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Práctica número 5: Diagnóstico de las Micosis Sistémicas

PRÁCTICA NRO 5: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS

OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

Establecer las diferencias macroscópicas y microscópicas de los diferentes agentes de micosis sistémicas. Interpretar las pruebas inmunológicas empleadas para el diagnóstico de las micosis sistémicas.

HISTOPLASMOSIS:

Producida por el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum, con sus dos variedades: H. capsulatum var. capsulatum e H. capsulatum var. duboisii. La primera produce micosis sistémica en el hombre y animales, es endémica en Ámerica del Norte, Central y del Sur; mientras que la variedad duboisii está limitada a África Central.

H. capsulatum var capsulatum habita en suelos con alto contenido de nitrógeno, asociado con excremento de pájaros y murciélagos, penetra al organismo por vía inhalatoria. La primoinfección es pulmonar pudiendo ser:

asintomática o subclínica y la asintomática que se subdivide en: pulmonar aguda, pulmonar crónica y diseminada, en pacientes inmunocomprometidos.

Diagnóstico:

Muestra: Dependerá de la forma clínica que presente el paciente. Esputo, lavado broncoalveolar, médula ósea, sangre, biopsias, exudados de lesiones mucosas y cutáneas, material de ganglios linfáticos, LCR y otros líquidos corporales.

Examen directo:

Extendidos coloreados con Giemsa o Wright.

Coloraciones histológicas (HE, PAS, plata-metnamina).

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Calcofluor.

Por ser las levaduras de H. capsulatum muy pequeñas no pueden ser reconocidas en fresco o con KOH.

Al examen directo se observan blastoconidias ovaladas de 2-3 m, intracelulares, generalmente con una sola gema (Figura 28); por efecto de algunas coloraciones ocurre una retracción de la membrana citoplasmática que le da apariencia de una cápsula. En los pacientes con SIDA, las blastoconidias pueden observarse extracelularmente debido a la multiplicación intracitoplasmática excesiva, causando la destrucción del fagocito.

En los cortes histológicos, la pared del hongo se tiñe débilmente con HE pero se destaca con PAS y plata metenamina (Figura 29). Se observan blastoconidias intracelulares y otras libres por la ruptura del fagocito, rodeadas por una reacción granulomatosa, con predominio de células epitelioides y gigantes.

con predominio de células epitelioides y gigantes. Figura 28: Blastoconidias (B) de Histoplasma capsulatum

Figura 28: Blastoconidias (B) de Histoplasma

capsulatum en el interior de una célula

fagocitica (F). Observe el núcleo del fagocito (NF). Extendido coloreado con Giemsa.

www.scielo.org.ar/ /abcl/v39n4/4a09f2.jpg

Cultivo:

Figura 29: Blastoconidias (B) de Histoplasma capsulatum. Coloración histológica Plata- metenamina.
Figura 29: Blastoconidias (B) de Histoplasma
capsulatum. Coloración histológica Plata-
metenamina.
pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-
6.htm

Se realiza sobre agar sangre, Sabouraud o extracto de levadura. Para verificar el dimorfismo de H. capsulatum, el cultivo se incuba tanto a temperatura ambiente

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como a 37 ºC. La identificación del H. capsulatum se hace en su fase micelial (temperatura ambiente), formando colonias blancas y algodonosas en los medios de cultivo. En el microcultivo se observan hifas tabicadas, microconidias y macroconidias tuberculadas, que identifican el agente etiológico. (Figura 30)

que identifican el agente etiológico. (Figura 30) Figura 30: Macroconidias tuberculadas (M) y
Figura 30: Macroconidias tuberculadas (M) y microconidias (m) de Histoplasma capsulatum. Observadas en cultivo
Figura
30:
Macroconidias
tuberculadas
(M)
y
microconidias
(m)
de
Histoplasma
capsulatum.
Observadas en cultivo en lámina, coloreadas con azul
de lactofenol. http://alsubs.blogspot.com/
con azul de lactofenol. http://alsubs.blogspot.com/ DIBUJO El cultivo es el método más específico para

DIBUJO

El cultivo es el método más específico para establecer definitivamente el diagnóstico. Sin embargo tiene poca sensibilidad en la mayoría de las formas clínicas de histoplasmosis y tarda entre 1 y 5 semanas por lo que se hace necesario la implementación de otras pruebas diagnósticas como lo son las inmunológicas.

