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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE MEDICINA
COMISIN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
CURSO DE ESPECIALIZACIN EN REUMATOLOGA
HOSPITAL UNIVERSITARIO DE CARACAS

Presenta: Luis Valderrama.


Caracas, julio de 2015.

DATOS DEL ESTUDIO

Escuela de Medicina de la Universidad de Osaka y Hospital Universitario de


Osaka, Japn.

Con apoyo del Ministerio de Educacin, Cultura, Deporte, Ciencia y


Tecnologa de Japn, la Sociedad Japonesa para la Promocin de la Ciencia,
el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar y la Agencia Japonesa de Ciencia
y Tecnologa.

Enviado para su publicacin el 22 de septiembre de 2014;aceptado en


forma revisada el 19 de febrero de 2015.

INTRODUCCIN

Los mecanismos de la sinovitis sostenida en AR permanecen poco


claros.Recientemente, citoquinas proinflamatorias tales como TNF e IL-6
demostraron tener un papel clave en la AR.

FARMEs biolgicos que pueden bloquear estas citoquinas constituyen un estndar


actual en el tratamiento.Sin embargo, una proporcin sustancial de pacientes
con AR an no alcanzan la remisin con estos frmacos.

A fin de que los pacientes con AR logren verdadera remisin de su enfermedad es


necesario identificar otra molcula clave que contribuya a la autoinmunidad, la
activacin inmunitaria y la destruccin sea.

INTRODUCCIN

Las semaforinas se identificaron originalmente como factores de orientacin


neural; la familia consta de ms de 20 protenas clasificadas en 8 subclases con
base en sus caractersticas estructurales.

Investigaciones recientes sobre semaforinas han demostrado que estas protenas


tienen papeles pleiotrpicos, incluyendo la regulacin de la respuesta
inmunitaria, angiognesis, metstasis tumoral y el metabolismo seo.

Semaforinas involucradas en diversos aspectos de las respuestas inmunitarias se


denominan "semaforinas inmunitarias".

INTRODUCCIN

Estudios previos han demostrado que las semaforinas inmunitarias tienen un rol
importante en trastornos inmunolgicos: esclerosis mltiple, hipersensibilidad de
vas respiratorias, GPA y AR.

Por ejemplo, el nivel de semaforina 4A soluble (sSema4A) es elevado en el suero


de pacientes con esclerosis mltiple, donde la poblacin de clulas Th17 tambin
est incrementada.

Recientemente, una variante de Sema6A fue identificada como un importante


contribuyente al riesgo de GPA.Los niveles sricos de Sema3A y Sema5A se han
sugerido como relevantes en AR. Sin embargo, la importancia patolgica de las
semaforinas en autoinmunidad an no est clara.

INTRODUCCIN

Sema4D/CD100 fue la primera semaforina que demostr tener un papel en el


sistema inmunitario y era originalmente identificada como un marcador de
activacin de clulas T, de hecho, se expresa abundantemente en su
superficie;sin embargo, tambin se expresa en una amplia gama de clulas
hematopoyticas.

Aunque Sema4D es una protena de unin a membrana, tambin existe una


forma soluble (sSema4D) despus de su escisin proteoltica tras la activacin
celular.

Sema4D se une a varios receptores, entre ellos plexina B1/B2, CD72 y plexina
C1, que median los efectos de Sema4D sobre las clulas neuronales,
inmunitarias, endoteliales y epiteliales.

Immune semaphorins and their receptors in lymphoid and non-lymphoid cells.

Takamatsu H and Kumanogoh A. Diverse roles for semaphorin-plexin signaling in the immune system. Trends in Immunology March 2012, Vol.

INTRODUCCIN

Varios estudios han demostrado que Sema4D tiene papeles cruciales en el


sistema inmunolgico.

Por ejemplo, promueve la activacin de las clulas B y la produccin de


anticuerpos, expresada en clulas dendrticas est involucrada en la activacin
de clulas T, induce la produccin de citoquinas por monocitos y media seales
retrgradas en la restauracin de la integridad del epitelio.

Varios estudios han demostrado que Sema4D es relevante en la patognesis de la


autoinmunidad.

Involvement of immune semaphorins in various phases of immune responses.

