INTRODUCCION Las enzimas como catallzadores Catdlisis. Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energia muy rapidamente debido a la presencia de catalizadores bioldgicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgénicos, las enzimas modifican la velocidad de una reaccién quimica sin afectar el equilibrio final; y sdlo se requieren pequefias cantidades para efectuar la transformacién de un gran numero de moléculas de sustrato. Sin embargo, a diferencia de la mayoria de catalizadores inorganicos, las enzimas son bastante especificas, ya que catalizan un numero comparativamente pequefio de reacciones y en algunos casos tan solo una reaccién. Asi mismo, las enzimas funcionan solamente bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentra- cién de sustrato, cofactores, etc., propiedades que se ilustran en algunos de los experimentos siguientes. Clasificacién. Las enzimasse designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccién que catalizan. Los seis grupos principales de enzimas so! 1. Oxidoreductasas. 2. Transferasas. 3. Hidrolasas. 4. Liasas. 5. Isomerasas. 6. Ligasas (sintetasas). 230Enzimas 231 Cada enzima se designa por un nombre sistematico y por un numero que la identifica de acuerdo a sus grupos y subgrupos. La lactato: NAD oxido- reductasa, por ejemplo, es la ntimero 1.1.1.27. El primer numero nos dice que la enzima esté en el grupo 1 y por lo tanto es una oxidoreductasa. El segundo numero es el subgrupo e indica el grupo quimico que modifica, que en este caso es el —CHOH. El tercer nimerodenota el subgrupo, el cual indica que el aceptor de hidrégeno es el NAD o NADP. El cuarto es el nimero carac- teristico de la enzima. Existe también un nombre comun recomendado, mas corto y mas conveniente que el nombre sistematico. Para el caso delaenzima antes mencionada este es deshidrogenasa lactica. EXPERIMENTO 9.1 Catdlisis enzimatica Fundamento El perdxido de hidrégeno se descompone en agua y oxigenoen presenciade un catalizador. En este experimento, se compara la capacidad de la enzima catalasa y del catalizador inorgdénico para descomponer el peréxido de hidrégeno. Esto puede medirse titulando con permanganato de potasio y usando Mn" como catalizador. 5H,0,+2MnO,- +6H* ——> 50, +2Mn‘* +8H,0 Materiales 100 1. Peréxido de hidrégeno (10 mmol/1). 221 2. Amortiguador de fosfato sédico 0 potasico 51 (50 mmol/l, pH 7.2). 3. Solucién de catalasa (0.2 g/ml). 31 4, Platino coloidal (20 ug/ml). 31 5, HCl (5 mmol/l). 151 6. MnCl, (0.1 mol/l). 500 ml 7. Patrén de KMnQ, (2 mmol/I). 101 8. Buretas (10 ml). 50 9. Bafio de agua a 37°C. 25 10. KCN (10 mmol/1). ;Cuidado: Veneno! 31 Método . Catélisis. Prepare cinco tubos de ensayo pyrex que contengan la mezcla indicada en la tabla siguiente y coléquelos en un bafio de agua a 37°C. Al mismo tiempo, coloque la solucién de perdxido de hidrégeno en el bafio de agua hasta alcanzar una temperatura de 37° C. Después de que permanezca5 minutos a esta temperatura comience la reaccién afiadiendo 5 ml ala mezcla presente en cada uno de los tubos. Remueva los tubos después de 3, 6,9, 12 y 15 minutos de incubacién e inmediatamente pare la reaccién agregando 5 ml de232 Bloquimica practica Componentes mi agua 3ml amortiguador de fosfato (50 mmol/l, H 7.2). Imi catalizador (catalasa o Pt coloidal) Imi HCI 5 mol/l para inactivar el catalizador. Coloque los tubos en un bafio de hielo y titule los contenidos de cada tubo con solucién patrén de KMnO,. Titulacién. A cada muestra agregue dos gotas de MnCl; 0.1 mol/I titule con KMnO, 2 mmol/I hasta obtener un color rosado palido. Si el KMnO, ha sido preparado en tal forma que sea realmente una solucién patrén, entonces 1 ml serd equivalente a5 1 mol de H, O,. Usando los datos de la titulacién, haga un grafico de la desaparicién de H, O, contra tiempo después de corregirel error debido a la descomposicién espontanea del H, Op. Controles. El H,O, es inestable y se descompone un poco espontdneamente en ausencia del catalizador. Para corregir el error que esta descomposicién introduce en los resultados se debe incubar paralelamente con la muestra una serie de tubos que contengan H, O;, amortiguador y agua pero sin catalizador. El valor obtenido en estos tubos se resta del de las muestras. Comparacién de los catalizadores. Los estudiantes deben trabajar en parejas y mientras uno de ellos hace el experimento con catalasa, otro usa platino coloidal. Todos los ensayos deben hacerse por duplicado. Usando el grfico calcule la actividad de cada catalizador a partir de la pendiente de la curva y exprese los resultados en términos de micromoles de H,O, descompuesto por minuto por miligramo de catalizador. Ademés, exprese los resultados en forma de micromoles de H,O, descompuesto por minuto por micromol de catalizador y compare la eficiencia relativa de la catalasa y del Pt coloidal. Peso molecular del platino = 195, Peso molecular de la catalasa = 25 000. Para efectos de los célculos suponga que hay s6lo un centro activo por cada &tomo o molécula. Envenenamiento. Repita el experimento con los dos catalizadores, pero utilice 1 ml de una solucién de KCN 10 mmol/l en vez de 1 ml de agua. Precaucién: este compuesto es venenoso; por tanto, no use pipetas sino una bureta para dispensarlo. Comente los resultados. Medicién de la actividad enzimatica Ensayo de la enzima. Debido a quesélo se necesitan muy bajas concentracio- nes de enzima para catalizar una reaccién dada, s6lo muy pocas enzimasEnzimas 233 pueden medirse directamente. Por consiguiente, la presencia de una enzima se demuestra generalmente siguiendo la desaparicién del sustrato o la aparicién de un producto de la reaccién. La enzimaes incubada con el sustrato bajo condiciones cuidadosamente controladas y se sacan alicuotas aintervalos de tiempo apropiados para ser analizados. Controles. Ademés de las ‘muestras’, siempre se preparan ‘controles’, unode los cuales no contiene enzima mientras el otro contiene enzima pero no sustrato. Pueden ser necesarios también otros ‘controles’ cuando la enzima requiere varios cofactores, El objeto de los controles es corregir los errores que se presenten debido a reacciones quimicas esponténeas no especificas ni catalizadas por la enzima. Curvas de progreso. La velocidad de una reaccién enzimatica se puede expresar como funcién de la concentracién de sustrato transformado o producto obtenido con respecto al tiempo, luego de restar los valores debidos a cualquier transformacién no enzimatica. El tipo de curva obtenidose muestra en la figura 9.1 y se conoce como gurva de progreso. La transformacién del sustrato con respecto al tiempo es lineal al comienzo, pero pronto comienzaa disminuir. Inicialmente no hay productos presentes en la mezcla de incubacién, pero, a medida que progresa la reaccién, la reaccién inversa se hace més y més importante hasta alcanzar el equilibrio. La concentracién de sustrato también disminuye con el tiempo de manera que la actividad se hace menor porque la enzima estard menos saturada de sustrato. Finalmente, la enzima puede ser inhibida por los productos formados o puede inactivarse lentamente bajo las condiciones experimentales. Todos estos efectos juntos hacen que sea casi imposible derivar una ecuacién esténdar que se ajuste ala curva de progreso. Por tanto la actividad enzimética (v) se determina conside- rando tinicamente la velocidad inicial de reaccién (v = a/b) ya que en tales condiciones los efectos discutidos son mas pequefios (figura 9.1). Le actividad enzimética inicial es la pendiente ‘do la parte lineal de la curva, v= 2/6. Sustanc! wansformada, s Tiempo, ¢ Figura 9.1 Curva tipica de progreso234 Bloquimica practica Unidades enzimaticas. La actividad enzimdtica se expresa frecuentemente en términos de unidades (U). Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la conversién de un micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas. En algunos casos la unidad es muy grande y laactividad debe expresarse mAs adecuadamente en términos de nmol/min o pmol/min. La unidad SI de actividad enzimatica es la’ katal (kat) que representa la transformacién de 1 mol de sustrato por segundo, Esta unidad es grande pero se pueden obtener valores més facilmente manejables expresando las actividades en microkatals (kat), nanokatals (nkat) o picokatals (pkat). 