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Atlas de Pruebas Bioquimicas para Identificar Bacterias-Libre
Atlas de Pruebas Bioquimicas para Identificar Bacterias-Libre
DE MXI CO
FACULTAD DE ESTUDIOSSUPERIORESZARAGOZA
CONTENI DO
Pgina
I nt r oduccin
9
9
10
12
12
12
12
13
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14
15
16
16
18
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20
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23
23
Tcnicas de inoculacin
En placa
Est r a cr uzada
Est r a en Z
Est r a simple
Siembr a masiva
Vaciado en placa
En t ubo: medio semislido
Siembr a en medios lquidos
En t ubo: medios slidos
24
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30
31
35
35
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48
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63
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73
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82
87
92
102
112
116
Met abolismo
Pr oduccin de ener ga
Va de degr adacin de las hexosas
Gluclisis
Ent ner -Duodor of f
Pent osa f osf at o
Ciclo de Kr ebs
Fer ment acin
Lct ica
Het er olct ica
Alcohlica
Pr opinica
cido mixt a (f r mica)
De met ano
But ilenglucolt ica (acet onica)
Respir acin anaer bica con acept or es
inor gnicos de hidr geno
Fij acin de nit r geno
Reduccin de sulf at os
125
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158
160
162
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164
Ref er encias
Dir ecciones elect r nicas
165
168
NDI CE DE FI GURAS
No.
1
2
3
4
5
6
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30
Figura
Mor f ologa bact er iana
For mas de nut r icin de bact er ias
Repr oduccin bact er iana
Repr oduccin bact er iana: Tr ansf or macin
Repr oduccin bact er iana: Conj ugacin
Super f icie de placas de agar EMB que ilust r a el br illo ver de
pr oducido por miembr os de las Ent er obact er ias que f er ment an
vidament e lact osa: Escher ichia coli .
Placa de agar soya - t r ipt icasa, inoculado con una bact er ia que
pr oduce un pigment o amar illo. La pr oduccin de pigment o es una
impor t ant e car act er st ica dif er encial par a ident if icar bacilos
Gr am negat ivos no f er ment ador es.
Super f icie de placas de agar EMB que ilust r a cult ivo mixt o de
Escher ichia coli y Shigella sp.
Mor f ologa colonial en agar sangr e.
Super f icie de placas de agr a EMB que ilust r a el br illo ver de
pr oducido por Escher ichia coli.
Agar BCYE
St r ept ococcus sp.
Pr uebas bioqumicas: Fer ment acin de car bohidr at os
Pr uebas bioqumicas: Cit r at o
Pr uebas bioqumicas: Licuef accin de gelat ina
Micr ococcus sp
Pr uebas bioqumicas: Leche con t or nasol
Pr uebas bioqumicas: Leche con azul de met ileno
Salmonella sp.
Pr uebas bioqumicas: Oxidacin/ f er ment acin
I nt er pr et acin O/ F
Pr uebas bioqumicas: Ur ea
Salnonella t yphi
Pr uebas bioqumicas: Voges - Pr oskauer
Escher ichia coli
Pr uebas bioqumicas: Roj o de met ilo
Escher ichia coli , obser vese pili
Pr uebas bioqumicas: Reduccin de nit r at os
Pr uebas bioqumicas: Fenilalanina desaminasa
Salmonella t yphi
31
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33
34
35
36
37
38
39
Pr uebas bioqumicas:
Salmonella t yphi
Escher ichia coli
Pr uebas bioqumicas:
Salmonella sp.
Fundament o: TSI
Pr uebas bioqumicas:
Pr uebas bioqumicas:
Shigella
40
41
Pr oduccin de quesos
Pr oduccin de vino
8
9
10
Ref erencia
Enciclopedia Encar t a, 2002
Enciclopedia Encar t a, 2002
Enciclopedia Encar t a, 2002
Enciclopedia Encar t a, 2002
Enciclopedia Encar t a, 2002
Koneman, 1992
Koneman, 1992
18
Koneman, 1992
19
20
21
Koneman,1992
Museun of Hist or y Nat ur al
31
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85
91
96
Sullivan, 2002
SI M
Pf eizer , 2002
TSI
Koneman, 2002
LI A
MI O
Museum of Hist or y Nat ur al,
2002
Black, 1996
Black, 1996
Pg.
9
11
13
14
15
16
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101
107
107
110
114
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ndice de Tablas
No.
Tabla
Pg.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
68
98
101
111
115
123
124
154
157
159
161
ndice de Esquemas
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
Esquema
Gluclisis
Va de Hexosa monof osf at o
Ciclo de Kr ebs
Copr ocult ivo
Aislamient o de bact er ias pat genas de heces
Aislamient o de St aphylococcus
Ur ocult ivo
Exudado f ar ingeo
Pgina
133
138
141
155
156
158
162
164
I nt r oduccin
Como est udiant e la licenciat ur a de Q.F.B. la cual abar ca en
gr an par t e el est udio bact er iolgico he obser vado que la
mayor a de las veces, los alumnos al r ealizar las pr uebas
bioqumicas par a la ident if icacin de bact er ias no t ienen un
conocimient o r eal o suf icient e de los pr incipios o bases par a
r ealizar las as como las pr ecauciones e inconvenient es que se
pr esent an en cada pr ueba bioqumica.
Par a poder conocer los pr incipios, bases bioqumicas, mt odos,
aplicaciones, int er pr et acin y pr ecauciones as como los
r esult ados esper ados en cada pr ueba es necesar io a menudo
r ecur r ir a muchas r ef er encias bibliogr f icas y publicaciones
que no siempr e se encuent r an a disposicin de los alumnos o
micr obilogos en gener al.
En est e at las de pr uebas bioqumicas se han seleccionado las
pr uebas que se ut ilizan a lo lar go de la licenciat ur a de Qumico
Far macut ico Bilogo en la Facult ad de Est udios Super ior es
Zar agoza. Por lo t ant o el usuar io encont r ar la inf or macin
suf icient e y necesar ia per o sobr e t odo, sencilla y amena de
cada pr ueba, su pr incipio f undament al, bases bioqumicas,
medios de cult ivo, r eact ivos empleados, r esult ados,
int er pr et acin, r epor t e de r esult ados, pr ecauciones y
obser vaciones, t cnicas de inoculacin y condiciones de
incubacin as como r ef er encias bibliogr f icas. Est as han sido
r eunidas al f inal par a per mit ir , cuando se desee una
pr of undizacin acer ca de un aspect o det er minado de algn
7
1.
membr ana
plasmt ica
!"La
pr esent a
invaginaciones, que son los mesosomas, donde
se encuent r an enzimas que int er vienen en la
snt esis
de
ATP,
y
los
pigment os
f ot osint t icos en el caso de bact er ias
f ot osint t icas. En el cit oplasma se encuent r an
inclusiones de diver sa nat ur aleza qumica.
!"Muchas bact er ias pueden pr esent ar f lagelos
gener alment e r gidos, implant ados en la
membr ana mediant e un cor psculo basal .
Pueden poseer t ambin, f imbr ias o pili muy
numer osos y cor t os, que pueden ser vir como
pelos sexuales par a el paso de ADN de una
clula a ot r a.
!"Poseen ARN y r ibosomas car act er st icos, par a
la snt esis de pr ot enas.
!"Par ed celular r gida y con molculas exclusivas
de bact er ias.
2.
Nut r icin
10
11
At endiendo a las ant er ior es cat egor as, ent r e las bact er ias
podemos encont r ar las siguient es f or mas, como puede
apr eciar se en el esquema:
quimiohet er t r of as,
ut ilizan
un
bact er ias
1. Las
compuest o qumico como f uent e de car bono, y a su vez,
est e mismo compuest o es la f uent e de ener ga. La
mayor par t e de las bact er ias cult ivadas en labor at or ios
y las bact er ias pat genas son de est e gr upo.
12
3.
Repr oduccin
Gener alment e las bact er ias se r epr oducen
bipar t icin, como se ve en el siguient e esquema:
por
Tr as la duplicacin del ADN, que est a dir igida por la ADNpolimer asa que se encuent r a en los mesosomas, la par ed
bact er iana cr ece hast a f or mar un t abique t r ansver sal
separ ador de las dos nuevas bact er ias.
Per o adems de est e t ipo de r epr oduccin asexual, las
bact er ias poseen unos mecanismos de r epr oduccin sexual o
par asexual, mediant e los cuales se int er cambian f r agment os
de ADN. Est e t ipo de r epr oduccin puede r ealizar se por :
13
!"TRANSFORMACI ON:
Consist e
en
el
int er cambio gent ico
pr oducido cuando una
bact er ia es capaz de
capt ar f r agment os de
ADN, de ot r a bact er ia
que
se
encuent r an
disper sos en el medio
donde vive.
14
!"
