(12) SOLICITUD INTE (19) Organizacién Mundi Intelectual Oficina interna de la Propiedad ional (43) Fecha de publicacién internacional 1 de septiembre de 2011 (01.09.2011) NACIONAL PUBLICADA EN VIRTUD DEI DE PATEN TRATADO DE COOPERACION EN MATERIA, PCr) ATA A 1A (40) Némero de Publicacién Internacional WO 2011/104410 Al PCT (1) Clasifteacton Internacional de Patentes: A231. 1/00(2006.01)——_ABIK 8/64 (2006.01) Niimero de la solieitud internacional PCT/ES201 1070118 an @) tael6n internaclonal: 24 de febner» de 2011 (24.02.2011) es) espaiiol (26) Idioma de publican: espaol 80) Datos relatives ala pe 201030286 26 de febrero de 2010 (26.02.2010) ES. (1) Solietantes (para todos ios Estados designados salvo US): INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA, S.A. [ESIES] Avda. Pio X11, 53, 31008 Pamplona ~ Navara (ES). CENTRO NACIONAL DE TECNOLOGIA Y SEGURIDAD ALIMENTARIA, LABORATORIO D FS}; Cm. NA Navarra (FS). RO IF 134, Kin $0, E-31570 San Adit = Tnventores;€ TnventoresSollitantes (para US solamente: AGUEROS BAZO, Maite [ESITS}, ICT (DP.D, Avis, Pio Xi, 53, E-31008 Pamplona - Navara (ES). SPARZA CATALAN, Irene [ES/PS}, ICT (DPD, Avda, Pio XIl, $3, £31008 Pamplona - Navara (ES) GONZALEZ, FERRERO, Carolina [ES/ES], CNTA, Cra, NA-134, Ken 50, £31570 San Adrian = Navarra (ES). GONZALEZ NAVARRO, Carlos Javier [FS/ES}: CONTA, Cra NA-I34, Kin $0, F-31570 San Adsiin = Navarra (ES). IRACHE GARRETA, Juan Manuel [ES/ ES}, ICT (DLP), Avda Pio XI, $3, F-31008 Pamplons ‘Navarra (ES). ROMO HUALDE, Ana [ESIES]; CNTA, Cura, NA-I34, Ken 50, F-31570 San Adin - Navarra «). (74) Mandatario: ARIAS SANZ, Juan; ABG Patentes, S.L., ‘Avda, de Burgos, 16D, Edificio Euromor, F-28036 Madrid (ES), (81) Estados designados (a monos que se indigue otra cosa para toda clase de proteccién nacional admisible): AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE DK, DM, DO, DZ, EC, FE, FG, FS, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HIN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, IK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, M\W, MX, MY, MZ, NA, NG, NINO, NZ, OM, PE, PG, PH, PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, ‘TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, Uz, VC, VN, ZA, 2M. LW. Bstados designados (a menos gue se indique otra cosa, para toda clase de proteccitn regional admisibl): ‘ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), eutoasiitica (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), europea (AL, AT, BE, BG en CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IF, 1S, 1T, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BE, BI, CF, CG, CI, CM, GA,GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG) Declarnciénes sein la Regla 4.17 sobre el derecho del solicitante para solicitary que le sea ‘concedida ta patente (Regla 4.1711) Publicads: con informe de bisqueda i ternacional (Art. 21(3)) antes de la expiracién del plazo para modificar las reivindicaciones y para ser republicada si se reciben modificaciones (egla 48.20) (4 Title: NANOPARTICLES FOR THE ENCAPSULATION OF COMPOUNDS, PREPARATION THEREOF AND USE OF SAME (64) Titulo : NANOPARTICULAS PARA ENCAPSULACION DE COMPUESTOS, SU PREPARACION Y USOS (67) Abstract: The invention relates to nanoparticles comprising a casein matrix, a basic amino acid and a metal selected from ‘among a divalent metal, @ trivalent metal and combinations of same, Said nanoparticles can encapsulate a biologically active ‘water-soluble of fat-soluble compound. The invention is suitable for se in the food, pharmaceutical and cosmetic sectors, as well as in nanotechnology (57) Resumen: Las nanoparticulas comprenden wna mattiz de easeina, un aminoscido bisico y un metal seleccionado entre wn ‘metal divalente, un meta irivatente y sus combinaciones. Dichas nanoparticulas pueden encapsular un compuesto biolégicsmente activo, hidrosoluble © liposoluble. De splicacién en los sectores alimentario, farmacéutica y cosmético y en el de la nanoteenologia15 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118 NANOPARTICULAS PARA ENCAPSULACION DE COMPUESTOS, SU PREPARACION Y USOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invenei On se encuadra en los sectores alimentario, farmacéutico y cosmético y en el de la nanotecnologia, y consiste en la encapsulacién de compuestos biologicamente activos empleando caseina como agente de recubrimiento. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La industria alimentari necesita evolucionar tecnolégicamente para s las nuevas demandas del consumidor. La nanotecnologia presenta un in potencial para revolucionar la industria alimentaria ya que, a través de esta tecnologia es posible encapsular compuestos biolégicamente actives [CBA], ¢.g., sabores, taminas, minerales, aceites esenciales, compuestos antioxidantes ete, con el fin de prebidticos obtener numerosos beneficios, por ejemplo, incrementar la vida util del producto; reducir la cantidad de CBA a utilizar, controlar su liberacion; incrementar su biodisponibilidad; enmascarar sabores indeseados, etc. A la hora de disefiar un vehiculo adecuado para encapsular un CBA es muy importante seleccionar correctamente el material utilizado como agente de recubrimiento o matri; ; para ello, se debe tener en cuenta, entre otros factores, la forma de administracién, su toxicidad, el producto (alimenticio, cosmético, farmacéutico, ete.) cen la que se va a incorporar la formulacién, etc. En el campo de la nanotecnologia alimentaria, no es recomendable emplear polimeros sintéticos ya que pueden presentar problemas de toxicidad. Los polimeros naturales no presentan esos inconvenientes; sin embargo, su utilizacién implica el desarrollo de métodos de produccién de particulas mis complicados; ademis, en la mayoria de los casos, cl tamaiio de particula obtenido (superior a 100 um en muchos casos) es dificil de controlar, por lo que tales nanoparticulas pueden ser percibidas por el consumidor y alterar las caracteris organolépticas del alimento diana, Entre los materiales empleados tradicionalmente como agentes de recubrimiento de CBA se encuentran las proteinas. Se ha descrito el empleo de caseina como vehiculo15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, para encapsular CBA de cardcter hidréfobo para su aplicacién en alimentos (CA2649788 y EP2011472). El acido folico (acido pteroilmonoglutamico 0 vitamina B9), una vitamina hidrosoluble de tipo B luida dentro del grupo de los folatos, es esencial para procesos bioquimicos importantes tales como la sintesis de DNA. Su carencia esté asociada a la presencia de anemia megaloblastica, enfermedad de Alzheimer, sindrome de Down, desérdenes de humor, algunos tipos de cancer (colon, cérvi . Ieucemia, pancreas), defeetos del tubo neural durante el desarrollo del feto, complicaciones en el embarazo e infertilidad masculina, Sin embargo, no puede ser sintetizado por el organismo, por lo que debe ser suministrado a través de diversos suplementos 0 de la dieta. Aunque los folatos se encuentran presentes de un modo natural en los alimentos (c.g., frutas y hortalizas), fundamentalmente en forma de polighutamatos, su biodisponibilidad es incompleta, tipicamente del 50% o inferior. Por tanto, el consumo de alimentos fortificados con acido félico puede constituir una opeién complementaria para incrementar la ingesta de dicha vitamina en aquellos casos en los que la ingesta de folatos sea inferior a la recomendada. No obstante, la biodisponibilidad del dcido folico atadido a los alimentos no es total debido, entre otras causas, al efecto matriz (el dcido folico puede enlazarse a algin componente de! alimento impidicndo asi su absorcién), 0 bien a la presencia en el alimento de algin componente que reduzea su Diodisponibilidad. Ademéds, el acido folico no se absorbe bien cuando no se encuentra cido folico solubilizado en el intestino. Los suplementos o fortificaciones con & administrados mediante cépsulas, comprimidos, etc., presentan el inconveniente de que al disgregarse en el estémago debido a los acidos gastricos, el acido félico precipita, convirtiéndose en su forma menos soluble, con lo que tan solo una parte del