1U=14umolmin", 1 katal = 1 mols’, 1 U = wkat/60 = 16.67 nkat. La pureza de una enzima se expresa en términos de actividad especifica que se define como el ntimero de unidades enzimaticas (U) por miligramo de proteina. La actividad especifica en unidades SI se da en katals por kilogramo de proteina. Las actividades relativas de enzimas puras pueden ser comparadas usando como referencia sus actividades molares. Esto se conoce también como actividad molecular 0 niimero de recambio definido como el niimero de moléculas de sustrato transformados en un minuto por una molécula de la enzima bajo condiciones éptimas. Por ejemplo, la actividad molar de la catalasa es aproximadamente de 5 x 10°. EXPERIMENTO 9.2 Curva de progreso obtenida durante la hidrélisis de p-nitrofenilfosfato por la fosfatasa alcalina sérica (monoéster ortofosférico fosfohidrolasa, 3.1.3.1.) Fundamento La fosfatasa alcalina (pH éptimo 9—10) se halla en hueso, rifién, higado e intestino y acttia sobre los ésteres fosféricos liberando fosfato inorgénico. OH OH R-O-f-0 + H,0 ——> R-OH + Ho-f-0 HH OH Para su determinacién se usa como sustrato p-nitrofenilfosfato y el p-nitrofenol liberado por la hidrélisis enzimatica es medido colorimétrica- mente. El p-nitrofenol en solucién alcalina absorbe a 405 nm. El sustrato p-nitrofenilfosfato no absorbe a esta longitud de onda, de manera quel curso de la reaccién catalizada por la-enzima puede ser seguido facilmente midiendo el cambio de la extincién a 405 nm (experimento 4.7).Enzimas 235 | Materiales 100. 1. Amortiguador de bicarbonato-carbonato de sodio 500 ml (0.1 mol/1, pH 10.0). 2. Solucién de sustrato, p-nitrofenil fosfato (5 mmol/1 en 500 ml amortiguador alcalino). 3. Patrones de p-nitrofenol (50 “mol/1). Disuelva 69.6 mg li de p-nitrofenol en 100 ml de amortiguador alcalino, diluya esta solucién 1 a 100 con el amortiguador. Las soluciones (2) y (3) siempre deben estar frescas para cada experimento. 4. Suero. 50 ml 5. Colorimetros. 50. Método Prueba. Agregue 0.8 ml de amortiguador de carbonato-bicarbonato a 2ml de lasolucién de sustrato y mezcle vigorosamente. A un tiempo cero agregue 0.2 ml de suero y siga el cambio en extincién a 405 nm. Blanco. Se prepara lo mismo que la muestra, excepto que en vez de 0.2 ml de suero.se usa amortiguador. Patrén. Prepare una serie de soluciones de p-nitrofenol y haga un grafico de la extincién a 405 nm en funcién de la concentracién. Actividad enzimatica, v Concentracién de enzima, @ A. Respuesta normal 8. (i) Parte no lineal de 1a curva de progreso usada para calcular la actividad. {ii) Inhibidor presente en la preparacién de enzima, ©. Activador presente en la praparacién enzimatica, D. Agotamiento del sustrato. E, Inactivadores tales como metales pesados en la mezcla de reaccién, Figura 9.2 Efecto de la concentracién de enzima sobre la actividad236 © Bloquimica practica Célculos Reste el valor de la extincién obtenida para el blanco del valor dela muestray calcule a partir de la curva patrén el p-nitrofenol liberado. Exprese la actividad de la fosfatasa alcalina sérica en términos de unidades por mililitro de suero recordando que en el ensayo se usaron 0.2 ml de suero. Concentracién de la enzima Las pruebas enziméticas se hacen en una alicuota del material disponible pero la actividad debe referirse al volumen total de la soluci6n o del peso de la enzima. Por ejemplo, en bioquimica clinica se usa 0.1 ml 60.2ml desuero pero la actividad se expresa en unidades por litro. Por esta razén es importante determinar si la actividad varia linealmente con la concentracién de la enzima. Cualquier desviacion de la linealidad es el resultado de algin factor limitante (figura 9.2). EXPERIMENTO 9.3 Variacion de la actividad de la fosfatasa alcalina con la concentracion de la enzima Materiales Prepara 21 de amortiguador y sustrato y 200 ml de suero tal como lo hizoenel experimento anterior. Este material es suficiente para 50 parejas de estudiantes. Método Repita el experimento anterior con voliimenes de suero desde 0.1 a 0.6 ml. El volumen del sustrato se mantiene constante (2 ml) y el volumen del amortiguador se ajusta de manera que la mezcla final sea 3 ml como anterior- mente. Se prepara una curva de progreso para cada volumen de suero como se describié arriba y se determina la velocidad inicial de la reacci6n. Haga un grafico de la actividad enzimatica en funcién de la concentracién de enzima expresada como mililitros de suero. : Escoja un tiempo conveniente mas all de la porcién lineal de la curva de progreso y exprese la actividad como la cantidad promedio de p-nitrofenol liberada por minuto. Haga un grafico de la concentracién de enzima en funcién de la actividad y compare los resultados con la curva anterior, en la cual se usaron las velocidades iniciales para expresar la actividad. ACTIVIDAD ENZIMATICA Y CONCENTRACION DE SUSTRATO Enzimas del tipo Michaelis-Menten Cinética. Si se determina la actividad de una enzimaen presencia de concen- traciones crecientes de sustrato, se obtiene generalmente una curva hiperbélica rectangular similar a la que se muestra en la figura 9.3.Enzimas 237 Actividad enzimatica, v Concentracién de sustrate, s Figura 9.3 Efecto de la concentracién de sustrato sobre Ja actividad enzimatica A bajas concentraciones de sustrato v cambia linealmente con s, dando cinética de primer orden: v = —ds/dt = Ks, donde k es la constante de velocidad. A concentraciones altas de sustrato v es independiente de s, dando una cinética de orden cero: v = —ds/dt = constante = V. A concentraciones intermedias de sustrato se halla una mezcla de ciné- ticas de cero y primer orden. Se puede obtener una ecuacién que relacione v y s para la curva entera. Esta ecuacién fue derivada por primera vez por Michaelis y Menten en 1971: Vs . donde V y K,, son constantes. El supuesto basico en su derivacién es que la enzima y el sustrato forman un complejo que se disocia para dar la enzima y los productos. Derivacién de la ecuacién de Michaelis, Para derivar esta ecuacién, Mi- chaelis y Menten presumieron que la velocidad de disociacién del complejo es tan pequefia que no perturba significativamente el equilibrio entre la en- zima y el sustrato. Posteriormente, Briggs y Haldane extendieron esta idea y derivaron una ecuacién para condiciones de equilibrio dindmico, es decir, cuando la velocidad de disociacién del complejo es la misma que su velocidad de formacién durante el perfodo en que se hacen las mediciones.+ 238 Bloquimica practica Este supuesto més general se hace en la derivacién siguiente. El proceso total puede representarse por la ecuacién general: E +s ate Es ++ E+ Productos, (e—p) (s) “" @) donde e = concentracién de la enzima (E),$ = concentracién de sustrato (S), p = concentracién del complejo enzima-sustrato (ES) y ky, Rea, k-1 = constantes de velocidad. La concentracién del sustrato libre se considera igual asu concentracién total, ya que la cantidad que se encuentra ligadaen el com- plejo es generalmente pequefia. La velocidad de formacién de ES = k, | (e—p)s. La velocidad de disociacién de ES = k_ 1p + Rs 2p. . Bajo condiciones de equilibrio dindémico, la velocidad de formacién = la velo- cidad de disociacién, asi que: heyy (@ — p)s = (R-1 + Re2)p- Reagrupando esta ecuacién tendremos: PM o# (Bay the Mea) La velocidad de la reaccién enzimatica esté dada por v = k,, p, asi que: keynes s+ (Ray + Rea (Re) Cuando toda la enzima esté presente en forma de complejo, se obtiene entonces la velocidad maxima posible la cual est4 dada por V = k,, e. Sise reemplaza la expresién (k_, +hk,2)/(k+1) Por Km, entonces la ecuacién se transforma.en: Vs v o v=. s+Km 1+Ky/s v= Estas expresiones pueden reagruparse para obtener la forma usual de: (V—v)(Km +8) = VKm-Enzimas 239 Las constantes cinéticas Ky, y V. Sis = Km,entonces v = V/2, por lotanto, la constante de Michaelis es la concentracién de sustrato a la cual se obtiene la mitad de la velocidad maxima. Si se dan las condiciones de equilibrio sugeridas por Michaelis y Menten, entonces k, 2 es pequefia en comparacién de k, ,y puede ser ignorada. Por lo tanto, Km = k,/ks1,y es la constante de disociacién del complejo enzima- sustrato. Una Km grande implica, por tanto, una constante de disociacién grande o una constante de asociacién pequefia (1/Km). Al contrario, una K,, pequefia implica una constante de disociacién pequefia o una constante de asociacién grande (1/K,,). La constante de Michaelis da por lo tanto una medida de la afinidad enzima-sustrato. K,, grande = baja afinidad enzima-sustrato. K,, baja = alta afinidad enzima-sustrato. Las constantes cinéticas K,, y V pueden determinarse més conveniente- > mente utilizando una transformacién lineal de la ecuacién de Michaelis, que se obtiene tomando reciprocos: Km =a+5@yx Vv ein |e sustrato depende, por lo tanto, del nimero de sitios activos ocupados en * determinado momento por las moléculas del sustrato. A pesar de que la hemoglobina no es una enzima se puede usar como un buen ejemplo de una proteina alostérica que posee cuatro sitios de unin para el oxigeno. La facilidad relativa con que se unen los 4tomos de oxigeno del primero al cuarto es del orden de 1:4:24:9. Control metabélico. Las enzimas alostéricas tienen sitios especificos para la unin de activadores e inhibidores los cuales pueden actuar causando unEnzimas 243 Actividad enzimatica, v Coneentracién de sustrato, s. Figura 9.5 Efecto de la concentracién de sustrato sobre la actividad de una enzima alostérica cambio en la conformacién'de la proteina. Esto permite a los compuestos que no estan quimicamente relacionados con el sustrato unirse a la enzima y afectar su actividad. Por tanto, las enzimas alostéricas se encontrarén en muchos puntos de control metabdlico. Por ejemplo, el citrato es un inhibidor alostérico de la fosfofructocinasa, una enzima clave en el control de la gli- célisis, asi que, cuando el citrato se acumula en el ciclo de los dcidos tricar- boxilicos, la velocidad de la glicélisis disminuye para evitar la acumulacién de intermediarios del mismo ciclo. Por el contrario, AMP y ADP son acti- vadores alostéricos de la fosfofructocinasa, asi que cuando la concentracién de ATP es baja (ADP y AMP altos), la velocidad de la glicélisis aumenta. Cinética alostérica. La derivacién de una ecuacién exacta’ para la curva sigmoidea de las enzimas alostéricas es complicada, pero se puede obtener una ecuacién simplificada en la forma sugerida por Atkinson, si se hacen los siguientes supuestos: 1. Los intermediarios ES, ES,, ES,, etc., tienen sélo una existencia transi- toria. 