Estudio Inmunológico

Inmunidad celular: se estudia con la aplicación, por vía intradérmica, de 0,1 c.c. de histoplasmina, en la cara anterior del antebrazo. La lectura se realiza a las 48 horas, siendo positiva con la presencia de una induración igual ó mayor de 5 mm de diámetro. La IDR con la histoplasmina es de poco valor diagnóstico, sólo indica contacto con el hongo.

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como

antígenos circulantes. La técnica más usada es la IDD donde pueden ser observadas dos bandas de identidad, una banda “M” y una “H”. La banda M es la que se encuentra con mayor frecuencia y es evidencia presuntiva de infecciones iniciales o de infección pasada (esta banda persiste rara vez después de 3 a 6 meses de la recuperación clínica del paciente). La banda “H” aparece con menor frecuencia que la “M”, usualmente indica la presencia de una enfermedad clínica activa, sin embargo su ausencia no excluye la histoplasmosis activa. Esta banda tiende a desaparecer con la curación del foco infeccioso.

Inmunidad

humoral:

Se

pueden

determinar

tanto

anticuerpos

BANDA “H” BANDA
BANDA “H”
BANDA

PARACOCCIDIOIDOMICOSIS:

Es causada por el hongo dimórfico Paraccocidioides brasiliensis, constituye una de las micosis sistémicas más importante de la América Latina. Hasta la fecha se desconoce el hábitat del hongo, sólo ha sido aislado de tierras en contadas ocasiones y en forma ocasional ha sido asilado de alimentos para perros y de heces de pingüinos; sin embargo el consenso general señala el suelo de áreas endémicas como el nicho ecológico.

Afecta principalmente a hombres adultos entre 30 y 60 años de edad,

que la

trabajadores de la tierra, que se infectan por vía inhalatoria, por lo

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primoinfección ocurre en los pulmones, desde donde se disemina a otros órganos.

La menor frecuencia de casos en mujeres parece estar relacionada con factores

hormonales.

Se describen las siguientes formas clínicas:

Infección subclínica asintomática.

Enfermedad, se subdivide en:

Juvenil

Crónica del adulto (Figura 31)

Residual

L L
L
L

Figura 31: Forma crónica del adulto. Lesiones (L) en paladar

Figura : Forma crónica del adulto. Lesiones (L) en

blando ocasionadas por P. brasiliensis. Foto cortesía Profa.

paladar ocasionadas por P. brasiliensis . Foto cortesía

Leyla Humbría.

Profa. Leyla Humbría.

DIAGNÓSTICO

Muestra: dependerá de la forma clínica que presente.

Esputo o lavado broncoalveolar

Exudado de ulceras en mucosas y el piel

Material purulento de nódulos linfáticos

Biopsias

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Orina

LCR y otros líquidos corporales.

Examen directo:

En fresco, entre lamina y laminilla

KOH al 10% con o sin tinta

Negro de clorazol

Calcofluor

Coloraciones histológicas (PAS, HE, plata-metenamina)

Se observan blastoconidias de diferentes tamaños, entre 3-40 µm de diámetro,

redondeadas, de pared gruesa y refringente, con inclusiones citoplasmáticas.

Característicamente se observan células multigemantes, llamadas de timón de

barco, unidas entre sí directamente o a través de un pequeño puente

citoplasmático. Además de las formas multigemantes, es posible ver cadenas de

blastoconidias o células con gemación única o solitarias (Figura 32).

o células con gemación única o solitarias (Figura 32). DIBUJO L Figura 32: Levadura (L) multigemante

DIBUJO

L Figura 32: Levadura (L) multigemante de P. brasiliensis observada en examen directo con KOH
L
Figura 32: Levadura (L) multigemante de P.
brasiliensis observada en examen directo
con KOH al 10%. Foto cortesia Profa. Leyla
Humbría.

