Instituto Mexicano Del Seguro Social

Hospital General De Zona N° 46.
Programa Académico para pasantes en servicio social.

Manual de prácticas básicas en el área de patología clínica.

Pasante en servicio social de técnico Laboratorista clínico.

Periodo de servicio social: 1 de agosto de 2009 a 1 de febrero de 2010.

Villahermosa, Tabasco a 29 de enero de 2010.

Introducción.
La división de patología es, posiblemente, una de las áreas menos conocidas por los pacientes de cualquier hospital. En ella se lleva a cabo una serie de procedimientos y actividades que garantizan el correcto diagnóstico del paciente, utilizando múltiples técnicas que se han ido perfeccionando. El objetivo de este manual es mostrar cuáles son estas técnicas más comunes y básicas a realizarse dentro un laboratorio de patología clínica. A su vez está diseñado para futuras generaciones de pasantes de servicio social de laboratorio que cumplan con la condición de realizar sus prácticas en ésta área y también para todos aquellos que deseen consultarlo.

1.

Conceptos principales.

Para que sea de fácil comprensión este texto inicio con las definiciones de los conceptos que utilizare después. Primero definiré los conceptos de patología clínica, médico patólogo, etc. y todos los que sean necesarios para un adentramiento inicial.

1.1. Patología clínica. La Patología constituye la especialidad médica encargada de explicar la evolución de la enfermedad a través de la interpretación científica de las modificaciones que esta produce en las células, los tejidos, los órganos y en los sistemas que conforman el organismo humano, razón por la cual integra bajo una visión morfológica el conocimiento aportado por las ciencias básicas como la anatomía, la fisiología y la bioquímica, con las diversas especialidades medico quirúrgicas. El desarrollo acelerado de la inmunología, la biología molecular, la genética y su aplicación en los campos de la oncología y la microbiología, se ha logrado en parte, gracias al papel integrador de la Patología, es así como en la actualidad, sobre especímenes ya procesados por el método tradicional de inclusión en parafina, se aplican técnicas inmunológicas para establecer por ejemplo la expresión de un determinado antígeno, de un receptor, o de un gen sobre la superficie o en el interior de una célula, metodología que ha jalonado el avance de la investigación médica, pero que además ha permitido mejorar el diagnóstico de muchas enfermedades y de la misma manera, el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes.

El Departamento de Patología tiene un papel importante en los procesos de vigilancia en salud pública o vigilancia epidemiológica, teniendo en cuenta que es un centro de recepción de muestras de toda el área de influencia, como del Hospital, donde se procesa material de biopsia o de autopsia, para confirmar o descartar diagnósticos de posibles enfermedades de notificación obligatoria, con el fin de aportar en la implementación de medidas de prevención y control y así evitar que las enfermedades se propaguen a la comunidad y los daños en salud sean mayores1.

1.2. Médico patólogo. Mediante su actuar médico científico, el especialista en Patología, interviene en labores de promoción y prevención, apoyo diagnóstico, educación médica e investigación. Como especialidad de apoyo diagnóstico a las demás especialidades médicas, es muy notorio su papel, ya que en la actualidad el desarrollo biotecnológico ha permitido la implementación de una diversidad de equipos mediante los cuales, con mínimo riesgo para el paciente es posible explorar e intervenir en la mayoría de órganos internos y de manera simultánea tomar minúsculas muestras de tejido y a veces tan solo células, las cuales al ser analizadas por el médico patólogo, se puede llegar a un diagnóstico definitivo. En el mismo campo del apoyo diagnóstico, es además ya muy conocido el papel del patólogo en el estudio de las diferentes piezas anatómicas extirpadas en cirugía.

