De la Gendmica a la Protedmica Juan Jose Cazzulo Isto de Fwestgeciones Bitecnoligas Dr. Rod Ugalds- sto Tecnoldgo da Cnasco mis (BANTEOH, UNSAN-CONCED, 1. El Genoma y la gendmica. El término “genoma” fue introducido por el botdnico aleman Hans Winkler en 1920, a partir de las palabras ‘GENes" y ‘eromosOMts" (1), y puede detnrse en censecuencia como e! juego ‘completo de crorrosomas y Sus genes en una espacie biolbgia determinada, \Wihelm Johanssen introdujo en 1911 las conceptes de “genctipo" y “fenotipo". EI genotipo Cconsiste en la informacion hereditaia completa de Un individo, se exprese 0 No en un momen: to dado. Puede considerérselo como el plano maestro 0 juego de instrucciones. para constr yy mantener funcional a una criatura vviente. El fenctipo, en cambio, es la manifestacion visible del genotipo; son las propiedades observables de la oélula U organism, coma su marioiogi, ‘su desarrollo, su compportamionto.€] fenotipo depende no sélo del genatipo, sino, aunque en menor medida, de la interaccién del erganismio con su ambiente. Dos organismos que diieran ain en un solo locus {posicién en el genoma) tienen distintos genotipos, aunque eventuaiment pueden tener fenotipos incistinguibles.Inversamente, das indviduos con idéntico genatipo (por «ejemplo, los hemanos gemelas) pusden tener diferencias menores en su fenotipo. La “genémica’ (genomics, en Ingiés) es o! estuxio de los genomas completos de los cfferentes Corganismas, y consiste en la determinacion de la secuencia completa de su ADN y la ubicacsén, de los genes secuenciados en los dferentes cromosomas, El estucio intensivo de un tnioo gen, ¥ Sus) productofs) no entra en esta deficin de genémrica, La secuenciacién completa de un ‘genoa impica el conocimiento completo del genctipo del ncividuo del cual se exrajo el ADN. La ‘secuenciacién de los genomas se hizo posible con laintroduccién dels métodos de secuencia- organela; fa velocidad de sintesis y desradaci6n, do las cuales dependerla conoeniracion de la proteina en un momento determinado; la especiicidad de sexo, en los organismos que lo pre sent; la presencia durante ol desarrolo emiionaro, el period post-natal y/o el envejecrmienton (1), Es evidente entonoas que la diucdacién completa del proteoma da un organismo es ura ferea mucho més complejay ifcl que a Glucidecion de su genome, El desarrollo Fistérico da las matodologias apicables a lo qua ahora lamamos protaémica (4) 98 inicié en 1964, con la introduccidn de la “disc electrophoresis" en geles de poliacrlamida por L Onstein y B.J. Davis. En 1970 Laemml intockio el uso del dodecisufato de socio (SDS) para separar las proteines en funcidn de su peso molecular (SDS-PAGE). A mediados de Ia década de 1970 varios autores, entre ellos J. Kose y PH. O Farrel, nttoduieron la electoforesis bicimensional (2D-PAGE}, combinando el isoelectroenfocado (EF} con la SDS-PAGE; OFarell ud detectar con esta técnica, usando las protenas totales dle Escherichia coli marcadas ra- pemeetria 011 | Baegenndloactvernente, 1100 manchas en un crico gol de 20-PAGE, de las cuales akedodtor de 400 ‘eron detectadas tambien por tncién con Coomassie BL. En 1982 Noman y Leigh Anderson gresertaron un plan para catalogar todas las proteas producidas en el cuerpo human, al ue llamaxon "The Hurian Protein index’, La introduccién de la espectrometia de masa para la identiicacién de las proteinas separadas en los geles 2D dié un enorme impulso a esios est dios. La Humen Proteome Organization (HUPO, httpy/mwhupo org fue fundada en Febrero de 2001 y e! "Hurran Proteome Project, cisefiado a partir de 2008, tiene un Grupo de Tareas establecido desde principios de 2010. Para comprender la complejdad del estudio del proteoma, hay algunas preguntas fundamen- tales que debernos contestar, 8. ZEI nmero de proteinas que produce un organismo es igual al numero de genes?. La respuesta intntva es que asi daberia ser, y de hecho la tecxa orignal de George Brace y ward Tatum en 1941 se basaba en el postlado ‘un gen, una ena’, luego exerci “un gen, una proteina’, y finalmente, al abservarse la existencia de proteinas heterooligoméricas, 4 “un gen, un polipéptido". Sin embargo, la respuesta es claramente negativa. Los organismos pluiceldares en general son capaces de