TRANSDUCCI N: En est e caso la t r ansf er encia
de ADN de una bact er ia a ot r a, se r ealiza a
t r avs de un vir us bact er if ago, que se
compor t a como un vect or int er mediar io ent r e las
dos bact er ias.
(Bibliot eca de Consult a Micr osof t Encar t a 2002. 1993-2001 Micr osof t Cor por at ion.)
15
16
17
1. Medios bsicos
Solo cont ienen algn ext r act o de car ne u ot r a inf usin
simple, pept ona, sal y agua.
El ext r act o o la inf usin de car ne pr opor cionan al or ganismo
los aminocidos, vit aminas, sales, y pequeas cant idades de
car bono, nit r geno, hidr geno y ot r os element os.
Las sales (usualment e clor ur o de sodio) sir ven par a obt ener
isot onicidad r equer ida par a el mant enimient o de pr esiones
osmt icas const ant es.
El agua sir ve como disolvent e, como medio de t r anspor t e, o
par a ambos f ines (siempr e se debe usar agua dest ilada par a
pr epar ar los medios de cult ivo).
Los medios de cult ivo que solo cont ienen ext r act o de car ne,
pept ona, sal y agua, son lquidos; par a el est udio de las
car act er st icas de las colonias es indispensable el uso de
medios slidos.
La solidif icacin se consigue
agr egando agar , gelat ina, albmina
de suer o o de huevo, a los ot r os
ingr edient es.
18
2. Medios enriquecidos
Son aquellos medios bsicos que han sido complement ados
con lquidos cor por ales, vit aminas especf icas, aminocidos,
pr ot enas y ot r os nut r ient es clar ament e def inidos como
t ales.
19
Ej emplos:
1. Agar pr ot eosa
2. Agar sangr e
3. Agar chocolat e
4. Caldo de suer o
5. Agar con suer o
6. Suer o de Loef f ler con
sangr e
3.
Medios
select ivos,
enriquecimient o
dif erenciales
de
20
21
4. Medios especiales
Son los medios que no pueden ser f cilment e agr upados
baj o alguno de los ant er ior es gr upos.
La mayor a de ellos ser n medios empleados par a
compr obar una o ms a car act er st icas bioqumicas.
Ej emplos:
Pr uebas bioqumicas
1. Fer ment acin de car bohidr at os
2. Pr ueba de cit r at o
3. Pr ueba de leche con t or nasol
4. Reduccin de leche con azul de met ileno
5. Pr ueba de oxidacin y f er ment acin: Hugh-Leif son
(O/ F)
6. Pr ueba de ur easa
7. Pr ueba de Voges Pr oskauer
8. Pr ueba con r oj o de met ilo
9. Reduccin de nit r at os
10. Pr ueba de f enilalanina
11. Pr ueba de Sulf ur o, indol, movilidad: SI M
12. Agar hier r o y t r iple azcar : TSI
13. Descar boxilacin de la ar ginina y lisina: LI A
14. Descar boxilacin de la or nit ina: MI O
22
De acuerdo a la composicin
26
27
28
30
31
33
34
35
$"
Fundament o
La f er ment acin es un pr oceso met ablico de oxido-r educcin
que ocur r e en un medio ambient e anaer obio y, en lugar de
oxgeno, un sust r at o or gnico sir ve como el acept or f inal de
hidr geno (elect r ones). En los sist emas de pr ueba
bact er iolgicos, est e pr oceso se det ect a obser vando cambios
de color en indicador es de pH a medida que se f or man
pr oduct os cidos.
Las bact er ias que f er ment an un hidr at o de car bono son por
lo gener al anaer obios f acult at ivos. Por medio del pr oceso de
f er ment acin un hidr at o de car bono es degr adado y
descompuest o en dos molculas de car bono (t r iosas) que son
nuevament e degr adadas en un nmer o de compuest os de 1,
2, 3 y 4 car bonos. Los pr oduct os f inales var an con cada
especie bact er iana y depende del sist ema enzimt ico
exist ent e en la especie y las condiciones del medio
ambient e.
El ms impor t ant e ciclo f er ment at ivo de la degr adacin de
la glucosa es el ciclo de Embden - Meyer hof aun cuando
st e t ambin puede pr oducir se por la der ivacin de pent osa
o el ciclo de Ent ner - Duodor of f . Pueden ut ilizar se diver sos
hidr at os de car bono. La bact er ia usada depende de las
dif icult ades que se pr esent en par a ident if icar un or ganismo
det er minado.
36
Bact er ia
I ndicador de pH + CHO
(aldehdos)
gluclisis
H2 CO2
+
cambio de color
$"
Consist encia del medio
Lquido
$"
I noculacin
Por dif usin, inculo denso
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 hor as
Figura 12. Streptococcus
Temper at ur a: 35 - 37 C
37
$"
Result ados
NEGATIVO
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
Figura 13. Pruebas bioqumicas de Fermentacin de Carbohidratos
$"
I nt er pr et acin
Posit iva = Color amar illo (cido)
Negat iva = Color r osa - r oj izo (alcalina)
Color nar anj a
38
$"
Obser vaciones
Exist en ocasiones que con algunas especies de bact er ias es
necesar ia la incubacin ms pr olongada, est o se r ecomienda
cuando apar ece un color nar anj a, se incuban baj o las
mismas condiciones 24 hor as ms. S aun as se pr esent a
est e color la pr ueba se r epor t a como negat iva ya que lo
ms pr obable es que el micr oor ganismo est f or mando
pr oduct os met ablicos que no necesar iament e son por
f er ment acin por ello no alcanza el color r oj o esper ado.
El hecho de incubar por 24 hor as ms es poco pr ct ico ya
que la mayor par t e de las ocasiones se t iene el t iempo
necesar io par a la incubacin de 24 hor as, por ello en est e
manual se consider a que la pr ueba se t ome como negat iva si
pr esent a un color nar anj a.
$"
Repor t e de r esult ados
A = cido
K = alcalino
G = gas
39
$"
Aplicaciones
$"
Micr oor ganismos f er ment ador es de car bohidr at os:
Fer ment ador es de glucosa: Todos los miembr os
de las Ent er obact er iaceae.
Fer ment ador es de glucosa y lact osa:
Escher ichia coli, Klebsiella y gr upos
Ent er obact er .
Fer ment ador es de manit ol: St aphylococcus
aur eus
Fer ment ador es de inosit ol: Pr ot eus r et t ger i
Fer ment ador es de lact osa: Neisser ia lact amica
Pr ovidencia
Fer ment ador es de adonit ol:
alcaligenes.
Fer ment ador es de inulina: St r ept ococcus
salivar ius y St r ept ococcus sanguis.
Yer sinia
Fer ment ador es
de
sacar osa:
ent er ocolit ica.
List er ia
Fer ment ador es
de
salicina:
monocyt ogenes.
40
$"
Micr oor ganismos no f er ment ador es de Car bohidr at os:
No
f er ment ador es
de
lact osa:
Ent er obact er ias pat genas como Salmonella y
Shigella.
No f er ment ador es de manit ol: St aphylococcus
epider midis.
No f er ment ador es de salicina: Especies de
Cor ynebact er ium.
No f er ment ador es de r af inosa: Ot r as especies
de Aer omonas.
No f er ment ador es de inosit ol: Pr ot eus
mor ganii.
No f er ment ador es de adonit ol: Pr ovidencia
st uar t ii.
No f er ment ador es de inulina: St r ept ococcus
del gr upo D.
No f er ment ador es de sacar osa: Ot r as
especies de Yer sinia.
41
2. PRUEBA DE CI TRATO
$"
Medio de cult ivo: Cit r at o de Simmons
Composicin:
a) Sulf at o de magnesio
b) Monof osf at o de amonio
c) Fosf at o dipot sico
d) Cit r at o de sodio
e) Clor ur o de sodio
f ) Agar
g) Agua dest ilada
h) I ndicador de pH: Azul de br omot imol (pH= 6)
Alcalino: color azul de Pr usia int enso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Color ver de (pH = 6.9)
$"
Fundament o
Det er mina si un micr oor ganismo es capaz de ut ilizar cit r at o
como nica f uent e de car bono par a el met abolismo y
cr ecimient o, pr ovocando alcalinidad.
El medio incluye cit r at o de sodio, un anin como nica
f uent e de car bono y f osf at o de amonio como nica f uent e
de nit r geno.
42
Cit r at o
Oxalacet at o
acet at o
pH cido:
2 Pir uvat o
2 Pir uvat o
$"
Consist encia del medio
Slido inclinado (pico de f laut a)
$"
I noculacin
Se t oma una colonia bien aislada de la super f icie del medio
de aislamient o pr imar io y se inocula como una est r a nica
en la super f icie del pico de f laut a.
