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MONTAJE PRUEBAS HEMATOLOGIA

1.

VSG: VELOCIDAD
GLOBULAR

DE

SEDIMENTACION

Determinacin de la VSG
Habitualmente se emplean dos procedimientos:
Mtodo Westergreen
Mtodo de Wintrobe
En la actualidad no existe ningn mtodo de referencia para la determinacin de VSG,
aunque el ISCH (International Commitee for Standardization in Hematology)
recomienda el de Westergreen como el ms aconsejable para la prctica clnica. El
mtodo se describe a continuacin
Mtodo de Westergreen
1- Extraer sangre venosa (aprox. 1-2 mL) y homogenizar con el anticoagulante.
Se recomienda realizar la determinacin dentro de las 2 horas posteriores a la
extraccin de la muestra.
2- Cargar una pipeta de Westergreen y en el momento de llegar a la marca 0,
poner en marcha el cronmetro. Asegurarse que la pipeta esta en una posicin
de 90 respecto la superficie, exenta de vibraciones o cualquier factor que
modifique la VSG.
3- Transcurridos 60 minutos exactos, leer la sedimentacin eritrocitaria, que se
expresa en mm/hora y comparar los resultados obtenidos con los resultados
normales.

Indicaciones
La VSG es una prueba analtica anloga a las conocidas como reactante de fase
aguda, como lo es la protena C reactiva o PCR. Esto significa que es un marcador
inespecfico, no relacionado con ninguna enfermedad en concreto, cuya elevacin
implica procesos inflamatorios, infecciosos o neoplsicos. Por otra parte, sus valores
son ampliamente variables por mltiples factores an mal establecidos (se sabe que
aumenta con la edad), por lo que su interpretacin debe estar en el contexto de la
clnica y el resto de pruebas analticas. Existen tablas de valores normales mximos
por edad y sexo (por ejemplo, 10 mm por hora en varones jvenes).
La VSG se utiliza como dato de rutina en el despistaje inicial de enfermedades, como
seguimiento de mltiples enfermedades crnicas, y excepcionalmente como criterio de
diagnstico (por ejemplo en la arteritis de clulas gigantes). Algunos procesos tambin
pueden presentar disminucin de la VSG.

2. RETICULOCITOS
Informacin: Los reticulocitos son eritrocitos jvenes "recin nacidos" que ocupan una
posicin intermedia entre los eritrocitos maduros anucleados y los precursores eritroides
nucleados que se encuentran en la mdula sea. Se consideran como el mejor ndice
para evaluar cmo est la produccin de glbulos rojos en la mdula sea.
Usos: De utilidad en anemias hemolticas, en estados post- hemorrgicos, cuando se
recibe tratamiento para su anemia bien sea originada por carencia de vitamina B 12 en
la anemia perniciosa o hierro en la ferropnica.
Normales: La cifra normal en los extendidos perifricos est comprendida entre 0.2 al
2. 6 % en hombres y de 0.2 a 2. 4 % en mujeres.
METODO AZUL DE CRESIL BRILLANTE:
Azul de cresil brillante 1.0 gr
Solucin salina al 0.85% .. 99 ml
Citrato de sodio..0.4 gr
METODO:
Tomar un tubo y agregar partes iguales de sangre bien mezclada y solucin de ACB,
tambin pueden ser dos gotas de sangre del paciente por una gota de colorante.
Mezclar varias veces y fuertemente el tubo con la mezcla de sangre-colorante
(durante 10 minutos) y se deja en reposo a temperatura ambiente por 30 minutos en
Bao de Maria por 15 minutos, para asegurar tiempo adecuado para colorear los
reticulocitos.
Mezclar la solucin y se hacen dos frotis en laminas portaobjetos limpias.