product un nimero de protanas aorecablemente ‘superior al nmero de sus genes. Hay dos razones principales para este aparente contrasentido. La gran mayoria de los genes de organisrnos eucariéticos tienen en su Secuencia zonas que se expresan, a trevés del ARN, en la protena codiicada, y se denominan ‘exores’, y oFas zonas que se eliminan durante el procesamiento del pre-ARNM para llegar al ARNm macduro, no codifican en consecuencia residuos de aminodcides presentes en la proteina expresada, y se derominen rirenes*. Ahora bien, hay numerosos genes, sobre todo en los eucarotas superio- res, que constan de un némero considerable de intones y exones. En tales cas0s,frecuents- mente existe lo que se denomina, empleando el término inglés, et corte y empalme ("splicing") ateratio, que mpica que, durante la maduracion del ARN, se pueden generar dferentes combinaciones de exones (2). Un ejemplo de esta situacién es el gen Unico que codifica a los dos kinindgenos humanos, el de alto peso molecular y el de bajo peso molecular, cuya diferen- cia esta dada por la expresién o no dé un largo exén en le zona C-terminal de la proteina. Pero sl ertecortad attematvo na 6 la (rca razen de la discrepancia numérica; muchas proiahas corttonen residues de arinoicidos que no son iris alos codticados en su gen estructural, nant aon — Pests sm val =o oe — a eee ALE 17 Peot.27—Prot.2"" Prot.3? Prot. 3°” Manual de Proteémica 11debido a qus han stirido modticaciones quimicas covalontes después dela vaduccién a rivel de los rlsosomas. Se conocen mas de 200 madficactones post-racucconales covsertes, que en general son esenciaes para la funcionaldad de una determinada protena. Mas ain, nume- 1082s protenas requieren, después de terinada la trad.ccin, un procesarianto proteoiioo parcial, que require proteesas altamente especticas. Un ejemplo son las protenes que deben seguir a va secretoia, todas las cues requiren la presencia de un “pSpido sera” en su ex- ‘remo N-terminal, el cuales remavido proteolicamenta al ingresar la proteina naciente al amen del reticulo endoplésmico. Este procesado es absolutarente esenca: se ha comprobado por experimentos de mutagénesis sio-aigda que ateandd el so de chu de a protefna nacien- te, lamisma permenece unida a la membrana del rticuo y no sigue la va oral, perdiendo en Consecuencia su funcicnaldad. Lo que necesita la 0Stia es la protna ‘madura’, es decir bien sintetzada y plegada, con las modicaciones post-raduccionales yo procesadh protealico co- rrecto, lovaizada en ol compartimento sub-celular comecto, para que sea funcional El resutado de los cversos procesos que hemos descito os que se estima que la maytxia do os genes en un organismo superior pueden dar origen a ses o mas protenas dfeentes Fg. 1). Si considera- mas un nero de 20 a 25,000 genes en e genoma humana, es atarrente posible que las fxO- teas que nuestro organism es capaz de product sean mas de 150,000, talvez muchas més. 4, 4Una célula produce en todo momento todas las proteinas que seria capaz de producir? Nuevamente, la respuesta a esta pregunta es negativa, En primer término, cada oélua Sard ‘capaz de producr sdlo ciertas proteinas y otras no, debido a las modficaciones en la cromatna, especticas para cada tino celular, que llevan ala flta de transcripcién de un nimero grande de genes. En segundo término, el proteoma tiane un cardcter cinémico, lo que impica que est fen continuo cambio ajusténdose a las necesidades de la célula en ese momento y en esas. Condiciones ambientales. El proteoma determinado para una oélula en una dada condicion ‘expatimental podemos considerario como una fotogratia que nos muestra la situacién en ese "momento, y que sera diferente en algunos aspectos de otra tomada bajo ciferentes condiciones: expetimentales, Un ejemplo clfsico y muy claro es la induccién y represién de envirnas en las bbacterias, Escherichia col es capaz de producr todas las erzimas necesarias para la sintesis de los 20 aminacides proteices, y lo hace cuando crece en un medio smple, con glucosa como fuente carbonada. Sin embargo, si se le suministra en el medio de cultvo uno o més aminoéc- dos, répidamente la bacteria reprimira la sintesis de las enzimas que evan a la produccién de ‘e800 e808 aminodcidos, y los tomard del medio. Es obvio que si determindramos el proteoa de E. coll crecida en uno u otro mecko de cuttvo, encontraremnos ciferencias, debidas ala pre- ssencia o ausencia de una serie de proteinas enzimaticas. Por certo, este fendmeno no es priva- tivo de los procariotas; todas nuestras oélulas deben ajustar la expresién de muchas proteinas, fen relacién con las variaciones del medio y con los estimuios de diferentes clases que reciben. 