$"
I ncubacin
Tiempo = 24 - 48 hor as
Temper at ur a = 35 - 37 C
$"
Pr ecauciones
El inculo debe ser liviano.
S st e es demasiado gr ande, compuest os or gnicos
pr ef or mados dent r o de la par ed celular de las bact er ias
que est n mur iendo pueden liber ar suf icient e car bono y
nit r geno como par a dar un r esult ado f also posit ivo.
44
$"
Result ados
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
POSITIVO
Figura 14. Pruebas bioqumicas de citrato
45
POSITIVO
$"
I nt er pr et acin
Posit ivo: Cr ecimient o aunque no exist a cambio de color .
Cr ecimient o y el medio de color azul int enso en
pico de f laut a.
Negat ivo: No se obser va cr ecimient o y medio de color
ver de.
Si se ut iliza car bono a par t ir de cit r at o de sodio, t ambin
se ext r ae nit r geno del f osf at o de amonio cont enido en el
medio, liber ndose amoniaco. En ocasiones se det ect a un
cr ecimient o visible a lo lar go de la lnea de siembr a ant es
de la apar icin de color . Est e cr ecimient o visible t ambin
indica r esult ado posit ivo.
$"
Repor t e de r esult ados
Negat ivo
(-)
Posit ivo
(+)
46
$"
Aplicaciones
$"
Micr oor ganismos posit ivos
Especies de:
Salmonella
Ar izona
Cit r obact er
Ent er obact er
Klebsiella
Ser r at ia licuef aciens
Pseudomonas cepacia
$"
Micr oor ganismos negat ivos
Edwar siella
Yer sinia ent er ocolt ica
Escher ichia coli
Shigella
Yer sinia pseudot uber culosis
Ot r as especies de Mor axella
Pr ot eus mor ganii
47
3.
PRUEBA
GELATI NA
DE
LI CUEFACCI N
DE
$"
Medio de cult ivo: Gelat ina nut r it iva
Composicin:
a) Ext r act o de car ne
b) Pept ona
c) Gelat ina
d) Agua dest ilada
$"
Fundament o
Det er minar la capacidad de un or ganismo de pr oducir
enzimas de t ipo pr ot eolt ico (gelat inasas) que licuan la
gelat ina.
Las pr ot enas que se pr oducen nat ur alment e son demasiado
gr andes par a ent r ar en una clula bact er iana; por lo t ant o,
par a que una clula ut ilice las pr ot enas, pr imer o deben ser
cat abolizadas en component es ms pequeos. Las enzimas
exonuclear es de t ipo pr ot elt ico, gelat inasas, son
secr et adas por cier t as bact er ias par a desdoblar a las
pr ot enas y est a capacidad ayuda a la ident if icacin
bact er iana.
48
gelat inasas
Pr ot ena + H 2 O
polippt idos
Pr ot easas
gelat inasas
Polippt idos + H 2 O
Pept idasas
aminocidos
individuales
$"
Consist encia del medio
Semislido
$"
I noculacin
Picadur a en posicin ver t ical hast a una pr of undidad de 2 2.5 cm, inculo denso.
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18 - 24 hor as
Temper at ur a: 35 - 37 C
Al t r mino de la incubacin se coloca el t ubo en un
r ef r iger ador o bao de hielo dur ant e dos hor as par a
det er minar si se ha pr oducido o no la digest in de la
gelat ina (licuef accin).
49
$"
Result ados
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
$"
I nt er pr et acin
Posit ivo: Medio licuado (est ado lquido)
Negat ivo: Medio slido
$"
Repor t e de r esult ados
Posit ivo
(+)
$"
Aplicaciones
$"
Micr oor ganismos posit ivos
$"
Micr oor ganismos negat ivos
List er ia monocyt ogenes
51
Lact osa
Glucosa
caseinasa
c. Lct ico + casenat o de Ca
54
caseingeno (pp)
55
$"
Consist encia del medio
Lquido
$"
I noculacin
Dif usin
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-48 hor as
Temper at ur a: 35 - 37 C
56
$"
Result ados
Medio no
inoculado
Fermentacin
de lactosa
Digestin
Reduccin
de tornasol
No fermentacin
de lactosa
$"
I nt er pr et acin
Roj o r osado: cido; f er ment acin de lact osa
Azul pur pr eo: No f er ment acin de lact osa; sin cambio del
indicador de pH.
Azul: Alcalino; Ausencia f er ment acin de lact osa. El
or ganismo at aca las sust ancias nit r ogenadas que se
encuent r an en el medio.
Blanco: Reduccin del t or nasol a una leucobase.
For macin de cogulo: Coagulacin de la pr ot ena de la
leche.
Aclar acin del medio: Digest in; se a inger ido la pr ot ena de
la leche.
Gas: Pr oduccin de bur buj as en la campana de Dur ham.
57
Cogulo
$"
Repor t e de r esult ados
En la t abla de r esult ados solo se escr ibir n las let r as que
apar ecen dent r o del par nt esis.
Roj o r osado (A)
Azul pur pr eo (SC)
Azul (K)
Blanco (Red)
Cogulo (C)
Digest in (D)
Gas (G)
$"
Aplicaciones
Ayuda a la dif er enciacin de especies sobr e t odo del
gner o Clost r idium.
Sin cr ecimient o:
Clost r idium cochlear ium
C. dif f icile
C. put r ef aciens
C. t et anomor phum
St r ept ococcus equinus
Con cr ecimient o:
St r ept ococcus bovis
58
$"
Medio de cult ivo: Medio de leche con azul de
met ileno
Composicin:
a) Leche descr emada deshidr at ada
b) Agua dest ilada
c) I ndicador : Azul de met ileno
I ncolor o : Est ado r educido
Azul : Est ado oxidado; medio no inoculado
(pH=6.4)
$"
Fundament o
Per mit e dif er enciar or ganismos por su capacidad de r educir
el azul de met ileno en un medio con leche. El sist ema
cit ocr omo oxidasa act iva la oxidacin del cit ocr omo
r educido por el oxgeno molecular que a su vez act a como
un acept or de elect r ones en el per iodo t er minal del sist ema
de t r ansf er encia de elect r ones. Cuando exist en condiciones
aer bicas el oxgeno es el acept or f inal del hidr geno,
pr oduciendo agua o per xido de hidr geno segn la especie
bact er iana y su sist ema enzimt ico.
59
N(CH3)2
(CH3)2N
N(CH3)2
(CH3)2N
S
$"
Consist encia del medio
Lquido
$"
I noculacin
Dif usin, inculo denso
60
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 hor as
Temper at ur a: 35 - 37 C
$"
Result ados
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO
$"
I nt er pr et acin
Posit iva: I ncolor o; r educcin
Negat iva: Azul; no hay r educcin
61
POSITIVO
$"
Repor t e de r esult ados
R = Reduccin
(-) = Negat ivo, sin cambio de color
$"
Aplicaciones
Est a capacidad enzimt ica se ut iliza f undament alment e
par a
dif er enciar
los
ent er ococos
(especies
de
St r ept ococcus del gr upo D) de ot r os miembr os del gner o
St r ept ococcus.
$"
Micr oor ganismos posit ivos
Ent er ococos ( St r ept ococcus del gr upo D)
$"
Micr oor ganismos negat ivos
Especies de St r ept ococcus que por lo gener al no son
ent er ococos.
62
$"
Medio de cult ivo: Medio bsico de Hugh Leif son,
medio O/ F.
Component es:
a) Pept ona
b) Clor ur o de sodio
c) Fosf at o de pot asio
d) Hidr at os de car bono (glucosa, lact osa, sacar osa,
malt osa).
e) Agar
f) Agua dest ilada
g) I ndicador de pH: Azul de br omot imol
cido : Color amar illo (pH = 6)
Alcalino : Azul de Pr usia int enso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Ver de (pH = 7.1)
Se deben t ener dos t ubos par a est a pr ueba uno sin sello y
ot r o con sello de par af ina.
$"
Fundament o
Det er mina el met abolismo oxidat ivo o f er ment at ivo de un
hidr at o de car bono.
63
$"
Consist encia del medio
Semislido (t ambin per mit e la obser vacin de movilidad).
$"
I noculacin
Picadur a, inculo poco denso. Picar
apr oximadament e hast a 0.6 mm de f ondo.
65
ambos
t ubos
$"
Condiciones de incubacin:
Tiempo: 18 - 24 hor as
Temper at ur a: 35-37 C
$"
Result ados
MEDIO NO INOCULADO
FERMENTADOR
OXIDANT E NO FERMENTADOR
NO OXIDANT E NO FERMENTADOR
66
$"
I nt er pr et acin
Amar illo: cido
Bur buj as: Gas
Ver de: alcalino
Incubacin
Fermentador
Oxidativo
No
fermentador
No
oxidativo
No
fermentador
$"
Aplicaciones
1. Fundament alment e par a dif er enciar gner os
int est inales no ent r icos, Gr am negat ivos de la Familia
Ent er obact er iaceae.