Takamatsu H and Kumanogoh A. Diverse roles for semaphorin-plexin signaling in the immune system. Trends in Immunology March 2012, Vol.

INTRODUCCIN

Ratones deficientes en Sema4D son resistentes al desarrollo de encefalomielitis


autoinmune experimental, un modelo murino de EM.

Sema4D se expresa en macrfagos asociados a tumor y est implicada en la


angiognesis tumoral.

Sema4D derivada de osteoclastos suprime la formacin de hueso por los


osteoblastos; su bloqueo conlleva a aumento de la masa sea.

La anormalidad inmunitaria, angiognesis y destruccin sea tienen papeles


crticos en la progresin de la AR, lo que sugiere que Sema4D pudiera exacerbar la
enfermedad; sin embargo, su participacin en la patognesis de AR no se ha
determinado.

OBJETIVO
Semaforina

4D (Sema4D)/CD100 tiene papeles


pleiotrpicos en la activacin inmunitaria, la
angiognesis, el metabolismo seo y el desarrollo
neural.

Este

estudio se realiza para investigar el papel de


Sema4D en AR.

MATERIALES Y MTODOS

Los niveles de Sema4D soluble (sSema4D) en suero y lquido sinovial fueron


analizados mediante ELISA.

Se analiz la expresin de Sema4D en superficie celular y la de sus transcriptos en


clulas de sangre perifrica de pacientes con AR, y se llevo a cabo su tincin por
inmunohistoqumica en la sinovial.

Se evalu la generacin de sSema4D en una lnea celular monoctica (clulas THP1) tratada con ADAMTS4.

Se evalu la eficacia de anticuerpos anti-Sema4D en ratones con artritis inducida


por colgeno (CIA).

SUJETOS Y MTODOS
Sujetos

Se obtuvieron muestras de sangre de 101 pacientes con AR, 34 con LES, 10 con EA
y 10 con OA en el Hospital de la Universidad de Osaka y el Centro Mdico de
Minami de la Organizacin Hospitalaria Nacional de Osaka.

Los pacientes con AR fueron diagnosticados segn los criterios ACR de 1987.

Tambin se obtuvieron muestras de sangre de individuos sanos reclutados del


personal de la universidad/hospital y de la poblacin estudiantil.

Adems, se obtuvieron 7 muestras de tejido sinovial de pacientes con AR y 10 con


OA sometidos a sinovectoma o a reemplazo de rodilla, y muestras de lquido
sinovial de pacientes con AR y OA mediante artrocentesis de rodilla.

SUJETOS Y MTODOS
ELISA

Se midieron los niveles de Sema4D soluble en muestras de suero, en lquido


sinovial y en sobrenadantes de cultivo celular.

El lmite inferior de deteccin de sSema4D fue 125 pg/ml.

Se determinaron los niveles de ADAMTS4 en las muestras de suero y lquido


sinovial.

Tambin se determinaron las concentraciones de TNF e IL-6 en los sobrenadantes


de cultivo.

SUJETOS Y MTODOS
Histologa

Se realiz tincin por inmunohistoqumica de las muestras de tejido sinovial (7 de


AR y 10 de OA) y se bloque la actividad peroxidasa endgena.

Las secciones se dejaron reaccionar con anticuerpos anti-Sema4D, anti-CD3, antiCD20 e Ig (control negativo), todos de ratn, o anti-CD31 de conejo.

Las muestras se incubaron despus con un polmero marcado con peroxidasa


conjugado con anticuerpos anti-conejo secundarios y luego con un cromgeno.

Los anlisis histolgicos se realizaron en las articulaciones de los miembros


posteriores de ratones con CIA; estas fueron fijadas y descalcificados para posterior
tincin con hematoxilina y eosina y tincin de safranina O.

SUJETOS Y MTODOS
Preparaciones de clulas

Se separaron las clulas mononucleares de sangre perifrica mediante


centrifugacin por gradiente de densidad y se recolectaron > de 90% de los
monocitos CD14+ usando perlas magnticas para CD14.

Citometra de flujo

Las clulas fueron marcadas con anticuerpos contra antgenos de superficie


celular.Se utilizaron los siguientes anticuerpos conjugados: anti-Sema4D, antiCD3, anti-CD14 y anti-CD19.

