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Laboratorio de Biotecnologa

Prctica N 1
Extraccin de ADN a partir de tejido vegetal (arveja)
Aguirre C. Marlon, Gaez A. Camilo
Universidad de Antioquia, Facultad de Qumica Farmacutica
Medelln, Antioquia, Colombia
2013

Resumen
La presente prctica se realiza con el fin de conocer los procedimientos
necesarios para la extraccin de ADN, identificar la presencia de algunos
metabolitos secundarios y como interfieren stos en el aislamiento, obtener la
mayor cantidad posible de ADN con un alto grado pureza.
Para el desarrollo de la prctica se utiliz material vegetal (Arveja), el inicio del
proceso se dio con la destruccin de la pared celular, posteriormente la
liberacin del ADN se dio por medio de cloroformo y la precipitacin se dio en
un medio alcohlico para finalmente lograr la extraccin del ADN. La tcnica
utilizada para la verificacin de obtencin del ADN fue la espectroscopia
ultravioleta.
Palabras claves: ADN, extraccin.

1. Introduccin
El ADN es la sustancia qumica
responsable de la transmisin de la
informacin hereditaria de todos los
organismos celulares y casi todos
los virus. Este lleva la informacin
necesaria para dirigir la sntesis de
protenas y la replicacin.
El ADN es una molcula cargada
que est asociada a protenas y en
el
caso
de
los
organismos
eucariotas est encerrado dentro de
un ncleo. Para extraer el ADN
primero es necesario romper las
clulas y luego se necesita separar
el
ADN
del
resto
de
los
componentes
celulares
como
protenas y membranas lipdicas.
Un detergente es una solucin
capaz de disolver las membranas y
as permitir que stas se separen
del resto de los componentes.
2. Objetivos
Extraer ADN de un tejido vegetal

Comprender los procedimientos


necesarios para extraer ADN de
buena calidad y alta pureza.

Obtener la mayor cantidad de


ADN de alto peso molecular, libre
de protenas, carbohidratos y
otros inhibidores de enzimas.

3.
Materiales,
equipos
y
reactivos
Material vegetal (arveja)
Mortero
Tubos de ensayo con tapa
Centrifuga
Solucin buffer 1
Solucin buffer 2
Micropipeta
Cloroformo:alcohol isoamlico
24:1
Isopropanol
Etanol 70%
Solucin tris-EDTA

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Espectrofotmetro

4. Parte experimental
Procedimiento:
1. se quito la primera capa de la
arveja, se macero y luego se
peso 70 g de muestra.
2. Se agreg 1 mL de buffer 1 y
se agit
3. Se centrifug a 12000 rpm/5
min., en fro a 5C
4. Se descart el sobrenadante
5. Se
suspendi
el
slido
agregando 500L del buffer 2
6. Se incub a 60C por 15
minutos
7. Se adicion 500 L de
cloroformo: alcohol isoamlico
24:1
8. Se agito manualmente por 5
minutos.
9. Se centrifug a 12000 rpm/5
min.
10.Se transfiere la fase acuosa
que contiene el ADN a otro
tubo
11.Se
agreg
1
mL
de
Isopropanol (-20 C)
12.Se centrifug a 12000 rpm/5
min
13.Se decant el Isopropanol y al
precipitado se le adicion 500
L de Etanol al 70%
14.Se centrifug a 12000 rpm/5
min
15.Se elimin el sobrenadante y
el precipitado se resuspendi
en 1 ml de Tris EDTA y se
agit.
16.Se finaliz el proceso con la
lectura
en
el
espectrofotmetro a 260 nm
para el ADN y a 280 para
protenas.
5. Resultados y anlisis de
resultados:
De
la
lectura
en
el
espectrofotmetro del extracto de
ADN, a dos longitudes de onda 260

y 280 nm, se obtuvieron


siguientes resultados:
Muestr
a ADN

260
nm

280
nm

Grupo
1
Grupo
2
Grupo
3
Grupo
4

0.85
9
0,84
1
0,84
8
0,85
8

0.73
6
0,67
8
0,73
0
0,73
3

los

ADN/Pr
ot
(260/2
80)
1,17
1,24
1,16
1,17

Para todos los grupos ADN/protena


fue menor a 1,8 indicando que hubo
contaminacin del extracto con
protenas, es decir, que el proceso
no fue satisfactorio.
Concentracin ADN (g/mL)=
(Abs260 x FD x 50)
% extraccin ADN=
(concentracin (g/mL) x solvente
(mL) x 100) / (g muestra)
Muestra
ADN
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo

1
2
3
4

Concentrac
in
(g/mL)
42,95
42,05
42,4
42,9

%
extracci
n ADN
61,35
60,07
60,57
61,28

Durante la extraccin de ADN se


mejoro el proceso de separacin por
centrifugacin,
aumentando
a
12000 rpm es posible disminuir el
tiempo de espera a 5 min, lo que se
convierte en una ventaja debido a la
extensin de la prctica
Cuando se procede a hacerse la
separacin de protenas del ADN
utilizando el cloroformo, debido a la
falta de repeticiones en el lavado, la
interface entre el ADN y el

Laboratorio de Biotecnologa

cloroformo
es
muy
grande,
dificultando
la
separacin
por
vertido, se utilizo entonces la pipeta
pero aun as las prdidas por
faltante o por contaminacin eran
inminentes.
La razn por la cual se hace la
lectura de las protenas a 280 nm es
porque presentan un pico de
absorbancia a esta longitud de onda
debido
a
que
ellas
tienen
aminocidos aromticos como la
tirosina, triptfano y fenilalanina.
Los porcentajes de extraccin de
ADN se mantuvieron alrededor de
El cociente entre la absorbancia del
ADN y la absorbancia de las
protenas para los cuatro grupos
estuvo entre 1,16 y 1,24 lo que nos
indica
una
contaminacin
por
protenas.
Se
esperaba
cumplir
satisfactoriamente el objetivo de la
extraccin y separacin de ADN de
tejido vegetal, y aunque no se logr
extraer con alto grado de pureza, se
aprendi la tcnica de manera
adecuada, lo cual nos servir para
una futura extraccin que solo
necesitara un poco mas de prctica
y experiencia para dar resultados
positivos.

60,81%, este valor se podra


mejorar si se aplican correctivos en
el procedimiento como el aumento
de lavados y una mejor separacin
de las fases acuosa y orgnica, as
como una mejor desnaturalizacin
de protenas.

7. Conclusiones:
Para una mejor extraccin de ADN
de
alto
peso
molecular
es
indispensable que la inhibicin de
nucleasas sea muy efectiva.

Se identificaron los posibles errores


en el desarrollo de la prctica, lo
que a futuro permitir corregir y no
cometer el mismo error.
8. Bibliografa:
Protocols for Nucleic Acid Analysis
by Nonradioactive Probes. Isaac,
Peter G. Humana Press inc. 1994.Vol
28.
Manual
de
laboratorio
biotecnologa
prctica No
extraccin de AND.

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