67
$"
Repor t e de r esult ados
Met abolismo
Oxidacin (O)
Ferment acin (F)
Ferment acin (F)
Tubo
c/ reaccin
Abier t o
Cubier t o
Cubier t o
Ni
f erment acin
ni oxidacin (- )
Ninguno
Ferment acin
y
oxidacin (O+F)
Ambos
68
Ver de (-)
Amar illo (A)
Amar illo (AG)
Ver de (-)
Amar illo (A
AG)
Amar illo (A
AG)
6. REACCI N DE LA UREASA
$"
Medio de cult ivo: Agar ur ea de Chr ist ensen
Composicin:
a) Pept ona
b) Clor ur o de sodio
c) Fosf at o monopot sico
c) Glucosa
d) Ur ea
e) Agar
f ) Agua dest ilada
g) I ndicador de pH: Roj o de f enol
!"cido: Amar illo (pH = 6.8)
!"Alcalino : Roj o r osado (pH = 8.4)
!"Medio no inoculado: Amar illo (pH = 6.8)
$"
Fundament o
Det er mina la capacidad de un or ganismo de desdoblar la
ur ea f or mando dos molculas de amoniaco por la accin de la
enzima ur easa pr oduciendo un cambio de color r oj o en el
medio.
La hidr lisis de la ur ea es cat alizada por la ur easa, par a dar
dos molculas de amoniaco. La ur easa es una impor t ant e
enzima micr obiana vinculada con la descomposicin de los
compuest os or gnicos.
69
H2N
C=O + 2 HOH
CO2 + H 2 O + 2 NH 3
H2N
Ur ea
$"
Consist encia del medio
Slido en pico de f laut a (cola de pescado)
$"
I noculacin
Est r a en pico de f laut a (no hacer puncin).
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 hor as
Temper at ur a: 35-37 C
70
(XH 4 ) 2 CO2
$"
Result ados
MEDIO NO INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
POSITIVO
Figura 22. Pruebas bioqumicas: Urea
$"
I nt er pr et acin
Posit ivo: Roj o r osado int enso en el pico de f laut a
Negat ivo: Amar illo
$"
Repor t e de r esult ados
Posit ivo (+)
Negat ivo (-)
71
$"
Obser vaciones
En muchas especies, la r eaccin posit iva de ur easa se
det ect a pr imer o por un cambio de color r oj o en la par t e de
pico de f laut a, el cual, al pr incipio se vuelve r oj o por que la
accin alcalina, r esult ado de la degr adacin de pequeas
cant idades de ur ea, es aument ada por las aminas f or madas
a par t ir de la descar boxilacin oxidat iva de los aminocidos
en la par t e del medio expuest a al air e.
$"
Aplicaciones
1. Se usa par a dif er enciar los or ganismos Pr ot eus
r pidament e ur easa posit ivos de ot r os miembr os de las
ent er obact er ias, ot r os gner os pueden ser posit ivos
r et ar dados.
-
Klebsiella (+)
Escher ichia coli (-)
Pr ot eus (+ r pido)
Pr ovidencia (-)
72
Composicin:
a) Polipept ona
b) Dext r osa
c) Fosf at o de pot asio
d) Agua dest ilada
$"
Fundament o
Det er mina la capacidad de algunos or ganismos de pr oducir
un pr oduct o f inal neut r o, la acet ona a par t ir de la
f er ment acin de glucosa.
La r eaccin de VP se basa en la det eccin de acet ona como
pr oduct o f inal neut r o der ivado del met abolismo de la
glucosa. st a es met abolizada en cido pir vico,
int er mediar io clave en la gluclisis. A par t ir del cido
pir vico, una bact er ia puede seguir muchas vas. La
pr oduccin de acet ona (pr ecur sor de la pr oduccin de 2,3but anediol) que es uno de los ciclos par a la degr adacin de
la glucosa en las bact er ias. La f or macin de acet ona y
but ilenglicol es una va alt er nat iva del met abolismo del cido
pir vico. Las bact er ias que ut ilizan est a va pr oducen solo
pequeas cant idades de cidos mixt os que son insuf icient es
73
par a disminuir
bast ant e como
mot ivo muchas
posit ivas, con
vicever sa.
O H
C H 3
C H 3
O2 OXIDADO
+
KOH
C H O H
Alfa-naftol (catalizador)
C H 2
C H 2
Diacetilo
Acetona
+
N H 2
N H
C
N H
condensacin
Color rojo rosado
Ncleo de guanidina
74
$"
Consist encia del medio
Lquido
$"
I noculacin
Dif usin
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 hor as
Temper at ur a: 35-37 C
$"
React ivos adicionales
a) Alf a naf t ol al 5%, int ensif icador del color
b) Hidr xido de pot asio 40%, agent e oxidant e
Agr egar dir ect ament e los r eact ivos al t ubo despus de la
incubacin en el siguient e or den:
1) 0.6ml de alf a naf t ol
2) 0.2ml de KOH
3) Agit ar el t ubo suavement e, dej ar r eposar de 10 a
15 minut os ant es de la int er pr et acin.
75
$"
Pr ecauciones
El or den de adicin de los r eact ivos es impor t ant e, ya que la
inver sin de incor por acin dar como r esult ado un dbil
posit ivo o f also negat ivo.
No debe exceder se un volumen exact o de KOH ya que el
exceso puede ocult ar una r eaccin VP dbilment e posit iva.
$"
Result ados
POSITIVO
NEGATIVO
MEDIO NO
INOCULADO
$"
I nt er pr et acin
Posit ivo: Roj o r osado en la super f icie del medio (pr esencia
de acet ona).
Negat ivo: Amar illo. Puede f or mar se un color cobr izo per o
an as la r eaccin es negat iva.
76
$"
Repor t e de r esult ados
Posit ivo (+)
Negat ivo (-)
$"
Aplicaciones
$"
Micr oor ganismos posit ivos
- Klebsiella pneunoniae
- Yer sinia ent er ocolit ica
$"
Micr oor ganismos
negat ivos
-Escher ichia coli
-K. ozaenae
77
$"
Medio de cult ivo : Medio de Clar k y Lubs (caldo RM/ VP)
Composicin:
e) Polipept ona
f) Dext r osa
g) Fosf at o de pot asio
h) Agua dest ilada
i) I ndicador : r oj o de met ilo
PH inicial = 6.9, medio no inoculado, color r oj o.
cido: r oj o (pH = 4.4)
Alcalino: amar illo (pH = 6)
$"
Fundament o
Compr obar la capacidad de un or ganismo de pr oducir y
mant ener est ables los pr oduct os t er minales cidos de la
f er ment acin de la glucosa y vencer la capacidad
amor t iguador a del sist ema. Es una pr ueba cualit at iva de la
pr oduccin de cido (det er minacin de pH). Las bact er ias
que pr incipalment e siguen la va de f er ment acin de cidos
mixt os a menudo pr oducen suf icient e cido par a mant ener
un pH menor de 4.4.
78
$"
Consist encia del medio
Lquido
$"
I noculacin
Dif usin
79
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 48 hor as
Temper at ur a: 35-37 C
$"
React ivos adicionales par a Roj o de Met ilo
Roj o de met ilo. Adicionar 5 got as al t ubo pr eviament e
incubado.
I nt er pr et ar el r esult ado del color inmediat ament e.
Conser vacin: Guar dar el r eact ivo en r ef r iger acin (4 C)
mient r as no se usa.
$"
Result ados
MEDIO NO INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
80
$"
I nt er pr et acin de r oj o de met ilo
No debe int ent ar se int er pr et ar un r esult ado con el r oj o de
met ilo despus de menos de 48 hor as de incubacin.
Posit iva: Roj o en la super f icie del medio (pH = 4.4)
Algunas bact er ias pueden pr oducir menor es cant idades de
cido a par t ir del sust r at o por ello es posible que apar ezca
un color nar anj a. Est o indica una pr ueba posit iva.
Negat ivo: Amar illo (pH = 6) nar anj a
$"
Repor t e de r esult ados
Posit ivo (+)
Negat ivo (-)
$"
Aplicaciones
!"Micr oor ganismos posit ivos
- Escher ichia coli
- Especies de Yer sinia
Figura 27.
$"
Fundament o
Det er minar la capacidad de un or ganismo de r educir el
nit r at o en nit r it os o en nit r geno libr e.
La r educcin de nit r at o en nit r it o y en gas nit r geno t iene
lugar gener alment e en condiciones anaer obias, en las cuales
un or ganismo obt iene su oxgeno del nit r at o. El oxgeno
sir ve como un acept or de hidr geno.