dcido folico suministrado Hega al intestino, Por otra parte, la fortificacién de alimentos con folatos 0 con dcido félico es un proceso complicado debido a que tanto los folatos y sus derivados como el acido félico son sensibles a la temperatura, luz, y cambios de pH, entre otros factores, por lo que su estabilidad se ve comprometida por las condiciones de procesado del alimento y la cantidad bioactiva de la vitamina accesible para el consumidor puede resultar muy reducida. Asi pues, a la hora de fortificar alimentos con dicha vitami tener15 20 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 3 en cuenta estos aspectos, ya que las mayores pérdidas pueden tener lugar durante el almacenamiento de los alimentos y su preparacin. Se ha descrito el enriquecimiento de alimentos con acido folico, fundamentalmente en productos Licteos y cereales. También se han descrito suplementos dietéticos (EP2002839) 0 alimentos enriquecidos con Acido félico o folatos, como embutidos carnicos (ES2302571), lécteos (EP1941804), alimentos infantiles (US4753926), o incluso alimentos enlatados a base de pollo, cerdo 0 vacuno (RU2223672 y RU2213493). Sin embargo, en los casos descritos no se contemplan las iteracciones de la vita 1a con la matriz alimentaria, ni su biodisponibilidad. También se ha descrito un método de obtencién de microcapsulas de alginato y pectina que contienen dcido félico para protegerlo de los factores medioambientales que dan lugar a su degradacién, asi como de las condiciones gastricas, consiguiendo su liberacién en intestino. Sin embargo, las microcapsulas obtenidas son de tamaiios exeesiv. mente grandes, lo que incide en las caracteristicas organolépticas del alimento diana, También se ha disefiado un método para encapsular el acido folico en nanosferas de poli(acido Lictico-co-glicélico) (PLGA) y conseguir una liberacién sostenida de la misma; aunque los resultados fueron positives, su aplicacién en alimentos queda comprometida por el empleo de ese polimero, ya que esta restringido a las areas de medicina y farmacia, Existe, por tanto, la necesidad de desarrolla jemas de encapsulacién de CBA, preferentemente hidrosolubles, mas preferentemente CBA hidrosolubles acidos, e.g. Acido félico, que superen la totalidad o parte de los inconvenientes previamente mencionados. COMPENDIO DE LA INV. Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que nanoparticulas formadas con caseina que comprenden, ademés, un aminodcido basico (e.g. arginina o lisina) y un metal apto para alimentacién (c.g., calcio), constituyen un nuevo sistema de encapsulacién y estabilizacion de compuestos biolégicamente activos (CBA), tanto hidrosolubles como liposolubles, preferentemente hidrosolubles, més preferentemente CBA hidrosolubles dcidos, para su aplicacién en alimentos, en cosmética y en farmacia,15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118 4 Por tanto, en un aspecto, la invencién se relaciona con unas nanoparticulas que comprenden una matriz de caseina, un aminoacido basic y un metal de grado alimentario seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones. Dichas nanoparticulas pueden ser utilizadas como ai nes vos tecnolégicos; ademas, tienen la capacidad de encapsular un CBA, preferentemente, un CBA hidrosoluble, més preferentemente un CBA hidrosoluble dcido, como por ejemplo una vitamina de tipo B 0 C, tal como dcido folico, acido pantoténico y dcido ascérbico, u otros compuestos de cardcter hidrofilico, aunque también pueden incorporar CBA liposolubles. Dichas nanoparticulas son estables y capaces de proteger el CBA de su degradacién por agentes externos, ¢.g., luz, cambios de pH, oxidacién, ete., tanto durante el procesado del producto (¢.g,, alimento, producto farmacéutico 0 cosmético) como durante su almacenamiento, y, ademas, cuando se aplican en alimentacién, protegen el CBA de las condiciones dcidas del estomago, impidiendo su liberacién a lo largo del tracto gastrico, evitando a i su precipitacion y, por lo tanto, que su biodisponibilidad se vea reducida. Ademds, se ha encontrado que dichas nanoparticulas son capaces de disolverse en medio intestinal (simulado) facilitando la completa indo ademas liberacién del CBA en el intestino para su correcta absorcidn, y evi problemas de toxicidad de cualquier tipo. Ventajosamente, dichas nanoparticulas son inertes en el alimento en el que se introducen, evitando de este modo que el CBA reaccione con los distintos componentes de la matriz y se reduzea su biodisponibilidad. Adicionalmente, una de las caracteristicas mas importantes de las nanoparticulas proporcionadas por esta invencién radica en el aprovechamiento de la caseina como vehiculo natural para la proteccién del CBA tanto de las condiciones ambientales como de las condiciones gastricas, facilitando su liberacién en el intestino y mejorando ast su biodisponibilidad, ya que la caseina per se posce demostradas propiedades nutricionales, de modo que complementa los efectos beneficiosos del propio CBA. En otro aspecto, la invencién se relaciona con un procedimiento para la produccién de dichas nanoparticulas. Dicho procedimiento es sencillo y aplicable a scala industrial, Ventajosamente, dicho procedimiento no incluye polimeros sintéticos ni reactivos que no estén aprobados como aditivos alimentarios, minimizando la15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 5 inclusi6n de tensioactivos 0 emulgentes, y permite obtener nanoparticulas de escala nanométrica, con un tamafio de particula controlable. En una realizacién particular, dicho procedimiento comprende, ademés, el secado de la suspensién que contiene dichas nanoparticulas con el objetivo de obtener la formulacién en forma de polvo, manteniendo estable en el tiempo el CBA; este tipo de formulacién en forma de polvo es particularmente adecuado para su empleo en alimentos sélidos. Ventajosamente, dicho tratamiento de secado se lleva a cabo en presencia de un agente protector de las nanoparticulas. Las nanoparticulas conteniendo un CBA asi obtenidas se pueden resuspender con facilidad en medio acuoso, protegiendo cl CBA de su degradacién en disolucién. El producto final obtenido es estable y protege al CBA durante largos periodos de almacenamiento y, ademas, es aplicable a distintos tipos de alimentos, tanto liquidos (¢.g., bebidas, ete.) como sdlidos. En otro aspecto, la invencién se relaciona con una composicién que comprende dichas nanoparticulas para su empleo en los sectores alimentario, farmacéutico 0 cosmético. De hecho, dichas nanoparticulas pueden incorporarse en cremas, geles © hidrogeles, con el fin de obtener preparados cosméticos estables y adecuados para su empleo en este campo. Asimismo, dichas nanoparticulas pueden formularse con excipientes adecuados para la administracién de dichas nanoparticulas por via tépica, En otro aspecto, la invencién se relaciona con un producto alimenticio, que comprende dicha composicién a base de nanoparticulas de caseina proporcionadas por esta invencién, En una realizacién particular, dicho producto alimenticio se encuentra cn forma liquida, semi-sélida o sélida. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS, Figura 1, Muestra una representacién esquematica de una realizacién particular del procedimiento de la invencién aplicado a la obtencién de las nanoparticulas de caseina conteniendo acide falico. Figura 2. Imagenes de microscopia electronica de transmision (TEM) de nanopat ulas de caseina vacias. La barra negra situada en el margen inferior izquierdo de las imigenes corresponde a una referencia de 100 nm.15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 6 Figura 3. Imagenes de microscopia electronica de transmisién (TEM) de nanoparticulas de caseina conteniendo dcido félico. La barra negra situada en el margen inferior izquierdo de las imagenes corresponde a una referencia de 100 nm. Figura 4, Relacién entre la cantidad de dcido folico encapsulada y la cantidad de caseina por cada mg de acido félico atadido a la formulacién, En todas las formulaciones la proporeién en peso entre la lisina y la proteina, antes de la adicién de la solucién de dcido félico, es de 1:12. Figura 5, Micrografias de microscopia electronica de barrido (SEM) de nanoparticulas de caseina conteniendo acido folico y con lisina en su formulacién sin tratamiento de altas presiones (A y B), con tratamiento a 100 MPa, 5 minutos (C), con tratamiento a 400 MPa, 5 minutos (D) y con tratamiento a 800 MPa, 5 min (E). Figura 6, Micrografia de microscopia electrénica de barrido (SEM) de nanoparticulas de caseina conteniendo dcido félico y con arginina en su formulacién con tratamiento a 400 MPa, 5 minutos. Figura 7. Liberacién de acido folico desde las nanoparticulas de caseina sin tratamiento de altas presiones tras su incubacion en medios gistrico simulado (FGS) (durante las 2 primeras horas: 0-2 h) e intestinal simulado (FIS) (2 a 24h) a 371°C. Los datos muestran la media * desviacién tipica (n=6) Figura 8, Liberacién de dcido folico desde las nanoparticulas de caseina con tratamiento de altas presiones (A) 150 MPa, 5 minutos y B) 400MPa, 5 minutos) tras su incubacién en medios gistrico simulado (FGS) (durante las 2 primeras horas: 0-2 h) € intestinal simulado (FIS) (2 a 8h) a 37+1°C. Los datos muestran la media + desviacion tipica (n=4). Figura 9. Concentracién de dcido félico en suero (ng/mL) en funcién del tiempo, tras la administracién de las distintas formulaciones de la vitamina en animales de Laboratorio, Los resultados muestran la media + desviacién estindar (n ~ 5) A) Via intravenosa, dosis | mg/kg. B) Via oral, dosis 1 mg/kg: dcido folico no encapsulado disuelto en agua (#) Jicido folico encapsulado en nanoparticulas de cascina dispersas en agua (m); ficido félico encapsulado en nanoparticulas de cascina tratadas por altas presiones dispersas en agua (A),15 20 25 30 Wo 2011/104410 PCT/ES2O11/070118 te DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invencién proporciona unas nanoparticulas de caseina y unos métodos para la encapsulacién de compuestos biolégicamente actives (CBA), con el objetivo de preservarlos de la degradacién por agentes externos, tales como luz, cambio de pH, oxidacin, ete. Definiciones Para facilitar la comprensién de la presente invencién, a continuacién se expone el significado de algunos términos y expresiones tal como se utilizan en el contexto de la invencion. ido bi Un “aminoai ico”, tal como aqui se utiliza, incluye lisina, arginina ¢ histidina, “Caseina”, tal como aqui se utiliza, se refiere a una proteina conjugada que constituye aproximadamente el 80% del total de proteinas de la leche, Se trata de una proteina de tipo fosfoproteina que entra dentro de la definicién de globulinas; es soluble; posee una gran capacidad de retencién de agua y precipita a un pH aproximado de 4,6 a 20°C. Se encuentra constituida por cuatro fracciones fundamentales (as- cascina, as’ ascina, B-cascina y K-cascina) diferenciadas entre si por su composicién en aminodcidos, su distribucién de cargas y su tendencia a formar agregados en presencia de calcio, En la leche, las casefnas se encuent in formando grandes particulas coloidales de entre 50 a 600 nm de didmetro (150 nm aproximados en promedio) denominadas “micelas de caseina”, Estas particulas se forman por interacciones hidrofébicas y por complejacién del fosfato de calcio por parte de los radicales de fosfoserina presentes en la estructura de la caseina, Dichas micelas constituyen un sistema coloidal muy estable en la leche, siendo una de las principales causas de su color, estubilidad al calor y coagulacién por renina, Un “compuesto biolégicamente activo” 0 “CBA”, tal como aqui se utiliza, se refiere a cualquier compuesto que presenta una actividad nutricional, terapéutica y/o cosmética, tanto liposoluble como hidrosoluble. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de CBA de acuerdo con la presente invencién incluyen aminodicidos, antimicrobianos, hormona aromatizantes, conservantes, edulcorantes, esteroides, firmacos idos,10 25 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, péptidos, polinuclestidos, polisacéridos, proteinas, proteoglicanos, saborizantes, vitaminas, ete. Un “compuesto biolégicamente activo hidrosoluble” o “CBA hidrosoluble”, tal como aqui se utiliza, se refiere a un compuesto que presenta una actividad nutricional, terapéutica y/o cosmética y que es soluble (muy soluble, ficilmente soluble, soluble, bastante soluble © poco soluble) en una solucién acuosa segiin los criterios definidos por la Real Farmacopea Espafiola: Voimenes aproximados de disolvente en mifiitros (mi) por gramo de soluto, referido a una temperatura comprendida entre ISC y 25°C Muy soluble Inferior a T dcilmente soluble de 1a 10 Soluble de a 30 Bastante soluble de 30a ‘+100 Poco soluble de Too a ‘1.000 Muy poco soluble de 7.000 a 10.000 Précticamente insoluble | mayor que 10.000 Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de CBA hidrosolubles incluyen vitaminas, por ejemplo, vitaminas de las familias B 0 C, y sus derivados, sales 0 ésteres; acido hialurénico, condroitin sulfato, dcido tidctico, sus sales o ésteres, etc. En una realizacion particular, dicho CBA hidrosoluble se selecciona del grupo formado por dcido félico, ficido 4-aminobenzoico, niacina, acido pantoténico, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfuto, tiamina trifosfato, dcido ascérbico, acids pteroilpoliglutimicos (derivados del fcido folico: poliglutamatos de folato; folatos de poliglutamato), cide folinico, Acido nicotinico, acido hialuronico, acido tidctico (acido alfa-lipoico), acido p- cumérico, écido cafeico, sus derivados, ésteres o sales farmacéuticamente o cosméticamente aceptables, 0 de grado alimentario, y sus mezelas. Un “compuesto _biolégicamente activo liposoluble” 0 “CBA liposoluble”, tal como aqui se utiliza, se refiere a un compuesto que presenta una actividad nutricional, terapéutica y/o cosmética y que es soluble (muy soluble, ficilmente soluble, soluble, bastante soluble o poco soluble) en grasas y aceites, segiin los criterios definidos por la Real Farmacopea Espaiiola, Ejemplos ilustrativos, no limitativs, de CBA liposolubles incluyen vitaminas, por ejemplo, vitaminas de las familias A, D, E, K y sus derivados, fosfolipidos, carotenoides (carotenos, licopeno, luteina, capsantina, zeaxantina ete.),15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 9 cido docosahexanoico (DHA), dcido eicosapentanoico (EPA), etc,), fitostanoles y fitosteroles (sitosterol, campesterol, estigmasterol, etc.), polifenoles (quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isoramnetina, ete.) y sus derivados Un producto se dice que es de “grado alimentario” cuando es seguro para su empleo en alimentacién, humana o animal, segin el Cédigo Alimentario (Codex Alimentarius) de un pais o de una organizacién, por ejemplo, de la Organizacién de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacién (FAO) o de la Organizacién Mundial de la Salud (OMS); en consecuencia, un producto de “grado alimentario” es un producto no t6xico “apto para su empleo en alimentaci6n” por lo que ambas expresiones indnimas y se utilizan indistintamente en esta descripeién, Un “metal _divalente”, tal como aqui se utiliza, incluye a cualquier elemento metalico cuya valencia es 2, por ejemplo, un metal alcalinotérreo, e.g., calcio, magnesio, zine, etc., 0, si tiene varias valencias, una de ellas es 2, por ejemplo, hierro, etc., con la condicién de que sea farmacéutica 0 cosméticamente aceptable, 0 apto para su empleo en alimentacion. Un “metal trivalente”, tal como aqui se utiliza, incluye a cualquier elemento metalico cuya valencia es 3, 0, si tiene varias valencias, una de ellas es 3, por ejemplo, hierro, etc., con la condi n de que sea farmacéutica 0 cosméticamente aceptable, 0 apto para su empleo en alimentacién. “Nanoparticula”, tal como aqui se utiliza, se refiere a sistemas coloidales de tipo esferas o formas similares de tamaiio inferior a 1 micrémetro (jum), preferentemente del orden de 10 a 900 nanémetros (nm). “Tamafio medi tal como aqui se utiliza, se refiere al didmetro promedio de la poblacién de nanoparticulas que se mueve conjuntamente en un medio acuoso. El tamaiio medio de estos sistemas se puede medir por procedimientos estindar conocidos por el experto en la materia, y que se