Figura : Levadura (L) multigemante de P. brasiliensis observada en examen directo con KOH al 10%. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

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En las biopsias, la observación del hongo es más fácil con la coloración de plata-metenamina y PAS que con HE (tiñe mal la pared del hongo). Se observan una respuesta tisular mixta, característica de una micosis crónica, con formación de microabcesos y granulomas. El hongo suele encontrarse asociado con las células gigantes multinucleadas del granuloma, donde exhibe sus características descritas anteriormente, excepto las inclusiones intracitoplasmáticas y la refringencia de la pared.

Cultivo:

Se realiza en agar Sabouraud adicionado o no de antibióticos y cicloheximida. Se incuba a temperatura ambiente y a 37 ºC para demostrar su dimorfismo. P. brasiliensis es de crecimiento lento.

A temperatura ambiente, en el anverso, crece como un moho de color

blanco o crema y en el reverso de la colonia muestra un color marrón claro. Al microscopio, en un cultivo en lámina, se observan hifas delgadas con artroconidias y clamidosporas intercalares y terminales. Este tipo de crecimiento es de escaso valor diagnóstico.

A 37 ºC se forman colonias blanquecinas, de aspecto cerebriforme, que al

ser observadas al microscopio demuestran la presencia de levaduras multigemantes que permiten la identificación definitiva del hongo (Figura 33).

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P Figura 33: Cultivo levaduriforme de P. brasiliensis. Agar Sabouraud. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.
P
Figura 33: Cultivo levaduriforme de P. brasiliensis. Agar Sabouraud.
Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

Figura : Cultivo levaduriforme de P. brasiliensis . Agar Sabouraud. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

Estudio inmunológico

de

paraccoccidioidina, vía intradérmica en la cara anterior del antebrazo. Se aplican

simultáneamente un antígeno control (PPD) y la histoplasmina, para evaluar

posibles reacciones cruzadas. La lectura se realiza a las 48 horas, considerándose

positiva una induración igual ó mayor de 5 mm de diámetro (Figura 34).

Inmunidad

celular:

se

estudia

con

la

aplicación

de

0,1

c.c.

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P H Figura 34: Resultados de la aplicación de la prueba intradérmica con histoplasmina (H)
P
H
Figura 34: Resultados de la aplicación de la prueba intradérmica
con histoplasmina (H) y paracoccidioidina (P). Foto cortesía
Profa. Leyla Humbría

Figura : Resultados de la aplicación de la prueba intradérmica con histoplamina (H) y paracoccidioidina (P). Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

La IDR con paraccoccidioidina carece de valor diagnóstico, sólo indica

contacto previo con el hongo. Esta prueba se hace negativa en estados anérgicos,

de pronóstico reservado, por lo que su aplicación se recomienda cuando se desee

evaluar las condiciones inmunológicas del paciente, para hacer seguimiento

después del tratamiento y para estudios epidemiológicos.

Inmunidad humoral:

En los casos de paracoccidioidomicosis pulmonar crónica unifocal, en los

cuales se hace difícil una toma de muestra clínica representativa que facilite la

observación del hongo con un examen directo, la IDD es recomendada por su

simplicidad y efectividad diagnóstica. Esta prueba detecta anticuerpos de tipo IgG

en un 93% de los casos activos y puede utilizarse de forma cuantitativa para

determinar aumento o disminución de anticuerpos circulantes durante el

seguimiento de tratamiento del paciente.

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C+ Pb 1/16 P Ag Pb Figura 1/8 35: Estudio cuantitativo para la detreminación de
C+ Pb
1/16
P
Ag Pb
Figura 1/8 35: Estudio cuantitativo para la
detreminación de titulo de anticuerpos 1/2 circualantes
freante a antígeno de P. brasiliensis por IDD. Titulo
1/16. Se observa banda 1/ de total identidad (flecha).
Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

Figura

:

Estudio

cuantitativo

para

la

determinación

de

anticuerpos

circulantes

frente

a

antigeno

de

P.

brasiliensis

por

IDD,

título

1/16.

Se

observa

banda

de

total

identidad

(flecha).

Foto

cortesía

Profa.

Leyla

Humbría.

