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LABORATORIO DE BIORREACTORES
MANUAL DE PRCTICAS
PRESENTACIN
La Biotecnologa, concebida como la aplicacin del conocimiento para la obtencin de
productos y servicios mediante el uso de seres vivos o enzimas, hace necesaria la
participacin de profesionales que posean capacidades y habilidades para la operacin
y control de biorreactores. En ellos es en donde los seres vivos o enzimas llevan a cabo
las transformaciones de materias primas a productos.
Este manual consta de diez prcticas de laboratorio. Cada prctica tiene una
introduccin, objetivos e instrucciones paso a paso para que el alumno alcance los
objetivos planteados. Tambin, tiene instrucciones para la recopilacin, anlisis y
discusin de los resultados obtenidos, as como para que el alumno haga un reporte
escrito del trabajo prctico realizado.
La prctica 1 est diseada para que los alumnos conozcan y distingan los diferentes
tipos de biorreactores que existen en la industria biotecnolgica. La prctica 2 tiene el
propsito de que los alumnos manejen sistemas de medicin y control de variables de
La apropiacin del conocimiento prctico de este curso por parte de los alumnos, les
facilitar la comprensin y el anlisis de los contenidos temticos de la asignatura de
Ingeniera de Biorreactores, situada un nivel adelante del Laboratorio de Biorreactores
en el plan de estudios de la carrera de Ingeniera Biotecnolgica.
CONTENIDO
PRCTICA 1
Prctica 1. Presentacin de biorreactores diversos
Presentacin de
biorreactores
diversos
INTRODUCCIN
Cualquier proceso biotecnolgico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las
siguientes escalas de operacin: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden
temporal).
Cada escala tiene sus propias caractersticas y objetivos, mismos que sern tratados en
otra asignatura (Ingeniera de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores,
habr que hacer la distincin entre tamaos, forma de operacin y configuracin
geomtrica.
Entre las caractersticas que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:
1. Calidad de mezclado; incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que
favorezcan tanto la distribucin de la materia prima en el biorreactor como su
conversin a producto.
2. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con
economa aceptable.
3. Factibilidad tcnica y econmica en la construccin de unidades de gran
volumen.
4. Bajos costos de operacin y mantenimiento.
5. Operacin asptica.
Agitado
Biorreactores
Columna
Propelas
Circulacin
Airlift
Jet
Biorreactores agitados
Biorreactores de columna
Biorreactores de circulacin
OBJETIVOS
Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniera
Biotecnolgica se relaciona con el diseo, construccin, implementacin, operacin y
mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente prctica se propone como
objetivo que el alumno identificar y describir los diferentes tipos de biorreactores y
sus partes accesorias. As mismo, describir de que forma se operan, se controlan,
esterilizan, cargan y descargan, etc.
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS Y DISCUSIN
BIBLIOGRAFA
1. Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. 1983. Bioreactors for submerged culture. Adv.
Biotech. Process. 1: 1-30.
2. Charles, M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends in
Biotech. 3: 80-84.
3. Schegerl, K. 1982. New biorreactors for aerobic processes. Int. Chem. Eng. 22:
591-610.
4. Schegerl,
K.
1985.
Nonmechanical
agitated
biorreactor
systems.
En:
PRCTICA 2
Instrumentacin para el
seguimiento y control
de la biorreaccin
INTRODUCCIN
Los biorreactores estn equipados con distintos instrumentos. Estos se utilizan para
facilitar el registro y anlisis de variables de operacin y de parmetros especficos que
sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de
operacin de la biorreaccin con fines de maximizar la productividad y garantizar el
xito de la biorreaccin. La instrumentacin ha sido definida como una ventana al
proceso y su objetivo es mantener al mnimo la diferencia entre el valor medido y un
valor deseado. El control de un parmetro particular se lleva a cabo a travs de un
sistema que consta de un sensor (o electrodo), un medidor y un controlador: el sensor
es un dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir,
en otra que facilita su medida. El medidor recibe la medida del valor de la propiedad que
emite el sensor. El controlador compara dicha medida con un valor fijo. Del resultado de
la comparacin, el controlador toma una decisin enviando una seal (generalmente
Vzquez Gurrola, Orozco lvarez, Ordaz Contreras, Garca Salas
10
elctrica) a algn dispositivo que ajustar el valor medido de la propiedad hasta el valor
predeterminado o de control (set point). La seal implica usualmente la modificacin
del estado de una vlvula, el encendido o apagado de una bomba dosificadora, la
modificacin de la velocidad de giro de un motor de algn equipo, etc. Si, por ejemplo,
se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el estado de una
vlvula, se requerir de un transductor y de un actuador. El transductor es un
dispositivo que convierte un tipo de energa en otro tipo de energa, mientras que los
actuadores son dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energa elctrica,
gaseosa o lquida. Existen tres tipos de actuadores:
1. Hidrulicos
2. Neumticos
3. Elctricos
Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo
con la masa lquida o slida de fermentacin), en cuyo caso se dice que estn en
lnea, si no estn conectados directamente al biorreactor entonces se dice que estn
fuera de lnea.
11
Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos, es fcil concluir que los sensores en
lnea son mucho ms adecuados para controlar el valor de una propiedad en una
biorreaccin.
1. Temperatura
2. pH
3. Flujo de aire
4. Presin
5. Intensidad de agitacin
6. Nivel o Volumen de medio de cultivo
7. Espuma
8. Concentracin de oxgeno disuelto
9. Concentracin celular
10.Concentracin de sustrato
11.Concentracin de producto
12
Medicin y control de pH
El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H+) en una disolucin acuosa
y est definida por la siguiente ecuacin:
pH = - log10 [H+]
(1)
Para la medicin y control del valor de pH, se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en
forma asptica, en el biorreactor y que est directamente en contacto con el caldo de
fermentacin. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un
medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set
Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medicin.