2. El equilibrio entre la enzima y las moléculas de sustrato se obtiene répidamente. Si hay n sitios de unién para el sustrato S, entonces: E+nS = ES, 4+ E+ Productos. Suponiendo condiciones de equilibrio, ka _(EMS)" | ku: (ES, ] °244° Bloquimica practica reordenando, [B} = ae (1) Ahora, si la cantidad total de enzima presente es [Ep], entonces: [Eo] = [E] + [ES,], y reordenando, [E] = [Eo] —[ES,,]. Multiplicando por ks: 3 [E] = k3 [Eo] —k3[ES, ]. (9-2) Ahora v=k3[ES,] (9-3) Bd V= ks [Eo]. (94) Sustituyendo (9-3) y (9-4) en (9-2) se obtiene: kes [E] = V—v. (9-5) Sustituyendo (9-1) en @-5) tenemos: Sustituyendo (9-3) en (9-6): V-v= a . (9-7)Enzimas 245 Reordenando la ecuacién, v[s]” - VIS" BG K+ [s]" Si hay un solo sitio de unién parael sustrato(n = 1),entonces esta ecuacidn se transforma en la ecuacién de Michaelis y se obtiene una curva hiperbilica. Constantes cinéticas. Se puede obtener una transformacién lineal facil de usar tomando los logaritmos de la Eq. (9.7). Las constantes cinéticas se pueden calcular a partir del grafico de linea recta (figura 9.6). log u/(V — v) = nlog [S] —log K nda el ntimero de sitios de unién si los supuestos originales son correctos, pero en la préctica n es usualmente menor, puesto que la existencia de intermediarios no es transitoria. n puede ser considerado como el grado de cooperatividad: a medida que se incrementa el valor de n, el grafico v con respecto a [S] se hace més sigmoideo. Kes en la préctica una constante de equilibrio dinémico complicada, y pa- ra las enzimas alostéricas, cuando [S] = K, v no es V/2; pero, cuando v = V/2, podemos obtener a partir de la Eq. (9.7): 2[S]}" =K. Figura 9.6 Determinacién de las constantes cinéticas para una enzima alostérica246 © Bloquimica practica Por consiguiente, la concentracién de sustrato que da el 50% de la actividad méxima se relaciona con la constante K en la siguiente forma: K=[S]3o0 0, usando logaritmos, : log K = n log{S]} 50 EXPERIMENTO 9.5 Deshidrogenasa isocitrica de levadura: una enzima alos- térica* Fundamento La deshidrogenasa isocitrica de levadura cataliza la conversi6n de L-iso- citrato aa -cetoglutarato y diéxido de carbono usando NAD como coenzima. Este es un punto de control fundamental en el ciclo del Acido tricarboxilico que puede ser modificado por un numero de efectores incluyendo NAD, AMP y Mg”. La actividad enzimatica se mide siguiendo el incremento en ‘extincién a 340 nm a medida que el NAD se reduce a NADH). coo" coo" bu, bu, u-t-coo-+NaD ==> i + NADH, +C0, Ht H 0: 007 boo- L-Isocitrato a-Cetoglutarato Materiales 10 1. Levadura fresca de panaderia. 150 g 2. Arena lavada. = 3. Bicarbonato de sodio (0,1 mol/1). 200 ml 4. Amortiguador de tris-HCI (30 mmol/1, pH 7.4). 500 ml 5. D, L-isocitrato de sodio en amortiguador de tris, pH 7.4. 200 ml 6. NAD (2 mmol/l) en amortiguador de tris, pH 7.4. 250 ml 7, AMP (3 mmol/l) en amortiguador tris, pH 7.4. 50 ml 8 MgCl, (0.1 mol/l). 50 ml 9. Morteros y manos de mortero. 5 10. Espectrofotémetros ultravioleta con registrador. 5 11. Bafios de agua a 30°C. 5 *Con permiso del Dr. P. J. Butterworth.Enzimas 247 Método Preparacién de la enzima. Usando un mortero y una mano de mortero, prepare un extracto crudo de la enzima moliendo levadura fresca con arena lavada y solucién de bicarbonato de sodio (0.1 mol/l). La pared celular de la levadura es muy resistente y se necesita molerla muy bien para quese rompa. La proporcién de levadura y arena se ajustan en forma tal que haya suficiente arena para dar un méximo de accién abrasiva y suficiente bicarbonato para que la enzima que se libera pueda disolverse. La molienda requiere practicay se aconseja que un monitor prepare el extracto fresco para la clase. Después de molerla, transfiera la mezcla a tubos de centrifuga y remueva la arena y las particulas celulares grandes centrifugando a 1000 g durante 10 minutos. Recoja el sobrenadante y vuelva a centrifugar a 30 000 g durante 1 hora. Descarte el precipitado y almacene el sobrenadante sobre hielo hasta que se necesite. Determinacidn de la enzima. Prepare una serie de tubos que contengan las siguientes miezclas de reaccién e incube a 37° C durante 10 minutos. NAD (2 mmol/l) 1.5 ml MgCl, (0.1 mol/1) 0.1 ml Enzima diluida 0.2 ml La cantidad de enzima necesaria debe determinarse previamente y si la preparacién es muy activa debe diluirse con amortiguador de tris. Comience la reaccién afiadiendo 1.2 ml de sustrato previamente incubado a 37° C y siga el incremento en extincién a 340 nm. Incluya los blancos y controles apropiados para corregir el efecto de reacciones no enziméticas. Experimento. Mida la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato desde 0.1—1.2 mmoi/I. Esto se obtiene comenzando la reaccién con 0.1 a 1.2 ml de sustrato y afiadiendo amortiguador tris hasta que el volu- men final afiadido sea 1.2 ml. Se usa como sustrato una mezcla de las formas Ly Dy por consiguiente la concentracién de L-isocitrato varia de 0.05 a 0.6 mmol/1. Repita el experimento pero ahora incluya AMP en la mezcla reaccionante para obtener concentraciones finales de este metabolito de 0.2 mmol/I y 0.5 mmol/l]. Exprese la actividad enzim&tica en términos de nanomoles de NAD reducido por minuto y prepare gr&ficos de v con respecto a [S], 1/v con respecto a 1/[S] y log v/(V - v) con respecto a log [S]. Si el tiempo lo permite, repita el experimento anterior después de calentar . la enzima a 60° C durante 5 minutos. Otro experimento posible consiste en examinar el efecto de la.concentraci6n de Mg” sobre la reaccién.248 Bloquimica practica COENZIMAS Y ACTIVADORES. Hay muchos casos en que si se mezcla una enzima con su sustrato bajo condiciones apropiadas, o no hay catdlisis ose obtiene sélomuy poca actividad. Esto se debe frecuentemente a la ausencia de una coenzima o activador. Coenzimas Son compuestos organicos de bajo peso molecular que participan activamente en la catdlisis. Con frecuencia actiian como aceptores.o donadores de grupos quimicos especificos. Por ejemplo, NAD acepta y dona dtomos de hidrégenoy es una coenzima para muchas de las dehidrogenasas. El nombre coenzima se daa cofactores solubles, mientras que el término, grupo prostético, se reserva para coenzimas que estén fuertemente unidas a la proteina. Activador Son compuestos de naturaleza quimica simple y no son tan especificas como las coenzimas, Parece que actdan activando el complejo enzima-sustrato. Se sabe que muchos de los iones metélicos son activadores de una gran variedad de enzimas; por ejemplo, Mg"*, como en el experimento 9.7. EXPERIMENTO 9.6 Nicotinamida adenina dinucledtido como coenzima de la deshidrogenasa ldctica (L-lactato: NAD oxidorreductasa, 1.1.1.27). Fundamento Muchas de las oxidaciones biolégieas se efecttan mediante la remocién de hidrégeno que es transferido a un aceptor tal como NAD. La enzima y el sustrato pueden estar presentes en la mezcla reaccionante, pero la reaccién no se efectiia sin la coenzima. El piruvato forma un compuesto de hidrazona altamente coloreado con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNP), mientras que los otros compuestos de la mezcla de reaccién no absorben a la longitud de onda usada en el ensayo. La cantidad de piruvato transformada en lactato puede ser medida. Se preparan dos tubos de ensayo en duplicado, uno con NADH y el otro sin ella. CH;CO-COOH +NADH, <= CH,CH(OH)COOH + NAD Piruvato Lactato Materiales 100 1. Amortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/1), pH 7.4. 11 2. Piruvato de sodio. Disuelva 0.5 g en 100 ml de amorti- 500 ml guador de fosfato. El sustrato amortiguado se prepara diluyendo la solucién anterior 1 a 50 con amortiguador, para dar una concentracién de 100#g/ml.Enzimas 249 3. Nicotinamida adenina dinucleétido reducido (10 mg/ml), 20 ml Se prepara antes de usarla en amortiguador de fosfato, 4. 2,4-dinitrofenilhidrazina (2 mmol/l). Disuelva 40 mg 500 ml en 9 ml de dcido clorhidrico concentrado y complete con agua hasta 100 ml. 5. Hidréxido de sodio (0.4 mol/1). 