Con esta técnica se evidencian una o varias bandas de precipitación, de las

cuales las denominadas 1 (banda “E”) y 2 son específicas para la entidad, la

banda 3 parece corresponder a una reacción cruzada con H. capsulatum y menos

frecuente con otras micosis profundas o sistémicas.

La banda “E” puede persistir después del tratamiento. No debe suspenderse el

tratamiento a menos que las pruebas serológicas hayan sido negativas o hayan

dado resultados negativos en tres oportunidades, mediando estas un período de 3

a 6 meses.

COCCIDIOIDOMICOSIS:

La Coccidioidomicosis (CDM), también conocida como la fiebre del Valle de

San Joaquín, es una micosis sistémica, causada por dos especies de hongos

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dimórficos pertenecientes al género Coccidioides: Coccidioides immitis conocido como la especie Californiana, y la recién nombrada especie no Californiana, Coccidioides posadasii. La fase saprofítica de estos microorganismos se desarrolla en la tierra de áreas endémicas; parte del suroeste de los Estados Unidos, México, Centro y Suramérica; y la infección en humanos, así como en varias especies de animales, se adquiere principalmente por vía inhalatoria.

En Venezuela, las áreas endémicas de esta micosis se localizan en la región noroccidental, en las zonas áridas y semiáridas de los estados Falcón, Lara y Zulia.

Se considera como principal mecanismo de infección la inhalación de las artroconidias presentes en el suelo, las cuales se desprenden al moverse la tierra seca, o bien, se desplazan con las corrientes de aire. La infección depende de la exposición al hongo en un área endémica; afecta a cualquier edad o sexo y es más frecuente en campesinos, soldados, arqueólogos, entre otros. Los casos se pueden incrementar después de temblores de tierra, épocas de sequías, así como cambios en el suelo (altas concentraciones de sales eliminan flora microbiana competitiva), migraciones de individuos susceptibles y la humedad relativa del suelo y aire.

Coccidioides posadasii e immitis producen un espectro amplio de manifestaciones clínico-patológicas que van desde una infección asintomática a una enfermedad pulmonar primaria, enfermedad cutánea primaria, enfermedad pulmonar progresiva y la diseminación extrapulmonar que puede ser aguda, crónica, o progresiva (Figura 36). La severidad de la infección va a depender de los mecanismos de defensa del huésped, tamaño del inóculo y, posiblemente, de factores específicos de la virulencia o de resistencia del hongo.

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Práctica número 5: Diagnóstico de las Micosis Sistémicas

Figura 36: Lesión en nariz de un paciente con coccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa. Dilia
Figura
36:
Lesión
en
nariz
de
un
paciente
con
coccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa. Dilia
Martinez.

Figura : Lesión en nariz de un paciente con coccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa. Dilia Martinez.

DIAGNÓSTICO

Muestra:

Esputo

Lavado bronquioalveolar

Exudados de lesiones en mucosas y piel

Biopsias

Material purulento

Sangre

Médula ósea

LCR y otros líquidos corporales.

Examen directo:

En fresco entre lamina y laminilla

KOH al 10-20%, con o sin tinta

Coloraciones histológicas (PAS, HE, Plata-metenamina)

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Calcofluor.

Se observan esférulas de 10 a 80 µm, con pared doble y refráctil y endosporas

de 2 a 5 µm (Figura 37).

e E e e E e E Figura 37: Examen directo con KOH al 20%
e
E
e
e
E
e E
Figura 37: Examen directo con KOH al 20% de muestra clínica proveniente de lesión en nariz de
un paciente con coccidiodomicosis diseminada. Se observan esférulas (E) rotas y completas,
con endosporas (e) en su interior y libres. Foto cortesía Profa. Leyla Humbria.
Figura : Examen directo con KOH% de muestra clinica proveniente de lesión en nariz.
Se observan esférulas (E) rotas y completas, con endosporas (e) en su interior y
libres. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

Cultivo:

El método definitivo para confirmar el diagnóstico de CDM es el aislamiento

del hongo a partir del espécimen clínico. Coccidioides spp crece fácilmente en la

mayoría de los medios de cultivo utilizados en los laboratorios clínicos. En medio