13
Como el valor del pH del caldo de fermentacin puede cambiar despus de ser
esterilizado, por causas del drstico tratamiento trmico, se recomienda recalibrar el
electrodo. Para esto, se hace necesario tomar aspticamente una muestra del caldo de
fermentacin y medirle, con un medidor y un electrodo fuera de lnea, su valor de pH.
En caso de que el valor que muestre el electrodo en lnea sea distinto del que marca
el fuera de lnea, se ajustar el valor de aqul con el equipo de medicin empleado en
el biorreactor.
Vzquez Gurrola, Orozco lvarez, Ordaz Contreras, Garca Salas
14
Una vez realizado todo lo anterior, se est en posibilidades de medir y controlar el valor
del pH de una biorreaccin en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al
valor del Set Point, entonces el controlador emitir una seal elctrica con la cual se
podr activar alguna bomba para adicionar cido o lcali, dependiendo de la
diferencia entre el valor medido y el Set Point.
ELEMENTO
DE CONTROL
E = VM -VSP
VSP
CONTROLADOR
COMPARADOR
BIORREACTOR
MEDICION
VM
Aunque no existe un consenso para establecer cual de todas las variables de operacin
es la ms importante de mantener y controlar en una biorreaccin, la temperatura se
cuenta entre las ms importantes. El control, la medicin precisa y adecuada de la
temperatura resultan esenciales para la biorreaccin. Un sistema de medicin de la
15
temperatura debe presentar una precisin menor a los 0.5 C respecto a la temperatura
de medicin y en muchos casos, una variacin de 1 a 1.5 C durante la biorreaccin,
puede dar lugar a grandes prdidas econmicas en el bioproceso, por lo que se
recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre
0.5 y 1.5 C. Generalmente, la temperatura en un bioproceso se mide con sensores
RTD (resistance temperature devices) ya que estos son los que presentan las mejores
caractersticas antes mencionadas. Consta de un elemento metlico cuya resistencia
elctrica cambia con la temperatura, hecho en el que se basa la medicin de la misma.
Generalmente se utiliza platino por sus mejores caractersticas lineales de cambio
respecto a la temperatura, aunque tambin se utiliza nquel, cobre y aleaciones de
nquel. Una desventaja es su precio moderamente alto.
Para sensores RTD la relacin entre la temperatura y la resistencia est descrita por la
siguiente ecuacin:
RT
R0
T
T
= 1 + T
1
100 100
(2)
Ecuacin en la que:
RT = resistencia a la temperatura T [=]
R0 = resistencia a 0C [=]
16
T = temperatura [=] C
= una constante (1.48 1.51 para Platino)
El oxgeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del
caldo de biorreaccin. Una parte del oxgeno contenido en el aire se disuelve en el
caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxgeno disuelto es el que
utilizarn los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformacin de
la materia prima a producto. Por esta razn es importante distinguir entre oxgeno
disuelto y oxgeno en el gas.
el
oxgeno
difunde
travs
de
una
membrana
semipermeable
Ctodo:
O2 + 2H2O + 4e-
4OH-
nodo:
4Ag + 4Cl-
4AgCl + 4e-
17
18
19
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
Equipo:
Biorreactor tipo tanque agitado
Instrumentacin.
Sistema de medicin y control de temperatura
Sistema de medicin y control de pH
Sistema de medicin y control de oxgeno disuelto
Sistema de medicin y control de espuma
20
4. Controlador
5. Bombas de adicin de cido o lcali
Materiales
Reactivos
21
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Actividades previas
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Consultar los manuales de operacin tanto del biorreactor como de los equipos
de medicin y control que se utilizarn.
3. Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medicin y control de temperatura,
pH, oxgeno disuelto y espuma.
4. Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solucin protica o de
detergente (su profesor se lo indicar).
5. Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxgeno disuelto.
6. Establecer las condiciones de operacin (Todo lo anterior auxiliado por sus
instructores).
El equipo de medicin y control debe tener acoplado el sistema de adicin de lcali que
consta de una bomba peristltica capaz de agregar al biorreactor una disolucin de
NaOH 0.5 N, de acuerdo a la seal del controlador.
22
23
24
Elija una velocidad de agitacin y un flujo de aire que tengan la ms alta formacin de
espuma, con objeto de que el controlador enve la seal de adicin de antiespumante.
Anote y discuta sus observaciones.
Elabore diagramas (en autocad) en los que se observen los sistemas de medicin y
control de pH, temperatura, oxgeno disuelto y espuma en un biorreactor.
Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a las
necesidades de instrumentacin y control en las biorreacciones.
BIBLIOGRAFA
1. Aiba, S., Humphrey, A.E., Millis N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition
Academic.
2. Harper, E.H. 2000. El ABC de la instrumentacin en el control de procesos
industriales. Limusa. 1 Edicin. Mxico.
3. Lydersen, B.K., D'Elia N. A., Kim, L. N. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc., USA.
4. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.
25
PRCTICA 3
Servicios Auxiliares
INTRODUCCIN
Aire:
El aire tiene varios usos en un biorreactor, entre ellos por orden de importancia
mencionaremos:
1. Proveer oxgeno al medio de cultivo.
2. Como fuerza motriz para la transferencia de momento y masa.
3. Como fuerza motriz para transferir lquidos de un recipiente a otro.
Vzquez Gurrola, Orozco lvarez, Ordaz Contreras, Garca Salas
26
La eleccin del tipo de aire a utilizar depender del uso que se haga de l. El aire debe
ser seco y libre de aceite. Adems, cuando se requiera que el proceso o producto no se
afecte por la introduccin de microorganismos ajenos, contenidos en la corriente de
aire, ser necesario que ste sea estril.
