PRIMERA PARTE BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

DEL CNCER

QUMICA FISIOLGICA Y
PATOLOGA INTEGRADA I
2015

Generalidades y Conceptos
Oncogenes y Supresores de Tumores
Caractersticas del Cncer (hallmarks)
Proliferacin, Diferenciacin y Muerte Celular
Angiognesis

BIOLOGA CELULAR Y
MOLECULAR DEL CNCER
METSTASIS

Marcadores Emergentes
Invasin de Tejidos y Metstasis

SEGUNDA PARTE
Vicente A. Torres, PhD
Laboratorio de Biologa Celular y Molecular

La Cascada de Metstasis
Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cncer

Instituto de Investigacin en Ciencias Odontolgicas

Facultad de Odontologa Universidad de Chile
Centro FONDAP-ACCDIS

Muertes en Chile: aos 1970, 1990, 2004

Prevalencia de Distintos Tipos de Cncer en Chile

rgano/tejido vs ranking

mujeres

biliar

1o
2o

3o

11

10

hombres

El Cncer de Colon como Modelo de Estudio

Qu sucede a nivel celular y

molecular durante el cncer?
PRDIDA DE LA
HOMEOSTASIS CELULAR

TUMORIGNESIS

HOMEOSTASIS CELULAR
En un determinado tejido, las clulas deben co-existir de manera
organizada e interdependiente. En relacin a sto, se destacan una serie
de caractersticas que deben ser finamente reguladas:

tejido normal

plipos y adenomas

adenocarcinoma

PROLIFERACIN Y VIABILIDAD CELULAR

INTERACCIONES DE LA CLULA CON SU ENTORNO
RESPUESTA A SEALES EXTRACELULARES
(MITGENOS Y FACTORES INHIBITORIAS DEL CRECIMIENTO)

TRANSFORMACIN CELULAR

tejido normal

Ejemplo en el cncer de colon

muerte celular

Se han definido una serie de eventos caractersticos o marcadores

(hallmarks) asociados al cncer

Proliferacin

Douglas Hanahan &

Robert Weinberg
Cell 2000: 100: 57-70

Proliferacin sostenida
cncer colorectal

Evasin de la muerte celular

Douglas Hanahan &

Robert Weinberg
Cell 2011: 144: 646-674

muerte celular

muerte
celular

Proliferacin

Proliferacin
Normal
normal

cncer

Hallmarks del Cncer

INMORTALIDAD REPLICATIVA
SEALIZACIN PROLIFERATIVA SOSTENIDA
PRDIDA DE LA RESPUESTA A SEALES DE DIFERENCIACIN E
INHIBIDORAS DEL CRECIMIENTO
RESISTENCIA A LA MUERTE CELULAR
INDUCCIN DE LA ANGIOGNESIS
INVASIN DE TEJIDOS Y METSTASIS

El orden y la temporalidad de
cada uno de estos
marcadores es propio de
cada neoplasia en particular

PROLIFERACIN Y VIABILIDAD CELULAR

INTERACCIONES DE LA CLULA CON SU ENTORNO

La capacidad de proliferacin en una clula somtica es limitada. Esta

proliferacin ocurre hasta alcanzar el Lmite de Hayflick (Exp Cell Res
1965; 37: 614). Este lmite restringe hasta 40-50 divisiones, luego del
cual se llega a un estado de senescencia y muerte celular

Dependencia de anclaje a sustrato: La proliferacin celular est directamente

asociada a la interaccin clula-matriz extracelular, mediada por integrinas

Inmortalizacin celular
Poblaciones clonales con
crecimiento continuo

Senescencia

(alteraciones telomricas y
cromosomales, aneuploida)

Prdida de la dependencia de anclaje a sustrato

Las clulas pueden crecer en suspensin

Inhibicin por contacto: En cultivos celulares, el contacto entre clulas del

mismo tipo inhibe su movimiento

Prdida de la inhibicin por contacto:

Las clulas pueden crecer por sobre la capacidad
permitida en una monocapa

Transformacin Celular:

SUPRESORES DE
TUMORES

Proliferacin Celular

PROTENAS
ONCOGENES

Viabilidad Celular
ONCOGENES

Interaccin Clula-Clula

1. Son genes cuya sobre-expresin o mutacin con ganacia de funcin

favorecen la tumorignesis

Respuesta a Seales Extracelulares

2. Descubiertos a raz de virus con accin transformante

Cul clula ser ms transformada?