describen, por ejemplo, en Ia parte experimental (véase mas adelante), Las nanoparticulas de la inveneién se caraeterizan por presentar un tamaiio medio de particula ferior a | um, comprendido, tipicamente, entre 1 y 999 nm, preferentemente entre 10 y 900 nm, mas preferentemente entre 50 y 500 nm, ain mis preferentemente entre 100 y 200 nm, En una realizacién particular, las15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, nanoparticulas de la invencién presentan un tamafio medio de particula comprendido entre 50 y 200 nm, preferentemente de alrededor de 140 nm aproximadamente. Nanoparti En un aspecto, la invencién se relaciona con una nanoparticula, en adelante nanoparticula de la inveneién, que comprende una matriz de caseina, un aminodcido basico y un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones. En una realizacién particular, dicho aminodcido basico se selecciona del grupo formado por arginina, lisina, histidina, y sus mezclas. En otra realizacién particular, dicho metal es, preferentemente, un metal divalente, de grado alimentario, scleccionado del grupo formado por caleio, magnesio, zinc, hierro (en su forma divalente), y combinaciones de los mismos. En otra realizacién particular, dicho metal es un metal trivalente, de grado alimentario, tal como, por ejemplo, hierro en su forma trivalente. Las nanoparticula de la invencién pueden ser utilizadas como aditivos tecnoligicos, por ejemplo, como sustitutos de grasa, ete. Ademés, las nanoparticulas de la invencién tienen la capacidad de encapsular un compuesto bioldgicamente activo (CBA). Asi, en otra realizacién particular, la nanoparticula de la invencién comprende, ademas, un compuesto biolgicamente activo (CBA). Dicho CBA puede ser un CBA hidrosoluble o un CBA liposoluble; en este caso, la nanoparticula de la invencién se identifica, en ocasiones, en esta descripeién como “nanoparticula cargada de la invencién”. En una realizacién particular, dicho CBA es un CBA hidrosoluble, preferentemente, un CBA hidrosoluble dcido. En una realizacin mas particular, dicho CBA hidrosoluble se selecciona del grupo formado por: a) una vitamina de la familia B 0 C; b) un derivado de una vitamina segin a); ©) un compuesto seleccionado entre el icido hialurénico, condroitin sulfato y ido tidctico; 4) una sal o un éster de cualquiera de los compuestos )-c) anteriores; y15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, u ©) combinaciones de los mismos. En una realizacién concreta, dicho CBA hidrosoluble se sele: iona del grupo formado por acido félico, acido 4-aminobenzoico, niacina o vitamina B3, acido pantoténico o vitamina BS, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, tiamina trifosfato, ficido ascérbico, cidos pteroilpoliglutamicos (derivados del cido _folico: poliglutamatos de folato; folatos de poliglutamato), acido folinico, acido nicotinico, Acido hialurdnico, dcido tidctico 0 acido alfa-lipoico, icido p-cumirico, acido cafeico, sus derivados, ésteres o sales farmacéuticamente 0 cosméticamente aceptables, 0 de grado alimentario, y sus mezclas. En una realizacion concreta, dicho CBA es un CBA hidrosoluble acido, tal como el dcido felis 0, el acido ascérbico, ete. 0, el acido pantoténi Aunque no se desea estar vinculado por ninguna hipdtesis, se cree que, en presencia del metal, tal como el metal divalente (c.g., Icio), las caseinas a y B se agregan del jo a que pierden su hidrofilia y su carga superficial al unirse con el cation por parte de los radicales fosfoserina presentes en su estructura. El CBA hidrosoluble, preferentemente dcido (¢.g,, dcido félico), también interactiia electrostaticamente con dicho metal, por lo que quedaria atrapado en la matriz hidrofébica generada por estos tipos de cascina. Por su parte, la caseina x no reacciona con cl metal (¢.g., calcio), por lo que quedaria unida por su parte hidrofébica a la particula, quedando su fraceién hidrosoluble en contacto con el medio acuoso externo, Dicha fraccién hidrosoluble cuenta con grupos polares correspondientes a los residuos serilo y treonilo unidos a tri- y tetra- sacdridos, ademas de una alta proporcién de grupos carbonilos (grupos dcidos de aminoacidos como el glutimico o el aspartico). Asi se considera que, tras la formacién de las nanoparticulas, el aminodcido basico (c.g,, lisina) presente en disolucién quedaria adherido a la superficie de éstas por su interaccién clectrostética [e.g., tras cl calentamiento que sufren en su paso por el spray dryer (en su caso) pueden ser enlaces de caracter covalente] con los grupos carboxilicos de dicha fraccién. La Figura | muestra una representacién esquematica de unas nanoparticulas cargadas de la presente invencién que comprenden una matriz de caseina, lisina (aminodcido basico) y calcio (metal divalente) En otra realizacién concreta, dicho CBA es un CBA liposoluble si bien, en este caso, seria necesario formar una suspensidn, preferentemente homogénea, del CBA en15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 12 medio acuoso, 0 bien, mis preferentemente, disolver el CBA en una solucién orginica, aiiadir lentamente dicha suspensién acuosa o dicha solucién orgénica sobre la solucién que contiene la fuente de cascina (¢.g., cascinato), ¢ incubar la mezcla. El mecanismo de atrapamiento seria diferente del que se describe para los CBA hidrosolubles ya que los CBA liposolubles quedarian atrapados, independientemente de si tienen capacidad de interactuar con el metal (divalente o trivalente) 0 no, en la fraccién hidrofébica interna de las nanoparticulas por afinidad entre ambas fracciones. En una realizacién particular, dicho CBA es un CBA liposoluble seleccionado ados, centre vitaminas, por ejemplo, vitaminas de las familias A, D, E, Ky sus der fosfolipidos, carotenoides (carotenos, licopeno, luteina, capsantina, zeaxantina, etc.), -leucina, leucina, icidos grasos omega-3 (e.g. DHA, EPA, ete.), aminoacidos (c.g., i metionina, fenilanina, triptéfano, y valina), fitostanoles y fitosteroles (e.g, sitosterol, campesterol, estigmasterol, etc.), polifenoles (e.g. quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isoramnetina, etc.) y sus derivados. La proporcién en peso CBA:caseina en la nanoparticula cargada de la invencién, puede variar dentro de un amplio intervalo; a modo ilustrativo, no limitativo, la proporcién en peso CBA:caseina en la nanoparticula cargada de la invencién puede estar comprendida entre 1:1 y 1:200, preferentemente entre 1:10 y 1:80, mas preferentemente entre aproximadamente 1:15 y 1:35. En una realizacién particular, el CBA es un CBA hidrosoluble, y la proporcién en peso CBA (hidrosoluble):caseina en la nanoparticula cargada de la invencién, esté comprendida entre 1:1 y 1:50, preferentemente entre 1:10 y 1:30, mas preferentemente entre aproximadamente 1:15 y 1:20. En otra realizacién particular, el CBA es un CBA liposoluble, y la proporeién en peso CBA (liposoluble):caseina en la nanoparticula cargada de la invencién, esta comprendida entre 1:1 y 1:200, preferentemente entre 1:10 y 1:80, mas preferentemente centre aproximadamente 1:20 y 1:35 Adicionalmente, si se desea, las nanoparticulas de la invencién, tanto las que estén cargadas con un CBA como las que no lo estén, pueden incorporar en su formulacién un antioxidante, ¢.g., dcido ascorbico (vitamina C), ete., con el fin de incrementar su estabilidad frente a la temperatura y la oxidacién. En una realizacién particular, el CBA es el acido félico y el antioxidante es el dcido ascérbico que parece actuar protegiendo al dcido félico de la degradacién por radiacién ultravioleta, cambio15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 13 de pH, calor, oxigeno, etc., y proporcionando ademis el aporte nutricional del propio Acido ascérbico. Dicho antioxidante podria ser introducido co-encapsulado con el CBA, en la cubierta de las nanoparticulas de la invencién, Procedimiento de obtencién de nanoparticulas En otro aspecto, la invencién se relaciona con un procedimiento para la produccién de nanoparticulas que comprenden una matriz de caseina, un aminodcido basico y un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones (nanoparticulas de la invencién), en