27
Los compresores de aire para plantas biotecnolgicas son generalmente de dos tipos:
rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo. Tambin existen los compresores
de tipo centrfugo para grandes volmenes de aire a bajas presiones. El aire es tomado
directamente de la atmsfera. Independientemente del tipo, preferentemente debern
ser especificados como libres de aceite.
Adems del aire comprimido algunos gases comprimidos tambin tienen aplicaciones
en biorreactores. Los ms comunes son nitrgeno y oxgeno puros: el nitrgeno para la
formacin de atmsferas inertes, mientras que el oxgeno se usa para enriquecer el aire
y alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxgeno en el biorreactor. Estos
gases son generalmente suministrados en cilindros a una presin mayor que la
atmosfrica de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubera de
distribucin y suministro debe cumplir con las mismas caractersticas que la del aire.
Vapor:
siguientes razones:
28
29
El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo (ver tabla 1)
para proteger los equipos contra la incrustacin, la corrosin y otras complicaciones.
Por eso es necesario acoplar a sta un sistema de acondicionamiento previo del agua
que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.
El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catinica depositada
sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva
a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la
dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene
30
cero
cero
Sulfitos
50 100 ppm
pH
10.5 a 11.5
Slidos en suspensin
cero
Slidos disueltos
Agua de enfriamiento:
El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la
temperatura del caldo de fermentacin en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del
agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la
Vzquez Gurrola, Orozco lvarez, Ordaz Contreras, Garca Salas
31
biorreaccin, ni con las superficies en contacto con stos; sino que circula a travs de
las chaquetas o serpentines segn el diseo del biorreactor.
la
32
Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y
del rea de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero
no requiere ningn tratamiento adicional.
Energa elctrica:
Esto se logra a travs de lneas de alambrado que unen el generador con el punto
donde se necesita la energa conectando todos los componentes y que se dividen en
secciones segn el servicio y el rea dando lugar a los circuitos.
33
tpica
para
motores
elctricos
dems
equipos
accionados
Corriente.- La corriente puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC) que es
peridica con pequeas oscilaciones, desde un valor mximo en un sentido hasta el
mismo valor pero en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y
la corriente continua o directa (DC CC) que proporciona un valor constante todo el
tiempo, como la producida por dnamos, pilas y acumuladores.
Equipo elctrico para reas peligrosas.- Cuando las materias primas o productos de
la biorreaccin son potencialmente peligrosos, es decir que emiten a la atmsfera
grandes cantidades de partculas muy pequeas que pueden penetrar hacia los
circuitos elctricos e iniciar una chispa (p.ej. polvos, solventes, etc), tanto el equipo
elctrico como los transformadores, mecanismos de distribucin y motores deben ser
especificados a prueba de explosin.
34
OBJETIVOS
PROCEDIMIENTO
Para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno buscar, en todas las fuentes
posibles, informacin sobre los tipos de sistemas de compresin de aire, generacin de
35
2.
Se mostrar a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta
piloto y los laboratorios, se les pedir que identifiquen y describan sus
componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la
literatura.
3.
4.
Los alumnos identificarn las lneas de agua, vapor, aire y electricidad de la planta
piloto, observando su ruta y registrando sus caractersticas: (materiales,
aislamiento, dimetros, color, etc.), se har lo mismo en el laboratorio de
biorreactores indicando la clasificacin de colores en caso que la haya.
Los
alumnos realizarn un esquema tipo lay-out de la planta piloto indicando las rutas
de estos servicios hasta los biorreactores que se utilizarn en prcticas
posteriores.
5.
36
RESULTADOS Y DISCUSIN
El alumno realizar un informe de las actividades desarrolladas que deber contener los
siguientes puntos:
Introduccin, objetivo, tipo y descripcin de caldera, tipo y descripcin de compresores,
diagrama de flujo de servicios, diagrama de ruta de servicios, observaciones sobre cada
una de las actividades realizadas, conclusiones generales sobre el desarrollo de la
prctica y bibliografa.
BIBLIOGRAFA
37
PRCTICA 4
Tiempo de mezclado en
biorreactores
INTRODUCCIN
Tanque agitado
En los biorreactores de tanque agitado, la agitacin del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante las dos formas siguientes:
1. Por el movimiento de dispositivos mecnicos tales como impulsores de tipo
turbina o de propelas.
38
Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones
de inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxgeno o de algn otro nutriente,
gradientes importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en lo obtencin de
bajas productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de
las variables de operacin sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el
biorreactor.
Columna
39
El elemento estructural a travs del cual tiene lugar la dispersin del gas se llama
dispositivo de dispersin primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser
redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersin secundaria. En las
columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa, el aire se
introduce a travs de dispositivo de dispersin primaria, tal como un tubo perforado, un
plato perforado o un plato sinterizado, en donde es dispersado finamente. Tambin, las
burbujas de aire que aumentan de tamao debido a la coalescencia pueden ser
redispersadas al pasar a travs de dispositivos de dispersin secundaria, tales como
mallas o bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores
de columna de burbujas multietapa, la dispersin de aire se lleva a cabo
predominantemente en los dispositivos de dispersin primaria
Airlift
Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos
dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del
lquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersin gas-lquido es
diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la
de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido, es una medida de
la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-lquido en dichas zonas, la cual
es la fuerza motriz para la circulacin del lquido en el biorreactor.
Debido al movimiento del lquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente
subirn ms rpido, disminuyendo la fraccin de gas retenido y la diferencia de presin
hidrosttica. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los
biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por
una distribucin ms uniforme de la fase gaseosa a travs de la seccin transversal de
la zona de flujo ascendente, con un mximo de la fraccin de gas retenido local cerca
de la pared de la zona de flujo ascendente. Tambin, en contraste con las columnas de
burbujas, los airlift muestran velocidades de lquido mucho ms altas. La velocidad del
40
lquido afecta decisivamente todos los parmetros que caracterizan el desempeo del
biorreactor, tales como la fraccin de gas retenido, el tiempo de mezclado y el
desempeo en cuanto a transferencia de masa y calor. En general, la velocidad del
lquido en los biorreactores airlift se determina por la velocidad de aireacin, la
geometra del biorreactor y las propiedades fsicas de la fase lquida.