51 6. Deshidrogenasa lactica. Se puede usar en suero o una 50 ml dilucién apropiada de enzima comercial preparada a partir de misculo de conejo. 7, Bafios de agua a 37°C. 20 Método Prepare cuatro tubos de ensayo en duplicado en la forma como se indica enseguida y equilibre a 37° C. Muestra Muestra Blanco (B) Control (C) (™ 1) (M 2) Sustrato en amortiguador (ml) 1 1 1 Amortiguador de fosfato (ml) . F NADH, (ml) OL = = = Se afiade 0.1 ml de la enzima a todos los tubos excepto al control. Después de incubar por 15 minutos, se agrega 1 ml de DNP.a todos los tubos.y se les deja reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Se desarrolla el color mediante la adicién de 10 ml de hidréxido de sodio. Después de 10 minutos, se lee la extincién a 510 nm contra un blanco de agua. Célculos El tubo de control contiene 10 4g de piruvato, asi que la cantidad de piruvato convertida en 15 minutos esta dada por: control — muestra control — blanco. * 20 #E: EXPERIMENTO 9.7 Activacién de la fosfatasa alcalina de intestino de ternero por iones de magnesio Fundamento La fosfatasa alcalina es activada por iones divalentes incluyendo Mg**, Mn**, Zn**, Co**, pero el efecto se obtiene especialmente con Mg” . La concentra- cién de Mg** para obtener la maxima activacién es un poco alta, alrededor de250 Bioquimica practica 5 mmol/l, y por tal raz6n se ha sugerido qué la sal de magnesio del éster de fosfato sea el verdadero sustrato. Materiales y métodos Los materiales y métodos usados son los mismos del experimento 9.2, excepto que la enzima de intestino de ternera se usa en lugar de suero y también se necesita MgCl). Diluya la enzima de ternera hasta obtener una actividad conveniente para el ensayo con 10 mmol/l MgCl», luego prepare una serie de tubos. con diferentes concentraciones de MgC], desde 0 hasta 10 mmol/l y determine la actividad. Prepare un grafico de la actividad en funci6n de la concentracién de MgCl. INHIBICION ENZIMATICA Tipos de inhibicién Muchos compuestos reaccionan con las enzimas produciendo una disminu- cién en su actividad. Esta propiedad de las enzimas es usada para disefiar drogas e insecticidas que inhiban selectivamente ciertas enzimas en la bacteria o insecto infectante, pero que no afecten a los animales o las plantas. Los dos principales tipos de inhibicién son: competitiva y no competitiva. Inhibicién competitiva. En este caso el inhibidor reacciona con la énzima compitiendo con el sustrato por el sitio activo. El grado de inhibicién depende de las concentraciones relativas del sustrato y del inhibidor, y se puedé précticamente obtener la velocidad méxima en presencia del inhibidor cuando la concentracién del sustrato es suficientemente alta. Ocasionalmente, la inhibicién es irreversible y el sustrato no puede desplazar el inhibidor ligado a la enzima, Este es el caso de algunos inhibidores organo-fosforados de la colinesterasa. La inhibicién competitiva se puede observar cuando el inhibidor se une a un lugar suficientemente cercano al sitio activo para disminuir la afinidad de la enzima por el sustrato. Los inhibidores competitivos tienen estructuras quimicas semejantes al sustrato natural y son bastante espectficos. Esto puede ilustrarse para el caso de la enzima succinico deshidrogenasa, la cual cataliza la conversién de succinato a fumarato, El malonato y el maleato actian como inhibidores competitivos de esta enzima. CH, COOH CHCOOH : +FAD == I + FADH, 1H, COOH HOOCCH Sustratos: Succinato FumaratoEnzimas 251 COOH CH-COOH 1H du. COOH ‘00H Inhibidores: Acido malénico Acido maléico Inhibicién no competitiva. En la inhibicién no competitiva, el inhibidor se combina con la enzima pero no en‘el sitio activo, de manera que la enzima puede ligarse al sustrato y al inhibidor al mismo tiempo. El sitio de unién del inhibidor esta generalmente lejos del sitio activo, por lo cual noafecta la ynién del sustrato. El complejo enzima-sustrato-inhibidor no puede disociarse y la inhibicién ocurre por disminucién de la cantidad de enzima disponible. El aumento en la concentracién de sustrato no tiene efecto sobre el grado de inhibicién. La mayoria de los inhibidores no competitivos no estan relacionados quimicamente con el sustrato y ef mismo inhibidor puede afectar varias enzimas. Entre los ejemplos de inhibicién no competitiva tenemos la accin de los agentes que bloquean los grupos tioles tales como el p-cloromercuribenzoato, los iones de metales pesados como Ag** y Cu**, y la reacci6n del cianuro con las enzimas que contienen hierro-porfirina. Determinacién de las constantes de inhibicién (K,). En presencia de un inhibidor, la ecuacién de Michaelis-Menten varia tal como se muestra a continuaci6n, donde i es la concentracién del inhibidor y K, la constante de inhibicién. Sin inhibid = in inhibidor, ——.. 1+ (Km/s) v Inhibidor competitivo, v= ———__—_.. 1+Kyq/(1 + i/Kj) Inhibidor no competitivo es °° 0+ Kn + VK) ‘Tomando los reciprocos de la ecuacién: Km Sin inhibidor, 2 =— v v ole 1 sot Le252 Bloquimica practica Inhibidor competitive, 2-+,4%e (2 a )2. vu V Vv Inhibidor no competitivo, Un gréfico de (1/v) en funcién de (1/s) puede usarse para determinar K, y el tipo de inhibicién en la forma como se indica abajo (figuras 9.7 y 9.8). Un inhibidor competitivo altera el K,, mientras que el no competitivo origina un cambio en V. Vy “atiKy Vy K,, se determinan en ausencia y en presencia de un inhibidor y como se conoce i, el K, se puede calcular facilmente. Otra forma util de determinar K, y el tipo de inhibicin consiste en medir la actividad de la enzima a concentraciones fijas de sustrato variando las concentraciones del inhibidor. Se hace un grafico de (v/v,) en funcién de i, donde v es la actividad en ausencia del inhibidor y v; la actividad en presencia de inhibidor en una concentracién (i). Se repite el experimento usando diferentes concentraciones de sustrato y se comparan los resultados. Inhibidor , Sin inhibidor 1 1 0 1 Figura 9.7 Efecto de un inhibidor competitivo sobre la presentacién de Lineweaver-BurkEnzimas 253, Inhibidor - “oy Sin inhibidor Figura 9.8 Efecto de un inhibidor no competitivo sobre la representacién de Lineweaver-Burk Para un inhibidor no competitivo: Para un inhibidor competitivo: Tal como se puede apreciar de las ecuaciones anteriores, el grafico de (v/v,) en funcién dei para el caso de 1a inhibicién no competitiva es indepen- dierite de la concentracién de sustrato s, mientras que la pendiente para el tipo de inhibicién competitiva es dependiente de s, Este método es especialmente Util si se tiene dos sustratos y se desea saber si una misma enzima actiia sobre ambos. Se puede absolver esta pregunta introduciendo un inhibidor no competitivo puesto que en un grafico (v/v,) en funcién de i, los puntos deberan aparecer sobre.la misma linea si la enzima actta sobre los dos sustratos. En la practica, se obtienen otros tipos de inhibicién diferentes de los casos simples considerados acd. EXPERIMENTO 8.8 Efecto de los inhibidores sobre la deshidrogenasa léctica de corazén de buey Fundamento La deshidrogenasa lactica cataliza la reduccién reversible de Piruvato a lactato usando como coenzima NADH,. La coenzima reducida (NADH,) adsorbe fuertemente a 340 nm, mientras que la forma oxidada (NAD) no254 Bioquimica practica adsorbe a esta longitud de onda, y el avance de la reaccién puede seguirse midiendo el descenso en la extincién a 340 nm usando piruvato como sustrato. La teoria de este método se expuso més extensamente en el capitulo 4. En este experimento se examinan dos compuestos que tienen estructura similar al sustrato natural piruvato para ver sison inhibidores competitivos 0 no competitivos. CH; CH, =O + NADH, == u-t-on + NAD 100" 007 Sustratos: Piruvato L-lactato OH NH; bo y bo boo- boo- Inhibidores: Oxalato Oxamato Materiales 10 1. Amortiguador de fosfato (0.1 mol/l, pH 7.4). 11 2. Piruvato de sodio (21 mmol/l, preparese fresco en 200 ml amortiguador de fosfato). 3, NADH, (3.5 mmol/I, preparese fresca). 25 ml 4, Deshidrogenasa léctica de corazén de buey, diluida en 100 ml amortiguador de fosfato, si lo cree necesario. 5. Oxalato de sodio (3 mmol/1 en amortiguador de fosfato). 50 ml 6. Oxamato de sodio (15 mmol/l, en amortiguador de fosfato). 50 ml 7. Bafios de agua a 37°C. 5 8. Espectrofotémetros registradores. 