SUJETOS Y MTODOS
PCR con transcripcin inversa cuantitativa (qRT-PCR)

Las clulas CD3+, CD19+ o CD14+ se clasificaron mediante citometra de flujo.

Se extrajeron el ARN y ADN complementario total.

Se realiz qRT-PCR para Sema4D y ADAMTS4 humano.

Liberacin (conversin) de sSema4D

Se cultivaron monocitos de la lnea celular THP1 y clulas mononucleares de sangre


perifrica de pacientes con AR en medio con metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3),
MMP-9, ADAM-17 y ADAMTS4.

Las concentraciones de Sema4D soluble se midieron mediante ELISA.

SUJETOS Y MTODOS
Aislamiento de clulas sinoviales y estimulacin por IL-6 y TNF

Se obtuvieron las muestras de sinovial de rodilla de los pacientes con AR.Las


clulas sinoviales adherentes se recolectaron y separaron.

Para los experimentos, las clulas sinoviales se sembraron en placas y despus se


estimularon durante 2 das con IL-6 y TNF.Al final del perodo de estimulacin se
recogieron las clulas y se extrajo el ARN mensajero.

Se realiz anlisis por qRT-PCR de ADAMTS4;tambin se midi su concentracin en


los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA.

SUJETOS Y MTODOS
Cultivo de monocitos y ensayos de citoquinas

Los monocitos CD14+ de pacientes con AR fueron estimulados con o sin varias
concentraciones de protena de fusin sSema4D-Fc, sSema4D escindida o
anticuerpo de ligando de CD72.

Para los experimentos de bloqueo, las clulas se cocultivaron con sSema4D y


anticuerpos anti-Sema4D/CD100 o IgG isotipo de control.

Se determinaron las concentraciones de TNF e IL-6 en los sobrenadantes de


cultivo mediante ELISA .

SUJETOS Y MTODOS
Induccin y evaluacin de la artritis inducida por colgeno (CIA)

Fueron adquiridos ratones machos DBA/1J de 8 semanas de edad y fueron


inmunizados mediante inyeccin intradrmica con 100 l de emulsin de colgeno
bovino tipo II en el da 0.

Se administr una inyeccin de amplificacin con la emulsin el da 21.

Los ratones con CIA recibieron inyecciones intraperitoneales de anticuerpos antiSema4D (25 mg/Kg [n=8] o 50 mg/Kg [n=6]), o anticuerpos de isotipo control en los
das 28 y 35.

Se determinaron los niveles sricos de IL-6, TNF e IL-1 el da 42.

Se determinaron los ttulos sricos de anticuerpos anti-colgeno tipo II mediante


ELISA.

SUJETOS Y MTODOS
Induccin y evaluacin de la artritis inducida por colgeno (CIA)

Se evalu la artritis clnica en una puntuacin de 0 a 4 para cada pata:

0 = normal;

1 = eritema y edema de 1 dedo;

2 = eritema y edema de 2 dedos o eritema y edema del tobillo;

3 = eritema y edema de 3 dedos o edema de 2 dedos y tobillo;

4 = eritema y edema severo de tobillos, patas y dedos con deformidad.

Se evaluaron histolgicamente 2 patas de cada ratn.Los patas de los ratones


tratados con el anticuerpo anti-Sema4D, anticuerpo control o sin anticuerpo
fueron teidas con anticuerpos anti-CD31.

Se contaron los vasos manualmente en 5 campos por pata y se promediaron.

SUJETOS Y MTODOS
Anlisis estadstico

Los datos se expresan como la media de SD o SEM.

Se utiliz las prueba no paramtrica U de Mann-Whitney para la comparacin de 2


grupos.

Se realizaron las comparaciones entre 3 grupos mediante la prueba de KruskalWallis seguido por la prueba U de Mann-Whitney.

Se consideraron significativos valores de P 0,05.

Se determinaron las correlaciones entre los parmetros clnicos y los niveles


sricos sSema4D mediante el coeficiente de correlacin de Pearson (r).

RESULTADOS

n=101

Caractersticas de los
pacientes con AR

Age, y (min, max)


56.713.8, (1982)
Female
90 (89.1)
Disease duration, y
11.087.12
Steinbrocker Stage
I
II
III
IV

13
25
35
28

(12.9)
(24.8)
(34.7)
(27.7)

53
24
21
3

(52.5)
(23.8)
(20.8)
(3.0)

Functional Class
I
II
III
IV

Infliximab: 11.
Adalimumab: 14.
Etanercept: 20.
Tocilizumab: 21.
Abatacept: 1.

RF positive
ACPA positive
CRP, (mg/dL)
DAS28,

93 (92.1)
82 (81.2)
0.531.09
3.881.28
Treatment

MTX, n, dose
Biologic
Corticosteroid, dose

Dosis MTX: 6,9 mg/sem.


Dosis esteroides: 4,9 mg/da.

69 (68.3)
67 (66.3)
53 (52.1)

Supplementary Table 1. Demographics and characteristics of RA patients. Data are presented as n (%) or meanSD. DAS28, disease activity score 28; RF,
rheumatoidfactor;ACPA,anticitrullinatedpeptideantibody;CRP,Creactiveprotein;MTX,methotrexate.MeandoseofMTXwas6.972.3mg/week,andmean
doseofcorticosteroidwas4.93.6mg/day.Forbiologics,nwasasfollows:infliximab,11;adalimumab,14;etanercept,20;tocilizumab21;abatacept,1.

Niveles sricos de sSema4D


en pacientes con AR

Niveles de sSema4D en lquido


sinovial de pacientes con AR

Expresin de Sema4D en sinovial de pacientes con AR

Expresin de Sema4D en sinovial de pacientes con AR

Supplementary Figure 1. Sema4D expression in RA synovium. Immunohistochemical staining for Sema4D, CD3, CD20, and CD68 in synovial
tissue of patients with RA. Representative images from seven RA patients are shown. (40 field)

No asociacin con:
Edad.
Sexo.
Duracin de enf.
Medicacin.

Correlacin de niveles sricos de


sSema4D con marcadores de
actividad de AR

Niveles sricos de sSema4D antes y


despus de la terapia biolgica

Correlacin entre la tasa de cambio en los niveles sricos de


sSema4D y la tasa de cambio del DAS28 luego de la terapia biolgica

No hubo diferencia entre


pacientes tratados con
TNFi y aquellos tratados
con IL-6i.

Expresin de Sema4D en la superficie celular de clulas de sangre perifrica

Expresin de mRNA de Sema4D en clulas de sangre perifrica

Niveles de sSema4D en sobrenadante de clulas THP-1 cultivadas con


metaloproteinasas

Niveles sricos y sinoviales de ADAMTS4 en pacientes con AR

Produccin de sSema4D inducida por ADMATS4 en clulas mononucleares


de sangre perifrica de pacientes con AR

Supplementary Figure 2. sSema4D production from PBMCs. Levels of sSema4D in culture supernatant of PBMCs from healthy individuals and RA
patients (n=5 per group). Data are representative of three independent experiments. ** p < 0.01.

Produccin de citoquinas inflamatorias inducida por sSema4D


en monocitos de pacientes con AR

Produccin de citoquinas inflamatorias inducida por protena sSema4D-Fc


en monocitos de pacientes con AR

Supplementary
Figure
3.
sSema4D-Fc
induces
production of inflammatory cytokines. TNF- and IL-6
levels in culture supernatant of CD14 + monocytes from RA
patients stimulated with Sema4D-Fc protein (n = 5). Results
shown are representative of three independent experiments.
** p<0.01.

Niveles de citoquinas inflamatorias en monocitos de pacientes con AR


tras la estimulacin con sSema4D y anticuerpo anti-Sema4D

Induccin de la produccin de citoquinas inflamatorias por anticuerpo


agonista de CD72 en monocitos de pacientes con AR

Supplementary Figure 4. CD72 agonistic


antibody induces production of inflammatory
cytokines. CD72 agonistic antibody induced TNF-
and IL-6 production from CD14+ monocytes from RA
patients.
Representative
results
of
three
independent experiments are shown (n = 5). ** p <
0.01.