OBJETIVOS
Tanque agitado
El alumno determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo
diferentes condiciones de aireacin y agitacin.
Columna
El alumno determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de columna de burbujas
bajo diferentes condiciones de aireacin, utilizando dos diferentes tipos de dispersores.
Airlift
El alumno determinar el tiempo de circulacin, el tiempo de mezclado y las fracciones
de gas retenido global, en la zona de flujo ascendente y en la zona de flujo descendente
en un biorreactor airlift bajo diferentes condiciones de aireacin.
41
MATERIALES Y MTODOS
Biorreactores
1. Biorreactor de tanque agitado.
2. Biorreactor de columna de burbujas
3. Biorreactor airlift
Instrumentacion
1. Cronmetros.
2. Rotmetros.
3. Manmetros.
4. Termmetros.
5. Medidor de pH con adquisicin de datos en lnea.
6. Computadora y software para la adquisicin de datos en lnea.
Reactivos
1. Solucin de NaOH 6N.
2. Solucin de HCl 6N.
3. Solucin de azul de bromocresol.
4. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.
Airlift
a) Determinacin del tiempo de circulacin y del tiempo de mezcla
42
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Actividades previas
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Llenar el biorreactor con agua de la llave.
3. Agregar al biorreactor 0.2 ml de la solucin de indicador.
4. Una vez conectado el sistema de medicin de pH a la computadora, calibrar el
electrodo y colocarlo en el biorreactor.
Condiciones de operacin
Tanque agitado
o Las velocidades de agitacin sern: 300, 500 y 700 rpm.
o Para cada velocidad de agitacin, se probarn las siguientes velocidades de
aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Columna
o Velocidades de aireacin: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm
o Tipos de dispersores: tubo perforado y plato poroso.
43
Airlift
o Velocidades de aireacin: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm
o Tipos de tubos de arrastre: 2 dimetros diferentes.
44
Tanque agitado
1. Elaborar grficas de pH en funcin del tiempo.
2. Calcular el tiempo de mezclado.
3. Construir grficas del tiempo de mezcla en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
4. Calcular la potencia de agitacin sin aireacin y con aireacin.
5. Calcular la potencia de aireacin.
6. Obtener las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado
con las variables de operacin empleadas.
Columna
1. Elaborar grficas de pH en funcin del tiempo.
2. Calcular el tiempo de mezclado.
3. Construir grficas del tiempo de mezcla en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
4. Calcular la potencia de aireacin.
5. Obtener las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado
con la velocidad de aireacin (expresada como vvm y vs).
Airlift
1. Elaborar grficas de pH en funcin del tiempo.
2. Calcular el tiempo de circulacin y el tiempo de mezclado.
3. Construir grficas del tiempo de circulacin en funcin de la velocidad de
aireacin (expresada como vvm y vs) y del
4. Elaborar grficas de tiempo de mezclado en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs) para cada tipo de tubo de arrastre.
5. Calcular las fracciones de gas retenido en la zona de flujo ascendente y en la
zona de flujo descendente.
6. Calcular la fraccin de gas retenido global.
45
DISCUSIN Y CONCLUSIONES
Airlift
La discusin deber incluir al menos lo siguiente:
1. Comparacin de los tiempos de circulacin y de mezclado obtenidos en cada
velocidad de aireacin.
2. Comparacin de las fracciones de gas retenido.
3. Comentarios sobre el aspecto de la dispersin gas-lquido.
4. Investigacin sobre la relacin de dimetros entre el tubo de arrastre y el del
biorreactor que ofrece la mnima resistencia al flujo.
46
BIBLIOGRAFA
Tanque agitado
1. Aiba, S., Humphrey A.E., Millis, N.F. 1973. Biochemical engineering, 2nd. Edition
Academic.
2. Hicks, R.W., Gates, L.E. 1976. How to select turbine agitators for dispersing gas into
liquids. Chem. Eng. July 19: 141-148.
3. Moser, A. 1988. Bioprocess technology. Kinetics and reactors. Ed. Springer - Verlag.
4. Wang, D.I. C., Cooney, C L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.
Columna
1. Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. 1983. The size of bubbles generated from
perforated plates. Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523.
2. Schegerl, K. 1982. New bioreactors for aerobic processes. Int. Chem. Engng. 22. 4:
591-610.
3. Schegerl, K., Lucke, J., Oels, U. 1980. Bubble column biorreactors. Adv. In
Biochem. Engng. 45. 7: 1-84.
Airlift
1. Blenke, H. 1985. Biochemical loop reactors. Biotechnology 2, Ed. by Rehm, H. J., y
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2. Joep, J.M. 1988. Gas hold up measurements in bioreactors. Trends in
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3. Weiland, P., Onken, V. 1981. Differences in the behaviour of bubble columns and
airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.
47
PRCTICA 5
Transferencia de oxgeno en
biorreactores agitados y neumticos
INTRODUCCIN
Tanque agitado
48
VTO = k L a (C * C )
(1)
donde:
El kLa es un parmetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere
oxgeno del aire al lquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes mtodos para
determinar la velocidad de transferencia de oxgeno. En esta prctica se combinan dos
de ellos, el de balance de oxgeno o medida directa con el del sulfito. Por lo tanto, se
emplear un sistema fsico aire-agua y no uno biolgico. Un balance de oxgeno del aire
considerando la entrada y la salida del biorreactor es:
7.32 x 10 5
VL
VTO =
Qi Pi y i Qo Po y o
T
T
0
i
(2)
donde:
En esta prctica para que haya una transferencia neta de oxgeno debe haber consumo
del mismo, por lo que como consumidor de oxgeno se emplea sulfito de sodio. En
este caso la reaccin de oxidacin es tan rpida que la concentracin de oxgeno
disuelto en el lquido es cero. La reaccin que se efecta es:
Vzquez Gurrola, Orozco lvarez, Ordaz Contreras, Garca Salas
49
2 Na2SO3 + O2
Cu2+
2Na2SO4
Columna
Este fenmeno conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho
de que una pelcula lquida entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez
ms delgada hasta que eventualmente se rompe.