La prueba consiste en la administracin de un "anti-suero" que contiene anticuerpos


dirigidos contra una serie de molculas presentes en la membrana de los eritrocitos; la
unin del anti-suero con estos eritrocitos ocasiona una reaccin inmediata de
aglutinacin. La prueba de Coombs se utiliza como mtodo diagnstico de
enfermedades como las anemias hemolticas, la enfermedad hemoltica del recin
nacido y en las reacciones transfusionales.

3. COOMBS DIRECTO
PROCEDIMIENTO MANUAL:
o
o
o
o
o

Lave tres veces los hemates del paciente con solucin salina fisiolgica.
Haga una suspensin de hemates lavados al 2-5 %.
Aada en un tubo debidamente rotulado dos gotas de la suspensin.
Aada dos gotas de Suero de Coombs poliespecfico.
Centrifugue un minuto a 1000 rpm.

4. COOMBS INDIRECTO
A diferencia de la prueba de Coombs directa, la prueba indirecta se basa en la
"incubacin" del suero del paciente con una muestra de sangre tipo O, y
posteriormente se procede a administrar el "anti-suero". A diferencia de la prueba
directa, en la prueba indirecta se busca la presencia de "anticuerpos" en el suero del
paciente y no "anticuerpos" pegados a la superficie de los glbulos rojos. La prueba
indirecta se usa para realizar "tipificacin" de grupos sanguneos, pruebas sanguneas
cruzadas y como mtodo de rastreo para evitar reacciones transfusionales.
PROCEDIMIENTO MANUAL
o
o
o
o
o
o
o
o

Centrifugue la muestra de sangre 10 min a 3 000 rpm para obtener el suero y


decntelo en un tubo debidamente identificado.
Prepare una suspensin al 2-5 % con la mezcla de hemates O y en el caso
del Coombs cruzado utilice una muestra de la sangre a transfundir para
preparar la suspensin.
En un tubo debidamente rotulado aada dos gotas del suero y dos gotas de la
suspensin y mezcle bien.
Prepare un tubo control rotulado C+ (control positivo) y aada en l dos gotas
de la suspensin de hemates O y dos de suero hemoclasificador anti-D y
mezcle bien
Incube ambos tubos en un Bao de Mara a 37C por 30 minutos
Lave tres veces con solucin salina escurriendo totalmente el sobrenadante
del ltimo lavado.
Aada dos gotas de suero de Coombs poliespecfico a cada tubo.
Centrifugue 1minuto a 1000 rpm.

5. EXTENDIDO DE SANGRE PERIFERICA


TECNICA MANUAL CON DOS PORTAOBJETOS EN ANGULO:
Se recomienda usar dos portaobjetos de vidrio nuevos con bordes biselados y
esquinas romas.
El tamao de la gota de sangre tambin es muy importante, si es muy grande crea un
extendido muy largo y grueso y viceversa.
El portaobjetos extensor se sostiene con firmeza a un ngulo de 30 a 45 y se lleva
hacia atrs hacia la gota de sangre, dejando que sta se esparza en todo el
ancho del portaobjetos.
Entonces se empuja con rapidez y suavidad hacia delante hasta el final del
portaobjetos y se crea un extendido. Es importante que toda la gota se incluya
en el extendido.

Caractersticas de un buen extendido:

Cubre alrededor de dos tercios a tres cuartas partes de la longitud del


portaobjetos
Tiene forma de dedo no forma de bala

Los bordes laterales deben ser visibles

El extendido es parejo, sin irregularidades, hoyos ni estrias

Secar rpidamente

Coloracin:
Se emplea la tincin de Wright
-

Se realiza sobre un soporte para coloraciones, los portaobjetos se


colocan sobre el soporte boca arriba una vez secos.
El colorante de Wright se puede preparar o venir listo para su uso y debe
filtrarse antes de usarlo.

Es importante cubrir todo el portaobjetos con el colorante

Mezclar con un agua o buffer hasta que aprezca un color brillante sobre la
lamina

Se suele mezclar soplando el reactivo con el buffer

La mezcla se deje por al menos 3 minutos (cada laboratorio estandariza


su tcnica de acuerdo a su reactivo).