Reduccin del nit r at o en nit r it o
NO3 + 2 e 2 H +
Nit r at o
NO2 + H 2 O
nit r it o
82
N 2 + 6 H2O
NH2
+ HNO2
NH2
SO2H
SO2H
cido sulfanilico
(incoloro)
NH2
P-sulfobenceno-azo-affa-naftilamina
(rojo)
Alfa-naftilamina
Zn
+
CH2COOH
cido actico
SO2H
NH2
83
(C6H3NHNH3) OSO3H
Arilhidracina
$"
Consist encia del medio
Lquido
$"
I noculacin
Dif usin, inculo denso.
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 hor as
Temper at ur a 35 - 37 C
Rar ament e es necesar ia una incubacin pr olongada de hast a
5 das. La mayor a de los or ganismos capaces de r educir el
nit r at o, lo hacen dent r o de las 24 hor as.
$"
React ivos adicionales
1. Alf a - naf t ilamina 0.05 %
2. cido sulf anilico 0.8 %
Adicionar dir ect ament e al t ubo de r eaccin en el siguient e
or den:
1. Alf a - naf t ilamina 1 ml.
2. cido sulf anilico 1 ml.
84
$"
Result ados
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
$"
I nt er pr et acin
Se int er pr et an los r esult ados un minut o despus de adicionar
los r eact ivos.
Posit ivo: r osa a r oj o int enso
Negat ivo: Amar illo
85
$"
Pr ecauciones
Una pr ueba negat iva indica que los nit r at os, no han sido
r educidos o que han sido r educidos a ot r os pr oduct os, como
amoniaco, nit r geno molecular , oxido nt r ico u xido nit r oso
e hidr oxilamina.
Dado que los r eact ivos de pr ueba det ect an solo nit r it os, est e
lt imo pr oceso llevar a a una lect ur a f alsa negat iva. Por
ende es necesar io agr egar una pequea cant idad de polvo de
zinc a t odas las r eacciones negat ivas.
Los iones zinc r educen nit r at os a nit r it os y la apar icin de
color r oj o despus del agr egado de zinc indica una r eaccin
posit iva.
$"
Repor t e de r esult ados
Posit ivo (+)
Negat ivo (-)
$"
Aplicaciones
Ayuda a la ident if icacin de Ent er obact er ias que por lo
gener al son posit ivas.
Todas las Ent er obact er ias, con excepcin de cier t os t ipos de
Ent er obact er agglomer ans y especies de Er winia, r educen
nit r at os a nit r it os.
86
$"
Medio de cult ivo: agar f enilalanina
Composicin:
a) D-L-f enilalanina
b) Ext r act o de levadur a
c) Clor ur o de sodio
d) Fosf at o de sodio
e) Agar
f) Agua dest ilada
g) PH inicial = 7.3
$"
Fundament o
Det er mina la capacidad de un or ganismo de desaminar la
f enilalanina en cido f enilpir vico por su act ividad
enzimt ica, con la consiguient e acidez r esult ant e.
El aminocido ar omt ico f enilalanina suf r e una desaminacin
oxidat iva cat alizada por un aminocido oxidasa par a pr oducir
el cido cet nico.
La desaminacin oxidat iva da como r esult ado la ext r accin
del gr upo amino del aminocido par a f or mar un doble enlace
alf a-cet ocido y libr e de amoniaco.
87
CH2
CH
COOH
- 2H
NH2
1/2 O
FLAVOPROTENA
FENILALANINA
CH2
COOH
NH2
AMONIACO
CIDO FENILPIRVICO
cido f enilpir vico. La r eaccin posit iva con est e r eact ivo se
debe a la f or macin de una hidr azona. El clor ur o f r r ico
act a como agent e quelant e act uando con el cido
f enilpir vico par a f or mar un color ver de.
Cuando se expone al oxgeno at mosf r ico un t ubo de cult ivo
con f enilalanina despus del agr egar el clor ur o f r r ico
aument a la pr oduccin y la int ensidad de la r eaccin
posit iva.
CH2
COOH
CH2
N
O + RNH
NH2
Hidracina
cido fenilpirvico
Fenilhidrazona
$"
Consist encia del medio
Slido en pico de f laut a
$"
I noculacin
Est r a en pico de f laut a, inculo denso.
89
COOH
NHR
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 hor as
Temper at ur a 35 - 37 C
$"
React ivos adicionales
Clor ur o f r r ico 10%
Adicionar de 4-5 got as a un t ubo incubado
Hacer r ot ar suavement e el t ubo par a que el cr ecimient o se
separ e.
Esper ar de 1 a 5 minut os par a leer la r eaccin.
Conser vacin: Guar dar los r eact ivos en r ef r iger acin y
colocar los
en
f r ascos
oscur os
par a evit ar
la
descomposicin.
$"
Aplicaciones
Est a act ividad enzimt ica es car act er st ica de t odas las
especies de Pr ot eus y del gr upo Pr ovidencia, y se usa par a
separ ar est os dos gner os de ot r os miembr os de las
Ent er obact er ias.
90
$"
Result ados
MEDIO NO
INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
$"
I nt er pr et acin
Posit iva: Roj o clar o a int enso en el pico de f laut a.
Negat ivo: Amar illo
$"
Repor t e de r esult ados
Posit ivo (+)
Negat ivo (-)
91
$"
Fundament o
Det er minar si un or ganismo es mvil o inmvil, si es capaz de
liber ar cido sulf hdr ico por accin enzimt ica de los
aminocidos que cont ienen azuf r e pr oduciendo una r eaccin
visible de color negr o y por lt imo la capacidad de
desdoblar el indol de la molcula t r ipt f ano, adems que la
consist encia del medio per mit e la obser vacin de la
movilidad de algunas bact er ias.
1. Pr oduccin de cido sulf hdr ico
2. Pr oduccin de indol
3. Movilidad
92
1.
Primera et apa:
La bact er ia r eacciona con el t iosulf at o de sodio por medio
de una r eaccin de r educcin que da un sulf it o y un sulf at o.
Est e es un pr oceso de r espir acin anaer bica donde el
t omo de azuf r e sir ve como acept or de elect r ones par a la
oxidacin de los sust r at os or gnicos. El t iosulf at o
r eemplaza al sulf at o como acept or de elect r ones y es una
f uent e de azuf r e par a el or ganismo.
Segunda et apa:
El gas incolor o SH 2 r eacciona con una sal pesada, cit r at o
f r r ico de amonio par a pr oducir un pr ecipit ado negr o
insoluble, sulf ur o f er r oso.
93
SH 2 + iones f r r icos
gas SH2
$"
Agar sulf it o de bismut o
$"
Agar cit r at o sulf ur o
$"
Agar desoxicolat o - cit r at o
$"
Medio LI A
$"
Medio TSI
$"
Agar acet at o de plomo
$"
Agar S-S
$"
Agar XLD
$"
Medio SI M
2.
95
COOH
NH
T rip to fa n a s a
H 2O
D e s a m in a c i n
L - T r ip t f a n o
+
H
N H
COOH
H
In d o l
c id o P ir v ic o
A m o n ia c o
3. Movilidad
Det er mina si un or ganismo es mvil o inmvil. Las bact er ias
t ienen movilidad por medio de sus f lagelos, que se
encuent r an pr incipalment e ent r e los bacilos; sin embar go
algunas f or mas de cocos son inmviles.
Las bact er ias mviles pueden cont ener un solo f lagelo o
muchos; adems su localizacin var a
con su especie bact er iana y las
condiciones de cult ivo. A veces, las
bact er ias con movilidad pr oducen
var iant es no mviles que par ecen ser
est ables y r ar ament e se r evier t en en
f or mas mviles.
Figura 30. Salmonella typhi
96
$"
Consist encia del medio
Semislido en f or ma ver t ical
$"
I noculacin
Picadur a en f or ma ver t ical
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 hor as
Temper at ur a 35 - 37 C
Los cult ivos que van a somet er se a pr uebas de indol deber n
ser incubados aer bicament e el descenso de la t ensin de
oxgeno disminuye la pr oduccin de indol.
97
$"
React ivos adicionales
Prueba de indol
React ivo de Kovacs
Adicionar 5 got as y agit ar suavement e el t ubo
I nt er pr et ar inmediat ament e.
Conser vacin: Los r eact ivos deber n guar dar se en el
r ef r iger ador (4 C) mient r as no se usan, su est abil idad es
var iable, por lo t ant o se har t odas las semanas un cont r ol
de calidad, desechndolos si muest r an una r eaccin dbil o
negat iva con un or ganismo posit ivo conocido.
$"
Repor t e de r esult ados
PRUEBA
Sulf uro
I ndol
Movilidad
POSI TI VO
+
+
+
98
NEGATI VO
-
$"
Result ados
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
MEDIO SIN
INOCULAR
H2S
POSITIVO
GAS
Figura 31. Pruebas bioqumicas del medio SIM
$"
I nt er pr et acin
1.