50
La coalescencia de las burbujas afecta entonces el dimetro de las burbujas. ste junto
con la fraccin de gas retenido determinan el rea superficial de contacto entre las
fases lquida y gaseosa, de acuerdo a la siguiente ecuacin:
a=
6
d b ((1 ))
(3)
donde:
Airlift
El kLa es un parmetro que sirve para conocer la rapidez con la que se transfiere
oxgeno del aire al lquido contenido en un biorreactor. Este coeficiente depende del
grado de coalescencia de las burbujas. Por ejemplo, el kLa empleando una solucin
acuosa con una fuerza inica de I=0.4, es ms grande, por un factor de seis, que el
obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del rea interfacial.
51
OBJETIVO
52
MATERIALES Y MTODOS
Biorreactor
1. Biorreactor de tanque agitado.
2. Biorreactor de columna de burbujeo.
3. Biorreactor airlift
Instrumentos
1. Rotmetros.
2. Analizador de oxgeno en fase gaseosa.
3. Manmetros.
4. Termmetros.
5. Medidor de pH.
Reactivos
1. Na2SO3
2. Almidn en solucin al 1%.
3. HCL 3N
4. NaOH 3N
5. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.
Mtodos
o Determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno: mediante el mtodo
combinado del balance de oxgeno con el del sulfito.
o Determinacin del kLa usando la siguiente ecuacin:
kLa = VTO / C*
o C* se calcula con la ecuacin de la ley de Henry.
o Determinacin de la fraccin de gas retenido global: mtodo de expansin de
gas.
53
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Actividades previas
1. Preparar en el biorreactor una solucin de Na2SO3 0.6N.
2. Adicionar Cu2SO4 a la solucin de sulfito, para tener una concentracin final de
0.25 g/L.
3. Ajustar el pH a 7.6 y mantenerlo constante durante la experimentacin.
Condiciones de operacin
Tanque agitado
o Las velocidades de agitacin sern: 300, 500 y 700 rpm.
o Para cada velocidad de agitacin, se probarn las siguientes velocidades de
aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Columna
o Velocidad de aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 vvm.
Airlift
o Velocidad de aireacin: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 vvm.
o Tipos de tubos de arrastre: de 2 dimetros diferentes.
54
Airlift
1. Medir la diferencia de alturas del agua contenida en los manmetros de presin
diferencial de cada zona del biorreactor,
2. Medir la distancia entre las tomas de presin esttica de la zona de flujo
ascendente y entre las de la zona de flujo descendente.
RESULTADOS
1. Calcular la VTO, el kLa y la fraccin de gas retenido global, para cada condicin
de operacin.
2. Calcular C*.
3. Obtener la correlacin del kLa con la velocidad de aireacin, sta expresada en
vvm y en m/s.
4. Obtener la correlacin del kLa con la fraccin de gas retenido.
DISCUSIN Y CONCLUSIONES
55
BIBLIOGRAFA
Airlift
1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England.
2. Merchuk, J. C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71.
3. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
4. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and
airlift loop reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.
56
PRCTICA 6
Mantenimiento de asepsia en
biorreactores
INTRODUCCIN
57
Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, se deben
proponer desde la etapa de diseo, una geometra interna y arreglos de tuberas, que
eviten la acumulacin de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las
substancias acumuladas pueden propiciar una contaminacin. Tambin, la asepsia se
facilita mediante una limpieza efectiva del biorreactor y tuberas, lo que se alcanza al
especificar materiales de construccin con un acabado que evite el atrapamiento de
partculas slidas con microorganismos. Las partculas slidas eventualmente limitan la
transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la
temperatura de esterilizacin y por lo tanto, dejndolos viables para generar una
contaminacin.
Una vez lavado el biorreactor y las tuberas, el biorreactor se llena con medio de cultivo
para proceder a la esterilizacin. Despus de la esterilizacin, el biorreactor debe
operar aspticamente. Para lograrlo, es necesario el buen funcionamiento del sello
mecnico para mantener una presin positiva que evite la entrada de microorganismos.
Tambin, se requiere el ms alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de
remocin del filtro para la esterilizacin del aire.
Existen diferentes mtodos para probar la integridad de filtros. Uno de ellos es la prueba
de la intrusin del agua. Es una prueba prctica y validada, que se puede considerar
para probar la integridad in situ de los filtros hidrofbicos para la esterilizacin del aire.
Otra prueba es la de mantenimiento de la presin.
58
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
Biorreactor.
1. Biorreactor agitado de 30 L, equipado con prefiltros y filtros hidrofbicos para la
esterilizacin de aire.
Instrumentacin.
1. Cronmetro.
2. Rotmetro.
3. Manmetro.
4. Termmetro.
Reactivos
1. Agua desionizada
2. Isopropanol
El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofbico seco
se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofbica de la membrana porosa
prevendr el flujo del lquido a travs del filtro hasta que se alcanza la presin de la
intrusin. A presiones por debajo de la presin de intrusin ocurre un flujo pequeo pero
59
Presin
Membrana
hidrofbica
Aire
Aire
Agua
Agua
Filtro:
Membrana
hidrofbica
Poro B
Poro A
Carcasa
Unidad de filtracin
60
AB1PFR7PVH4
Presin de prueba
Flujo mximo permisible
2500 mbar
0.33 mL/min
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
61
efectos se haya estabilizado, para que se puedan medir los flujos de agua muy
pequeos que pasan a travs de la membrana.