Expresin de mRNA de ADAMTS4 inducida por citoquinas


inflamatorias en clulas sinoviales de pacientes con AR

Expresin de ADAMTS4 inducida por citoquinas


inflamatorias en clulas sinoviales de pacientes con AR

Puntuacin de artritis en ratones con CIA luego de la


administracin de anticuerpo anti-Sema4D

Puntuacin de artritis en ratones con CIA luego de la


administracin de anticuerpo anti-Sema4D

Supplementary Figure 6. Dose dependent effect of anti-Sema4D to suppress CIA. Average arthritis scores of CIA mice. Anti-Sema4D or control
antibody (25 mg/kg) was administrated intraperitoneally on days 28 and 35 (arrow). (n = 8 per group). Data are representative of two independent
experiments. *** p<0.001.

Tincin de la seccin de tobillos de ratones con CIA luego de


la administracin de anticuerpo anti-Sema4D

Puntuacin histolgica de las secciones de tobillos de ratones


con CIA luego de la administracin de anticuerpo anti-Sema-4D

Niveles sricos de citoquinas inflamatorias de ratones con


CIA luego de la administracin de anticuerpo anti-Sema-4D

Angiognesis en la membrana sinovial de ratones con CIA


luego de la administracin de anticuerpo anti-Sema4D

Densidad de los vasos en la membrana sinovial de ratones con


CIA luego de la administracin de anticuerpo anti-Sema4D

Supplementary Figure 7. Anti-Sema4D antibody inhibits angiogenesis of CIA. Total synovial vessel density (assessed on paraffin sections
immunohistochemically stained for CD31) in mice treated with control antibody or anti-Sema4D antibody. A) photomicrographs of synovial membrane
tissues stained for CD31. B) Average density of vessels (vessels/mm 2). (n=12 per group). * p<0.05.

Produccin de anticuerpos IgG anti-colgeno en ratones con CIA


luego de la administracin de anticuerpo anti-Sema4D

Supplementary Figure 8. Anti-Sema4D antibody inhibits collagen-specific IgG production Collagen-specific IgG production in sera of mice treated
with control or anti-Sema4D antibody (n =6 per group). * p < 0.05. Data are representative of two independent experiments.

RESULTADOS

Los niveles de sSema4D estaban elevados en muestras de suero y lquido


sinovial de pacientes con AR; marcadores de actividad de enfermedad se
correlacionaron con los niveles sricos de sSema4D.

Las clulas que expresan Sema4D tambin estaban acumuladas en la


sinovial de AR. Los niveles de Sema4D en la superficie celular de clulas
CD3+ y CD14+ de pacientes con AR eran reducidos y los niveles de
transcriptos de Sema4D se encontraban sin cambios, en comparacin
con los controles sanos.

RESULTADOS

ADAMTS4 escindi Sema4D de la superficie celular para generar


sSema4D en clulas THP-1; esta indujo la produccin de TNF e IL-6
en monocitos CD14+.

IL-6 y TNF a su vez indujeron la expresin de ADAMTS4 en clulas


sinoviales.

El tratamiento con un anticuerpo anti-Sema4D suprimi la artritis y


redujo la produccin de citoquinas proinflamatorias en un modelo de
CIA.

Crculo vicioso de sSema4D/TNF-/IL-6/ADAMTS4


hipottico para AR

Supplementary Figure 9. Sema4D is a key component of the autocrine inflammatory loop in RA. We hypothesized that the sSema4D/TNF- and
IL-6/ADAMTS4 axis functions as a vicious cycle, triggering an inflammatory loop that contributes to the pathogenesis of RA. TNF- and IL-6 induce
osteoclastogenesis through RANKL production, and ADAMTS4 induces cartilage degradation in RA (47). In addition, Sema4D inhibits bone formation
(15). Thus, Sema4D may play a central role in RA as a component of an autocrine inflammatory loop.

CONCLUSIN

Un

bucle de retroalimentacin positiva que implica sSema4D/IL6/TNF/ADAMTS4 pudiera contribuir a la patognesis de la AR.

La

inhibicin de artritis por anticuerpos anti-Sema4D sugiere que


Sema4D representa una potencial diana teraputica en AR.