5, {Basta la integridad del gen estructural de una proteina para su correcta expresion y funcionalidad? Nuevamente, la respuesta es no. Por cierto, si el gen estructural que codifica a la proteina esta ‘mutado, de tal manera que la mutacién, por ejemplo la de residuos cataltcos en una engima, impde su funci6n, la proteina mutant no seré funcional, Pero la intagridad y comecta funcicn 01) DeeSenmicaa la Proteémicade otros genes es esencial para que la proteina en cuestién sea completamente funcional. Es rnecesaria la integridad de los genes que Coufican a las proteinas responsables de las modtica- clones post-traduccionales necesarias; a las proteinasas espectioas responsable del proce- ssado proteoltico; a las. proteinasas que ntervienen en su degradacién, y por lo tanto regulan, tanto como la sintess, el nivel de una protena en un determinado momento; a las protanas requeridas para el transporte y la localzacién de la protaina en cuestion en el compartimento subdoolular corecto; a los factores de transcripcion requerids para la exoreston de la protena: @ proteinas requlatorias que deben nteractuar con la proteina en cuestin pare que sea funcional a pxcteinas involucradas en la metlacion del ADNy en la estuctura de la cromiatina. Inluso, se requiere la integridad de secuencias requatoias en el ADN, como las secuertias potenciado- ras (enhancers) (Fig. 2). Mutaciones en genes como los antes mencionados que no anuien la actividad de la protsina que codfcan, pero inroduzcan cambios, pueden levar a cambios en la ‘concentracisn celular y a iferencias on propiedades de a proteina en cuestion. Esto ha levado ‘a Kose (1) a concluir que las proteinas tienen un carécter polgérico, en el sentido de que su. rivel cea y funcionaiided no depende exclusivamente del gen estructural 6. Los desafios de la protedmica. Ketimnan y col. (5} han calculado que un lnfocito humano podria contener en cualquier momento ‘akededor de 40,000 moéculas de ARNm, parteneciantes a 5,000 espacias diferentes, 4,000, de elas presents en bajo rivel, las Cuales codticarian aeededor de 1,000,000,000 ds moécu- las de proteina. De estas proteinas las 100 mas abundantes representarén un 90 % de la masa total proteica de la cfu, y las otras 4,200 especies moleculares proteicas el 10 % restart, E) rango de abundancia de las protainas celares es de alrededor de 10,000,000; una protein del citoesqueleto como la actina estaré presente con una abundancia 10 milones de veces mayor que Una proteina regulatoria, Estas oiftas, aunque sean una estimacién grosera, nos dan una primera idea de las Gficultadas con que se enienta la protaémica; las protsinas mas ‘abundantes tenderén a obiterer completamente a las de menor abundancia, y su deteccién requerré enfoques experimentales especiales, como por ejemplo la previa puricacién de la organela que contiene a las proteinas rrinoritarias, Esto es particularmente evidente cuando se Utiiza una de las técnicas mas empleadas en proteémica, la 20-PAGE, pues la carga proteica en el gel es limited y las proteinas mas abundantes darén manchas tan exterssas que Cubtirén completamente a las minortatia. Fame Gen estar Cemrationsenmsermeiin | magus: crm set S| tani er em ten stn ngtivin "| “Goat ei em |_—— ranean pat ‘tome nomen nie ‘ont pase Sr secre mpucanendaon | geen a Cemeen’) ————__, |, geet Manual de Proteémica 13Las dificutades quedan muy evidentes cuando se comparan en una serie de aspactos las pro- teinas con los cides nucleocs. Ya dimos que el nimera de proteinas en una eélula dada es cconsiderablemente mayor que el nero de sus genes al mens, de los que se expresan en ‘80 too celular. Ademnds, como indicaron claramente Hochstrassery Col. (6), la heterogeneidad de las protenas es mucho mayor que la de los écidos nucteicos. La suma de las masas de los residuos