4. Dejar pasar 10 minutos para que ocurra la estabilizacin tanto del flujo como de
la temperatura.
5. Despus de la estabilizacin, medir el flujo de agua. Esto se puede hacer,
determinando el flujo de aire corriente arriba que es requerido para mantener la
presin constante.
6. Al terminar la prueba, drenar el agua del filtro y de las tubera.
7. Secar el filtro y la tubera.
8. Comparar los resultados de la prueba con los lmites especificados.
9. Si los resultados estn dentro de los lmites especificados, entonces el filtro est
listo para usarse.
1. Mojar la membrana del filtro con una mezcla de isopropanol agua 60:40 (v/v).
2. Instalar el filtro en la carcasa.
3. Presurizar la unidad de filtracin a una determinada presin.
4. Aislar la unidad de filtracin de la fuente de presin y de la tubera corriente bajo.
5. La difusin del gas a travs de la membrana mojada se mide cuantitativamente
como un descenso de la presin despus de un periodo de tiempo especificado.
6. Medir el volumen corriente abajo de la carcasa.
7. Mantener constante la temperatura en el volumen corriente abajo de la carcasa.
8. Verificar que no haya fugas en el sistema de tuberas corriente abajo.
9. Comparar los resultados con los valores publicados de la disminucin de la
presin, los cuales se basan en carcasas estndares con vlvulas corriente
arriba localizadas tan cerca como sea posible de la carcasa del filtro.
10. Si los resultados estn dentro de los lmites especificados, entonces el filtro est
listo para usarse.
62
RESULTADOS
DISCUSIN Y CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
1. Lydersen B.K., Delia N.A., Nelson, K.M.L. 1994. Bioprocess engineering: systems,
equipment and facilities. John Wiley and Sons, Inc. New York.
2. Johnston P.R. 2004. Fluid sterilization by filtration. Interpharm, CRC Press LLC.
3. Jornitz. M.W. 2006. Sterile filtration. Springer-Verlag, Berlin.
63
PRCTICA 7
INTRODUCCIN
Una esterilizacin adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el xito
de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propsito, se emplea cualquier
mtodo capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables.
La tcnica ms comn es la destruccin de los microorganismos contaminantes. El
trmino destruccin, en este caso, significa la prdida de viabilidad del microorganismo.
64
dN
= kN
dt
(1)
N
= kt
No
(2)
N
= exp( kt )
No
(3)
ln
65
(4)
Se propone que una espora resistente NR sufre inactivacin o muerte a un estado final
ND a travs de un intermediario sensible NS.
Se establecen las ecuaciones diferenciales:
dN R
= kR N R
dt
(5)
dN S
= kR N R kS N S
dt
(6)
N kR
exp(k S t ) S exp( k R t )
=
N0 kR kS
k R
(7)
66
E
k = A exp
RT
(8)
No
E
= A exp
dt
N
RT
0
t
TOTAL = ln
(9)
67
2. Mantenimiento de temperatura
3. Descenso de temperatura o enfriamiento.
El perfil temperatura - tiempo durante la fase de calentamiento es funcin de varios
factores, por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea
inyeccin directa de vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta, mediante serpentines
o elctricamente. La tabla 1 muestra las relaciones tiempo temperatura de acuerdo a
la forma de transferencia de calor.
68
TIPO DE
RELACION
TRANSFERENCIA DE
TEMPERATURA-
CALOR
TIEMPO
Adicin de vapor al
at
T = To 1 +
1 + bt
medio
(Hiperblica )
Calentamiento con
ayb
a=
hs
MToC
b=
T =To(1 + at )
a=
dispositivo elctrico
s
M
q
MToC
( lineal )
T = TH 1 + be at
a=
(intercambiador de calor)
( exponencial )
b=
Enfriamiento
T = T 1 + be at
(Intercambiador de calor)
Ua
MC
To TH
TH
Ua
WC
a=
1 e MC
MC
b=
To T
T
69
OBJETIVO
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Material y equipo
1. Fermentador de 12 litros.
2. Cronmetro
3. Cajas de Petri estriles.
4. Pipetas estriles.
5. Frascos de dilucin con agua estril.
6. Agar nutritivo
7. Mechero.
8. Esporas de Bacillus subtilis.
Trabajo experimental
1. Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de
Bacillus subtilis.
2. Establecer la temperatura de esterilizacin.
3. Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilizacin,
en intervalos de un minuto.
4. Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de esterilizacin
(No), al final del perodo de calentamiento (N1), al final del perodo de
mantenimiento (N2), y al final del perodo de enfriamiento (N3).
5. De cada una de las muestras tomadas, se hace una dilucin y se siembran por
duplicado en cajas de Petri utilizando la tcnica de vaciado en placas.
Se
70
MUESTRA
DILUCIN
NO
10-1
10-5
N1
10-1
10-5
N2
10-1
10-3
N3
10-1
10-2
INFORME
Graficar
los
perfiles
para
las
etapas
de
calentamiento,
mantenimiento y enfriamiento.
71
10.Calcular los tiempos del ciclo de esterilizacin para ambas escalas cuando se
usa una temperatura de mantenimiento de 121 C, No = 106 UFC/mL y N = 10-3
. Discutir estos resultados.
72
NOMENCLATURA
- Entalpa relativa al medio. kcal / kg (entalpa del vapor a la temperatura del medio
de cultivo).
k - Constante especfica de velocidad de muerte, min. -1
kR - Constante especfica de inactivacin de esporas resistentes.
ks - Constante especfica de intermediarios sensibles.