adelante “procedimiento [1] de la vencién”, que comprende: a) preparar una solucién acuosa que contiene una fuente de caseina y un aminodcido basico; y b) afiadir una disolucién acuosa de un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinac a), Asimismo, en otro aspecto, la invencién se relaciona con un procedimiento para nes a la solucién de la etapa la produccién de nanoparticulas que comprenden una matriz de caseina, un aminodcido bisico, un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, y un compuesto biolgicamente activo (nanoparticulas cargadas de la invencién), en adelante “procedimiento [2] de la invencién”, que comprende: a) mezclar (i) una solucin acuosa que contiene una fuente de caseina y un primer aminoacido basico con (ii) una solucién que contiene un compuesto biol6gicamente active b) afadir una disolucién acuosa de un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones a la mezela resultante de la etapa a), En la etapa a) del procedimiento [1] de la invencién se prepara una solucién acuosa que contiene una fuente de caseina y un aminoacido basico por métodos convencionales conocidos por los téenicos en la materia, por ejemplo, mediante la adicién de dicha fuente de caseina y el aminoacido basico a un medio acuoso. En la etapa a) del procedimiento [2] de la invencién se mezcla una solu acuosa (i) que contiene una fuente de caseina y un aminodcido bisico, con una solucién15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 14 (ii) que contiene un CBA. La naturaleza y composicién de dicha solucién (ii) que contiene el CBA puede variar en funcién del tipo y naturaleza del CBA. Asi, en una realizacién particular, cuando el CBA cs un CBA hidrosoluble, dicha solucién (ii) que contiene el CBA es una solucién a n otra realizacién particular, cuando el CBA 10sa; es un CBA hidrosoluble acido, dicha solucién (ii) que contiene el CBA es una solucién acuosa que comprende, ademds, un segundo aminodcido basico; y, en otra realizacion particular, cuando el CBA es un CBA liposoluble, dicha solucién (ii) que contiene el CBA es una suspensién del mismo en medio acuoso o preferentemente una solucién organica, més preferentemente una solucién organica de un disolvente miscible con ‘agua, tal como un alcohol, por ejemplo, etanol.. La ci ‘a que puede ser utilizada para la puesta en priictica de ambos procedimientos [procedimientos [1] y [2] de la invencién] puede proceder pricticamente de cualquier fuente de caseina, por ejemplo, leche, judias, ete. La caseina puede encontrarse en dicha solucin en forma de acido caseinico o caseinato, En una realizacién particular, dicha fuente de cascina comprende caseina en forma de caseinato, preferiblemente caseinato sédico. Aunque el caseinato célcico y el fosfocileico también se podrian utilizar, en la prictica resultan menos ventajosos ya que el calcio se emplea para formar las nanoparticulas tras mezclar el caseinato con el principio activo por lo que sila solucién de caseinato cuenta ya con calcio en el medio, la puesta en prictica de dichos procedimientos puede verse seriamente comprometida, La cantidad de caseina que puede contener la solucién acuosa formada en la etapa a) del procedimiento [1] de la invencién, asi como la solucién acuosa (i) [que contiene una fuente de caseina y un primer aminodcido basico] utilizada en la etapa a) del procedimiento [2] de la invencién, puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacién particular, la cantidad de caseina contenida en dicha solucién acuosa esti comprendida entre 0,1% y 10% (p/v), preferentemente entre 0,5% y 5%, mas preferentemente entre 1% y 3%. El aminoicido basico contribuye a la disolucién de la caseina y, en su caso, del CBA, en particular, de CBA hidrosolubles dcidos, por lo que desempefia un papel muy importante en la produccién de las nanoparticulas, tanto cargadas con CBA como no cargadas, de la invencién, Efectivamente, parece que el aminodcido basico, al aumentar el pH de la solucién permite disolver el caseinato sin necesidad de tener que utilizar15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 15 sales inorganicas, y, ademés, actita como base para mantener los extremos hidréfilos de las fracciones kappa (x) de la caseina en forma aniénica, de modo que las particulas con carga superficial negativa se mantienen en suspensién y no se agregan debido a El aminodcido basico que puede ser utilizado para la puesta en prictica de ambos procedimientos [procedimientos [1] y [2] de la invencién] se selecciona del grupo formado por arginina, lisina, histidina, y sus mezclas, preferentemente, entre arginina, lisina y sus mezclas. El aminodcido basico, que puede estar dentro o fuera de \s nanoparticulas de la invencién, juega un papel fundamentalmente tecnolégico ya que facilita la disolucion de los componentes antes de la formacién de las nanoparticulas y mantiene el pH apropiado tras su obtencién, a ambos lados de la nanoparticula (interior y exterior). A modo ilustrativo, el dcido folico es poco soluble en agua, pero ficilmente soluble en solucién acuosa ligeramente alcalina, por lo que la presencia del aminodcido basico ayuda a disolver el dcido folic. En una realizacién particular del procedimiento [2] de la invencién, cuando el CBA es un CBA hidrosoluble Acido, dicha solucién (ii) que contiene el CBA es una solucién acuosa que comprende, ademas, un segundo aminodcido basico (con el fin de evitar que precipite el CBA), Aunque en ese caso se contempla la posibilidad de utilizar dos aminodcidos basicos diferentes, en una realizacién particular, el aminodcido basico utilizado en la elaboracién de la solucién acuosa que contiene una fuente de caseina (primer aminoacido bisico) y el utilizado en la elaboracién de la solucién acuosa que contiene un CBA (segundo aminoacido basico) es el mismo y se selecciona del grupo formado por arginina, lisina, histidina, y sus mezelas, preferentemente, entre arginina, lisina y sus mezelas. La cantidad de aminoacido basico que puede contener la solucién formada en la etapa a) del procedimiento [1] de la invencién y en la solucién (i) de la etapa a) del procedimiento [2] de la invencién puede variar dentro de un amplio intervalo, y, en general, depende de! aminodcido basico empleado, Por tanto, aunque la relacién en peso aminodcido basico:caseina puede variar ampliamente, en una realizacién particular, la relacién en peso aminoiicido basico:caseina en la solucién formada en la etapa a) del procedimiento [1] de la invencién o en la solucién (i) del procedimiento [2] de la invencién esta comprendida entre 1:1 y 1:50, preferentemente entre 1:10 y 1:40, mis15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 16 preferentemente de aproximadamente 1:12 cuando el aminodcido basico utilizado es lisina o de aproximadamente 1:25 cuando el aminodcido basico utilizado es arginina. Cuando el CBA es un CBA hidrosoluble dcido, la solucién (ii) de la etapa a) del procedimiento [2] de la invencién, que contiene dicho CBA, comprende, adem: Ss, un segundo aminoacido basico, que, como se ha mencionado previamente, puede ser igual © diferente a dicho primer aminodcido basico; en este caso, la relacién aminodcido basico:caseina en el procedimiento [2] de la invencién, es decir, tras la mezcla de las soluciones (i) y (ii) de la etapa a) de dicho procedimiento, est comprendida entre 1:1 y 1:50, preferentemente entre 1:5 y 1:20, mas preferentemente de aproximadamente 1:6 cuando el aminoscido basico utilizado es lisina 0 de aproximadamente 1:9 cuando el aminoacido basico utilizado es arginina Tanto el procedimiento [1] de la invencién como el procedimiento [2] de la invencién comprenden la etapa de afladir a la solucién de la etapa a) una disolucién acuosa de un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal tri valente y sus combinaciones [etapa b)}. Aunque no se desea estar vinculado por ninguna teoria se cree que dicho metal, tal como un metal divalente (¢.g., calcio) permite crear un puente que ayuda a estabilizar el CBA, en particular, cuando el CBA es un CBA hidrosoluble, preferentemente, un CBA hidrosoluble écido, 0 un CBA hidrosoluble capaz de interaccionar con dicho metal (e.g., ealeio), por ejemplo, dcido fSlico, deido pantoténico © una vitamina del grupo B 0 C, 0 sus derivados, en el interior de la nanoparticula cargada de la invencién; en este caso, parece que dicho metal, por ejemplo, dicho metal divalente (¢.g., calcio), actua de puente entre la caseina (en forma de cascinato) y el CBA, preferentemente un CBA hidrosoluble, mas preferentemente un CBA hidrosoluble Acido, o un CBA hidrosoluble capaz de interaccionar con dicho metal, dejando a dicho CBA atrapado en la fraccién hidrofébica de las nanoparticulas cargadas dela wvencién. En una realizacion particular, dicho metal es un metal divalente seleccionado entre calcio, magnesio, zinc, hierro en forma divalente, y sus combinaciones, preferentemente, calcio. En otra realizacién particular, dicho metal es un metal trivalente tal como hierro en forma trivalente. Aunque pricticamente cualquier disolucién acuosa de calcio, ventajosamente de grado alimentario [véase la “Norma General del Codex para los Aditivos Alimentarios”15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 7 GSFA Online para una relacién de sales caleicas empleadas en alimentacién- microencapsulacién], puede ser utilizada en la puesta en practica de dichos procedimientos [1] y [2] de la invencién, en una realizacion particular, dicha solucion acuosa de una sal célcica se selecciona del grupo formado por cloruro calcio, acetato calcico, gluconato cilcico, lactato cileico, sorbato calcico, ascorbato célcico, citrato cleico, propionato célcico, sulfato célcico y sus mezclas, preferentemente cloruro cileico. En la prictica, el carbonato caleico 0 el alginato cileico no resultan recomendables ya que se trata de sales insolubles 0 muy poco solubles en agua. Andlogamente, cualquier disolucién acuosa de magnesio, zinc o hierro en forma divalente o trivalente, de grado alimentario, puede ser utilizada en la puesta en prictica de dichos procedimientos [1] y [2] de la invencién, La relacién en peso metal:caseina, en donde “metal” se refiere a dicho metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacién particular, la relacién en peso metal:caseina esta comprendida 1:5 y 1:15, preferentemente entre 1:7 y 1:10, mas preferentemente alrededor de 1:8,5. En una realizacion particular, dicho metal es un metal divalente. El procedimiento [2] de la invencidn conduce a la obtencién de nanoparticulas cargadas de la invencién y, por ello, la etapa a) comprende la mezcla de (i) una solucién acuosa que contiene una fuente de casefna y un primer aminodcido basico con (ii) una solucién que contiene un CBA. Las caracteristicas de dicho CBA ya han sido mencionadas previamente. En una realizacién particular, dicho CBA es un CBA hidrosoluble, preferentemente, un CBA hidrosoluble acido, por ejemplo, acido folico, acido 4-aminobenzoico, niacina 0 vitamina B3, acido pantoténico o vitamina BS, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, tiamina trifosfato, dcido ascérbico, acidos pteroilpoliglutémicos (derivados del dcido folico: poliglutamatos de folato; folatos de Ppoliglutamato), acido folinico, acido nicotinico, acido hialurénico, acido tidctico, acido ido cafeico, sus derivados, ésteres o sales farmacéuticamente 0 p-cumarico. cosméticamente aceptables, o de grado alimentario, y sus mezclas, En otra realizacién particular, dicho CBA es un CBA liposoluble, por ejemplo, una vitamina de las familias A, D, E, K y sus derivados, un fosfolipido, un carotenoide (¢.g., carotenos, licopeno, luteina, capsantina, zeaxantina, etc.), un cido graso omega-3 (e.g., DHA, EPA, etc.), un15 20 25 30 Wo 2011/104410 PCT/ES2O11/070118 18 aminodcido (e.g., iso-leucina, leucina, metionina, fenilanina, triptéfano, y valina), un fitostanol o un fitosterol (¢.g., sitosterol, campesterol, estigmasterol, ete.), un polifenol (quercetin, . rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isoramnetina, etc.) 0 sus derivados La relacién en peso CBA:cascina cn la nanoparticula cargada de la invencién, puede vatiar dentro de un amplio intervalo; a modo ilustrativo, no limitativo, la relacién en peso CBA:caseina en 1a nanoparticula cargada de la invencidn puede estar comprendida entre 1:1 y 1:200, preferentemente entre 1:10 y 1:80, mas preferentemente entre aproximadamente 1:15 y 1:35. En una realizacién particular, el CBA es un CBA hidrosoluble, y la relacion en peso CBA (hidrosoluble):caseina en la nanoparticula cargada de la invencién, esta comprendida entre 1:1 y 1:50, preferentemente entre 1:10 y 1:30, mas preferentemente entre aproximadamente 1:15 y 1:20. En otra realizacién particular, el CBA es un CBA liposoluble, y la relacién en peso entre CBA comprendida osoluble):caseina en la nanoparticula cargada de la invencién, es entre 1:1 y 1:200, preferentemente entre 1:10 y 1:80, més preferentemente entre 5. Asimismo, la relacién en peso aminoicido basico:CBA (correspondiente a la aproximadamente 1:20 y solucién acuosa (ii) que contiene un CBA hidrosoluble dcido y un segundo aminoacido bisico, utilizada en la etapa a) del procedimiento [2] de la invencién) puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacién particular, la relacién en peso aminoacido bisico:CBA (hidrosoluble acido) en dicha solucién (ii) esta comprendida 1:0,1 y 1:3, preferentemente entre 1:0,5 y 1:1, mas preferentemente alrededor de 1:0,75. Como se ha mencionado previamente, las nanoparticulas de la invencién, tanto las que estén cargadas con un CBA como las que no lo estan, pueden incorporar en su formulacién un antioxidant e.g., dcido aseérbico (vitamina C), ete., con el fin de incrementar su estabilidad frente a la temperatura y la oxidacién, En este caso, dicho antioxidante podria ser introducido co-encapsulado con el CBA (en su caso) 0 en la cubierta de las nanoparticulas de la invencién; para ello, dichos procedimientos [1] y [2] de la invencién se adaptarin adecuadamente para incorporar el antioxidante en la formulacién de las nanoparticulas, por ejemplo, afladiendo el antioxidante a la solucién acuosa que contiene dicho CBA y un aminodcido basico15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 19 En una realizacién particular, el CBA es el acido folico y el antioxidante es el Acido ascérbico que parece actuar protegiendo al dcido folico de la degradacién por radiacién ultravioleta, cambio de pH, calor, oxigeno, etc., proporcionando, ademas, el aporte nutricional del propio acido ascérbico. Dicho antioxidante podria ser introducido co-encapsulado con el CBA 0 en la cubierta de las nanoparticulas de la invencién. Adicionalmente, s desea, tanto el procedimiento [1] de la invencién como el procedimiento [2] de la invencién, pueden inclui una o més etapas adicionales de estabilizacién de las nanoparticulas obtenidas mediante el uso de distintos tratamientos. En una realizacién particular, dicho tratamiento de estabilizacion comprende someter la suspensién que contiene las nanoparticulas de la invencién formadas, tanto las que estan cargadas con un CBA como las que no lo ticnen, a un tratamiento de alta presién, por ejemplo, a una presién comprendida entre 100 y 800 MPa, tipicamente entre 350 y 600 MPa. En una realizacién particular, dicho tratamiento comprende someter la suspensién de nanoparticulas MPa a 800 MPa, tipicamente entre 350 y 600 MPa a ciclos de 3 a 5 minutos, a una presion de 100 ; de hecho, una presién de 400 MPa proporciona buenos resultados. En otra realizacién particular, dicho tratamiento de estabilizacién comprende someter la suspensién que contiene las nanoparticulas de la invencién formadas, tanto las que estan cargadas con un CBA como las que no lo tienen, a un tratamiento UHT (Ultra High Temperature), por ejemplo, a una temperatu comprendida entre 130°C y 140°C durante 2 a 5 segundos, seguido de un rapido enfriamiento. Asimismo, si se desea, tanto el procedimiento [1] de la invencién como el procedimiento [2] de la invencién, pueden incluir una etapa de sceado de la suspension que con ¢ne las nanoparticulas formadas, con el fin de obtener las nanoparticulas de ta invencién, tanto las que estén cargadas con un CBA como las que no lo tienen, en forma de un polvo, Esta forma de presentacién de dichas nanoparticulas