1.3. Biopsia Una biopsia es procedimiento diagnóstico que consiste en la extracción de una muestra de tejido obtenida por medio de métodos cruentos para examinarla al microscopio. La palabra biopsia es compuesta y procede del griego bio, vida, y opsia, ver. Tipos de biopsia. La biopsia entrega la máxima certeza al diagnóstico. Hay distintas modalidades dependiendo de las circunstancias clínicas: 1. Biopsia de tejido como la bronquial o transbronquial en el curso de una fibrobroncoscopia. 2. Biopsia ganglionar. 3. Biopsia percutánea de ganglios palpables se debe realizar una exploración física detallada y si existen adenopatías se suelen biopsiar. 4. Biopsia de Daniel o biopsia de ganglios escalénicos: consiste en extirpar la grasa preescalénica y estudiarla histopatológicamente. Si el estudio es positivo, es un criterio de inoperabilidad. 5. Biopsia de masa de partes blandas: se biopsiará las lesiones sospechosas accesibles si aún no se ha establecido el tratamiento o si la determinación del estadio se basa en el hecho de que una determinada lesión sea o no cáncer. 6. Biopsia ósea de una lesión osteolítica: se determina por la radiología del hueso afecto o por gammagrafía ósea.

7. Biopsia de médula ósea: se suele hacer una punción de cresta ilíaca sobre todo en el cáncer de pulmón que suele metastatizar en médula ósea frecuentemente. 8. Biopsia pleural: si es tumor periférico y existe derrame pleural.

1.3.1. Biopsia excisional También se llama excéresis. Una biopsia es la extirpación completa de un órgano o un tumor, generalmente sin márgenes, que se realiza normalmente en quirófano bajo anestesia general o local y con cirugía mayor o menor respectivamente. La biopsia excisional se realiza, por ejemplo en: a) La extirpación de una adenopatía aislada. b) En los tumores de mama pequeños: Si es un tumor benigno, la misma biopsia es terapéutica, pero si es maligno hay que volver a intervenir, ampliar márgenes y realizar una linfadenectomía o vaciamiento axilar homolateral. c) En las lesiones cutáneas sospechosas, sobre todo melánicas: Si son benignas, no se realiza más tratamiento quirúrgico y si es maligna como un melanoma, hay que ampliar márgenes y realizar la prueba del ganglio centinela. d) El bazo, no se puede biopsiar, en caso de linfoma, tomando una muestra por el riesgo de hemorragia, por lo que se extirpa completamente (esplenectomía). e) Biopsia intraoperatoria: Es la que se obtiene durante una laparotomía exploradora por ejemplo en un cáncer de ovario .

f) Biopsia Cérvica Perpendicular: La cual se realiza en la zona Cervical a 45 grados procediendo a extraer solo 1 cm de ligamento cérvico. El estudio arrojara si la muestra es dañina o sana. 1.3.2. Biopsia incisional. Es la biopsia en la que se corta o se extirpa quirúrgicamente sólo un trozo de tejido, masa o tumor. Este tipo de biopsia se utiliza más a menudo en los tumores de tejidos blandos como el cerebro, hígado, pulmón, para distinguir patología benigna de la maligna, porque estos órganos no se pueden extirpar, o porque la lesión es muy grande o difusa. 1.3.3. Biopsia estereotáxica. Son un conjunto de biopsias obtenidas y guiadas por pruebas de imagen que indican las coordenadas del espacio donde se encuentra la lesión, como por ejemplo lesiones de mama no palpables que se marcan con arpón en una mamografía, o con ABBI (AdvancedBreastBiopsyInstrumentation). Las biopsias cerebrales suelen ser biopsias estereotáxicas.

1.3.4. Biopsia endoscópica.

Es la biopsia obtenida por medio de un endoscopio que se quirúrgica. El endoscopio contiene un sistema de luz y de visualización para observar las lesiones de órganos huecos o cavidades corporales junto con pinzas que discurren a lo largo del tubo del endoscopio y que pueden extirpar pequeños fragmentos de la superficie interna del órgano o cavidad.  

La biopsia obtenida en una colonoscopia suele ser el método diagnóstico más frecuente en el cáncer colorrectal. La biopsia de una esofagoscopia o gastroscopia puede diagnosticar un cáncer de esófago o de estómago.

1.3.5. Biopsia colposcópica. Es la biopsia en la que se obtiene tejido de la vagina o del cuello del útero y que realizan los ginecólogos ante una prueba de Papanicolaou positiva, para descartar un cáncer de cérvix o de vagina, mediante un colposcopio.