Cuando termina la coloracin el portaobjetos se lava con un chorro


continuo pero suave de agua con pH neutro.

Limpiar la parte de atrs para limpiar el residuo del colorante

Secar al aire en posicin vertical

6. GOTA GRUESA
El examen de un preparado de sangre en "gota gruesa" es el primer paso para el
diagnstico de malaria. Si son vistos parsitos, se debe hacer un extendido para
verificar la especie.
Gota gruesa: se coloca una gota de sangre en un portaobjetos limpio y con la esquina
de otro, se disemina la sangre hasta llegar a un dimetro de ms o menos 1 cm. El
espesor debe ser tal que permita leer a travs de la preparacin. Se realiza de puncin
del dedo.
Solucin A

Cloruro de azul de metileno para microscopia


Azur l o azur B para microscopia

0.8 g
0.5 g

Cuando no se tienen los anteriores reactivos, pueden ser reemplazados por 1,3 g de azur ll.
Para disolver el colorante se utilizan 250 ml de agua amortiguadora pH 7.2.
Solucin B
Eosina amarillenta hidrosoluble para microscopia

1g

Disolver la eosina amarillenta en 250ml de agua amortiguadora pH 7.2.


Las soluciones A y B se almacenan en frascos mbar. Para el uso diario se recomienda
que sean alcuotas en frascos goteros de plstico que impidan el paso de la luz, los cuales
deben dispersar gotas del mismo tamao. Cada vez que se realice una coloracin los
frascos se cierran muy bien para evitar que haya contaminacin de los colorantes.
Las soluciones se pueden almacenar a 4oC, sin que sus componentes se precipiten.
Cuando sea necesario, se debe realizar filtracin de estas dos soluciones, en recipientes
limpios en caso de observar contaminacin y precipitado.
Procedimiento de coloracin para gota gruesa
La coloracin para gota gruesa consta de dos pasos: precoloracin y coloracin.
Precoloracin
Este proceso ayuda a preservar las clulas sanguneas e iniciar el proceso de
deshemoglobinizacion sin alterar la morfologa del parasito.
Verificar que la muestra este completamente seca para que no se desprenda
Sumergir la lamina en una solucin de azul de metileno por dos segundos
Escurrir la lamina sobre una gasa o papel absorbente para eliminar el exceso de azul de
metileno
Introducir la lamina en un recipiente que contenga una solucin amortiguadora pH 7.2, por
dos segundos
Esta solucin se cambia cada vez que tenga mucho tinte azul proveniente del azul de
metileno
Cuando las muestras precoloreadas han tomado un exceso de azul de metileno fosfatado,
se pueden volver a enjuagar para evitar muestras muy oscuras
Deje escurrir las lminas para continuar la coloracin
En los casos en que no es posible colorear inmediatamente, se procede a secar los porta
objetos a temperatura ambiente o con calor, suave y de manera rpida para prevenir el
desarrollo de hongos. Se debe evitar la sobreexposicin al calor porque se fija la
hemoglobina de los glbulos rojos.
Coloracin

Despus de la deshemoglobinizacion, la coloracin permite la diferenciacin de las


estructuras parasitarias. El color esperado para la cromatina es el rojo; para el citoplasma es
azul y el pigmento malarico vara entre el amarillo y el caf oscuro.
Por cada lmina que se necesita colorear, se adicionan 3 ml de solucin amortiguadora, una
gota de solucin A y una gota de solucin B en un tubo, y se mezcla suavemente por
inversin
Las muestras se colocan hacia la concavidad de la lmina de coloracin; se adiciona la
solucin colorante evitando la formacin de burbujas y se deja actuar segn el tiempo
estandarizado de la coloracin. La posicin invertida de la gota gruesa permite una
deshemoglobinizacion completa por el alto peso molecular de la hemoglobina
Pasado el tiempo de coloracin, coloque las lminas en posicin vertical en el soporte y
deje escurrir. No necesita lavar la muestra ya que puede desprenderla.