Sabouraud con o sin antibiótico, a temperatura ambiente, al tercer día se observan

colonias glabra, después vellosas y luego francamente algodonosas, de color

blanco grisáceo o amarillento (Figura 38). Microscópicamente se observan hifas

delgadas y septadas con artrosporas o artroconidias rectangulares de 2 por 4 ó 3

por 6 µm (Figura 39). La forma micelial de Coccidioides spp representa un alto

riesgo de infección al personal del laboratorio debido a que es altamente

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Práctica número 5: Diagnóstico de las Micosis Sistémicas

contagiosa, por lo que los cultivos deben ser manipulados únicamente dentro de

campanas de bioseguridad clase II.

únicamente dentro de campanas de bioseguridad clase II. Figura 38: Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo

Figura 38: Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo de Coccidioides immitis o

Figura : Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo de Coccidioides

posadasii. Se observa una colonia de color blanco, algodonosa. Foto cortesia Profa.

posadasii. Se observa una colonia de color blanco, algosonosas. Foto

Leyla Humbría.

cortesía Profa. Leyla Humbría.

Foto Leyla Humbría. cortesía Profa. Leyla Humbría. Figura 39 . Artroconidias de Coccidioides immitis de un

Figura 39. Artroconidias de Coccidioides immitis de un cultivo en forma micelial (preparación con azul de Lactofenol). Fragmentación del micelio (M) en esporas

(artroconidias) rectangulares. Preparación con Azul de

Lactofenol, 1200 X. tomado de: Restrepo M., A. Rev. Acad. Colomb. Cienc. 2006; 30 (116):367-386.

Estudio inmunológico:

Inmunidad celular: Se realiza la IDR utilizando antígenos fúngicos, que en el

caso de coccidioidomicosis, pueden ser de dos tipos: la coccidioidina, obtenida de

la fase micelial o saprófita y la esferulina, constituida por la pared de las esférulas.

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El antígeno se inyecta en volumen de 0,1 c.c., por vía intradérmica, en la cara

anterior del antebrazo y la reacción se observa a las 48 horas. Se considera positiva si se obtiene una induración igual ó mayor de 5 mm. de diámetro. Debido a que los preparados antigénicos contienen antígenos específicos y antígenos comunes a otros hongos, se pueden observar reacciones positivas en pacientes

con histoplasmosis y paracoccidioidomicosis.

La IDR se utiliza básicamente en estudios epidemiológicos para investigar la existencia de infección subclínica en una población y rara vez como orientación

diagnóstica, ya que una reacción positiva de 5 mm o más significa que la respuesta inmunitaria del paciente está intacta y sólo señala exposición al agente.

Por el contrario, una reacción negativa no necesariamente excluye infección y se

puede observar en pacientes con CDM diseminada, lo que indica un estado de anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera una prueba auxiliar en el diagnóstico, pronóstico y valoración del estado inmunitario del paciente con CDM. Es positiva 2 a 3 semanas después del inicio de los síntomas y puede persistir durante años. En pacientes sintomáticos la positividad a la IDR se considera de buen pronóstico; mientras que su negatividad se traduce en una inadecuada respuesta celular, anergia y por lo tanto, mal pronóstico.

Inmunidad humoral: Consiste en la detección de anticuerpos específicos contra Coccidioides immitis o posadasii en suero o LCR (en sospecha de meningitis). Su presencia confirma el diagnóstico, siempre y cuando los resultados obtenidos se correlacionen con los aspectos epidemiológicos, clínicos e histopatológicos del paciente.

La técnica más usada es la IDD, en donde se detectan la formación de varias bandas, especialmente la “F” establece el diagnóstico en un 93% de los

pacientes con formas activas. Una banda específica entre la muestra del paciente

y el pozo de antígeno para Coccidioides spp.es evidencia presuntiva de

coccidioidomicosis activa o reciente. Algunos individuos continúan la producción

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de anticuerpos detectables por periodos significativos (más de 1 año) después de la recuperación clínica de la enfermedad activa. Una prueba negativa no excluye la enfermedad. Existen reacciones cruzadas con H. capsulatum y P. brasiliensis, pero a títulos menores que los exhibidos con los antígenos homólogos.

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