5 Método Ensayo inicial. Prepare la mezcla siguiente en duplicado y equilibre a 37° C durante 10 minutos. a Componente mi Amortiguador de fosfato 25 NADH, (3.5 mmol/l) 01 Deshidrogenasa léctica de coraz6n de 03 buey (diluida) ——————Enzimas 255 Afiada répidamente 0.1 ml de la solucién de piruvato de sodio preincubada a 37° C, transfiera a una cubeta y observe el cambio de extincién a 340 nm en funcién del tiempo, en una celda (calentada termostaticamente) de un espectrofotémetro ultravioleta. Diluya la preparacién enzimatica hasta obtener en la regién un cambio de extincién de 0.05 - 0.10 por minuto. Cilculo de la actividad. Las actividades enzimaticas se pueden expresar adecuadamente en nanomoles por minuto por mililitro de enzima o en nanomoles por minuto por miligramo de proteina. El coeficiente de extincién molar de NADH, a 340 nm es 6.22 x 1031 mol~! cm™, asi que una solucién de 1 #mol/ml tiene una absorcién de 6.22. Para la mezcla de reaccién de 3 ml usados en la prueba, Actividad enzimética (umol/min) = cambio en extincién por minuto /6.22 x 3. Dado que se usaron 0.3 ml de la solucién enzimatica, Actividad enzimAtica (umol min“ ml~!) = Extincién por minuto /6.22 x 3 x 1.0/0.3 = Extincién por minuto x 1.61. La actividad final se obtiene multiplicando por el factor de dilucién para obtener micromoles por minuto por mililitro y dividiendo por la concentra- cién de proteinas en miligramos por mililitro para dar micromoles por minuto por miligramo. Determinacién de la constante de Michaelis. Diluya la solucién de piruvato de sodio diez veces y repita el experimento anterior usando volumenes desde 0.1 hasta 1.0 ml de sustrato para comenzar la reaccién. Ajuste el volumen inicial del amortiguador usado en cada caso hasta obtener una mezcla de reaccién de 3 ml. Calcule la actividad y haga un grafico de v en funcién des, 1/v en funcién de 1/s y s/v en funcién de s, y determine Km y V. Efecto de los inhibidores. (i) Repita el experimento anterior, pero esta vez incluya 0.1 ml de inhibidor en la mezcla de reaccién, ajustando de nuevo el volumen del amortiguador para dar un volumen final de 3 ml de mezcla de reaccién. Haga un grafico de 1/v en funcién de 1/s y determine la constante de inhibicién K,. (ii) Repita el ensayo inicial pero esta vez determine la actividad a dos concentraciones de sustrato fijas variando la concentracién del inhibidor hasta llegar a concentraciones finales de 0.1 mmol/l de oxalato y 0.5 mmol/l de oxamato. Si v; es la actividad en presencia del inhibidor y v es la actividad en ausencia del inhibidor, haga un gréfico de v/v, en funcién de i. Use estos grAficos para decidir el tipo de inhibicién dado por exalato y oxamato y determine las constantes de inhibicién. Concentraciones altas de sustrato. Examine el efecto de concentraciones al- tas de sustrato en un grafico de v en funcién de sy s/v en funcién de s. Esto se256 © Bloquimica practica logra usando voltimenes hasta de 1 ml de piruvato de sodio 21 mmol/1 para comenzar la reaccién enzimética. {Hay algo inesperado en los graficos? Si lo hay, explique lo que ha observado. TEMPERATURA Y pH Efecto de la temperatura sobre las enzimas La velocidad de una reaccién catalizada por una enzima, al igual que la mayoria de las reacciones quimicas, aumenta con la temperatura. Esto se debe principalmente al efecto sobre las constantes de velocidad de las diversas reacciones parciales que componen la reaccién total, tales como ky, k_ 1, k+2 y ala afinidad de la enzima por los cofactores, activadores, etc. Los valores de pK de los grupos ionizables involucradosen la reaccién son también afectados por la temperatura, pero dado que esto no es facil de interpretar, no se considerard detalladamente en este libro. A elevadas temperaturas, la pro- teina de la enzima se desnaturaliza dando como resultado una pérdida de actividad. Esto significa que la velocidad inicial de la reaccién aumentaré con la temperatura hasta que se haga practicamente imposible de medir debido a una inactivacién casi inmediata. En la practica, la mayorfa de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los 70° C. Sin embargo, si la ‘actividad’ de la enzima es medida ‘incorrectamente’ determinando la cantidad de sustrato transformado en un tiempo dado a temperaturas diferentes, se puede obtener la asi llamada ‘temperatura éptima’ (figura 9.9). Sustrato transformado en un tiempo dado 7 Temperatura Figura 9. una enzima “Temperatura 6ptima’ (T) deEstado de transicion Energie Iibre Ener je una rea E! esponténe T Energie de activacion de una reaceién catalizada por una enzima libre ac Producto B Progreso de reaccién Figura 9.10 Diagrama de energia de la reaccin A > B en presencia (= — —) y ausencia (——) de una enzima Esta ‘temperatura éptima’ es el resultado de un balance entre el incremento en la ‘actividad’ y la velocidad de destruccién de la enzima. La ‘temperatura éptima’ no es un valor constante para una enzima dada, sino que depende del tiempo durante el cual se hace la medicién de la actividad. Entre més corto sea el tiempo de medicién, més alta sera la temperatura éptima aparente. Efecto de la temperatura sobre la reaccién enzimética. Las moléculas deben poseer cierta energia de activacién (E’) para que puedan reaccionar, y las enzimas acttan como catalizadores disminuyendo la energia de activacién (E), permitiendo que la reaccién avance més rdpidamente (figura 9.10). El cambio total en la energia libre (AG) permanece inalterado. La energia de activacién puede determinarse midiendo la velocidad méxima a diferentes temperaturas y haciendo un gréfico de logy, V en funcién de 1/T. La pendiente de la linea esta dada por E/2.303 R. Esta relacién se obtiene a partir de la ecuacién empirica de Arrhenius: dink/aT = E/RT*. Integrando esta ecuacién se obtiene log; 9 k = C — E/2.303RT,258 Bloquimica practica donde C = una constante, k = constante de velocidad de la reaccién, T = temperatura absoluta, R = constante de los gases (8.32 x 10-? J mol! K7"!), E = energia de activacién (J/mol). No es siempre facil obtener la constante de reaccién pero, dado que la velocidad m4xima es directamente proporcional ak, esta actividad se expresa usualmente en un grafico en funcién del recfproco de la temperatura. La ecuacién de Arrhenius es semejante a la ecuacién derivada de la teoria de las velocidades absolutas de reaccién: dink/dT = (AH + RT)/RT?. De esta ecuacién se deduce que la energia de activacién es igual a E=AH+RT, donde AH es el calor de activacién o entalpia de la reacci6n. Efecto de la temperatura sobre la proteina enzimatica, Se puede determinar facilmente este efecto exponiendo la enzima a temperaturas altas y midiendo luego la actividad a una temperatura a la que la enzima es estable. Esto nos dice la cantidad de enzima que ha sido destruida. Se hace un grafico del cambio de la actividad enzimatica en el tiempo a cada una de las tempe- raturas. La velocidad inicial v se obtiene a partir de este grafico, el cual se repite a diferentes temperaturas. La energia y por lo tanto el calor de la inactivacién, puede ser obtenida como se describié anteriormente a partir de un grAfico de log, v en funcién de 1/T. El calor de inactivacién AH es generalmente bastante alto como resultado del cambio considerable en la entropia, debido a la apertura y desenrollamiento de la molécula de proteina durante la desnaturalizaci6n. EXPERIMENTO 9.9 Determinacién de la.temperatura éptima para law -ami- lasa Fundamento Lac-amilasa cataliza la hidrélisis de los enlaces «1-4 del almidén produ- ciendo azucares reductores. La reaccién puede seguirse midiendo el incre- mento en azticares reductores mediante el reactivo 3,5-dinitrosalicilato en solucién alcalina de 4cido 3,5-dinitrosalicilico que se reduce a acido 3-amino- 5-dinitrosalicflico produciendo una coloracién que se mide a 540 nm. Se recomienda que este experimento y el préximo se efecttien como proyectos opcionales debido a que implican un gran nimero de mediciones. Las cantidades requeridas se calculan asumiendo que cada pareja ensayard por duplicado solamente a una temperatura. ales. 100 1. Amortiguador de fosfato de sodio o de potasio (0.1 mol/t, 51 pH 6.7). 2. Solucién de almidén en amortiguador (5 g/l en amor- 31 tiguador de fosfato. Mezcle 5 g de almidén soluble conEnzimas 259 50 ml de amortiguador hasta obtener una pasta blanda. Agregue 500 ml de solucién de amortiguador de fosfato hirviendo, continue la ebullicién por 1 minuto, enfrie luego a temperatura ambiente y diluya a 1] con solucién de amortiguador). 3. Cloruro de sodio (10 g/1). 11 4, &-amilasa convenientemente diluida. 11 5. Hidréxido de sodio (2 mol/l). 11 6. Colorimetros. : 50 7, Bafios de agua a temperaturas hasta de 75° C. 30 8. Tartrato sédico potdsico. (Disuelva 300 g de la sal en 500 ml. cerca de 500 ml de agua). 9. Acido 3,5-dinitrosalicilico. (Disuelva 10 g de este reactivo 200 ml en 200 ml de hidréxido de sodio 2 mol/l). 10. Reactivo de dinitrosalicilato. (Prepare mezclando las 11 soluciones 8 y 9, y complete con agua hasta 1 1). Método Prepare ocho tubos que contengan las siguientes mezclas reaccionantes: Contenidos ml Almidén (5 g/1) 25 ‘Amortiguador de fosfato (0.1 mol/l, pH 6.7). 