SUPRESORES DE TUMORES
1. Son genes cuya prdida o disminucin de su funcin favorece la
tumorignesis
2. Inicialmente se describieron en el contexto de mutaciones, ya sean
de la lnea germinal (hereditarias) o de origen somtico. Ejemplos,
pRb, p53, APC, BRCA1

RESPUESTA A SEALES EXTRACELULARES

(MITGENOS)

ALTERACIONES
EN LA
PROLIFERACIN Y
CRECIMIENTO
CELULAR

Dependencia de factores de crecimiento: La proliferacin depende de la

disponibilidad de factores de crecimiento especficos para el tejido. En
cultivos celulares, la privacin de estos factores (por ejemplo, suero
suplementario) lleva a muerte celular. Otro factor importante es la
produccin autocrina de estos factores

Prdida completa o parcial de la dependencia de factores de

crecimiento
Factores de suplemento en cultivo (suero)
In vitro
Crecimiento a menor densidad inicial

SEALIZACIN POR FACTORES DE CRECIMIENTO

RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA

RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA

1. Son protenas integrales de membrana
2. Poseen actividad tirosina kinasa
intrnseca
3. Sus ligandos son usualmente
MITGENOS
EGF, PDGF, FGF, VEGF, insulina
4. La unin de ligando lleva a la
dimerizacin del receptor
5. Catalizan la transfosforilacin en
residuos de tirosina (autofosforilacin)

SEALIZACIN INTRACELULAR POR RECEPTORES DE

TIROSINA KINASA

La cascada de protenas MAP kinasa (MAPK, Protena Kinasa

Activada por Mitgeno)
Las MAPK son kinasas que fosforilan en residuos de Ser o Thr
Estas enzimas se activan en respuesta a estmulos extracelulares,
como MITGENOS, shock trmico y citoquinas
La cascada de sealizacin MAPK se inicia por Ras-GTP

Ras
MAPKKK
MAPKK
MAPK
Proliferacin y
Diferenciacin Celular

Apoptosis
Mitosis

Expresin gnica

1.Sobre-produccin de ligando (mitgeno)

Mecanismos moleculares por

los cuales las clulas
tumorales sobre-activan las
vas de sealizacin de
mitgenos (RTKs)

VIABILIDAD Y
MUERTE CELULAR

2.Mutaciones activadoras del receptor (RTK)

3. Mutaciones en la cascada ro abajo: Ras

Mecanismos de Control de la Viabilidad y Muerte

Celular
Receptor de factor
de crecimiento

Receptor de la MEC
(integrinas)

muerte celular

En el modelo de
adenocarcinoma de
colon

Receptor de
muerte celular
Proliferacin

MEMBRANA
PLASMTICA

MUERTE CELULAR PROGRAMADA

DESARROLLO Y PROCESOS
FISIOLGICOS

Principal forma caracterizada:

apoptosis
Otras formas: autofagia, necrosis
programada
Seales de
sobrevivencia
www.invesmed.com

APOPTOSIS: DOS VAS PRINCIPALES CON UN MISMO FIN

ANGIOGNESIS,
INVASIN DE TEJIDOS
Y METSTASIS

ANGIOGNESIS
Crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos sanguneos pre-existentes

Angiognesis de sprouting
(brotante)

Factores de regulacin importantes:

Factores de crecimiento: FGF, VEGF, PDGF
Receptores: VEGFR
El sprouting de vasos sanguneos ocurre a razn
de varios milmetros por da (dependiendo del
estmulo)

Receptores de adhesin clula-clula: VE-cadherina

Enzimas: eNOS, COX2

VEGFR (Tirosina kinasa receptora)

El receptor VEGF (VEGFR) es una protena tirosina kinasa receptora, del tipo
PDGFR

PRIMERA PARTE BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

DEL CNCER
Generalidades y Conceptos
Oncogenes y Supresores de Tumores
Caractersticas del Cncer (hallmarks)
Proliferacin, Diferenciacin y Muerte Celular
Angiognesis
Marcadores Emergentes
Invasin de Tejidos y Metstasis

SEGUNDA PARTE
La Cascada de Metstasis
Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cncer

La METSTASIS ocurre a travs de una serie de

pasos interrelacionados, en donde cada uno de ellos
puede ser una etapa limitante