1.3.6. Punción aspiración con aguja fina (PAAF). Es la biopsia obtenida mediante la punción con una aguja de escaso calibre conectada a una jeringa y la realización de una aspiración enérgica. Se obtiene generalmente células aisladas que se extienden sobre una laminilla. Más que una biopsia es una citología. La PAAF suele utilizarse para obtener muestras de órganos profundos como el páncreas y el pulmón, guiadas por TAC o ecografía. El inconveniente de la citología es que no es un diagnóstico de certeza. 1.3.7. Biopsia con sacabocados. También se llama punch. Es la biopsia de piel, que se realiza con una cuchilla cilíndrica hueca que obtiene un cilindro de 2 a 4 milímetros, bajo anestesia local y un punto de sutura.

1.3.8. Biopsia de médula ósea. Es la biopsia que practican los hematólogos (también patólogos e internistas) procedente de la cresta ilíaca posterosuperior de la pelvis, del sacro o del esternón para obtener médula ósea y diagnosticar el origen de determinados trastornos sanguíneos principalmente. Se debe insensibilizar la piel y el periostio con anestésico local. A continuación, se introduce en el espacio medular una aguja rígida de mayor calibre, se fija una jeringa a la aguja y se aspira. Las células de la médula ósea son absorbidas al interior de la jeringa. En el contenido de la jeringa, aparece sangre con fragmentos pequeños de grasa flotando en su entorno. Después de la aspiración se realiza una biopsia para extraer tejido óseo con una aguja hueca.

1.3.9. Biopsia por punción con aguja gruesa. También se llama core biopsia o tru-cut que se realiza mediante la obtención de biopsia con pistolas automáticas, que reduce las molestias en el paciente. Una vez que se coloca la aguja en posición de predisparo, guiada por palpación o prueba de imagen, se presiona el disparador y la parte interior de la aguja, que es la que succiona el tejido, se proyecta atravesando la lesión y saliendo de ella con la muestra muy rápidamente. Precisa de anestesia local.

2. Proceso Histológico.
La mayoría de las técnicas histológicas van encaminadas a preparar el tejido para su observación con el microscopio, bien sea óptico o electrónico. Ello es debido a que la estructura de los tejidos está basada en la organización de los tipos de células que los componen y, salvo contadas ocasiones, las características morfológicas de las células sólo se pueden observar con estos aparatos. Existen procedimientos para la observación de tejidos y células vivas que reciben el nombre de vitales. Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso, pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se conservan, más o menos dependiendo del tipo de técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son las más comúnmente usadas en los laboratorios de histología. Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados para poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de técnicas que se utilizarán dependiendo de qué característica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los métodos y técnicas comúnmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos "caminos" y su elección dependerá del resultado final que queramos obtener.

Esquema del proceso histológico.

El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de los distintos órganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porción de dicho tejido o procesar una parte, órgano o parte corporal, o el animal completo. En cualquier caso las muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas que contienen unas sustancias denominadas fijadores, las

cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. También podemos fijar las moléculas de los tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido es como si hiciésemos una fotografía del tejido que se mantendrá hasta su observación. Sin embargo, el uso de fijadores o medios de inclusión afectan a veces las características tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir a la congelación para endurecer el tejido para después poder obtener secciones del mismo. Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias líquidas que posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán consistentes (ceras). También se puede conseguir el mismo efecto mediante congelación rápida. Cortes más gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesidad de inclusión usando el vibratomo. Los medios de inclusión son normalmente no hidrosolubles por lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgánicos liposolubles y posteriormente añadir el medio de inclusión. Tras la inclusión o la congelación se procede a cortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanómetros), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm). Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscopía, por ejemplo con contraste de fase, permiten observar tejidos sin teñir. Normalmente las secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusión para que los colorantes puedan unirse al tejido. Las secciones, secciones ultrafinas, que se observan con el microscopio electrónico se pueden contrastar con metales pesados, opacos a los electrones, sin eliminar la resina.

Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos básicos de microscopios: electrónico y óptico. Los primeros permiten un gran poder de resolución, pudiéndose observar características ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder de resolución, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos: fluorescencia, contraste de fase, polarización o contraste de interferencia diferencial. Como dijimos al comienzo existen múltiples variaciones sobre este esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electrónico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos superficies. En las siguientes páginas veremos con cierto detalle algunas de las técnicas más empleadas para la observación de los tejidos.

2.1. Fijación. Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el organismo muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis (acción de enzimas intracelulares, es decir, autodigestión) y putrefacción (acción bacteriana). Además, el procesamiento histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone una metodología que puede degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en estado vivo. Es como hacer una fotografía del tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio. Así, los fijadores deben proteger frente a ataques bacterianos, evitar autolisis, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, penetrar y modificar el tejido para poder llevar a cabo tinciones específicas posteriores, si es necesario, etcétera. No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. Incluso podemos usar varios fijadores secuencialmente según nuestras necesidades. La elección depende de las características fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimáticas debemos usar un fijador que no nos altere el centro activo de dichas enzimas, y quizá para ello tengamos que sacrificar en cierta medida la morfología tisular. Si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar fijadores que la preserven y que protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de inclusión en resinas, y quizá esto altere su apetencia por los colorantes generales. Si queremos teñir un determinado componente celular difícilmente teñible quizá debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido más fácilmente por los colorantes.

En cualquier caso, hay características de los fijadores que tenemos que tener en cuenta antes de su uso: Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser rápido y la velocidad de difusión de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este parámetro condiciona el tamaño de la pieza que queramos fijar, más pequeña cuanto menor la velocidad de difusión, y el tiempo de fijación, mayor cuanto menor tiempo de difusión. Velocidad de fijación. Esta característica no depende de la velocidad de difusión sino de las propiedades químicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el fijador. Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a él. Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la célula producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario añadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar soluciones tamponadas a un pH semejante al del tejido e isosmóticas con dicho tejido.

2.2. Fijación. Existen diferentes formas de fijar los tejidos, dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y químicos. Los fijadores físicos están basados en una congelación muy rápida del tejido, en la aplicación de calor o microondas. Se utilizan cuando el tipo de muestra lo requiere, cuando los fijadores químicos alteran la estructura que queremos observar, o cuando necesitamos una fijación muy rápida. La congelación rápida es un buen método de preservación de las características moleculares y es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido. Existen variantes de esta técnica como son la criodesecación o liofilización y la criosustitución. La criodesecación parte de tejido previamente congelado, pero posteriormente se realiza una sublimación del hielo, es decir, el agua pasa de estado sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones químicas por lo que además de la fijación preserva el tejido en el tiempo. La criosustitución también parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustitución lenta del hielo por una solución fijadora. Con ello se posibilita una fijación química sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que está congelado. Los métodos de fijación por calor de fijación no son frecuentemente usados, excepto para observar microorganismos. Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que establecen puentes entre las moléculas celulares, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su degradación. Hay dos métodos de fijación con fijadores líquidos: inmersión y perfusión. En cualquier caso el fijador debe entrar en contacto con el tejido lo más rápidamente posible.

Inmersión. Por el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución fijadora. Tenemos que tener en cuenta algunas precauciones. a) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de penetración del fijador y de las características del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades por donde penetre la solución fijadora. b) El volumen recomendado de fijador debe ser 20 veces superior al volumen de la pieza. c) La osmolaridad entre tejido y solución fijadora deben estar equilibradas. d) El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico. e) El tiempo de fijación depende de cada tipo de fijador, pero generalmente existe un tiempo máximo para cada uno de ellos que no debe ser excedido. Perfusión. Por este procedimiento la solución fijadora se introduce a través del sistema circulatorio mediante el cual accede a todas las células del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este método se puede fijar un animal completo introduciendo la solución fijadora a través del ventrículo cardiaco, con lo que el fijador llegará a todas las células irrigadas por la sangre bombeada por dicho ventrículo (circuito pulmonar o corporal).

También podemos fijar un único órgano en el caso de que podamos aislar e introducir la solución fijadora en la arteria principal que irriga dicho órgano. La perfusión no siempre es posible llevarla a cabo, como es el caso de biopsias o tejidos vegetales. Este método es mucho más efectivo que el de inmersión, ya que la solución fijadora llega a escasa distancia de todas las células de la estructura refundida. Por tanto, la velocidad de penetración del fijador no es una condición limitante. El volumen de fijador necesario también es menor puesto que la solución fijadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye con el medio acuoso del tejido y no pierde potencial fijador.

Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el método de inmersión debemos cuidar aquí también la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijación.

2.2.1. Fijadores. Existen multitud de fijadores en los manuales de técnicas histológicas. Aquí sólo trataremos aquellos que consideramos de uso más común para la observación de tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los fijadores químicos son los más frecuentemente empleados, bien con un solo tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de ellas. ¡Atención! La mayoría de las sustancias fijadoras son tóxicas por inhalación o por contacto, algunas de ellas cancerígenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y utilización. 2.2.1.1. Fijadores simples

Alcohol etílico. (Etanol: CH3-CH2-OH) Fija por deshidratación y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para preservar moléculas, como ciertas enzimas, propiedades antigénicas, glucógeno, pigmentos y para las extensiones citológicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar también como un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la retracción de los tejidos. Carece de efecto mordiente. Ácido acético. (CH3COOH)Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleícos y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y mala fijación de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinación con otros fijadores.

Formaldehido. (C2H=O) Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas tisulares. Se utiliza a concentraciones próximas al 4 %. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa como conservante, produce poca retracción tisular, es un buen fijador para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica. 2.2.1.2. Mezclas fijadoras. La mayor parte de los procesos de fijación usan distintas sustancias fijadoras, bien mezcladas en la solución acuosa inicial o utilizada sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de éstos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qué tipo de tejido queremos fijar y qué queremos ver de dicho tejido. A continuación vamos a mencionar algunas combinaciones usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijación que las hace apropiadas para la observación de una gran variedad de tejidos y de técnicas de tinción. Líquido de BOUIN. Está formado por ácido pícrico, formaldehido y ácido acético glacial. Es una solución muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina (ver capítulo de inclusión) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el glucógeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersión. Tras la fijación las muestras de tejido se pueden

conservar en alcohol de 70°. No está recomendado para el riñón ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusión en parafina es conveniente eliminar el ácido pícrico mediante lavados en alcohol de 70° porque puede hacer que no se produzca una buena inclusión o que las tinciones no sean adecuadas. Karnoy. Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de carbono simples y para las proteínas fibrosas. Es bueno para visualizar los ácidos nucleícos, aunque no la morfología nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Está formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %. Mezclas con formaldehido. El formaldehido es quizá el fijador más usado hoy en día, tanto para técnicas histológicas rutinarias como para otras como la inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos nucleícos. Lo más frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores. Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehido y glutaraldehído. La función del formaldehido es iniciar una fijación rápida, por su mayo capacidad de penetración, mientras que el glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta que afectará a la estructura tisular puesto que el formaldehido ya ha realizado una fijación previa.

2.3. Inclusión. Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio. Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es que cuanto más delgada queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la fijación, pero ésta no es muy alta e impide la obtención de cortes generalmente más delgados que 20 o 30 µm. Sólo en el caso de que queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 µm) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo, que se utiliza en ciertas técnicas donde es necesaria una buena preservación molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer más el tejido para obtener secciones más finas y se puede hacer de dos formas: congelación e inclusión. 2.3.1. La congelación De los tejidos previamente fijados permite la obtención de secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta nm., para lo que se utilizan diferentes aparatos: micrótomo de congelación para secciones de decenas de µm, criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daños que se producen durante los procesos de congelación, formación de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se han de tener en cuenta dos procesos: a) Anticongelantes que impidan la formación de cristales. El crioprotector más usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección de uno u otro depende del tipo de muestra y de la técnica que se vaya a usar.

b) Una congelación lo más rápida posible, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores son las dimensiones de los cristales de agua formados. Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos. Secciones más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelación o embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina o resinas. Téngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos del dibujo no están a escala. Una rejilla es mucho más pequeña que un portaobjetos. Las dimensiones en µm y nm se refieren al espesor de las secciones.

2.3.2. La inclusión. Es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las características del tejido. Con ello se consigue obtener cortes delgados (desde decenas de µm a nm según el medio de inclusión) sin que el tejido se rompa o se deteriore. Además son un buen método de preservar las muestras durante largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusión dependiendo del grosor del corte y de la técnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observación con el microscopio óptico los medios de inclusión más frecuentemente usados son la parafina o la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrónico la inclusión se realiza con resinas, principalmente de tipo acrílicos o epoxy. La mayoría de los medios de inclusión no son hidrosolubles, es decir, no miscibles con el agua, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible con nuestro medio de inclusión. Si una muestra no está completamente embebida en el medio de inclusión se deteriorará y la obtención de secciones homogéneas será imposible.

2.3.3. Inclusión En Parafina. Para la inclusión de muestras que han de observarse con microscopía óptica se utiliza sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusión. Vamos a describir los pasos para la inclusión en parafina de muestras de tejido previamente fijadas. La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión puede variar entre 40 y 70 °C según su composición de la mezcla de hidrocarburos. Resultan distintos tipos de parafinas a temperatura ambiente que se emplean según las necesidades. Así, parafinas más duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras que las más blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras más duras. Las parafinas más usadas tienen un punto de fusión en torno a los 60 °C. Podemos también modificar las características de las parafinas añadiendo sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etcétera. La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina líquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgánico. Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes, normalmente metanol, de gradación creciente hasta alcohol de 100°. Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que sea miscible tanto con el alcohol de 100° como con la parafina, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración de la sustancia intermediaria en el tejido.

El tiempo de incubación de la pieza por algunos de estos líquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y provocar problemas hacer las secciones. Por último se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina para favorecer una buena impregnación. El tiempo que duran dichos pasos depende de lo volátil que sea el líquido intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Será mayor cuanto menos volátil es el líquido intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en un molde, se introduce la muestra y se coloca según la orientación deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente. Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el líquido intermediario. Sin embargo, los pasos son comunes a cualquier inclusión en parafina. Un protocolo común de inclusión en parafina es el de la página siguiente:

2.4. Corte. Las características tisulares y celulares microscópicas internas se observan con microscopios ópticos o electrónicos de transmisión. Con estos aparatos sólo se pueden observar grosores muy pequeños de tejido por problemas de difusión y penetración de la luz en el caso de los microscopios ópticos y de penetración de los electrones en el caso del microscopio electrónico de transmisión. Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, que pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanómetros hasta centenares de micras. La dureza de los tejidos depende de sus características, de la fijación que hayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido. Una manera más directa de endurecer el tejido es mediante congelación. Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de micrómetros se denominan micrótomos y existen diferentes tipos según el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el medio de inclusión en el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por congelación o por inclusión. Los micrótomos más usados son: Micrótomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 µm de grosor, para observar con el microscopio óptico. Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de µm de grosor, para observar con el microscopio óptico. Micrótomo de congelación: Con él se consiguen secciones de 30 a unas 100 µm de material congelado para su observación con el microscopio óptico.

Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 µm, para observar con el microscopio óptico. Ultra micrótomo: Con él se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanómetros de grosor, para observar con el microscopio electrónico de transmisión. Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanómetro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrónico de transmisión. Los aparatos de corte más usados tradicionalmente para estudiar las características generales de los tejidos y de las células son el micrótomo para material incluido en parafina para observaciones con el microscopio óptico y el ultra micrótomo para observaciones con el microscopio electrónico de transmisión. El criostato se usa también frecuentemente en microscopía óptica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido, incluso se puede cortar material no fijado. 2.4.1. Micrótomo parafina Los micrótomos para cortar material incluido en parafina son probablemente los más usados en los laboratorios de histología. Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla, un porta bloques y un sistema mecánico que permite acercar el bloque de parafina a la cuchilla una distancia que se corresponde con el grosor de la sección que pretendemos obtener y realizar el corte.

Micrótomo para parafina con mecanismo de rotación.

Hay dos tipos de micrótomo para parafina: el de rotación y el de deslizamiento. El micrótomo de rotación provoca el corte gracias a la transformación de un movimiento de rotación en otro de ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchilla se produce un acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla según el espacio seleccionado. En el portamuestras existe un sistema que permite orientar la superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos micrótomos la cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede regularse el ángulo de ataque a la muestra. Con el micrótomo de deslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos micrótomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posición del bloque, o de la cuchilla, una distancia que nos dará el grosor del corte.