10 Cloruro de sodio (10 g/1) 05 Coloque los tubos anteriores y el tubo que contiene la enzima en un bafiode agua a una temperatura dada. Después de 10 minutos agregue 0.5 ml de la enzima a siete de los tubos anteriores y 0.5 ml de agua al blanco. Incube los tubos durante 0, 5, 10, 15, 20, 30 y 40 minutos y pare la reaccién afiadiendo 0.5 ml de NaOH 2 mol/1 a todos los tubos. Agregue 0.5 ml de reactivo de dini- trosalicilato y caliente los tubos durante 5 minutos en un bafio de agua hirviendo, enfrie y lea la extincién a 540 nm contra un blanco. Nota: los tubos deben enfriarse a temperatura ambiente antes de tomar la lectura puesto que la extincién es sensible a cambios de temperatura. Haga un gréfico de la extincién de cada solucién en funcién del tiempo de incubacién y prepare una curva del progreso de la reaccién. Recoja los datos de los otros grupos y haga con ellos un gréfico del cambio en la velocidad inicial de reacci6n en funcién de la temperatura asi como de la cantidad de sustrato transformada por minuto a los 10 y a los 40 minutos en funcién de la temperatura. Compare los graficos y expliquelos. Haga un grfico de log, v en funcién de 1/T y determine el calor de activacién. ,Qué supuestos se han hecho en este experimento?260 Bioquimica practica Por conveniencia, la actividad puede expresarse en términos de cambios de extincién a 540 nm por minuto. EXPERIMENTO 9.10 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la a- amilasa Materiales Presumiendo que el experimento se efecttia como proyecto de clase, los reactivos y cantidades son los mismos utilizados en el experimento anterior. Método Prepare una dilucién apropiada de «-amilasa en tal forma que se obtenga una buena actividad cuando se incuba por 5 minutos a 37° C. Coloque la enzima en un tubo pyrex e incube durante 10 minutos. Pipetee 0.5 ml de la enzima en cuatro tubos de ensayo colocados en un bafio de agua a tempe- raturas fijas desde 50 hasta 75° C. Retire los tubos después de 5, 10, 15 y 20 jinutos, (u otros intervalos apropiados de tiempo) y enfrie répidamente bajo agua corriente. Incube los tubos a 37° C y mida la actividad enzimética después de afiadir el sustrato en la misma forma como se procedié en el experimento anterior. La muestra se incuba durante 5 minutos y se deter- mina la actividad con 3,5-dinitrosalicilato. Asi se puede determinar la velo- cidad de inactivacién de la enzima. Recoja los datos de los otros grupos que han trabajado a otras temperaturas y prepare con ellos un grafico de la velo- cidad de inactivacién (v) en funcién de 1/T, y determine el calor de inacti- vacién. Compare esta cifra con la obtenida para el calor de activacion en el experimento anterior. PH y actividad enzimatica El pH éptimo. Las enzimas son activas en un intervalo limitado de pH y un grafico de la actividad en funcién de pH da unacurvaen forma de campana parecida a la que se muestra en la figura 9.11. El pH al cual se obtiene la actividad maxima se conoce como el pH 6ptimo y es caracteristico de la enzima, siempre y cuando esta sea estable en las condiciones experimentales usadas. Los cambios de actividad con el pH se deben a cambios en el estado de ionizacién de la proteina enzimatica y de los otros componentes de la mezcla de reaccién. Michaelis y Davidsohn sugirieron en 1911 que de las diferentes formas de ionizaci6n de la proteina sdlo una es activa. A valores de pH por encima o por debajo del pH éptimo disminuye la cantidad de esta forma y por lo tanto se produce una disminucién en la actividad enzimatica. K,, y V. Los cambios en el pH modifican la actividad enzimatica afectando V, K,,, 0 la estabilidad de la proteina enzimatica. La mayorfa de los gréficosEnzimas 261 Actividad enzimatica, v pH optimo 9 10 12 pH Figura 9.11. pH éptimo de una enzima ilustrada con la fosfatasa alcalina de rata publicados de pH éptimos son resultados de cambios de Vy Kn y nose'les puede dar un tratamiento matemitico adecuado. Teéricamente los efectos del pH sobre Kp, y sobre V deben ser estudiados por separado. Estabilidad enzimdtica. Si la enzima no es estable a ciertos valores de pH, entonces el pH éptimo no es caracteristico de la enzima. La estabilidad puede verificarse exponiéndola a diferentes valores de pH durante un tiempo igual al del experimento, ajustando luego lasolucién a un pH en el cual la enzima es estable y midiendo luego la actividad. EXPERIMENTO 9.11 pH dptimo de una enzima Materiales y Métodos Determine el pH dptimo de la fosfatasa alcalina o de la @-amilasa usando los materiales y el método descrito en los experimentos 9.2 y 9.9. Para la fosfatasa alcalina use amortiguadores de bicarbonato-carbonato de sodio 0.1 mol/l en un intervalo de pH de 9a 11 y prepare una curva patré6n para cada valor de pH. Enel caso de la &-amilasa, utilice amortiguador de fosfato sédico o potdsico en intervalos de pH entre 5.8 y 8.0. AISLAMIENTO DE UNA ENZIMA Un gran nimero de enzimas han sido purificados parcialmente y muchas han sido obtenidas en forma cristalina. A continuacién se da un ejemplo de los muchos encontrados en la literatura. EXPERIMENTO 9.12 Separacién de muramidasa (mucopéptido N-acetilmura- mil hidrolasa, 3.2.1.17) a partir de la clara de huevo262° Bloquimica préctica Fundamento La enzima es un agente antibacteriano potente y acttia catalizando la hidrélisis de los enlaces 61-4 entre el Acido N-acetil murdmico y la N-acetil- glucosamina presentes en el mucopéptido de las paredes celulares. Esta propiedad particular constituye la base del método de ensayo en el que la ‘enzima se mezcla con una suspensién turbia de bacterias liofilizadas. A medida que la hidrélisis se va llevando a cabo, la turbidez de la suspensién disminuye y esto puede seguirse fécilmente en un espectrofotémetro a 450 nm. CH, OH CH, OH 0. 0. PK HH ~~ NHCOCH, ° NHCOCH; CH; -CH-COOH N-acetilglucosamina Acido N-acetilmurémico La muramidasa tiene un peso molecular bajo (14 300) y un punto isoeléctrico alto (pH 10.5); esta tiltima propiedad se usa para separar laenzima de otras proteinas. La muramidasa se conoce también con el nombre de lisozima, pero se recomienda el uso del primer nombre en lugar del segundo. Materiales 10 1, Huevos de gallina. 15 2. Muselina. = 3, HCl (1 mol/1 y 0.1 mol/1). 100 ml 4. Lana de vidrio. - 5. Solucién salina en amortiguador (NaCl, 0.5 mol/l y 21 tris- EDTA, 0.5 mol/I, pH 8.2). 6. Resina de intercambio catiénico, CM-Sephadex. 60g ‘7. Amortiguador de carbonato-bicarbonato de sodio 21 (0.2 mol/l, pH 10.5). 8. NaCl. 20g 9. Acido acético (1 mmol/1). 10 ml - 10. Patrén de albimina para la determinaci6n de proteina 100 ml (1 mg/ml). 11. Medidores de pH. 12. Colectores de fracciones. 13, Espectrofotémetros visibles y ultravioleta. 14. Bafios de agua a 25 0 37°C. aoaueEnzimas 263 15. Amortiguador de fosfato s6dico 0 potdsico (0.1 mol/l, pH7). 11 16. Suspensién liofilizada de Micrococcus lysodeikticus 500 ml recientemente preparada en amortiguador de fosfato a 0.3 mg/ml). Método Determinacién de proteina y actividad enzimatica Muramidasa. Equilibre la suspensién de bacterias liofilizadas a 37° C y agite antes de usarla. En una cubeta pipetee 2.8 ml de sustrato y comience la reaccién afiadiendo 0.2 ml de la solucién de muramidasa. Mezcle vigorosamente y siga el descenso en la absorbancia a 450 nm en el espectrofotémetro registrador. Calcule la actividad de la enzima usando la parte lineal de la curva de progreso y exprese los resultados en términos de microgramos de bacteria hidrolizada por minuto. Proteina. Prepare una curva patron para proteina midiendo la absorban- cia a 280 nm de soluciones de albtmina sérica bovina en concentracio- nes hasta de 1 mg/ml. El contenido de proteina puede determinarse en cada punto midiendo la extincién de la solucién a 280 nm y leyendo el valor de la protefna a partir de la curva patrén. Purificacién Preparacién de la columna cromatografica. Equilibre 10 g de CM-Sepha- dex en soluci6n salina preparada en amortiguador, diluida 1 a 10; agite suavemente durante 24 horas; luego prepare una columna cromato- grafica de este material tal como se describié en el capitulo 3. Tabla de purificacién. En cada estado de la purificacién anote los valores siguientes en forma de tabla: 1. Volumen (ml). 2. Actividad enzimatica (unidades/ml). 3. Actividad total de la muramidasa (unidades/ml x vol). 4. Contenido total de proteina (mg). 5. Actividad especifica (actividad total de la muramidasa/mg de proteina). 6. Factor de purificacién para la muramidasa (actividad especifica dividida por la actividad especifica inicial). 