MIGRACIN CELULAR
E INVASIVIDAD

Composicin del Tejido

(ECM y clulas vecinas)

Receptores de Superficie
Sealizacin Intracelular

MIGRACIN CELULAR
E INVASIVIDAD

Remodelamiento de la ECM

INTRAVASACIN
TRANSPORTE
EXTRAVASACIN
CRECIMIENTO DE
TUMOR 2RIO
Cada uno de estos procesos son
muy ineficientes: < 0,1% clulas
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816

MIGRACIN CELULAR
E INVASIVIDAD

diseminadas formarn mets

Composicin del Tejido

(ECM y clulas vecinas)

Receptores de Superficie

MIGRACIN CELULAR

Sealizacin Intracelular

(Medicin Experimental en Ensayo de

Cierre de Herida)

Remodelamiento de la ECM

MIGRACIN CELULAR: composicin del microambiente

INTERACCIN
CLULA ECM

Mol Biol Cell 2010; 21: 369

INTERACCIN
CLULA CLULA

La migracin celular es
un proceso fundamental,
tanto durante el
desarrollo, como en el
organismo adulto
Clula de cncer de mama (MCF10A)
sr.burnham.org

Clulas de melanoma
murino B16-F10

Durante la migracin celular existen alteraciones en estas uniones

E-cadherina
actina
ncleo

Qu Sucede con estas Interacciones

entre la Clula y su Entorno Durante el
Cncer?
Clula de cncer de mama (MCF10A)
sr.burnham.org

La clula sufre una serie de transformaciones, tanto

a nivel morfolgico, como bioqumico

ALTERACIONES EN LA INTERACCIN CLULA-CLULA

Expresin de E-cadherina
Caractersticas
de tipo epitelial

EMT

Caractersticas
de tipo
mesenquimticas

TRANSICIN
EPITELIO-MESNQUIMA
(epithelial-mesenchymal transition, EMT)

Cancer Res 2006;

66 (17): 9

BioEssays 2001; 23: 912

DIFERENCIAS PRINCIPALES
Polaridad Apical
y Basolateral
Adhesin celular e
inhibicin por contacto

Expresin de componentes
estructurales de Uniones Adherentes

MORFOLOGA

AJ, TJ, GJ y
desmosomas

CARACTERSTICAS
FSICAS
UNIONES
INTERCELULARES

E-cadherina y
citoqueratinas

MARCADORES
MOLECULARES

Microtbulos longitudinales
actina circunferencial

ORGANIZACIN
CITOESQUELETO

Asimetra: extremo
lder y posterior
Movilidad celular e
invasividad
Adhesiones focales /
GJ transitorios
N-cadherina, vimentina,

metaloproteasas
Microtbulos astrales /
Fibras de estrs

MECANISMOS DE DISMINUCIN EN LA EXPRESIN DE

E-CADHERINA

MIGRACIN
CELULAR

Adhesiones Focales
(sitios de adhesin celular)

Citoesqueleto Celular

Una clula de carcinoma pulmonar migrando

sobre matriz extracelular de fibronectina

MIGRACIN CELULAR: MECANISMOS MOLECULARES

Cancer Sci 2007;
98(10): 1512-1520

FACTORES QUE INFLUYEN EN

LA MIGRACIN CELULAR
ADHESIN CELULAR

Adhesin celular

CITOESQUELETO
FACTORES EXTRACELULARES
(ECM, QUIMIOQUINAS, ETC)

Remodelamiento
del citoesqueleto

PROTENAS DE SEALIZACIN
INTRACELULAR
Desensamble de
adhesiones

EXPRESIN GNICA

TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)

Modelo de estudio: migracin celular sobre sustrato 2D

Cules son los mecanismos moleculares implicados en la

migracin celular?