contribuye a su estabilidad y, ademas, resulta particularmente dtil para su eventual aplicacion en alimentos sélidos, tales como harina, pan, productos de bolleria, cereales, leche en polvo, etc., asi como en productos cosméticos y/o farmacéuticos. Précticamente cualquier método © técnica convencional adecuado para secar suspensiones que contienen nanoparticulas puede ser utilizado para realizar esta etapa de secado; no obstante, en una realizacién particular, el secado de la suspensién que15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 20 contiene nanoparticulas se lleva a cabo mediante secado por pulverizacién (“spray drying”) o mediante liofilizacin. En general, este tratamiento se lleva a cabo afiadiendo s nanoparticulas a la suspensién de las nanoparticulas un agente protector de dich: adecuado, tal como un sacérido, por ejemplo, lactosa, trehalosa, manitol, sacarosa, maltodextrina, glucosa, sorbitol, maltosa, ete., y sus mezelas. Dicho agente protector protege a las nanoparticulas de la invencién tanto frente a la degradacién térmica como frente a la oxidacién durante el proceso de secado, La relacién en peso caseina:sacérido puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacién particular, la relacién en peso caseina:sacarido esti comprendida 1:1 y 1:4, preferentemente alrededor de 1:2. ido Asimismo, en una realizacién particular, la solucién que contiene el. sa podria contener, ademas, un agente antioxidante, tal como dcido ascdrbico (vitamina C), ete.; en este caso, la relacién en peso caseina:sacérido:agente antioxidant, por ejemplo, vitamina C, podrian ser 1:0,75-2, La :0,01-1,5, preferentemente 1:2,0:0,10. nanoparticulas de la invencién obtenidas segin el procedimiento [1] de la invencién, es decir, las nanoparticulas que comprenden una matriz de casefna, un aminodcido bisico y un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, producida mediante un procedimiento que comprende: a) preparar una solucién acuosa que contiene una fuente de easeina y un aminodcido basico; y b) afadir una disolucién acuosa de un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, a la solucién de la etapa a), constituyen un aspecto adicional de la presente invencién. Asimismo, las nanoparticulas cargadas de la invencién obtenidas segiin el procedimiento [2] de la invencidn, es decir, las nanoparticulas que comprenden una matriz de caseina, un aminodcido bisico, un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, y un CBA, producidas mediante un procedimiento que comprende: a) mezclar (i) una solucién acuosa que contiene una fuente de caseina y un primer aminoacido basico con (ii) una solucién que contiene un CBA; y b) afiadir una disolucin acuosa de un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, a la mezcla resultante de la etapa a), constituyen un aspecto adicional de la presente invencién.15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 21 Apli 101 Las nanoparticulas de la invencién pueden ser utilizadas como aditivos tecnoldgicos, por ejemplo, como sustitutos de grasa, ete, Ademis, tienen la capacidad de encapsular un CBA, e.g., un CBA hidrosoluble 0 un CBA liposoluble. En una realizacién particular, las nanoparticulas de la invencién posibilitan la encapsulacién de un CBA, preferentemente, un CBA hidrosoluble, mi preferentemente, un CBA hidrosoluble acido, y su incorporacién en composiciones farmacéuticas, cosméticas y alimentarias ya que en su preparacién y en el producto final (nanoparticulas) no se utilizan otros ingredientes que no sean polimeros naturales (evitando toxicidad asociada a polimeros sintéticos) ¢ ingredientes de grado alimentario, Dichas nanoparticulas protegen al CBA de su degradacién frente a agentes externos (luz, cambios pH, oxidacién, etc.) Ventajosamente, las nanoparticulas de la invencién tienen un tamaiio medio inferior a 1 um, preferentemente comprendido entre 50 y 200 nm, mas preferentemente de alrededor 140 nm, con el fin de evitar la alteracién de propiedades organolépticas (textura al paladar), Asimismo, las nanoparticulas de la invencién mejoran la biodisponibilidad del CBA en el intestino, protegiendo a dicho CBA de las condiciones acido-pépticas del estémago y facilitando su disolucién y liberacién en el intestino. Las nanoparticulas de la invencién se pueden resuspender en medio acuoso ntarse en protegiendo al CBA de la degradacién en disolucién. Ademis, pueden pr forma de un polvo seco, manteniendo estable el CBA y posibilitando su almacenamicnto durante largos periodos de tiempo (en particular, para su incorporacién cen preparaciones alimenticias sélidas) Adicionalmente, las nanoparticulas de la invencién son también adecuadas para mes cosméticas y farmacéuticas de uso t6pico, Por tanto, en otro aspecto, la invencién se relaciona con una composicién, en adelante “composicién de la invencién”, que comprende, al menos, una nanoparticula de la invencién; en una realizacién particular, la nanoparticula de la inveneién es una nanoparticula que comprende una matriz de caseina, un aminodcido bisico y un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones; en otra realizacién particular, la nanoparticula de la invencién es una nanoparticula cargada de15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, la invencién, es decir, una nanoparticula que comprende una matriz de caseina, un aminoacido basico, un metal seleccionado entre un metal divalente, un metal trivalente y sus combinaciones, y un CBA con actividad nutricional, terapéutica y/o cosmétic: Wy un vehiculo farmacéuticamente 0 cosm icamente aceptable © un vehiculo apto para alimentacién, En una realizacién particular, dicho CBA se selecciona del grupo formado por aminodcidos, antimicrobianos, aromatizantes, conservantes, edulcorantes, esteroides, farmacos, hormonas, lipidos, péptidos, polinuclestidos, polisacéridos, proteinas, proteoglicanos, saborizantes, vitaminas, y sus mezclas, En una realizacion particular, dicho CBA ¢s un CBA hidrosoluble, idrosoluble aci ivos, de preferentemente, un CBA {o. Ejemplos ilustrativos, no limit CBA hidrosolubles incluyen vitaminas, por ejemplo, vitaminas de las familias Bo C, y sus derivados, sales 0 ésteres; dcido hialurénico, condroitin sulfato, écido tidctico, sus sales o ésteres, etc. En una realizacién particular, dicho CBA hidrosoluble se selecciona del grupo formado por acido folico, acido 4-aminobenzoico, niacina, acido pantoténico, tiamina monofosfato, tiamina pirofosfato, tiamina trifosfato, acido ascérbico, acidos pteroilpoliglutimicos (derivados del dcido folico: poliglutamatos de folato; folatos de poliglutamato), acido folinico, acido nicotinico, acido hialurénico, acido tiéctico, acido p-cumirico, acido cafeico, sus derivados, ésteres o sales farmacéuticamente o cosméticamente aceptables, 0 de grado alimentario, y sus mezclas. En otra realizacién particular, dicho CBA es un CBA liposoluble. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de CBA liposolubles incluyen vitaminas, por ejemplo de las familias A, D, E, K y sus derivados, fosfolipidos, carotenoides (carotenos, licopeno, luteina, capsantina, zeaxantina, ctc.), a idos grasos omega-3 (c.g. DHA, EPA, etc.), aminodcidos (¢.g., iso-leucina, Ieucina, metionina, fenilanina, triptéfano, y valina), fitostanoles y fitosteroles (e.g. sitosterol, campesterol, estigmasterol, etc.), polifenoles (e.g. quercetina, rutina, resveratrol, kaempferol, miricetina, isoramnetina, etc.) y sus derivados, En una realizacién particular, la composicién de la invencién es una composicién farmacéutica adecuada para su administracién por via tépica; para ello, dicha composicién comprende un vehiculo farmacéuticamente aceptable que comprende uno 0 mis excipientes adecuados para su administracién por via t6pica, por ejemplo, en15 20 25 30 Wo 2011/104410 PCT/ES2011/070118 23 forma de gel, pomada, crema, ete, Informacién sobre excipientes adecuados para la formulacién de composiciones farmacéuticas destinadas a su administracién por via topica si como sobre la produccién de dichas composiciones farmacéuticas puede encontrarse en el libro “Tratado de Farmacia Galénica”, de C, Fauli i Trillo, 10 