7. Rendimiento (porcentaje de la actividad total original). Extraccién. Recoja las claras de tres huevos, filtre a través de muselina para remover la chalaza, recoja 50 ml de filtrado y agréguele 100 ml de agua. Agite la mezcla cuidadosamente sin permitir la formacion de burbujas de aire para prevenir la desnaturalizacién. Separe muestras de 2 ml y déjelas en un bafio de hielo para la determinacién de actividad y proteina. Precipitacién por pH. Ajuste muy cuidadosamente el pH del extracto a 7.5 afiadiendo muy lentamente HCl 1 mol/l y 0.1 mol/1 a lo largo de un periodo264 Bloquimica practica de 10 minutos. Tenga cuidado de no excederse. Remueva la proteina precipi- tada mediante filtracién a través de lana de vidrio colocada en un embudo, y afiada al filtrado solucién salina en amortiguador hasta obtener una concen- tracién final de 0.05 mol/l] de NaCl y 0.05 mol/I de tris-EDTA, pH 8.2. Mida el pHy ajtistelo si es necesario a 8.2, Anote el volumen y luego separe muestras de 2 ml colocadas en un bafio de hielo para los ensayos de muramidasa y proteina. Cromatografia en columna. Aplique cuidadosamente el extracto a la colum- na de CM-Sephadex y recoja fracciones de 10 ml usando un colector de fracciones. Luego de que el extracto haya penetrado a la columna, lévela con 50 ml de solucién salina amortiguada antes de eluir con amortiguador carbo- nato-bicarbonato de sodio 0.2 mol/1. Continue recogiendo fracciones hasta que haya salido la muramidasa de la columna. Determine el contenido de proteina y enzima de cada fraccién y haga un grafico del perfil de elucién de la columna. Calcule el porcentaje de recuperacién de protefna y enzima. Cristatizacién. La muramidasa es una proteina fuertemente basica y forma facilmente sales cristalinas en cloro, yodo, carbonato, ete. Bajo condiciones 6ptimas, la cristalizacién se efecttia lentamente y alcanza un maximo después de 72—96 horas. Combine las fracciones de mayor actividad enzimética y ajuste el pH a 10.5, y luego agregue lentamente NaCl hasta una concentracién final de 0.3 mol/l, Deje reposar en el refrigerador durante 3—4 dias. Si se ha efectuado la cristalizacién, decante el sobrenadante que le sea posible y luego separe los cristales por centrifugacién. Disuelva el precipitado en 1 ml de acido acético 1 mmol/1 y remueva el material insoluble por cen- trifugacién. Determine el contenido de proteina y muramidasa y anote el factor final de purificacién y de rendimiento. Si el tiempo lo permite, use la solucién para determinar el peso molecular por filtracién en gel de capa delgada (experimento 3.5). FORMAS MOLECULARES MULTIPLES DE LAS ENZIMAS Las enzimas que catalizan la misma reaccién quimica pero difieren en algunas de sus propiedades fisico-quimicasse conocen como formas miiltiples moleculares y para su separacién e identificaci6n se puede usar electroforesis y cromatografia. Las propiedades fisico-quimicas de estas enzimas estén relacionadas con su actividad y por lo tanto también difieren en propiedades tales como K,,, sensibilidad al calor, efecto de inhibidores, etc. El término isoenzima se usa para aquellas formas en las que la multiplicidad deriva del control genético de la estructura primaria de la enzima. En 1971 la Comisi6n de Nomenclatura Bioquimica de la IUPAC—IUB propuso que estas formas miltiples deben clasificarse en siete gruposEnzimas 265, distintos (tabla 9.1). Las moléculas modificadas a causa del aislamiento y separacién de las enzimas no estan incluidas en esta clasificacién. Tabla 9.1 Clasificaci6n de las formas moleculares miiltiples de las enzimas. Grupos Razén para la multiplicacién Ejemplo I Proteinas genéticamente independientes Deshidrogenasa miélica en mitocondria y en el cito- @0 = II Heteropolfmeros (polimeros de dos o més Deshidrogenasa lactica cadenas polipeptidicas no unidas covalente- : mente) II] Variantes genéticas (alélicas) Glucosa-6-fosfato deshidro- ‘ genasa IV Proteinas conjugadas Fosfatasas alcalinas de ma- O by xe miferos V___Proteinas derivadas de una cadena polipeptidica Familia delaquimotripsina VI Homopolimeros (polimeros de una sola subuni- Glutémico deshidrogenasa dad no unida covalentemente) oo 8 B VII Formas conformacionalmente diferentes Todas las modificaciones Oo q = Lv alostéricas EXPERIMENTO 9.13 Separacién de fosfatasa alcalina de rifién en DEAE- celulosa Fundamento En este experimento se separan las formas moleculares de fosfatasa alcalina presentes en rifién, usando cromatograffa de intercambio iénico. Las molécu- las son glicoprotefnas que contienen cantidades variables de Acido silico. Posen, por lo tanto, diferentes cargas negativas y esta propiedad puede usar- se para separarlas empleando columnas de intercambio iénico.266 Bloquimica practica La enzima que se halla fuertemente ligada a la membrana celular se ex- trae primeroen butanol y su volumen se reduce por diélisis contra Carbowax. La enzima concentrada se coloca sobre una columna con el intercambiador aniénico DEAE-celulosa, y se eluye con un gradiente de cloruro. El principio de los gradientes de elucién y la teoria de la cromatografia de intercambio iénico aparecen en el capitulo 3. Materiales 1. Tal como en el experimento 9.2. . Rifiones de cerdo. : Is 2. 3. n-Butanol. 4. Homogenizadores. 5. Hielo. 6. Columnas de cromatografia de DEAE-celulosa (50 cm x 2,5 cm). - 7. Amortiguador Tris-HCl (0.05 mol/l, pH 7.7). 61 8. Amortiguador Tris-HCl-NaCl (como en 7, pero usando 21 cloruro de sodio 0.35 mol/1). 9. Espectrofotémetros ultravioleta. 5 10. Clorimetro 0 método quimico para determinacién - de cloro. 11. Carbowax (300 g/l en solucién acuosa). 41 12. Colectores de automaticos de fracciones. 5 yp g alacea| | 3 Método Separacién de la enzima. Remueva el exceso de grasa de los rifiones, lavelos, cuidadosamente con agua fria, séquelos ligeramente con papel defiltroy pese 20 g de tejido. Cértelu en pedazos pequefios y homogenice en’ agua helada hasta obtener una suspensién de aproximadamente 1 g/ml. Cuidadosamen- te agregue butanol (1.5 x vol. de suspensién) en cantidades muy pequefias durante un perfodo de 15 min para evitar sobrecalentamiento. Esta etapa se leva a cabo a temperatura ambiente ya que la enzima es bastante estable y la extraccién es bastante eficiente. Transfiera la suspensién a un tubode50mly centrifugue durante 40 minutos a 3000 g. Esto causa la formacién de varias capas (figura 9.12). Con una varilla de vidrio rompa la capa de fragmentos celulares livianos y usando una pipeta Pasteur saque la fase acuosa que con- tiene la enzima. Almacene el extracto a 0° C hasta cuando se necesite. Preparacién de la columna, Equilibre la DEAE-celulosa con amortiguador tris-HC1 0.05 mol/l, pH 7.7y llene la columna con el material comose describié en el capitulo 3. Deje que la resina empaque por: -* hasta que pase todo el amortiguador a través de la columna. Fraccionamiento de la fosfatasa alcalina de rifién. Concentre la enzima mediante didlisis en contra de Carbowax de un dia para otro; luego equilibreEnzimas 267 —}—_——— Fase de butanol Fragmentos celulares livianos {Fase acuosa (fosfatasa alcalina) Fragmentos celulares pesados Figura 9.12 Extraccién de la fosfatasa alcalina con butanol por diélisis durante 4 horas contra amortiguador tris-HCl 0.05 mol/1. Apli; que la enzima concentrada a la parte superior de la columna de resina y elayala con un gradiente lineal de cloruro como se indicé en el capitulo 3. El amortiguador inicial es 300 ml de tris-HCl 0.05 mol/l y el amortiguador de cloruro es el mismo, excepto por el hecho de contener NaC] 0.35 mol/I. Ajus- te el flujo de la columna entre 20 y 30 ml/h y recoja fracciones de 5 ml du- rante toda la noche usando un colector de fracciones. Determine en las fracciones cloro, proteina (midiendo la extincién a 280 nm), y la actividad de la fosfatasa alcalina (experimento 9.2). Haga un grafico de los valores obtenidos en funcién del volumen del efluente. La separacién termina luego de que hayan pasado 200 ml de amortiguador, cuando la concentracién de clorurose aproxima a 0.1 mol/l. Generalmente se obtienen 3 picos pequefios y uno grande. : EXPERIMENTO 9.14 Algunas propiedades de las distintas fracciones de fosfatasa alcalina de rifién Fundamento Con las fracciones separadas en el experimento anterior, se puede realizar una serie de experimentos. A continuacién se dan unos pocos de ellos. Para levarlos a cabo se mezcla el contenido de los tubos correspondientes a cada uno de los cuatro picos y se reduce el volumen por medio de diélisis contra carbowax. 7 Materiales y Métodos 1. Mida la constante de Michaelis. 2. Compare la actividad con varios sustratos midiendo la velocidad de liberacién de fosfato (p-nitrofenilfosfato, 8-glicerosfosfato, adenosina trifosfato). 3. Examine el efecto de la temperatura (55 y 60° C) sobre la estabilidad de las formas moleculares. 