M - Masa inicial del medio, kg.
N - Concentracin de microorganismos en el tiempo t
No - Concentracin de microorganismos to
N1 - Concentracin de microorganismos t1
N2 - Concentracin de microorganismos t2
N3 - Concentracin de microorganismos t3
ND -Concentracin de esporas inactivas.
NR -Concentracin de esporas resistentes.
NS - Concentracin de esporas sensibles
q
- Tiempo, min, h.
- Temperatura absoluta K
73
BIBLIOGRAFA
74
PRCTICA 8
Produccin de biomasa en
Cultivo por lote
INTRODUCCIN
Hasta la fecha la gran mayora de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo
en cultivo por lote. Este consiste en agregar al fermentador un medio de cultivo que
contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la
produccin de un metabolito. El medio despus de ser esterilizado y enfriado a la
temperatura de fermentacin, se inocular con el microorganismo para permitir su
desarrollo y produccin del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento
de uno o ms nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentacin, se cosecha la
totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.
75
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
Equipo
1. Autoclave (15 L de capacidad).
2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 litros).
4. Electrodo de pH esterilizable.
5. Medidor controlador de pH.
6. Bombas peristltica (0 a 2 L/h).
7. Placas de calentamiento y agitacin.
8. Espectrofotmetro (rango: visible y UV).
9. Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
10. Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad.).
11. Estufa.
12.Equipo de filtracin con vaco.
76
Microorganismo
Candida utilis
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.
Medios de Cultivo
Cuadro 1. Medios de cultivo
COMPONENTE
MEDIO PARA EL
MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
(g/L)
Glucosa
15.0
15.0
(NH4)2SO4
2.73
1.365
NaH2PO4
1.2637
1.2637
Extracto de levadura
0.990
0.990
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL)
a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inculo).
77
Mtodos analticos
Reactivos:
Procedimiento:
A 1mL del filtrado se le adiciona 1mL del reactivo DNS, se coloca en bao mara a
ebullicin durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua
destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el
espectofotmetro.
78
DESARROLLO EXPERIMENTAL
500 rpm
aireacin
1 vvm
temperatura
35 C
3.8
antiespumante (PPG-10%):
79
D) Procesamiento de muestras.
Las muestras se tratarn bajo el esquema de la figura 1.
(10mL)
Determinacin de conc.
celular por turbidez
MUESTRA
(5mL)
(5mL)
Filtracin al vaco
Filtrado
Paquete celular
Adicionar 5 mL de
agua destilada y filtrar
de nuevo
Determinacin de
glucosa residual
Determinacin de la
conc. celular por peso
seco
80
INFORME
DISCUSIN DE RESULTADOS
RESUMEN
81
BIBLIOGRAFA
82
Concentracin celular
turbidimetra)
TIEMPO DE
HORA
CULTIVO
(h)
No.
Dilucin.
Lectura
g/L
No.
pms
de
de
tubo
tubo
pmcs
Glucosa residual
g/L
tubo
Lectura
Dilucin
g/L
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pms : peso membrana seca
pmcs: peso membrana ms clulas Reunir todas las muestras y aplicar la
secas
Curva tipo de biomasa
tcnica de
DNS, empleando 2 controles de 0.4 y
0.8 g/L de glucosa
pendiente (m) =
ordenada (b) =
83
Actividades
5. Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo y esterilizacin
del lcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculacin con los matraces a el
fermentador / arranque de la fermentacin.
6. Toma de muestra cada hora del cultivo por lote/procesamiento de las muestras.
84
PRCTICA 9
Produccin de biomasa en
Cultivo por lote alimentado
INTRODUCCIN
Los cultivos continuos (simple etapa; con recirculacin; y mltiple etapa; principalmente)
pertenecen al segundo grupo, en donde existe entrada (nutrientes) y salida de
materiales (nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).
85
de nutrientes al
Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las
siguientes condiciones:
86
Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo)
el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo,
por lo que la concentracin del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo
esta condicin el microorganismo ajusta su maquinaria metablica al bajo suministro del
sustrato, ocasionando limitacin en su crecimiento que se ve reflejado en una baja
velocidad de crecimiento.
OBJETIVO
87
MATERIALES Y MTODOS
Equipo
1. Autoclave (15 L de capacidad).
2. Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
3. Fermentador con ambiente controlado (de 2 6 litros).
4. Electrodo de pH esterilizable.
5. Medidor controlador de pH.
6. Electrodo de oxgeno disuelto.
7. Medidor de oxgeno disuelto.
8. 2 Bombas peristltica (0 a 2 L/h).
9. 2 Placas de calentamiento y agitacin.
10. Espectrofotmetro (intervalo: visible y UV).
11.Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
12. Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad).
13. Estufa con vaco.
14.Equipo de filtracin con vaco.
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.
88
Medios de Cultivo
MEDIO PARA EL
MEDIO PARA EL
MEDIO PARA LA
INOCULO
ALIMENTACION
(g/L)
(g/L)
(g/L)
Glucosa
15.0
15.0
40.0
(NH4)2SO4
2.73
1.365
3.64
NaH2PO4
1.2637
1.2637
3.37
Extracto de levadura
0.990
0.990
2.64
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua de la llave
(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL)
a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inculo).
Mtodos Analticos
89
celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza
analtica).
Reactivos:
Procedimiento:
A 1mL del filtrado se le adiciona1mL del reactivo DNS, se coloca en bao mara a
ebullicin durante 5min. Posteriormente se deja enfriar y se adicionan 5mL de agua
destilada. Se leen los tubos a 540nm. Se emplean 2 controles de concentraciones de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa, y con el blanco de reactivos se ajusta a cero el
espectrofotmetro.