Edieién, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones. La dosis a administrar de nanoparticulas de la invencién puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 (g/cm’ de zona a tratar) y aproximadamente 2 (g/cm? de zona a tratar), de una composicién de la invencién que contiene entre un 0,1% y un 30% de nanoparticulas de la invencién, preferentemente, entre 0,5 % y 5%. En otra realizacién particular, la composicién de la invencién es una composicién cosmética adecuada para su administracién por via tépica; para ello, dicha composicién comprende un vehiculo cosméticamente aceptable que comprende uno o mils excipientes adecuados para su administracién por via tépica, por ejemplo, en forma de gel, crema, champii, loci etc, Informacién sobre excipientes adecuados para la formulacién de composiciones cosméticas destinadas a su administracién por via t6pica asi como sobre la produccidn de dichas composiciones farmacéuticas puede encontrarse en el libro “Manual de Cosmetologia”, de Octavio Diez Sales, I* Edicién, 1998, S.A, Editorial Videocinco, En otra realizacién particular, la composicién de la invencién es una cidn alimenticia, tal como una preparacién alimenticia sdlida, liquida 0 semi- En una realizacién particular, la composicién de la invencién comprende: caseina, entre 10% y 50% en pes Acido folico, entre 0,9% y 2,5% en peso; caleio, entre 1% y 6% en peso: y una ino icido basico, entre 1% y 7% en peso; y un sacirido, entre 30% y 80% en peso, donde todas las proporciones son en peso respecto al total de la composicién. En otra realizacién particular, la composicién de la invencién comprende: caseina, entre 10% y 50% en peso; Acido folico, entre 0,9% y 2,5% en peso; calcio, entre 1% y 6% en peso; y15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 24 un aminoacido ico, entre 1% y 7% en peso; un sacirido, entre 20% y 55% en peso; y acido ascérbico, entre 1% y 25%, donde todas las proporciones son en peso respecto al total de la composicién. Alternativamente, la composicién de la invencién puede ser incorporada en un producto alimenticio; por lo que, en otro aspecto, la invencién se relaciona con un producto alimenticio que comprende una composicién de la invencién. Dicho producto alimenticio puede encontrarse en forma liquida, semi-s6lida 0 sélida. Ventajosamente, con el fin de evitar 0 minimizar la disolucién total o parcial de las nanoparticulas de la invencidn y, de este modo, colaborar a su estabilidad, dicho producto alimenticio tiene un pH Acido, es decir, inferior a 7, preferentemente, igual o inferior a 6, mas preferentemente, igual o inferior a 5, Ejemplos ilustrativos de productos alimenticios que puede ser enriquecidos 0 fortificados con la composicién de la invencién incluyen la leche y sus derivados (yogures, quesos, cuajadas, etc.) zumos, mermelada productos de panaderia y bolleria, camnicos fermentados, salsas, etc. Igualmente, la composicién de la invencién puede ser incorporada en un producto para alimentacién animal, por ejemplo, en piensos. EJEMPLOS, Los siguientes ejemplos describen la produccion de particulas de caseina que pueden incorporar un compuesto bioldgicamente activo, concretamente el écido félico, en su interior, Son capaces de proteger el compuesto de las degradaciones que pueda sufrir en el alimento por los miiltiples factores anteriormente mencionados. Ademas, dichos ejemplos ponen de manifiesto la capacidad de stas nanoparticulas de proteger el Acido folico de las tricas tras su ingestién y de liberarlo en medio intestinal. Procedit jiento general de produccin de nanoparticulas de caseina vacias El procedimiento de produccién de nanoparticulas de cascina comprende la disolucién de cascinato sddico (ANVISA, Madrid, Espaiia) en medio acuoso junto con una cantidad determinada de aminodcido bisico, seguido de la adicién, bajo agita magnética y con flujo constante, de un volumen determinado de la disolucién calcica,15 20 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, dando lugar a la formacién de las nanoparticulas bajo apariencia de una suspensién lechosa. ‘aracterizacit sulas n fisico-quimica de las nanopart A continuacién se describen los distintos estudios necesarios para conseguir una caracterizacién fisico-quimica completa de las nanoparticul Dentro de los ensayos fisico-quimicos, se determiné el tamaito y la carga superficial de las nanoparticulas, siendo esta dltima determinada a través de la medida del potencial zeta. El primero de los parametros fue obtenido por espectroscopia de correlacion fotonica, utilizando un Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments! Optilas, Espaiia), mientras que el potencial zeta fue medido empleando un Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, New York, EEUU), El rendimiento del proceso de formacién de nanoparticulas se calculd a través de la cuantificacion de la caseina libre restante tras la obtencién de las mismas, recogida en los sobrenadantes obtenidos al centrifugar la formulacién (17,000 x g, 20 minutos). Asi, la cantidad de caseina que forma particulas en la formulacién se estimé como la diferencia entre la cantidad inicial aadida y la cantidad cuantificada en los sobrenadantes recogidos durante la ctapa de purificacién. Dicha cuantificacién se realizé por espectrofotometria ultravioleta (UV) a 282 nm (Agilent 8453, sistema de espectroscopia UV-visible.). El rendimiento se estimé como: Rendimiento (¥%) = [(mg caseinato totales ~ mg caseinato en sobrenadante)/mg caseinato totales] x 100 Eq. 1] Para la realizacién de los distintos cdleulos se utilizé una curva de calibrado entre 150 y 1.500 g/mL (R? = 0,9992; LD = 36 g/mL; LC = 119 pg/mL). Por otra parte, para confirmar los resultados obtenidos por diferencia entre el total y el contenido en caseinato del sobrenadante, se realizé un estudio de cuantificacién del pellet obtenido tras la centrifugacién, En este caso, para romper las NaOH 0,05M, siendo este el mismo medio empleado para la particulas se empl preparacién de la curva de calibrado. Asi pues, en este caso el rendimiento se estimd como10 15 25 30 WO 2011/104410 PCT/ES2011/070118, 26 Rendimiento (mg caseinato en pellet)img caseinato totales] x 100 [Eq. 2] El miximo de absorbancia encontrado para el cascinato preparado en dicho medio fue de 300 nm. Las concentraciones empleadas para la construccién de la recta cilaron también entre 150 y 1.500 pg/mL (R? = 0,9996; LD = 26 de calibrado os pg/mL; LC = 85 pg/mL). La morfologia de las nanoparticulas se observé por microscopfa electténica de barrido (Zeiss, DSM 940A Alemania). Para ello, las nanoparticulas liofilizadas se cubrieron con una capa de oro molecular de unos 9 nm (Equipo Emitech K550, Sputter- Coater, Reino Unido) y las fotografias se realizaron con un microscopio Zeiss DMS 940 A (Estados Unidos), Procedimiento general de produccién de nanoparticulas de caseina conteniendo Acido folico El procedimiento de produccién de nanoparticulas de caseina conteniendo acido folico comprende la disolucién de cascinato sédico en medio acuoso junto con una cantidad determinada de aminodcido bisico seguido de la adicién, bajo agitacién magnética, de un volumen determinado de una disolucién de acido félico previamente preparada en medio acuoso con una determinada cantidad de aminodcido bisico. Tras la incubacién de la mezcla durante unos minutos, el iltimo paso consiste en la adicién de la sal cileica, dando lugar a la formacién de las nanoparticulas bajo apariencia de una suspensién lechosa-amarillenta Opeionalmente, las nanoparticulas formadas pueden ser sometidas a tratamientos, de altas presiones hidrostaticas (Stansted Fluid Power, Modelo ISOLAB FPG11500B110; N° serie: 7844) en ciclos de entre 1 a 5 minutos entre 100 y 800 MPa, con el objetivo de estabilizarlas A continuacién, y tras una homogeneizacién de 3 minutos mediante agitacién, se aiiade, sin dejar de agitar, un volumen determinado de solucién de un sacrido (lactosa, trehalosa, manitol, glucosa, sorbitol, maltodextrina 0 malt sa). Finalmente, la suspensién se liofiliza, o bien se pulveriza en un spray dryer (Biichi Mini Spray Drier B-191, Biichi Labortechnik AG, Switzerland) bajo las siguientes condiciones: