién suspendida, en colonia deca y en aglomeracion directa. Después de 14 dias, aparecen las colonias singulares {aisladas) en las cajas donde se reaiz6 la siembra utilizando como inéculo la solucién suspendida. Las colonias singulares son luego traspasadas a medio liquido, en las mismas condiciones detalladas anteriormente. Tres dias después se tiene la oxidacién total del Fe press solucion, se fitra el cultivo para obtener un concentrado bacterial, seguardan estas cepas, refrigeradas a 4°C, cuidando mantenerias enun ambientetotalments estérily debidamenteidentificadas, para posteriores pruebas objeto de estudio, Serealizéelconteobactoral, ‘mediante ef método del Nomero Mas Probable. COMPORTAMIENTO DEL pH. Las prusbas de comportamiono dl pt. en los cutios en modi quid, se realzarn para determina’ romeo ctico de recipitacion de especies ferricas insolubles, por el incremento Bi debido als sclvidad quimico-bactenal Para la reaizacion de las pruebas de evolucién del pH, se trabajo con bacoras provenianiag dol soxto cultvo on media liquido, en relacién 100:10, obteniéndose aproximadamente 10° bacterias por militro. ‘So propararon dos cutivos on modioliquido TK, prusbas de evolucién (Prusbas E) y prusbas de control (Pruebas C). Estas pruebas secorrieron por duplicado, midiéndose elpH ydeterminando 1 poreentaje de oxidacion Fe'#iFe™ en perfodos constantes de tiempo. Las pruebas E se dejaron evolucionar libremente, éstas sivieron paradeterminar elpH critic de preciptacién de insolubles, Por ello se. deja precipitar los mismos, permitiendo evaluar oi Comportamiento del pH, durante, y después de la_preciptacién, determinandose el peso y cartidad de Fe contenido en estos precipitados. ‘Apert de la determinacién del pH crtico de precpitacién, se cortieron las pruebas, cuyo objetivo central fue ol de controlar y ‘mantener en solucion losiones Fe, efectuando un esticto control de ‘pH, para evita la prociptacion de ia jerosita y de los hidréxidos. de histo, ajustandolo con deido sultrico 1N, avalores menores al ertco. DISCUSION DE RESULTADOS CULTIVOS EN MEDIO LIQUIDO Las variaciones del pH y ol % de oxidacién (Fe"Fe"), son parémetros que confirman la actividad bacterial, EnelGratico 1, bservamos qualos comportamientos delos dos cuttivos son diferentes, el medio TK tisne un pH ascendant, partiendo de 1.58 hasta alcanzar 2.10 en ol 14avo dia, donde se lcanza ol 100% de oxidacién del Fe. Por otro lado la curva del cutive en medio 9K, muestra un comportamiento de descenso ‘durante los primeros 9 dias, y apartr de éste un ascenso hasta un valor de 2.48 en 21 dias, alcanzando la oxidacién total del Fe**. ‘ApH 2.03 on ol modio TK y a pH 2.25 en ol medio 9K, se produjeron precipitados de Fo insolubles en acido sulfirico. Las ourvas de oxidacién vs. tiempo (Grética 2), y la cuva tipica de crecimiento bacterial (N# de bacterias/mi vs. tiempo), presentan semejanza entre ambas, pues se pueden identificar hitidamente las etapas de adaptacién (fase lag) y de desarrollo (fase log), de esto se deduce que ha oxistido una actividad bacterial ‘que cataliza las reacciones de oxidacién dal Fer? Con la realizacién del primer cultivo se elevé el nimero de ias, (Conteo por el método del NMP), procediendo luego a \entticaras median ncn Gram, estas observaciones de las ‘caractaristicas morfolégicas, nos permiten deducir la presencia del ‘g6nero Thiobacilus. Por los resultados obtenidos en io sucesivo so utlizé al ‘medio TK, pues la velocidad de respuesta en éste fue més répida. Paraclaislamiontode labacteria, se hace necesariorealizar varias diluciones de los cultivos del género en estudio. Por esta razén se realizaron 6 3s sucesivos en relacién 100-10, ‘tomando como inéculo para el segundo cutive el anterior cultvo, y asi