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Análisis de La Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
Análisis de La Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
Sesin n 4
Extraccin y Purificacin de ADN
M. Somma
ndice
Sesin n 4
Extraccin y Purificacin de ADN
Introduccin
Mtodos de extraccin
Mtodos de purificacin
10
11
Prctica
13
Bibliografa
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Sesin n 4
Introduccin
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la
mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de
recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener
cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar
anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los
elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso
aplicar mtodos de extraccin adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el
anlisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos negativos
debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda
vivamente efectuar un experimento de control de la inhibicin de la PCR, que suele
hacerse mediante PCR especfica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la
especie.
Cuadro 1. Inhibidores de la PCR.
Inhibidor
Dodecilsulfato sdico
Fenol
Etanol
Isopropanol
Acetato de sodio
Cloruro de sodio
EDTA
Hemoglobina
Heparina
Urea
Mezcla de reaccin
Concentracin de inhibicin
> 0,005 %
> 0,2 %
>1%
>1%
> 5 mM
> 25 mM
> 0,5 mM
> 1 GM/ml
> 0,15 UI/ml
> 20 mM
> 15 %
organismo fuente;
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Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis
celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos
de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de
tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo
(un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico
diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares
suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:
extraccin/precipitacin;
cromatografa;
centrifugacin;
Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los
contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las protenas. Para
concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o
etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la mezcla
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Cromatografa
Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin: permeacin
sobre gel, intercambio inico, adsorcin selectiva o unin por afinidad. La
permeacin sobre gel aprovecha las propiedades de las partculas porosas del gel
para tamizar molculas. Se emplea una matriz con poros de tamao definido, que
dejan pasar las molculas ms pequeas por difusin, pero no las ms grandes, que
quedan eluidas en el volumen vaco. As pues, las molculas quedan eluidas por
orden de tamao decreciente. La cromatogrfica de intercambio inico es otra
tcnica, que se basa en la interaccin electrosttica de la molcula diana con un
grupo funcional de la matriz en columna. Los cidos nucleicos (polianiones lineales
con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio inico con
simples Tampones salinos. En la cromatografa de adsorcin, los cidos nucleicos
se fijan selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por
ejemplo, sales caotrpicas), mientras que otras molculas biolgicas no se fijan. A
continuacin, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampn hiposalino y
se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones
posteriores.
Centrifugacin
La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin eficaz. As, por
ejemplo, la ultracentrifugacin en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g
elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plsmidos. La
centrifugacin suele asociarse a otros mtodos, como la cromatografa de columna
centrifugada, en cuyo caso se combina la permeacin sobre gel y la centrifugacin
para separar el ADN o ARN de contaminantes ms pequeos (sales, nucletidos,
etc.), intercambiar tampones o seleccionar segn el tamao. Algunos procedimientos
combinan la adsorcin selectiva en matriz cromatogrfica (vase el apartado anterior
Cromatografa) y la elucin por centrifugacin para purificar de forma selectiva un
tipo de cido nucleico.
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ADN
Membrana
nuclear
Las ilustraciones que figuran en esta pgina y en las siguientes proceden del Genetic Science
Learning Center, Universidad de Utah, http://gslc.genetics.utah.edu.
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La figura 3 ilustra cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente captura los
lpidos y las protenas al entrar en contacto la membrana celular y el tampn de
extraccin con CTAB. Con una concentracin salina (NaCl) determinada, el
detergente forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es un
componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es
un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la
desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la
capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daa el ADN). Es
importante sealar que, como los cidos nucleicos se degradan fcilmente en esta
fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo transcurrido entre la
homogeneizacin de la muestra y la adicin de la solucin tampn con CTAB. Una
vez que se han roto las membranas de la clula y de los orgnulos (como los que se
encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN.
extrayendo
la
solucin
acuosa
con
cloroformo.
El
cloroformo
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cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las
impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los cidos
nucleicos, puede retroextraerse la fase orgnica con una solucin acuosa, que se
aade a continuacin al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de
cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin, ltima etapa del
procedimiento.
Precipitacin - En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente,
para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de precipitacin
compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl >
0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un precipitado
de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl
por su capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble
en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los cidos
nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor
purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual.
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bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparndola con unos patrones de
concentracin.
F
i
g
Figura 4. Representacin esquemtica de la transmisin de la luz.
Cada molcula absorbe la energa radiante a una longitud de onda especfica, a
partir de la cual es posible extrapolar la concentracin de un soluto en una solucin.
Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relacin lineal entre la absorbancia
A (tambin denominada densidad ptica, DO) y la concentracin de la
macromolcula, conforme a la ecuacin siguiente:
A = DO = lc
(1)
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ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal
como se ha sealado anteriormente, la absorbancia mxima de las soluciones de
ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de protenas, a 280 nm.
Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las
que contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores
obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimacin del grado de
pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el
ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una
longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente
a 50 g/ml de ADN bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o
30 g/ml de oligonucletidos. Si la muestra tambin contiene protenas, el cociente
A260/A280 ser considerablemente inferior a dichos valores y no podr determinarse
con exactitud la cantidad de cidos nucleicos. Debe precisarse que la
espectrofotometra no permite identificar de forma fiable impurezas de ARN
presentes en las soluciones de ADN. Puede emplearse la absorbancia a 325 nm
para poner de manifiesto la presencia de restos en la solucin o la suciedad de la
cubeta.
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ADN monocatenario:
c(pmol/l) = A260/0,027
ADN bicatenario:
c(pmol/l) = A260/0,020
ARN monocatenario:
c(pmol/l) = A260/0,025
Oligonucletido:
Absorbancia
0,01
0,28
0,56
0,30
A260/A280
Conc. (g/ml)
2,0
-
28
-
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Prctica
Instrumental
OBSERVACIONES
Antes de utilizar todo el instrumental hay que esterilizarlo y eliminar todos los
residuos de ADN. Para evitar la contaminacin, deben usarse puntas de pipeta con
barrera protectora contra aerosoles.
Microcentrifuga
Micropipetas
Mezclador de torbellino
Esptulas
Asas
N CAS 124-03-8
Cloroformo
Isopropanol
Na2EDTA
N CAS 6381-92-6
Etanol
NaCl
Proteinasa K
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Ribonucleasa A
Trometamol (Tris-HCl)
Agua desionizada esterilizada
Tampn a base de CTAB
CTAB 20 g/l
4g
NaCl 1,4 M
16,4 g
Tris-HCl 0,1 M
3,15 g
Na2EDTA 20 mM
1,5 g
1g
NaCl 0,04 M
0,5 g
NaCl 1,2 M
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Procedimiento
Debe efectuarse en condiciones estriles. La contaminacin durante la preparacin
de la muestra puede evitarse empleando material desechable y soluciones de
descontaminacin y evitando la formacin de polvo.
minutos ;
desechar el sobrenadante;
Estas etapas optativas se suelen incluir ahora en el mtodo de extraccin con CTAB para
aumentar el rendimiento de la extraccin de ADN genmico de matrices muy complejas.
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desechar el sobrenadante;
desechar el sobrenadante;
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Bibliografa
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Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos
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