H2S
NEGATIVO
2.
I ndol
3.
Movilidad
100
$"
Aplicaciones
Bact erias
Produccin de
H2S
Produccin de Movilidad
indol
Salmonella
t yphi
+o -
Salmonella
+o -
E. coli
+o -
Klebsiella
+o -
Ent erobact er
Cit robact er
Shigella
+o -
+o -
101
12.
$"
Medio de cult ivo: Agar hier r o t r iple azcar (agar hier r o
de Kligler , AHK)
Composicin:
f ) Ext r act o de car ne
g) Ext r act o de levadur a
h) Pept ona
i) Pr ot easa
j ) Lact osa
k) Dext r osa
l) Sulf at o f er r oso
m) Clor ur o de sodio
n) Tiosulf at o de sodio
o) Agar
p) Agua dest ilada
q) I ndicador : Roj o de f enol
!"cido: amar illo
!"Alcalino: r oj o
!"Medio no inoculado: nar anj a r oj izo (pH =7.4)
102
$"
Fundament o
Det er mina la capacidad de un or ganismo de at acar un hidr at o
de car bono especf ico incor por ado en un medio de
cr ecimient o bsico, con pr oduccin o no de gases, j unt o con la
det er minacin de posible cido sulf hdr ico.
El agar AHK es un medio dif er encial que det er mina t ant o la
f er ment acin de los hidr at os de car bono y la pr oduccin de
cido sulf hdr ico. Las bact er ias pueden ut ilizar cualquier a de
los sust r at os incor por ados en el medio y ser met abolizados,
car act er st icas que son ut ilizadas par a la dif er enciacin de
st as, pr incipalment e par a las Ent er obact er ias.
Est e medio cont iene lact osa con una concent r acin de 1% y
glucosa 0.1%, lo cual per mit e la obser vacin de la
f er ment acin de uno o de ambos car bohidr at os por par t e de
las bact er ias, adems de la pr oduccin de gas y de cido
sulf hdr ico.
La f er ment acin es un pr oceso que se lleva acabo en
condiciones aer bicas (pico de f laut a) y anaer bicament e
(capa inf er ior ). En el pico de f laut a la glucosa (monosacr ido)
es cat abolizada inicialment e por medio del ciclo anaer bico de
Embden-Meyer hof , ut ilizado t ant o por los aer obios como por
los anaer obios par a dar cido pir vico, y post er ior ment e st e
ser degr adado a t r avs del ciclo de Kr ebs par a dar CO2 , H 2 O
y ener ga.
103
Por ot r a par t e la lact osa (disacr ido) ser pr imer o degr adada
a sus monosacr idos cor r espondient es (glucosa y galact osa).
Ciclo de Kr ebs
Glucosa o galact osa
El medio TSI cont iene una cant idad limit ant e de glucosa y una
concent r acin
10
veces
mayor
de
lact osa.
Las
Ent er obact er ias y los f er ment ador es de glucosa comienzan
met abolizando est e azcar , ya que las enzimas que ut ilizan la
glucosa est n pr esent es como const it uyent es de las
bact er ias, y st as pueden obt ener mayor ener ga por
ut ilizacin del azcar ms simple.
Todos los ot r os car bohidr at os deben ser conver t idos en
glucosa par a ent r ar en el ciclo de Embden-Meyer hof . La
ut ilizacin de la glucosa se r ealiza en f or ma aer obia sobr e la
est r a, donde el oxgeno pr esent e act a como acept or
t er minal de elect r ones y en la par t e t er minal de la columna en
condiciones de anaer obiosis. Una vez que una bact er ia
f er ment ador a de glucosa ha r educido t oda la glucosa
disponible a pir uvat o, comenzar a met abolizar el pir uvat o a
t r avs del ciclo aer bico de Kr ebs (sobr e la est r a), f or mando
104
105
106
$"
Result ados
K/A
K/A
MEDIO
MEDIO
NO INO CULADO
NO INO CULADO
GAS
GAS
K/K
K/K
A/A
A/A
107
H2S
H2S
$"
I nt er pr et acin
1. Roj o en pico de f laut a: alcalino; degr adacin aer bica de
glucosa.
Amar illo en capa pr of unda: cido; degr adacin anaer bica
de la glucosa.
2. Amar illo en pico: cido
Amar illo en capa pr of unda: cido
3. Roj o en pico de f laut a: alcalino
Sin cambio de color en capa pr of unda: alcalina.
4. Pr oduccin de H 2 S: pr ecipit ado negr o
5. Pr oduccin de gases: Pr oduccin de bur buj as,
descomposicin del medio, liger a muesca del medio sobr e
el cost ado del t ubo o desplazamient o del medio del f ondo,
dej ando un espacio libr e.
$"
Obser vaciones
Una bact er ia pr oduct or a de H 2 S puede dar t al cant idad de
pr ecipit ado negr o de sulf ur o f er r oso que ocult e
complet ament e la acidez pr oducida en la capa pr of unda. Sin
embar go, si se f or ma H 2 S es que exist e en la capa pr of unda
una condicin cida, aun cuando no se obser ve, y debe ser
r egist r ada como t al.
Es esencial que se int er pr et e la f er ment acin al t r mino de
18 24 hor as de incubacin, ya que una int er pr et acin
pr emat ur a o demor ada dar f or mas de f er ment acin no
vlidas que llevar n a er r or es en el agr upamient o del gner o
o especie.
108
$"
Repor t e de r esult ados
1. K / A (Fer ment acin de glucosa solament e)
2. A / A (Fer ment acin de glucosa y lact osa)
3. K / K (No f er ment acin de glucosa y lact osa).
Los r esult ados se escr iben siempr e siguiendo un pat r n.
Pr imer o la r eaccin del pico de f laut a seguida por la r eaccin
de la capa pr of unda, separ adas por una bar r a.
$"
Reacciones de TSI
Pico de f laut a alcalino / prof undidad alcalina (K/ K). No
f er ment acin de hidr at os de car bono. Car act er st ico de
bact er ias no f er ment ador as como Pseudomonas aer uginosa.
Pico de f laut a alcalino / prof undidad cida (K/ A). Glucosa
f er ment ada, lact osa no f er ment ada. Car act er st ico de
bact er ias no f er ment ador as de lact osa como especies de
Shigella.
Pico de f laut a alcalino / prof undidad cida (negra)
(K/ A/ H 2 S). Glucosa f er ment ada, lact osa no f er ment ada;
pr oduccin de H 2 S. Car act er st ico de bact er ias no
f er ment ador as de lact osa y pr oduct or as de H 2 S como:
Salmonella, Ar izona, Cit r obact er y algunas especies de
Pr ot eus.
109
No fermentador
No fermentacin
pH = 7.4
Aminas
Pptidos
O2
No fermentador de lactosa
Dextrosa
cidos mixtos
Dextrosa
cidos mixtos
Aminas
Aminas
Pptidos
Pptidos
O2
O2
O2
Aminas
Pptidos
$"
Aplicaciones
Est e t ipo de pr uebas se ut ilizan pr incipalment e par a la
ident if icacin pr imar ia de los miembr os de las
Ent er obact er ias.
110
Especie
bact eriana
Ent erobact er
Haf nia
Klebsiella
E. coli
Shigella
Salmonella
t yphi
S. parat yphi
S.
choleraesuis
Ot ras
Salmonellas
Cit robact er
Edwarsiella
Serrat ia
Prot eus
vulgaris
P. mirabilis
P. morganii
P. ret t geri
Providencia
A
K
A
A
K
K
K
A
A
A
A
A
++
+
++
+
-
K
K
A
A
+
+
+++
K
K
K
K
A
A
A
A
+
+
+
+++
+++
+++
K
K
K
K
A
A
A
A
111
+ +++
+o -
$"
Fundament o
Mide la capacidad enzimt ica de un or ganismo par a
descar boxilar un aminocido (lisina y ar ginina) par a f or mar
una amina, con la consiguient e alcalinidad.
112
$"
Consist encia del medio
Slido en pico de f laut a
$"
Repor t e
r esult ados
$"
I noculacin
Por picadur a y est r a, inculo liviano.
$"
Condiciones de incubacin
Temper at ur a: 35 37 C
Tiempo: 18 24 hor as
113
de
A = cido
K = Alcalino
N = Neut r a
R = Roj o (desaminacin
oxidat iva)
$"
Result ados
K/K
K/K
H2S
H2S
K/A
K/A
GAS
GAS
MEDIO
MEDIO
NO INOCULADO
H2S
H2S
K/K
K/K
NO INOCULADO
$"
I nt er pr et acin
K/ K = azul de Pr usia / azul de Pr usia
Desaminacin oxidat iva / descar boxilacin
K/ A= azul de pr usia / lila
No desaminacin
Pr oduccin de H 2 S = Ennegr ecimient o del medio
Pr oduccin de gas = Bur buj as o levant amient o del
medio de cult ivo de las par edes del t ubo.
114
$"
Aplicaciones
Especie
bact eriana
Superf icie
inclinada
Fondo
Gas
H2S
E. coli
KoN
- o+
Shigella
Salmonella
t yphi
+o -
S. parat yphi
+o -
- o+
Ot ras
Salmonellas
KoN
Arizona
KoN
Cit robact er
- o+
+o -
Edwarsiella
- o+
Klebsiella
KoN
+o -
Ent erobact er
cloacae
+o -
E. aerogenes
KoN
E. haf niae
KoN
- o+
Prot eus
vulgaris
P. mirabilis
P. morgarnii
KoR
P. ret t geri
Providencia
115
13.
$"
Fundament o
El medio MI O se ut iliza par a la ident if icacin de
Ent er obact er ias sobr e la base de movilidad, la pr oduccin de
or nit ina descar boxilasa y de indol.
1. Descar boxilacin de or nit ina
2. Pr oduccin de indol
3. Movilidad
116
117
118
3. Movilidad
Det er mina si un or ganismo es mvil o inmvil. Las bact er ias
t ienen movilidad por medio de sus f lagelos, que se
encuent r an pr incipalment e ent r e los bacilos; sin embar go
algunas f or mas de cocos son inmviles.
Las bact er ias mviles pueden cont ener un solo f lagelo o
muchos; adems su localizacin var a con su especie
bact er iana y las condiciones de cult ivo. A veces, las
bact er ias con movilidad pr oducen var iant es no mviles que
par ecen ser est ables y r ar ament e se r evier t en en f or mas
mviles. Los or ganismos no mviles car ecen de f lagelos.
$"
Consist encia del medio
Semislido en f or ma ver t ical
$"
I noculacin
Por picadur a, en f or ma ver t ical
119
$"
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 48 hor as
Temper at ur a: 35 37 C
$"
React ivos adicionales
Prueba de indol
React ivo de Kovacs
Adicionar 5 got as y agit ar suavement e el t ubo
I nt er pr et ar inmediat ament e.
Conser vacin: Los r eact ivos deber n guar dar se en el
r ef r iger ador (4 C) mient r as no se usan su est abili dad es
var iable, por lo t ant o se har t odas las semanas un cont r ol
de calidad, desechndolos si muest r an una r eaccin dbil o
negat iva con un or ganismo posit ivo conocido.
120
$"
Result ados
ORNITINA POSITIVO
MOTILIDAD NEGATIVO
ORNITINA NEGATIVO
MOTILIDAD POSITIVO
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
MEDIO NO
INOCULADO
$"
I nt er pr et acin
1.
121
2.
I ndol
3.
Movilidad
122
$"
Repor t e de r esult ados
Prueba
Posit ivo
Negat ivo
Movilidad
I ndol
Ornit ina
+
-
+
-
+
-
$"
Aplicaciones
$"
Micr oor ganismos or nit ina posit ivos
Especies de Klebsiella
Ent er obact er aglomer ans
Pr ot eus vulgar is
Pr ot eus r et t ger i
Yer sinia pest is
Yer sinia pseudot uber culosis
123
Bact erias
Produccin
de indol
Movilidad
Produccin
de H 2 S
Salmonella
t yphi
+o -
Ot ras
Salmonellas
+o -
E. coli
+o -
+o -
Ent erobact er
Cit robact er
+o -
+o -
Klebsiella
Shigella
124
macr omolculas
(cpsulas,
125
127
PRODUCCI N DE ENERG A
Las clulas en cr ecimient o r equier en una pr ovisin const ant e
de ener ga met ablica, en una f or ma que pueda ser usada
par a la biosnt esis. El mundo micr obiano ha desar r ollado
modelos pr oduct or es de ener ga ext r aor dinar iament e
128
129
I . Gluclisis
Se r ef ier e a la degr adacin de la glucosa hast a pir uvat o. La
gluclisis puede ocur r ir en condiciones aer obias o anaer obias.
En aer obiosis gener alment e f unciona en conj unt o con el ciclo
de Kr ebs en el cual el pir uvat o se oxida hast a CO2 y agua. En
anaer obiosis el pir uvat o se lleva a la f er ment acin.
En la gluclisis ocur r en dos f osf or ilaciones a nivel del
sust r at o:
1) En el paso de 3-f osf oglicer at o a 2-f osf oglicer at o en
donde se sint et iza un ATP.
2) En el lt imo paso de la va, en la t r ansf or macin de
f osf oenilpir uvat o a pir uvat o, en donde se f or ma ot r o
ATP.
130
132
GLUCLI SI S
2 ADP
Glucosa
fosfoenolpiruvato
2 ATP
ADP
ATP
piruvato
H2O
2 2-fosfoglicerato
Glucosa-6-fosfato
2 3-fosfoglicerato
Fructosa-6-fosfato
ATP
2 ADP
ADP
2 ATP
2 1,3-bifosfoglicerato
Fructosa-1,6-bifosfato
2 NAD
2 PO4
3-fosfogliceraldehdo
Dihidroxiacetona fosfato
Esquema 1. Gluclisis
133
2 NADH
134
136
137
V A HEXOSA FOSFATO
Fructosa -5-P
Eritrosa -4-P
Fructosa -5-P
N ADPH
Sedoheptulosa -7-P
N ADP
Xilusa -5-P
Glucosa-6-fosfato
Gliceraldehdo -3-P
GL UC OL I S I S
Glucosa
5-P-gluconato
N ADPH
138
Gliceraaldehdo
Ribulosa-5-P
-3-P
CO2
Ribosa -5-p
N ADP
CI CLO DE KREBS
Es el pr oceso de la r espir acin mediant e el cual, las clulas
aer bicas obt ienen ener ga a par t ir de la oxidacin de las
molculas combust ibles por el oxgeno molecular .
El ciclo de los cidos t r icar boxlicos es una secuencia de
r eacciones que t iene ef ect o en los or ganismos aer bicos.
Est a cat alizada por un sist ema mult ienzimt ico que acept a el
gr upo acet ilo del acet il CoA como combust ible degr adndolo
hast a CO2 y H +. Est os lt imos son conduct or es a t r avs de
una secuencia de pr ot enas t r anspor t ador as de elect r ones
hast a el oxgeno molecular , que se r educe par a f or mar agua.
El pir uvat o ocupa una posicin clave en las dif er ent es r ut as
de degr adacin de car bohidr at os, es el pr incipal pr oduct o de
la gluclisis y puede suf r ir una gr an var iedad de
t r ansf or maciones, dependiendo de s el or ganismo se
encuent r a en un ambient e aer obio o anaer bico:
1. En aer obiosis el pir uvat o pasa al ciclo de Kr ebs.
2. En anaer obiosis puede ser t r ansf or mado en alcoholes o
cidos.
Mediant e la descar boxilacin del cido pir vico se f or man
compuest os con dos t omos de car bono que se unen a
cont inuacin con la molcula acept or a adecuada (cido
oxalact ico) y ent r ar a f or mar par t e del ciclo de los cidos
t r icar boxilicos (TCC) y mediant e una ser ie de r eacciones
139
NAD
CoA
Piruvato
CoA
CO2
Acetil CoA
oxalacetato
citrato
NADH
NAD
malato
isocitrato
NAD
H2O
CO2
NADH
fumarato
Alf a-cetoglutarato
FADH2
NAD
FAD
NADH
succinato
CO2
CoA
Succinil CoA
141
CoA
GTP
GDP
FERMENTACI ONES
En sent ido est r ict o se designan f er ment aciones aquellos
pr ocesos de consecucin de ener ga en los que el hidr geno
pasa f inalment e a un acept or or gnico de elect r ones. El
oxgeno no int er viene en los pr ocesos f er ment at ivos.
El t r mino f er ment acin hace r ef er encia al met abolismo
anaer obio de los hidr at os de car bono.
En la f er ment acin el acept or de elect r ones es un compuest o
or gnico, mient r as que en la r espir acin suele ser el oxigeno
(r espir acin aer obia).
Cier t o nmer o de f er ment aciones est n basadas en la va
glucolt ica (Embden Meyer hof ). Est a va gener a ATP dos
veces: pr imer ament e a t r avs de la oxidacin del
glicer aldehido-3-f osf at o y de nuevo a t r avs de la
conver sin del f osf oenolpir uvat o.