90
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5ml del mismo medio sobre la cepa
en tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora (110
golpes/minuto) a una temperatura de 350C durante 18 horas.
velocidad de agitacin
500 rpm
aireacin
1 vvm
temperatura
35 C
3.8
antiespumante (PPG-10%):
91
Se tomarn muestras slo al inicio y al final del cultivo por lote el cual durar 12 horas.
A las muestras se les determinar concentracin celular por peso seco (y turbiedad) y
glucosa residual por el mtodo del DNS.
A) Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo Fed Batch Lineal y se ajusta
el pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de 2 litros, y se esteriliza junto con la
manguera de adicin y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in2 durante 15 min.
C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que
contiene el medio estril a la bomba peristltica y a la entrada del fermentador en
condiciones aspticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentacin del medio
de cultivo. Esta adicin terminar cuando se agoten los 900 mL de medio de cultivo.
Este cultivo operar bajos las mismas condiciones de operacin del cultivo por lote:
velocidad de agitacin, aireacin, T, pH, etc.
Se tomarn muestras cada hora, las cuales sern procesadas de acuerdo a la siguiente
figura.
92
Determinacin de conc.
celular por turbidez
MUESTRA
(5mL)
(5mL)
Filtracin al vaco
Filtrado
Paquete celular
Adicionar 5 mL de
agua destilada y filtrar
de nuevo
Determinacin de
glucosa residual
93
Determinacin de la
conc. celular por peso
seco
INFORME
1. Determinar max, Yx/s (global) y Rx (global) de Candida utilis en el cultivo por
lote.
global)
y el rendimiento
celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s global) en el cultivo por lote
alimentado constantemente.
DISCUSIN DE RESULTADOS
RESUMEN
94
BIBLIOGRAFA
95
HORA
TIEMPO
DE
CULTIVO
(h)
Concentracin celular
(por turbidez)
No. dilu- lec g/L
de cin. tutubo
ra
Concentracin celular
(por peso seco)
No. pms
de
tubo
pmcs
g/L
Glucosa residual
tubo lectura
Metabolito de
inters
dilu- g/L
cin
96
Actividades:
97
PRCTICA 10
Produccin de biomasa en
Cultivo continuo
INTRODUCCIN
98
el sistema se
tambin predice que cuando los flujos de trabajo son ms elevados que el valor de la
velocidad especfica mxima de crecimiento, el sistema se quedar sin clulas,
condicin conocida como lavado del fermentador, debido a que se ha rebasado la
capacidad del microorganismo para metabolizar los nutrientes que le son suministrados
a altas velocidades.
99
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
Equipo
La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.
100
MEDIO PARA
MEDIO PARA
MEDIO PARA
EL INOCULO
EL CULTIVO
EL CULTIVO
CONTINUO
(g/L)
(g/L)
Glucosa
15.0
15.0
20.0
(NH4)2SO4
2.73
2.73
1.82
NaH2PO4
1.2637
1.2637
1.685
Extracto de levadura
0.990
0.990
1.32
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua de la llave
(*) Todas las sales estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL) a
emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
Vsales (mL) = 0.05 [ conc. de glucosa (g/L) ] [ volumen medio (L) ]
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inculo).
Mtodos Analticos
101
DESARROLLO EXPERIMENTAL
CONDICIONES
Velocidad de agitacin
500 rpm
Aireacin
1 vvm
Temperatura
35 C
3.8
Antiespumante
Polipropilenglicol al 10%
102
Se tomarn muestras al inicio y al final del cultivo por lote y ste durar 12 horas. A las
muestras se les debe determinar concentracin celular por peso seco (por filtracin) y
sustrato residual por el mtodo del DNS.
Cultivo continuo
C) Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del recipiente
que contiene el medio estril a la bomba y al puerto de suministro del fermentador, en
condiciones aspticas.
Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo al
fermentador. El fluido de salida se recibe en otro recipiente el cual es marcado con la
hora a la cual se inici el suministro de medio (el fluido de salida sale a travs del tubo
capilar colocado previamente en el fermentador).
103
El cultivo continuo operar en todas las velocidades de dilucin bajo las mismas
condiciones de agitacin (500 rpm), aireacin (1 vvm), temperatura (35 C), pH (3.8) y
control de la espuma.
Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilucin restantes. Tambin
se deben tomar 2 mL del medio alimentado para determinar la concentracin de
glucosa.
104
INFORME
RESUMEN
El alumno elaborar un resumen de la presente prctica.
105
BIBLIOGRAFA
1. Wang, D.I.C., Cooney, C.L., Demain, A.L., Dunill, P., Humphrey, A.E., Lilly, M.D.
1978. Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.
2. Tempert, D.W. 1970. The continuous cultivation of micro-organisms. I. Theory of the
Chemostat. Methods in Microbiology. Vol. 2. Academic. Press.
3. Herbert, A., Elsworth, F., Telling, H. 1956. The continuous culture of bacteria; a
theoretical and experimental study. Journal of Microbiology 14, 601-622.
106
HORA
TIEMPO
DE
CULTIVO
(h)
CONCENTRACION
CELULAR
(por turbidez)
No. dilu- lec g/L
de cin tu
tubo
ra
CONCENTRACION
CELULAR
(por peso seco)
No. pms pmcs g/L
de
Mta
GLUCOSA
RESIDUAL
METABOLITO DE
INTERES
Vr
D
(L) (h-1)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
F
SF
(L/h) g/L
[x]
[s]
Condiciones de
Fermentacin:
Agitacin: 500 rpm
Aireacin: 1 vvm
Temperatura: 35 C
pH :
3.8
M : membrana
Reunir todas las muestras
pms : peso membrana seca y aplicar la
pmcs: peso membrana mas
clulas secas.
tcnica de DNS,
empleando 2 testigos de
0.4 y 0.8 g/L de glucosa
0.4 g/L _________
0.8 g/L _________
107
Cultivo continuo
Actividades:
108