7. TIEMPO DE SANGRIA
Mtodo de Ivy
El mtodo de Ivy es la forma ms tradicional de realizar el examen. Se realiza una
incisin superficial en la piel del antebrazo o el lbulo auricular y se mide el tiempo que
tarda en detenerse la hemorragia. La incisin mide 10 mm de largo y 1 mm de
profundidad. El tiempo desde el cual se realiza la incisin y la herida para de sangrar
es conocido como el tiempo de sangra. Cada 30 segundos se utiliza papel filtro para
secar la sangre, sin presionar para evitar la alteracin del examen. Se considera
normal un tiempo de sangra de alrededor de 3 a 11 minutos.
Mtodo de Duke
En el mtodo de Duke, se pincha al paciente con una aguja especial o lanceta,
preferentemente en el lbulo auricular o la yema de los dedos, luego de limpiarlo con
alcohol. La puncin es de 3-4 mm de profundidad. El paciente limpia la sangre con un
papel de filtro cada 30 segundos. El test termina cuando cesa la hemorragia. El tiempo
usual es de entre 2 y 5 minutos.

8. TIEMPO DE COAGULACION
QU ES?
Material

estudiar:

sangre

venosa

extraida

en

tubo

seco

Finalidad: determina el tiempo que tarda en coagular la sangre recin extrada. Evala
la va intrnseca de la coagulacin. Al mismo tiempo evala en trminos generales: el
fibringeno y el nmero y calidad de las plaquetas. Sirve adems para controlar los
tratamientos con heparina aunque con menos certeza que el tiempo parcial de
tromboplastina
activada.
Preparacin

previa:

no

es

necesaria.

Resultados:
Valores normales: tiempo de coagulacin 5 a 15 minutos. Retraccin: comienza
despus de 1 hora de coagulado observndose una retraccin del 50 %.
Valores

anormales:

Hiperfibrinogenemia.

Anemia.

Fibrinolisis

secundaria.

Tiempo de coagulacin prolongados: deficiencia de factores de la coagulacin.


Presencia de anticoagulantes.
Retraccin lenta o incompleta del cogulo: Trombocitopenia. Tromboastenia.
Tiempo necesario para obtener los resultados: Varias horas de observacin para
determinar primero el tiempo que tarda en coagular la sangre extrada y el tiempo que
tarda el cogulo en retraerse para soltar finalmente el suero de la sangre.
Equipamiento a utilizar: adems de la jeringa de extraccin y la aguja para la puncin
venosa, el mdico o tcnico deber contar con un cronmetro y un bao de agua
caliente a 37 grados C.
Confiabilidad de los resultados: buena.
Medicamentos que pueden alterar los resultados:
Antibiticos (tetraciclinas)
Anticoagulantes
Corticoesteroides

MONTAJE PRUEBAS UROANALISIS


1. PARCIAL DE ORINA
1. Mezclar bien la orina antes de analizar.
2. Pasar la muestra a un tubo graduado o no debidamente identificado y observar:
a) Color: Vara de ambarino al amarillo plido, segn su contenido en pigmentos,
especialmente el urocromo, y en menor proporcin la uroeritrina y la hemato porfirina.
La intensidad del color es inversamente proporcional al volumen eliminado y la
densidad de la orina.
Coloraciones normales: Incolora, de color amarillo claro, amarillo oscuro o mbar
intenso.
Coloraciones patolgicas: Rojo o rojo pardusco, rojo pardusco o pardo negro,
amarillo verdoso o caoba oscuro, latescente, pardo al negro al oxidarse.
Cloraciones medicamentosas: Azul - verdoso, rosado o rojo en orinas alcalinas, rojo,
rosado, amarillo mbar, pardusco que vira al rojo al alcalinizarse.
b) Olor: El olor normal de la orina es un dbil olor aromtico, pero con el tiempo
adquiere un olor amoniacal desagradable debido a la descomposicin. El olor de las
orinas cidas y concentradas es ms fuerte (despus de la ingestin de carne,
ejercicios violentos, etc).
3. Luego de introducir la tira reactiva por parte del bacterilogo se lleva la muestra a
centrifugar por 10 minutos a 3500 r.p.m.
4. Luego de ese tiempo descartar el sobrenadante y mezclar el sedimento.
5. Tomar una gota del sedimento y colocarla sobre un portaobjeto, cubrir con una
laminilla y disponer para su lectura.