sucesivament Los resuttados obtenidos en los cultives sucesivos de silane, se musiran en Gri 3 conde ng beara qua 8 ‘medida que se realizan los traspasos la fase nde bactrias va disminyyendo consderablemente, con respaco al Cultivo anterior, sto demuestra que las bacterias se han adaptado y seleccionado con mayor faciidad al medio consecuentemente se ‘tone una fase de desarrollo mayor (fase log.) que facilta tener una elevada densidad bacterial Los resultados muestran como era de esperar, que en el ‘Ghimo traspaso (6° cultivo) la oxidacién total go alcanzé en menor tiempo, esto significa que précticamonta ha desaparecido la fase lag, ya quo ee foga a una oxidacion total del Fe" on tan solo dos Realizados los 6 cuttivos, se alcanz6 una dilusién de 10*, lo ue tebricamente permite un aislamianto indirecto del género en estudio. Sin embargo es probable que en los cuttivos en medios liguidos, exista contaminacién con otros organismos heterotroficos aepeciaimente hongos, existertes on ol medio ambonte y quo se desarrollan en medios acidos, por ello se realizaron cuttivos en ‘medio s6iido que permiten obtener colonias aisladas. CULTIVOS MEDIO SOLIDO ‘Se realzaron cuitivos en mecios sido (Agar en medio ferroso), logréndose por primera vez en Bolivia, aisar a la bacteria Thiobacilus Los primeros resultados obtenidos en medio agarosofueron positivos ya que se obtuvieron gran cantidad de colonias. ‘tres dias de realizada la siombra, se observé lapresencia de pequafisimas colonias amarilias brilantes sobre las siombras éstrfas (SE). En las siembras en hexagonal (SE) no se observa, ningtin desarrollo. En las prusbas (SE), las colonias se van aglomerando y forman puntos apreciables a simple vista, que luego de 15 dias “q wageforman grandes zonasde color marrén debido ala aglomeracién de ‘grandes cantidades de colonias hacia el borde de la caja. En las pruebas (SH), la evolucién es més lenta, las colonias ‘empiezan a ser visibies a pantr del quinto dia, alcanzandose el desarrollo total a los 20 dias. En las pruebas de repique al cabo de 3 dias se observ6 la presencia hacia el centro de las cajas Petr, de colonias marrones de gran tamafo (de 1cm. de didmetro aproximadamente), estas colonias a medida que transcurre el tiempo, van tomando una coloracion més oscura, tienen forma redonda, abultada y brilante. Después de catorce dias, se tienen colonias singulares (aistadas), que se encuentran en la superficie del gel hacia la dima ‘siria, son colonias de color marrén. Las colonias singulares son luego sembrados en medio liquido, con el objeto de conservar a las bacterias vivas y obtener luna mayor densidad bacterial de cepas aisladas, ya que el Agar después de 25 dias se reseca y por lo tanto la colonias al no tener ‘sustento nutftive mueren, ademas se facilta la conservacion y ‘almacenamiento de las bacterias aisladas, permitiondo utlizarias ‘en cualquier instante sin necesidad de reclizar todo el trabajo de Ccutivo y aislamiento, esto significa un importante ahorro de tiempo fen cualquier trabajo de investigacién y aplicacién, EFECTO DEL pH La presencia de precipitados en los cultivos liquidos y en la lixiviacién bacterial, se deben esencialmente a que el sulfato lérrico producto de la oxidacion, reacciona esponténeamente con ol agua para producirhidr6xido férrico. Numerosos complejos de hidrOxKdo {érrico pueden producirse, siendo uno de los mas frecuentes la jatosita, que precipita en el medio. Los complejosde estettipo tienen una aocin de tampén alectando las reacciones adicionales del iro. Elbalance general de las teacciones quimicas que ocurren, 5 40. e 20. 20. 10 °. TRatee ee Teo (o1A8) ‘ARCO 4 PRUEBAS potas basen ans 10 100 %° %. % w. iz z 70 it [see 3 © 5% § 50. 4 4 a 4°. Eso F 20 20 20. a 10, 0,