Tanto el micrótomo de rotación como el de deslizamiento tienen ventajas e inconvenientes. La principal ventaja del de rotación es su precisión, la posibilidad de obtener secciones seriadas con facilidad y la automatización del proceso de corte. Los micrótomos de deslizamiento son más sencillos mecánicamente y su disposición permite cortar bloques más grandes o bloques de celoidina, aunque están cayendo en desuso. Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafina antes de hacer el primer corte útil a nuestra muestra. En primer lugar hay que retallar el bloque hasta hacer una pirámide truncada. Antes de retallar hay que considerar cual de las caras de esta pirámide será el frente de ataque, es decir, cual será la que primero se ponga en contacto con la cuchilla. Esta cara deberá ser más ancha que la opuesta, y ambas han de ser paralelas. Con todo ello se consigue una buena orientación de nuestra muestra en las secciones, que cada nuevo corte arrastre sin problemas al previamente cortado y que se puedan obtener tiras rectas de cortes. Una vez retallada la pirámide nuestra muestra queda dentro de ella pero no está en contacto directo con la cara superior o de corte, por lo que es necesario un proceso de desbastado, es decir, la eliminación del espesor de parafina que hay entre la superficie del bloque y nuestra muestra.

Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortar es la orientación de la cuchilla respeto a la superficie de corte de la pirámide. Lo normal es orientar la cuchilla con un ángulo de uno 10° respecto a la superficie de corte, aunque se puede modificar según nuestras necesidades. Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su fijación definitiva en la superficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro tejido quede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofobicidad de la parafina, las secciones se colocan sobre agua calentada a unos 35 °C a 40 °C y el calor las hace extenderse sin llegar a su punto de fusión, que está en torno a los 60 °C. El estiramiento se puede realizar en baños de agua con regulación térmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de agua y colocados sobre una plancha térmica regulable.

Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que serán colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 °C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la hidrofobicidad de la parafina hacen que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos. La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes ha de estar previamente tratada para que nuestro tejido quede adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina, albúmina, u otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo entre el cristal y nuestro tejido. Una vez que el agua se ha evaporado y están extendidas las tiras de cortes de parafina sobre el portaobjetos, se procede a un secado exhaustivo en una estufa a una temperatura de entre 35 °C y 40 °C durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones están listos para el procesamiento posterior. 2.4.2. Criotomo o criostato La congelación de los tejidos es una manera rápida de endurecerlos sin necesidad de inclusión, por lo que la preservación molecular es máxima. Muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. Igual preservación se consigue con los cortes de vibratomo, pero las muestras congeladas pueden cortarse en secciones más finas, del orden de varias µm, cosa muy difícil con el vibratomo.

Otra ventaja de la obtención de secciones mediante congelación es que la calidad de las secciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente cornificados). Por último, es posiblemente la manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible congelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarla de inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelación muy rápida, normalmente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, lo que evita la formación de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares. En el caso de que no se requiera un corte rápido las muestras se fijan y posteriormente se incuban en una solución anticongelante que contiene sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la congelación se formen cristales de hielo grandes que puedan dañar las estructuras celulares. Como dijimos anteriormente, se puede congelar de manera muy rápida con nitrógeno líquido. Dicha congelación permite preservar incluso la ultraestructura celular y observarla al microscopio electrónico, siempre con el uso previo de anticongelantes. Pero normalmente se suele realizar la congelación de la muestra a temperaturas superiores que dependen del aparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso de anticongelantes. Los dos aparatos más usados para realizar cortes por congelación son el micrótomo de congelación y el criostato. El micrótomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de grosor y consiste en una plataforma que se enfría a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte seleccionado.

Actualmente se produce la congelación (de -30 a menos -40 °C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeración externo al propio dispositivo de corte. Además, existe la posibilidad de congelar también la cuchilla si se desea. En los apartados actuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a cientos de µm, se recogen con un pincel, se añaden a un recipiente con tampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación, igual que en el caso del vibratomo.

El criostato se utiliza para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C. La congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 °C. También se puede congelar el tejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrógeno líquido, pero es conveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de ésta para obtener secciones homogéneas. Antes de la congelación, la muestra se encastra en un medio que es líquido a temperatura ambiente y sólido a la de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque sólido, encastrado pero no incluido. Esto permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijará a un eje que avanza sobre la cuchilla. La preparación del bloque y el mecanismo de corte son similares al que se describió para el micrótomo de rotación para parafina. Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos están a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las técnicas que deseemos.