2. ORINAS DE 24 HORAS
1. Mezclar bien la orina antes de analizar.
2. Verter en una probeta graduada todo el volumen urinario recolectado por el paciente
3. Anotar el volumen y comunicar al Bacterilogo en mL segn la identificacin del
paciente.

MONTAJE PRUEBAS COPROANALISIS


1. COPROLOGICOS Y/O COPROSCOPICOS
1. Identificar la lmina de acuerdo al nmero de identificacin del recipiente
Exmen Macroscpico: Las heces se clasifican en liquidas, blandas o duras. El color
anormal tiene significado patolgico, por ejemplo: negro en melenas, blanco en acolia.
Debe observarse si existe moco, sangre, restos alimenticios o presencia de parsitos
grandes como helmintos o platelmintos.
MONTAJE: En un portaobjetos se coloca separadamente una gota de solucin salina fisiolgica
(0.85%) y otra de lugol(yodo 1.5gramos, yoduro de potasio 4 gramos y agua destilada 100 ml)
- Con un palillo se toma una pequea porcin de materia fecal y se hace una
suspensin en gota de solucin salina y luego se repite el mismo procedimiento en la
gota de lugol
- Se cubren con portaobjetos de 22 x 22 mm y se observa al microscopio con objeto de
10X y luego 40X, se deben evitar preparaciones muy gruesas o muy delgadas poder
ver bien a travs de ellas. Los parsitos mviles se observan en solucin salina. El
lugol hace resaltar algunas estructuras, como ncleos de protozoos y da una
coloracin caf a los huevos y larvas.
2. Para Coproscpicos se sigue el mismo procedimiento de montaje pero se
incluyen los siguientes anlisis:
- Medicin de pH: Se mide con papel indicador, colocando una pequea cantidad de
materia fecal con el aplicador sobre la tira de papel reveladora, quitar el excedente,
comparar el color con la escala que provee la casa comercial.
- Azcares reductores: Se realiza una suspensin acuosa de la materia fecal y se
agrega el reactivo Clinitest. La suspensin se prepara con agua destilada. EL reactivo
de clinistest es una pastilla que se adiciona a la suspensin y de acuerdo al cambio de
color determina la presencia o no de azcares reductores en la muestra.
Utilidad: Detectar deficiencia de enzimas intestinales, principalmente de sucrosa y
lactosa (disacridasas), debido a una deficiencia congnita o daos inespecficos en la
mucosa.
- Sangre oculta: Vara de acuerdo a la casa comercial o el reactivo empleado.

2. TINCION DE ZIEHL NEELSEN MODIFICADA


PARA CRYSPTOSPORIDIUM
Esta tincin sirve para observar coccidias intestinales tales como: Cryptosporidium sp,
Cyclospora sp; Isospora sp. Etc, que son parsitos intestinales que hoy da estn
afectando principalmente pacientes inmunosuprimidos :

Tcnica:
- Colocar en un portaobjetos nuevo, libre de grasa y seco una gota de solucin salina
al 0.85%. Homogenizar muy bien la muestra de materia fecal con un palillo de madera
de tal manera que quede un extendido aproximado de 2 cm de largo por 2 de ancho.
- Dejar secar a temperatura ambiente.
- Fijar la placa con calor.
- Dejar secar al medio ambiente.
- Cubrir el extendido de la placa con carbol-fuschina durante 10 minutos. NO APLICAR
CALOR.
- Lavar con agua de chorro hasta quitar el colorante.
- Decolorar con acido sulfrico a la concentracin requerida hasta que la placa quede
de un color rosado plido.
- Lavar con agua de chorro para eliminar el exceso del colorante.
- Cubrir con azul de metileno o verde de malaquita por 3 minutos.
- Lavar con agua de chorro para eliminar el exceso de colorante.
- Dejar secar la placa.