4, Examine el patrén electroforético en gel de poliacrilamida. Se usan las condiciones del experimento 3.16, y las zonas de actividad de la enzima_268 Bloquimica practica se detectan incubandolas barras de gel con «-nalftilfosfato (1 mg/ml) en amortiguador de carbonato-bicarbonato de sodio (0.1 mol, pH 10.0) que contiene MgSO, 10 mmol/l. Examine los geles bajo luz ultravioleta (350 nm) para observar la fluorescencia dela-naftol. Para obtener unas. bandas coloreadas permanentemente se acopla el a-naftol con ‘Fast blue B’ para obtener bandas de color azul oscuro. EXPERIMENTO 9.15 Separacién de las isoenzimas de deshidrogenasa léctica por electroforesis en gel de poliacrilamida Fundamento Origen de los isoenzimas. La mayoria de los tejidos animales contienen hasta cinco isoenzimas de deshidrogenasa ldctica que pueden ser separadas facilmente por electroforesis. Se enumeran de acuerdo con su velocidad de migracién hacia el 4nodo, en tal forma que la LD, es la especie que migra mas rpido y la LD,, la forma que tiene la movilidad mas baja. Las isoenzimas derivan de las varias combinaciones de dos subunidades diferentes para originar cinco posibles tetrameros. La LD, contiene inicamente subunidades H y se denomina asf por ser la forma predominante en el corazén (Heart), mientras que la LD, contienesélo subunidades My es la forma predominante en el masculo esquelético (Muscle). Las otras 3 isoenzimas (LD, LD, y LD,) provienen de la combinacién de estas dos subunidades para formar moléculas hibridas (figura 9.13). La cantidad y distribucién de las formas enzimaticas es caracteristica del tejido de origen y por tal razén se pueden usar para identificarlo. Visualizacién de la actividad enzimética por coloracién. Las isoenzimas de LDH se visualizan incubando los geles con una mezcla que contiene el sustrato normal y la coenzima, fenazina metosulfato (FMS) (un aceptor artificial de electrones) y un colorante de tetrazolio. Este colorante al reducirse forma bandas altamente coloreadas y poco solubles de formazan que precipitan en los lugares en donde hay actividad enzimética (figura 9.14). 10 Materiales 5 1, Soluciones y equipo para electroforesis en gel de poliacrilamida tal como en el experimento 3.16. 11 2. Amortiguador de fosfato sédico o potasico (0,05 mol/l, pH 7.4). 3, Rata (200—300 g de peso). 1 4. Deshidrogenasa léctica de corazén de buey y musculo = de conejo en lugar de tejidos de rata. 5. Amortiguador Tris-HCl (0.1 mol/l, pH 9.2). 11 6. Lactato de litio. 10gEnzimas 269 20 QO oe 00. oO ce Lo, Lo, Lo, O Subunided H © Subunidea M Peso molecular del tetramero, 136 000 Peso molecular de! monémero, 34 000 Figura 9.13 Composicién de las isoenzimas de deshidrogenasa lactica 7. Nicotinamida adenina dinucleétido (NAD). : 300 mg 8, Azul de nitrotetrazolio (NBT). 30 mg 9, Fenazina metosulfato (FMS). 20 mg 10, Reactivo revelador (lactato de litio 0.1 mmol/l, NAD 500 ml 50 mg y NBT 5 mg en 100 ml de amortiguador tris-HCl, PH 9.2). Esta solucién es estable durante 1 semana en Ja oscuridad a 4° C. Inmediatamente antes de usarse agregue PMS (aproximadamente 0.5 mg). 11. Incubadoras a 37° C. : 5 Método Prepare ocho geles de poliacrilamida tal como se describe en el experimento 3.16 y déjelos reposar. Mientras tanto sacrifique una rata y prepare homoge- nizados de higado, rifién, mtisculo esquelético, corazén y otros tejidos en amortiguador de fosfato 0.05 mol/l (0.5 — 1 gen 10 ml). Remueva los residuos por centrifugacién y almacene el sobrenadante en un bafio de_hielo hasta cuando se necesite. Coloque 5041 de cada muestra por duplicado sobre los geles de poliacrila- mida y efecttie la electroforesis tal como se describié anteriormente (experimento 3.16). Al final de la prueba incube los geles con el reactivo Lactato De NAD + YC FMS (red) XX NBT (ox) Piruvato, NADH FMS (ox) NBT (red) NAD nicotinamida-adenina dinuclestido Polimerizacién FMS fenasina metosulfato NBT azul de nitrotetrazolio Formazén insoluble (0x = oxidado red = reducido Figura 9.14 Reacciones involucradas en la deteccién de las isoenzimas de deshidrogenasa lactica270 Bloquimica practica revelador a 37° C hasta por 10 minutos en luz indirecta. Tome fotografias de los geles o dibuje a escala un esquema que sefiale cuidadosamente la posicién de las bandas. Anote exactamente el tiempo que gasta en aparecer cada ban- da, la intensidad final de la coloracién y el espacio entre las isoenzimas. Si el tiempo lo permite, repita el ejercicio con suero sanguineo, eritrocitos hemolizados, intestino delgado y tejido pulmonar. EXPERIMENTO 8.18 Aislamiento de las isoenzimas de deshidrogenasa léctica por electroforesis en bloque de almidén. Las isoenzimas se separan por electroforesis de zona usando como medio de soporte granos de almidén. La ventaja de este método es que las isoenzimas se pueden separar en cantidades suficientes para examinar sus propiedades. En Ja prueba se incluye una solucién que contiene albmina: sérica bovina tefiida con azul de bromofenol y hemoglobina humana como marcador, que también permiten verificar cualquier cambio en el patrén electroforético debido a electroésmosis. Materiales 10 1. Extracto de tejidos de rata como en el experimento 9.15. == 2. Amortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/I, pH 7.4). 61+5 veces : la capacidad del tanque 3. Almidén de papa. 3kg 4, Moldes para la preparacién del bloque (30 em x 12. cm x 5 lcm). 5. Gasa absorbente. - 6. Fuentes de poder. 7. Solucién marcadora de albimina sérica bovina y - hemoglobina humana. (Disuelva albimina sérica bovina en eritrocitos hemolizados y agregue azul de bromofenol para colorear la albamina). 8. Reactivos para la determinacién espectrofotométrica de - deshidrogenasa lactica (experimento 9.8). 9. Embudos de vidrio de fondo plano, con lana de vidrio. 50 a Las cantidades se han calculado suponiendo que cada uno de los cinco pares de estudiantes separa deshidrogenasa lactica de un tejido diferente. Método Lave por decantacién 500 g de almidén de papa dos veces con agua destilada y dos veces con amortiguador de fosfato. Después de la tiltima lavada, deje decantar el almidén durante 2 horas, remueva el exceso de amortiguador y prepare el bloque de almidén usando el molde respectivo. Remueva el exceso de Iiquido colocando el bloque entre dos hojas de papel Whatman 3 MM.Enzimas 271 Conecte el bloque al compartimiento de los electrodos mediante varias capas de gasa absorbente impregnadas con solucién amortiguadora. Aplique un po- tencial de 6—8 V/cm para equilibrar el sistema, desconecte y luego haga una ranura horizontal en el bloque (9 cm) a 22 cm del extremo anédico y al cm del borde lateral. Coloque en la ranura 1 ml de la muestra. Al mismo tiempo aplique la solucién marcadora a igual distancia del 4nodo y a 1 cm del otro borde lateral (figura 9.15). Llene el orificio con almidén y cubra el bloque con una lamina de ‘Perspex’ para mayor seguridad. Coloque todo el aparato en el cuarto frfo o en el refrigerador y aplique un potencial de 6—8 V/cm durante 20 horas. Después de la electroforesis midala distancia de migracién y la distribucién de los marcadores, remueva la parte del bloque que contiene los marcadores y descartela (figura 9.15). Corte el resto del bloque transversalmente en tiras de 1 cm de ancho y transfiera cada tira a un embudo de vidrio de fondo plano con lana de vidrio. Presione fuer- temente el almidén con una varilla de vidrio, eluya dos veces con 2 ml de amortiguador de fosfato pH 7.4. Anote el volumen final de elucién. Tome una muestra conveniente para la determinacién de la actividad de la deshidroge- nasa (0.1 —1 ml) y prepare un diagrama de la actividad total de cada fraccién en funcién de la distancia de migracién a partir del ctodo. Determine la enzi- ma en el extracto crudo y determine el porcentaje de recuperacién en el bloque. Coloque aqui tos mhavcadores . Bloque de almidén —Ranura pare la muestr cortadas. transversaimente Figura 9.15 Electroforesis en bloque de almidén272 Bloquimica préctica Si los tejidos no se pueden obtener facilmente, se puede usar deshidroge- nasa lactica de corazén de buey o de musculo de conejo preparada comer- cialmente. EXPERIMENTO 9.17 Otras investigaciones sobre las isoenzimas de deshidro- genasa lactica obtenida mediante electroforesis en bloque de almidén Materlales y Método Los experimentos siguientes pueden efectuarse con fracciones obtenidas en el experimento 9.16, pero también se pueden usar enzimas de corazén de buey y misculo de conejo para demostrar las diferencias en las proporciones de isoenzimas en estos dos tejidos. E] corazén de buey contiene predominante- mente las isoenzimas LD, y LD, mientras que el musculo de conejo contie- ne preferencialmente las LD,. Acontinuacién se describen algunos experimentos que pueden realizarse. Estos demuestran el cambio gradual en las propiedades de las diferentes isoenzimas: 1. Determine la constante de Michaelis usando como sustratos piruvato y 2-cetobutirato. 2. Examine la estabilidad de la enzima calentandola hasta por 30 minu- tos a 55 — 70°C. 3. Incube la enzima durante 30 minutos con concentraciones crecien- tes de urea hasta 6 mol/l y compare la actividad con el control. Haga un grafico de v/v; en funcién de la concentracién de urea. . Determine las constantes de inhibicién con oxalato. = Bibliogratia Bergmeyer, H. U., Methods of Enzymatic Analysis, Vols 1—4, Nueva York Academic Press, 1974. Dixon, M. y Webb, E. C., Enzymes, Londres, Longmans, 1964. International Union of Biochemistry, Enzyme Nomenclature, Amsterdam, Elsevier, 1973. Gutfreund, H., Enzymes: Physical Principles, Nueva York, Wiley Inter- science, 1972. Moss, D. W. y Butterworth, P. J., Enzymology and Medicine, Londres, Pitman Medical, 1974. Wilkinson, J. 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