Segn este modelo, la migracin celular puede ser descrita como una serie
sucesiva de etapas

MIGRACIN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

MIGRACIN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

Polarizacin celular (Cdc42, Rac)

POLARIZACIN CELULAR

POLARIZACIN CELULAR

EXTENSIN O PROTRUSIN
(leading edge)

EXTENSIN O PROTRUSIN
(leading edge)

FORMACIN DE CONTACTOS
CON LA ECM

CONTRACCIN CELULAR

Science 2003; 302: 5

golgi
ncleo

MDA-MB-231

Contraccin (Rho)

DESENSAMBLE Y
LIBERACIN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO

GTPasas de la Familia Rho

Cdc42
Rac
Rho

FORMACIN DE CONTACTOS
CON LA ECM

CONTRACCIN CELULAR

DESENSAMBLE Y
LIBERACIN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO

MIGRACIN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

Polarizacin celular, filopodios

Protrusiones celulares, lamelipodios,
polarizacin celular
Contraccin celular, maduracin de
adhesiones focales, fibras de estrs

Importancia del citoesqueleto en la

adhesin y migracin celular

POLARIZACIN CELULAR

EXTENSIN O PROTRUSIN
(leading edge)

FORMACIN DE CONTACTOS
CON LA ECM

15

Dev Biol 2004: 265: 23

Tanto la regulacin,
como la actividad de
estas GTPasas se ven
alteradas en cncer

45

60

CONTRACCIN CELULAR

DESENSAMBLE Y
LIBERACIN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
Clula expandindose sobre fibronectina. Tincin de actina con
faloidina. J Cell Sci 2013; 126(17): 3835

DINMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMTICA

Queratocito, microscopa de luz

Fibroblasto, microscopa electrnica de barrido

Molecular Biology of the Cell (Alberts, cap 16)

Lamelipodios y
procesos de membrana

Podosomas

DINMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMTICA

FIBRAS DE ESTRS (fibras de tensin)

Mol Cancer Ther 2005; 4 (5): 772-778

Invadopodios

www.lifetechnologies.com

Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647

MIGRACIN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas

FORMACIN DE CONTACTOS CON LA ECM

Formacin y desensamble de los sitios

de contacto celulares

INTEGRINAS
POLARIZACIN CELULAR

EXTENSIN O PROTRUSIN
(leading edge)

FORMACIN DE CONTACTOS
CON LA ECM

TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)

Estos sitios de contacto se encuentran

principalmente en la interfase clula-ECM

CONTRACCIN CELULAR

DESENSAMBLE Y
LIBERACIN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO

FORMACIN DE CONTACTOS CON LA ECM

FORMACIN DE CONTACTOS CON LA ECM

Complejos Focales

1. Unin ligando extracelular (ECM)/Activacin

Filamentos de Actina
Paxilina

2. Reclutamiento de protenas adaptadoras

Complejos Macromoleculares Formados por las

Integrinas

3. Anclaje del
citoesqueleto (actina o
filamentos intermedios)

Sitio de
Iniciacin

4. Formacin de
complejos
macromoleculares

CONTACTOS
FOCALES

ADHESIONES
FOCALES

Madurez del complejo de adhesin

DESENSAMBLE DE CONTACTOS CON LA ECM

Sitio de
Iniciacin

CONTACTOS
FOCALES

Adhesiones
Focales

ADHESIN
FOCAL

Madurez del complejo de adhesin

ADHESIN
FOCAL

MARCACIN DE ADHESIONES Y CONTACTOS FOCALES

CONTACTOS
FOCALES

Sitio de
Iniciacin

?
MECANISMO POCO CLARO
Protenas de sealizacin:
Kinasa de Adhesin Focal
(FAK), Pyk2, Src, MAPK

Traffic 2009; 10: 811818

Se ha postulado que el trfico

endosomal es esencial en el
desensamble de los complejos de
adhesin

Proteasas: Calpanas
Componentes de la endocitosis:
Dynamin, AP-2, Clathrin, Rabs

(GFP-vinculina, transfeccin transitoria de clulas de cncer de mama

MDA-MB-231)

REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR

1. Migracin celular
2. Estructuras derivadas
del citoesqueleto y la
membrana
3. Proteasas de la matriz
extracelular

REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ
EXTRACELULAR

Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647

VA
LINFTICA

VA
SANGUNEA

EVENTOS ASOCIADOS A LA METSTASIS

MIGRACIN CELULAR
E INVASIVIDAD
INTRAVASACIN
TRANSPORTE
EXTRAVASACIN

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816

CRECIMIENTO DE
TUMOR 2RIO

Mutation Research 2011; 1-12

CRECIMIENTO DE TUMOR SECUNDARIO

MMPs
Integrinas

MICROMETSTASIS

COLONIZACIN

METSTASIS
CLNICAMENTE
DETECTABLE

Integrinas

MIGRACIN CELULAR
E INVASIVIDAD
VEGFR
INTRAVASACIN

S Inmune

Asentamiento reciente
En estado de dormancia
No detectable mediante
tcnicas convencionales

Tcnicas convencionales de
deteccin macroscpicas
Caractersticas similares
al tumor primario

VEGFR

TRANSPORTE
EXTRAVASACIN
VEGFR

MMPs

CRECIMIENTO DE
TUMOR 2RIO

EL PROCESO DE COLONIZACIN INVOLUCRA DIVERSOS EVENTOS:

Interaccin con el nuevo estroma (ECM, clulas parnquima, etc)
Adquisicin (o re-adquisicin de hallmarks observados en tumor
primario): viabilidad, proliferacin
Modificaciones en el programa migratorio

FEBS Journal 2011; 278: 16

MODELOS DE ESTUDIO: in vitro versus in vivo

Tcnicas de estudio in vitro

APROXIMACIONES
EXPERIMENTALES Y MODELOS DE
ESTUDIO EN LA INVESTIGACIN
DEL CNCER

Protenas de sealizacin

Ensayos de transformacin celular

Proliferacin, viabilidad y muerte celular

Adhesin y migracin celular

Tcnicas de estudio in vivo

Tumorigenicidad

Modelos experimentales de metstasis

Modelos de Estudio in vitro

Ensayos de Transformacin Celular

Ensayos de Viabilidad

Tumorigenicidad

Agar blando
(crecimiento independiente de
anclaje)

(formacin de tumores
primarios)

14-21
das

Anlisis

Los ensayos de proliferacin y

viabilidad celular son ampliamente
usados en la caracterizacin de nuevos
frmacos antineoplsicos

Conteo de
colonias

Sal tetrazolium

Formazn (A490-500nm)

Muerte Celular / Apoptosis

Proliferacin y Ciclo Celular

El taxol (paclitaxel) acta estabilizando
microtbulos. Qu efecto tendr
sobre el histograma de DNA?

DNA laddering

Microscopa de
Fluorescencia
NT

qu sucede si la clula es privada de

factores de crecimiento (mitgenos)?
Histograma de DNA
(ciclo celular)

Citometra de Flujo
Tincin de DNA vs tamao celular

Otras Tcnicas:

Incorporacin de 5-bromo2-desoxiuridina

DNA content

3H-timidina

Microscopa de Fluorescencia

Cell Size

Cell number

Expresin de Ciclinas

Marcacin con

APOP
TOSIS

necrosis

Apoptosis
viable

Microscopa
Electrnica

apoptosis
DNA content

Otras Tcnicas:
Activacin de caspasas
Protenas sealizacin (WB)

Autofagia

Modelos de Estudio in vitro

MIGRACIN CELULAR

Ensayos de Migracin e Invasin Celular

Ensayo de cierre de herida

EXP 1

t=0h

t=12h

EXP 2

Cmara Boyden

Matrigel

Sustrato ECM

Invasin

Migracin celular
(quimiotaxis haptotaxis)

Matriz compuesta de
mltiples protenas ECM
Depende de MMPs

t=0h

Parmetros cinticos, como

velocidad de migracin,
polarizacin y direccionalidad

t=12h

Qu se puede decir de EXP2

en relacin a EXP1?

Modelos de Estudio in vivo

Modelos de Estudio in vivo

ANGIOGNESIS

Membrana corioalantoide de pollo

(Chick CAM assay)

MODELOS EXPERIMENTALES
DE METSTASIS
1. Metstasis Espontnea
14-21
das

2. Metstasis Experimental

Anlisis

Imagen
membrana
corioalantoide
Qu agente
contiene este
disco?

Disco de
papel filtro

qu ventajas y desventajas
destacan?

Anlisis

Modelos de Estudio in vivo

MODELOS EXPERIMENTALES
DE METSTASIS
3. Micrometstasis

Chick CAM Assay

Sembrar clulas de
tumor humano sobre
la CAM de embriones
de 10 das

Cosechar el
tumor

Tumor
primario

Extraer
pulmones y
mdula sea

PCR de
secuencia Alu

7-8 das

Metstasis

PRIMERA PARTE DE LA CLASE

Cell 2000: 100: 57-70

Cell 2011: 144: 646-674

SEGUNDA PARTE DE LA CLASE

Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816

Mutation Research 2011; 1-12