3- COLORACION DE WRIGHT PARA


LEUCOCITOS
Se realiza un extendido delgado y homogneo, preferiblemente de la parte que
contenga mas moco en una placa limpia y seca. Se deja secar muy bien y se realiza la
coloracin cubriendo el extendido con el colorante de Wright por 3 minutos y luego se
agrega agua destilada a PH de 6.7 a 7 durante 5 minutos. Lavar con agua y dejar
secar, observar con objetivo de 100X.

MONTAJE PRUEBAS QUIMICA CLINICA E


INMUNOLOGIA

Separacin de suero o plasma


El Suero o plasma debe ser separado lo mas pronto posible, salvo en casos donde se
demuestre que puede permanecer mas tiempo sin separarse.
El limite mximo se de DOS HORAS
NOTA: Un tiempo menor a dos horas se recomienda para Potasio, ACTH, Cortisol,
Catecolaminas y homocisteina:

Las muestras para SUERO deben coagular antes de ser centrifugadas


Tratar de evitar la hemlisis.
Los test o pruebas que se afectan seriamente por la hemlisis son: LDH, Potasio y
GOT.
Los test o pruebas que se afectan moderadamente son: Fsforo, protenas, albmina,
magnesio y calcio.
Evitar la exposicin a la luz en el caso de bilirrubina.
Algunas pruebas requieren sangre entera (e.g., plomo, cyclosporin, y
HemoglobinaA1C ). Estos especmenes no deben ser centrifugados. Si est
centrifugado accidentalmente, no deseche el espcimen; enve el tubo centrifugado.
Los tubos de la sangre deben ser mantenidos cerrados siempre preferiblemente y la
centrifuga debe ser cerrada para evitar aerosoles.
Mantener el tubo una posicin cerrada elimina la contaminacin exgena posible del
espcimen y previene la evaporacin y la posibilidad de derramamientos y de
aerosoles.

Preparacin previa al centrifugado


Lo ideal es no usar un separador plstico (palito revolvedor), pero si es necesario,
hacerlo con cuidado para evitar la hemlisis. Asegurarse de tapar el tubo nuevamente
luego de este procedimiento. El tubo debe permanecer tapado en todo momento.

Fase de Centrifugado
Las muestras en las que se realizara monograma (electrolitos), deben permanecer el
tiempo necesario para coagular y no se deben centrifugar ms de una vez, ya que se
incrementa falsamente el valor de potasio.
Se deben centrifugar las muestras de sangre a 2500-3000 rpm durante 15
minutos.

Fase post Centrifugado


Cuando sea necesario separar suero o plasma, se debe hacer en el menor
tiempo posible y con todo el volumen del mismo, la separacin se realizar en
un tubo limpio y seco previamente marcado con los datos del paciente y luego
de comprobar que se trata de la misma etiqueta en ambos tubos, se separar
por volcado, no se debe guardar el coagulo restante.

Una vez separado el suero debe ser refrigerado hasta su transporte o anlisis
De cualquier manera esta demostrado, que la mayora de los analitos, salvo
excepciones ya mencionadas, son estables por ms de 24 hs, y al menos por 8
hs a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, deben ser refrigerados. En el
caso de remitirse muestras, stas deben refrigerarse inmediatamente par el
envo en cadena de fro
Las muestra para glucosa en neonatos deben ser procesadas inmediatamente,
ya que sufren gliclisis mas rpidamente.

MONTAJE PRUEBAS COAGULACION


Las muestras que requieren PLASMA se deben separar tan pronto como sea posible
los tubos deben permanecer en posicin vertical.
Tratar de evitar la hemlisis.
Se deben centrifugar las muestras de sangre con citrato de sodio a 2500-3000
rpm durante 15 minutos.

MONTAJE PRUEBAS MICROBIOLOGIA

COLORACIONES
1. Coloracin de Gram:
La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas,
tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es
til como test para un rpido diagnstico presuntivo de agentes infecciosos,
tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para
valorar la calidad de la muestra clnica. Las bacterias se tien gram positivas (+),
gram negativas () o no se tien debido a sus diferencias en la composicin de
su pared y arquitectura celular.
Preparacin de la extensin: de eleccin sera utilizar portas mantenidos en un
contenedor con alcohol, los cuales se sacan y secan (al aire o por flameado)
justo antes de su uso. La extensin debe de rendir una fina monocapa
representativa
de
la
muestra:
- Torundas: hacerlas rodar ligeramente sobre el porta para evitar la
destruccin de elementos celulares y bacterias. Dejar secar al aire.
- Aspirados, exudados, esputos, heces, ... (muestras sin torundas):
seleccionar las partes ms purulentas y/o hemticas, y tras depositar una
pequea fraccin (con un asa, torunda, aplicadores estriles) hacer la
extensin con 2 portas:
- LCR y otros lquidos que requieren centrifugacin: tras centrifugacin (2.500-3.000
rpm durante 15 min.), desechar el sobrenadante y utilizar el sedimento (0,5 ml),
homogeneizndolo, verter una gota en un porta y dejar secar al aire. Puede
aadirse, opcionalmente, una segunda gota a la primera ya seca para aumentar
la
sensibilidad.
- Orina: sin centrifugarla, homogeneizar y depositar una gota sobre
el porta dejndola secar al aire (se considera que existen > 100.000 UFC/ml
orina si se observa 1 bacteria/campo de alto aumento [x1000] en todos los
campos
visualizados).
- Muestras muy reducidas: emulsionarlas con 0,5 ml de solucin
salina estril, agitar y depositar 1 gota en el porta, extenderla en una capa fina
con
la
ayuda
de
otro
porta
y
dejar
secar
al
aire.
- Biopsias: la tcnica ms utilizada es la extensin por cortado y
toques:
FIGURA
- Cultivos lquidos: depositar con pipeta Pasteur o con jeringaaguja estriles (hemocultivos, cultivos bifsicos de Castaeda), 1 2 gotas en
el porta y hacer una extensin fina con la ayuda de otro porta y dejar secar al
aire.
- Colonias en medio slido: colocar 1 gota de agua o solucin salina
(preferible, ya que el agua puede distorsionar la morfologa celular de
microorganismos frgiles) en un porta, depositar con un asa o aplicador estril 1

2 colonias, emulsionndolas (no muy vigorosamente por la posible formacin


de aerosoles) y extendiendo en una fina capa con la ayuda de otro porta y dejar
secar
al
aire.
Fijacin: La extensin puede fijarse con calor o metanol:
- Calor: se realiza sobre superficies calientes (hasta 60C) por
paso directo de 2 a 3 veces a travs de la llama, o por adicin de unas gotas de
alcohol sobre porta y posterior encendido hasta extincin de la llama. Evitar lo
posible el sobrecalentamiento. Esperar a que el porta se enfre antes de su
tincin.
- Metanol: previene la lisis de hemates y resulta en un ms claro
fondo. Tambin evita el probable arrastre de la extensin de muestras de orina,
semen, lquidos centrifugados en la etapa de lavado de la tincin. La tcnica
consiste en secar la extensin al aire, aadir unas gotas de metanol sobre sta
durante 1 minuto, decantndolo sin lavado y dejando secar la extensin otra vez al aire.
No
utilizar
el
calor
en
ningn
momento.
Tincin: existen varias modificaciones de sta segn reactivos recomendados,
tiempos de tincin y usos para la que se destine. Tradicionalmente se han venido
aplicando
las
3
siguientes:
- Bacteriologa en general: se 1 min el cristal violeta, 1 min la solucin
idica de Gram (lugol + bicarbonato sdico diluido), de 1 a 5 seg. la solucin
decoloradora de alcohol-acetona (1:1), y 30 seg. la safranina o fucsina bsica al 0,10,2%. A tener en cuenta que los tiempos de decoloracin son el paso crtico.

2. Coloracin de Ziehl Neelsen:


La tincin de Ziehl Neelsen fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner
de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras
clnicas de pacientes.
Esta tcnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
La tcnica de Z-N fuerza la penetracin de la fucsina bsica en la pared celular
mediante la accin combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa
de cidos miclicos: el calor derrite el componente ceroso y el fenol acta a modo de
disolvente, permitiendo el paso del colorante bsico que se une a los cidos miclicos
con carga negativa. Cuando cesa la aplicacin de calor y/o se elimina el exceso de
fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las
molculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor.
Con la coloracin de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados,
ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul.

Coloracin:
Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente
5 cm entre una y otra, una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloracin.
Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el
nmero de baciloscopias a colorear es pequeo, se puede filtrar la fucsina directamente
cuando se la deposita sobre el extendido a travs de un pequeo embudo con papel de
filtro.

Colocar sobre el soporte las lminas fijadas conservando el orden numrico con el
extendido hacia arriba y manteniendo una separacin de al menos 1cm entre ellas.
Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada recin filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el
embudo los extendidos.
Con la llama de un mechero calentar suavemente por debajo de los extendidos, con
movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores
blancos. No calentar demasiado ni hacer hervir..
En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
En el trmino de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisin de
vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se
fije a sus lpidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
Con una pinza, levantar cuidadosamente la lmina portaobjetos desde el extremo ms
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presin, con un frasco o un
grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la
solucin de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posterior.
Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y as evitar diluir los reactivos
que se utilizarn a continuacin.

Decoloracin:
Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar
aproximadamente 3 minutos.
Enjuagar con abundante agua a baja presin.
Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo
sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cmulos rojos o coloracin rosada
intensa, volver a cubrir con solucin decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos
y enjuagar nuevamente.

Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

Coloracin de fondo:
Cubrir todo el extendido con solucin de azul de metileno.
Dejar actuar durante un minuto.

Enjuagar las lminas en ambas caras con agua a baja presin y limpiar parte inferior
con un algodn si ha quedado coloreada.
Observar si las lminas conservan la numeracin clara y visible. Si no es as volver a
numerarlas.
Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical en un
soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

2. Coloracin de Giemsa:
Es la segunda coloracin en uso, luego de la tincin de Wright, y en importancia de las
mezclas de Romanowsky. Es quizs la mejor modificacin de este tipo de
coloraciones para descubrir parsitos en la sangre, como en el caso de malaria
(Plasmodium spp.) y tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de
Giemsa tambin da excelentes resultados para la tincin rutinaria de frotes
sanguneos. Cuando se va a teir con este colorante, debe fijarse primero la
muestra con metanol absoluto por un tiempo mnimo de tres minutos (cuando la
preparacin no incluye metanol). El colorante en solucin nunca se utiliza de
manera directa, por lo que se debe diluir con la solucin amortiguadora en una
proporcin de 1:10 1:20 y el tiempo de coloracin podr ser de 10 20
minutos, respectivamente.
Tcnica:
Fijar el frotis con alcohol metlico de 3-4 minutos. En caso de que la preparacin del
colorante ya posea metanol, este paso queda obviado.
Sumergirlo verticalmente en una solucin de Giemsa preparada extemporalmente a
partir de 1 volumen de la solucin colorante ms 9 volmenes de solucin tampn
(pBs, pH 6.8) o bien en agua desionizada.
Esperar durante 10-20 minutos.
Lavar el frotis con abundante agua, directamente del chorro.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol
para eliminar cualquier resto de colorante.
Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.