2.5. Tinción Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmento como la sangre o la melanina de la epidermis. Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cómo teñir los tejidos para poder desentrañar sus características morfológicas. Se observó que algunos pigmentos como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a determinados componentes de las células. La expansión de la industria textil y su necesidad de colorear las telas provocó un rápido desarrollo de los tintes o pigmentos en el siglo XIX. Muchas de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histología de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y perfeccionamiento de nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se usan según las necesidades del investigador. Con la llegada de la biología molecular se han puesto en marcha otras técnicas mucho más sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan anticuerpos, inmunocitoquímica, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o más sofisticadas aún como las que mediante el diseño de animales transgénicos permiten identificar y observar a las células que expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP). No vamos a describir con detalle las técnicas más complejas, al menos no en estas páginas básicas, sino las más comunes, las que se suelen emplear en un laboratorio para el estudio general de los tejidos. Dividiremos el conjunto de técnicas histológicas en cuatro categorías.

a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por afinidad química. b) Histoquímica. Son aquellas técnicas de tinción que implican la modificación química de algunas moléculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. c) Lectinas. Las lectinas son dominios de proteínas, como las selectinas, que son capaces de reconocer glúcidos que forman parte de polisacáridos. d) Inmunocitoquímica. Son técnicas histológicas muy potentes basadas en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron. Estos antígenos pueden ser cualquier molécula tisular que, purificada en inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos añadidos a una sección de tejido reconocerán y se unirán específicamente a dicha molécula. La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato.

Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son moléculas que poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno. Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en: Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina. Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina. Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, eosina de azul de metileno. Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante Sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilina y se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

2.6. Inmunohistoquimica Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos.

Pasos de la tinción histoquímica. Los pasos con letras en color verde son los específicos para esta tinción.

La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que tener en cuenta que cuando queremos detectar una actividad enzimática es recomendable no incluir el material para obtener secciones puesto que la deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la conformación de la enzima y por tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelación o con el vibratomo.

2.7. Observación. El último paso de todo proceso histológico es la observación del resultado producido por la técnica realizada. El poder de resolución del ojo humano es de 0.2 mm (poder de resolución: distancia mínima a la que se discriminan dos puntos), mientras que una célula eucariota típica suele tener unas dimensiones que oscilan entre 10 y 50 micrómetros (µm. 1 µm=10-6 mm). Además, si queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en cuenta que el grosor de una membrana celular es de unos 70 nanómetros. Todo ello implica que necesitamos aparatos que nos permitan aumentar al imagen de las muestras para discriminar estructuras tisulares diminutas como son las células o sus compartimentos. Estos aparatos se llaman microscopios. Hay dos tipos de microscopios: los ópticos y los electrónicos. Los microscopios ópticos, o de campo claro, utilizan la luz visible y lentes de cristal que permiten un aumento de las muestras de unas 1000 veces, con un poder de resolución de unos 0,2 micrómetros. Esto es la máxima resolución que permite la luz visible, por sus propiedades de onda. Se usan para observaciones generales, características celulares y tisulares, y están presentes en todos los laboratorios de histología. Los microscopios electrónicos se basan en la alta frecuencia de los electrones para conseguir un poder de resolución de 1 nanómetro. Se usan para observar la ultraestructura de la célula y los tejidos, es decir, para estudiar el nivel subcelular, como orgánulos, membranas u organizaciones moleculares (por ejemplo, se pueden observar los ribosomas).

A los microscopios, sobre todo los ópticos, se les puede añadir dispositivos que permiten ampliar su potencialidad. Por ejemplo, al microscopio óptico se le puede adaptar una fuente luminosa y una serie de filtros para observar moléculas fluorescentes, o filtros para destacar cambios de densidad en el tejido, etcétera. 2.8. Diagnóstico final. De acuerdo con las alteraciones histológicas y citológicas se llegará a un diagnóstico concluyente; el cual ratifique o desmienta el probable diagnóstico por el cual la pieza quirúrgica fue enviada al área de patología. Hasta este punto concluye la laboriosa tarea diaria de todo laboratorio patológico y el personal que todos los días procura mantener las condiciones adecuadas para realizar las acciones antes mencionadas.

Conclusión. Los procedimientos aquí descritos con anterioridad son algunos de los más importantes y utilizados en todas partes. Por lo cual es imprescindible el saber acerca de esto. Los pasos y ejemplos se colocaron con la mayor simplicidad posible, tratando de ser adecuados para todo el público que le sea posible leer este material. Sin más que aclarar espero que este trabajo haya sido de su agrado.

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