142
143
C6 H 12 O6
144
2 C6 H 12 O6 + H 2 O
CH 3 -CH 2 OH + CH 3 -COOH
+
2CO2 + 2 C3 H 8 O3
145
147
CH 4 + 2 H 2 O
NH 2 OH
HIDROXILAMINA
NO3
NO2
NITRATO
NITRITO
NH 3
AMONIACO
NO
XIDO DE
NITRGENO
N 2O
XIDO
NITRSO
150
N2
NITRGENO
REDUCCI N DE SULFATOS
Var ios Compuest os inor gnicos de azuf r e son acept or es de
elect r ones en la r espir acin anaer bica.
El sulf at o la f or ma ms oxidada del azuf r e, es uno de los
aniones pr incipales en el agua de mar y se ut iliza por las
bact er ias r educt or as de sulf at o.
El pr oduct o f inal de la r educcin del sulf at o es el sulf it o, un
impor t ant e pr oduct o nat ur al que par t icipa en muchos
pr ocesos bioqumicos.
La mayor a de las plant as y los micr oor ganismos ut ilizan el
sulf at o como f uent e de azuf r e y obt ienen el sulf ur o
necesar io par a la snt esis de los aminocidos sulf ur ados por
r educcin asimilat or ia de sulf at o. Como pr oduct o secundar io
de est a r educcin
del sulf at o apar ece el sulf ur o de
hidr geno:
8 H + + SO4
H 2 S + 2 H 2 O + 2 OH
151
152
ENTEROBACTERI AS
Las ent er obact er ias ms impor t ant es se incluyen en la
f amilia Ent er obact er iaceae, la cual est const it uida por
bacilos Gr am negat ivos. Hay especies mviles e inmviles.
Todas f er ment an glucosa con pr oduccin de cido y gas,
r educen los nit r at os a nit r it os y dan r esult ado negat ivo en la
pr ueba de indof enol oxidasa. Est a f amilia compr ende
bact er ias pat genas y no pat genas. Conviene r ecalcar que
las car act er st icas de pat ogenicidad r elat iva en las
ent er obact er ias en su hbit at nat ur al, que es el t r act o
gast r oint est inal, se modif ican r adicalment e cuando est as
bact er ias alcanzan una localizacin ext r a int est inal, en sit ios
como el t r act o genit our inar io, lquido cef alor r aqudeo,
t or r ent e sanguneo, mdula sea o la cavidad per it oneal.
En vist a de lo ant er ior , es posible aislar y cult ivar miembr os
de la f amilia Ent er obact er iaceae t ant o a par t ir de muest r as
f ecales y pr oduct os que pudier on haber suf r ido una
cont aminacin f ecal como el agua, aliment os, ut ensilios, et c.
153
BACTERIA
O XIDASA
I NDO L
VP
RM
CI TRATO
E. Coli
Shige lla
Sa lm onella
Arizona
--
Citr oba ct er
Kle bsiella
Serra t ia
Pr ot e us
v ulgar is
Pr ov ide ncia
154
ARGINI
NA
DESC.
COPROCULTI VO
En cualquier caso, es impor t ant e cont ar con pr ocedimient os
de labor at or io bien cont r olados que per mit an det ect ar la
pr esencia de agent es pat genos o bien dar alguna
inf or macin sobr e alt er aciones en el equilibr io de la f or ma
nor mal.
El esquema que se pr opone en st e at las par a aislamient o e
ident if icacin de ent er obact er ias pat genas f igur a ent r e
numer osas var iant es de t r abaj o ut ilizadas por dif er ent es
aut or es. Se consider a que est e esquema es uno de los ms
usuales y que puede dar r esult ados consist ent es y
sat isf act or ios.
COPROCULTIVO
MEDI OS
PARA AI SLAMI ENTO
Agar ent rico Hektoen
Agar de eosina y azul de met ileno
Agar ENDO
Agar XLD
Agar Salmonella Shi gella
Agar verde brillant e
AISLAMIENTO
ENRIQUECIMIENTO
PLACAS: Agar S-S,
ver de brillante, sulfito de
bismuto.
TUBOS: Caldo
tetrationato y/o
caldo s elenit o
Agar sangre
INCUBACIN
24 h 37 C
PLACA: Agar EMB
ENDO, XLD, Mac
Conkey
IDENTIFICACIN
BIOQUMICA
TSI, MIO, LI A, SIM,
fenilalanina,
RMVP,Citrato de
Simmons , urea
Esquema 4. Coprocultivo
155
PLACAS: Agar
ver de brillante,s ulfito
de
bismuto, XLD,EMB,
ENDO, Mac
Conkey.
EMB o XLD
Sulfito de bismuto
Caldo de selenito
Sulfito de
Colonia negra
Salmonella
Salmonella
t yphi
156
XLD, VB
Colonia lactosa
(-) =
FAMI LI A MI CROCOCACEAE
Racimos
irregulares
Tt radas
Cpsula
Movilidad
Crecimient o Gf urazolidona
Ferment acin
de glucosa
Oxidasa
No
desar r olla
de
Glicina
de
ppt ido- glicana
cidos
t eicoicos
en
pared celular
Resist encia
lisost af ina
157
ESTAFI LOCOCOS
El est af ilococo es un micr oor ganismo poco exigent e y de
f cil desar r ollo. En los medios no select ivos sus colonias son
gr andes, opacas, lisas, cir cular es y ent er as. A veces pueden
pr esent ar bor des liger ament e ondulados, color acin amar illa
o blanca.
En agar sangr e las colonias t ienen los car act er es
ant er ior ment e mencionados y pueden adems pr esent ar
hemlisis. La mayor par t e de las cepas vir ulent as son
hemolt icas,
f er ment an
manit ol,
r esist en
alt as
concent r aciones de clor ur o de sodio y gener alment e
pr oducen pigment o dor ado, aunque ot r as cepas vir ulent as son
blancas car ecen de pigment o.
La mej or pr ueba de vir ulencia es la f acult ad que t iene de
coagular el plasma (est af ilococos coagulasa posit ivos).
MEDI OS
PARA AI SLAMI ENTO
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
Ti ncin de Gram
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
158
3. Froti s
4. Prue ba s bioqumica s
Coagulasa
Catalasa
Fermentacin de
manitol
Susceptibilidad a
novobicina
PRUEBA
Pigment o colonial
Coagulasa
Fact or de agr egacin
Nucleasa t er moest able
Fosf at asa alcalina
Or nit ina descar boxilasa
Ur easa
Bet a-galact osidasa
Pr oduccin de acet ona
Resist encia a novobiocina
Resist encia a polimixina
Tr ehalosa
Manit ol
Manosa
Xilosa
Celulosa
Malt osa
Sacar osa
S. aur eus
S. epider midis
10-90% cepas +
+
+
+
+
10-90% cepas +
+
+
+
+
+
+
+
+
10-90% cepas +
+
+
+
+
+
+
+
+
10-90% cepas +
+
+
+
+
+
159
ESTREPTOCOCOS
160
Especie
Suscept ibilidad Suscept ibilidad Hidrlisis Hidrlisis Crecimient o Crecimient o CAMP Fenmeno
bacit racina
opt oquina
hiprat o esculina en bilis
en
NaCl
sat elit ismo
6. 5%
S
R
R
R
+
-
Ent erococos
No
ent erococos
S. viridans
S.
pneumoniae
161
UROCULTI VO
El ur ocult ivo debe hacer se cuando hay signos o snt omas de
inf eccin ur inar ia, insuf iciencia r enal o hiper t ensin.
Llevndolo a cabo siempr e en per sonas en que se sospecha
inf eccin sist mica o que pr esent en f iebr e de or igen
desconocido.
Las inf ecciones agudas o cr nicas pueden af ect ar en f or ma
ascendent e desde la ur et r a hast a los r iones,
especialment e cuando se t r at a de una invasin por la f lor a
nor mal del t r act o genit our inar io que al act uar sobr e el
mismo pr ovoca una accin pat ognica impor t ant e.
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre
Agar EMB
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar Biggy
PARA IDENTIFICACIN
TSI, Caldo rojo de fenol
Urea, SIM, MIO, LIA, Citrato
de simmons
PARA SENSIBILIDAD A
ANTIBITICOS
Agar de Mueller Hinton
Agra soya tripticasena
Orina
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIN
Tincin de Gram
Agar sangre,
identificacin de:
Estafilococos
Estreptococos
Neumococos
Observacin de
hemlisis
Agar EMB
Identificacin de:
Enterobacterias
Pseudomonas
Salmonella y
Shigella
Esquema 7. Urocultivo
162
HEMOCULTI VO
163
Agar S-110
Medio de transporte Stuart
Agar BIGGY
Tincin de Gram
Hemoltico grupo A
Disco de bacitracina
Agar sangre
Streptococcus
Neumococos
Agra eosina y
azul de metileno
Enterobacterias
Staphylococcus
aureus y otros
Micrococos
Catalasa y coagulasa
Candida albicans
Tubos germinales y
clamidiosporas
164
Disco de optoquina
Solubilidad de bilis
BI BLI O GRA F A
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