de arinodcides que componen a la proteina, su naturaleza y su secuencia, van a de- terminar sus propiedades: a) la masa dla proteina, que puede vari entre unos pooos miles y varios milones de Daltons, y no puede ser inferida de la Secuencia de! gen que la coaica, por la posible presencia de modiicaciones post-traduocionales y/o prooesamiento proteoliico. b) su carga total a diferentes valores de pH, y su punto isoeléctrico (ol), depencientes de la abundan- Cia telava de grupos Acidos y bésicos; en tanto que los acidos nucleicos presentan un rango estrecho de valores de pi en la zona dda, las proteinas presentan valores de pl entre menos de 3 y més de 12, con dos zonas de mayor abundancia, una alrededor de pH 5.5 y la otra ‘alrededor de 8.6. c) su hidrofobicidad, que dependeré de la abundancia relatva de residuos de aminodcides con cadenas laterales hidrof6bicas; en tanto que los dcidos nucteioos son muy solubles en agua, muchas proteins son muy hidrotbbicas @ insolubles en agua, pudiendose caicular que alrededor de un 15 % de fas proteinas de una cdiula eucariética no entrarén en un {gel de 2D-PAGE debido a su gran hidrofobicidad. Por todo esto, el andliss en gran escala de ln amplo rango de proteinas requiere una cuidadosa planifcacion experimental y la aplicacién de miitiples tecnologias, que incluyen, utiizadas en paralelo o secuencialmente, centrifugacién diterencial diversos métodos cromatogrétioos, como cromatogratia de atinidad, de intercambio lonico y en fase reversa; etectroforesis capiiar, y electroforesis en gel (mona o bidimensional), terminando siempre en la identficacién de las proteinas 0 los péptidos obtenidos de elas por hidrSlisis parcial, por alguna de las diferentes formas de espectromettia de masa. 7. Diferentes enfoques en los estudios protedmicos. Sibbien jos métodos a anlcary as dficutades exparimentales serén simlares en todos los casos, €l enfoque de un estudio protedmico puede variar considerablemente. Puede ir desde intentar identitear el prateca completo de una célula, en diversas crcunstancas de su vida, un objetivo de méxima y muy dificutoso, hasta obtener informacion mucho mas restigcla, pero mas fact ble, por ejemplo determinar el proteoma de una determinada organela previamente purfcada, o hacer une protedmica cierencial. Esta uma consist’ en la comparaciin del proteoma de una ‘misma célula sometida o no a un determinado estimulo, buscando identficar las proteinas que <2 ‘@xpresan 0 no, 0 en una cantidad muy diferente, en un estado u otto de la célula. En organismos Lnicelulres con ciclos de vida complejos, €s muy importante determiner el proteoma diferencia de los distintos estadios de ese ciclo; es decir, Identicar a las proteinas que se expresan dejan de expresarse, 0 lo hacen con diferencias cuanttatvas muy marcadas, en el proceso de diferenciacién de un estadio al siguiente. Otra variente de la proteémica diferencial puede ser fa bbisqueda de factores de viulencia, a través de estudios proteémicos comparados de un orga- rismo patégeno y una mutants eviulenta det mismo, Otro enfogue diectament relacionado con la protesimica consiste en la lammada genérica estructural, que busca deterrinar la estructura tridimensional de cada protsina codlicada por Un determinado genoa, usando una estrategia mia, experimental (cristalogratia de rayos X; resonancia magnética nuclear, AMIN) y de modelado computecional. Dado que la estuctura ft estrechamente igada ala funcin de la prteina, y el plegamiento esté mas conservado ue a secuencia, este enfoque podria permit ofentarse hacia la funcién, algo muy importante en el caso de las muchas protenas hpolsicas anotadas como tales en los diferentes geno- Dela Genera a 01] epcteemica‘mas. El enfoque experimental de la genémica estructural tne los problemas generates de la castalogratia, la obtenciin de cristal dela proteina que dfracten satisfactoriamente y permitan, ‘lcarzar una resolucién adecuada, preferentemente de 2A 0 mencr, y de la RMN, el tamafio de la molécua en estudio. Para ell, las protenas recombinartes deben obtenerse como proteinas solubles, puras y en cantidad sufciente, Todo esto limita este enfoque, pero no le {uita vale yen los casos exitosos aporta infomacion muy importante. Se han creado organ zaciones destinadas a llevar adelante ambiciosos proyectos de gentmica estructural, om0 la Protein Stuctural native (PS) de los Natonal Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos de Norteamérica fitp/w.rigms.nin.gov/pst), que ha obenido, desde suiniciacién en 2000 hasta Noviembre de 2013, las estructuras de mas de 6,300 proteinas. E} National institute of General Medical Sciences’ (NIGMS) ha anunciado que no planes continuar PSI despues de completa la PSLBoiogy phase en 2015, Como ejempio de un organismo espectico, el Myo- bacterium tuberculoss, ol TB Structural Genomics Consortium, que agrupa investigadores de varios paises, ha aportado ya (a Noviembre de 2013) 199 nuevas estructuras proteicas de este ppatogeno, sobre 1349 estructura fotles, alas cuales se puede acceder desde su pagina web (nitovvaw.nebib.ora/Sructures/ 8. Hacia una biologia de sistemas. 1 conocimiento del genoma completo de un organism, y an el del proteoma completo que es ccapaz de product, no nos da aiin una idea completa de la oda 0 del organismo en cusstién, Esté muy caro actualmente que, si bien las proteinas llevan a cabo, drecta o indirectamente, todas las funciones esenciales de una oélula, no actan indlidualmente. Lo hacen interac tuando con otras moléculas, proteicas 0 de otra composicién quimica, y esas interacciones ‘son esenciales para su funcién. El conjunto completo de interacciones entre las moléculas {ve constituyen una célula se ha defnido como el interactome’,térino acuriado por Bemara Jaca (7). Aparte de las nteracciones entre molécuas de dversa composicion qumica, desde e! punto de vista de la proteémica nos interesan pariicularmerte las interacciones enire proteinas {@linteractoma de proteinas), y tambien entre protenas y ADN fla red de interacciones entre factores de trancripcién y otras proteinas caoaces de interaccionar con el AD, y los genes, e! inferactoma proteina ADN). EI conjunto de los ARNm celulares se ha descripto como el "trans- ctiptoma’. Mas ain, la interaccién de los diversos compenentes macromolecuieres lleva en general a la produccién, modifieacién o utizacién de los distintos metaboltos presentes en la Célula en un momento dado; el conjunto de metabotios se ha defnido como el ‘metaboloma’, Fone r Genigien |r Prgesnin Modelado | BIOLOGIA DE SISTEMAS Manual de Proteémica 15Estos, y otros nuevos conceptos han dado crigen, del rismo modo que de gencma y proteo- ma s@ derivaron las dlsciplinas de genémica y protedmica, a transeriptérica, metabolémica, licémica {estudio del complemento de carbohidratos de la céia, ipidémica (similar para los lipidos}, etc. Todas estas discipinas y los resultados obtenidos a través de ellas conluyen, junto Ccon la Bioinforatica y otras ciencias, en lo que se denomina actualmente Biologia de Sistemas, (@) Fig. 9). Puede considerarse su precursor a Ludwig von Bartalanfy, que a part de la déoadia de 1940 dasarilé la tecria general de sistemas, La Biologia de Sistemas es, por lo tanto, un ‘estudio interciscipinario centrado en la Biologia, que intenta estudiar todas las nteracciones entre los componentes de un sistema bioligico, y comprender cémo esas interacciones dan, ‘ofigen al funcionamianto y comportarianto del sistema. Sus proponentes consideran que ‘esié basada en un concept diferente al seguido generalmente en Ciencia, al que consideran “reduccioniste’, por tratarse del andlisis de los cormponentes individuales de un sistema para ‘ratar de comprenderio, Su propussta seria, en cambio, “holstca’, tratando de comprender el “todo"aue constitye el sisterna, y que, por las interacciones entre las pertes, es mayor que ‘su simple suma. Obviamente, el conocimiento de los partes es fundarnental para comprender €l sistema en su conjunto, y aso hace a las diversas "émicas” herramientas esenciales para Biologia de Sistemas, 6 conocimiento de los Componentes, sus propiedades e nteracciones llevaré al desarollo de modelos que permiten predecir el comportamiento de los sistemas y ‘sus respuestas a las veriaciones dal ambiente, y tandré aplicaciones en diversos campos dal cconacimianto biol6gico y mécico. REFERENCIAS. 1. Klose J. Genotypes and phenotypes. Becrocharesis 1899:20, 649-52, 2.StryorL, Berg JM, Tymoczko J, Bioquimica. 5 ed. Barcelona: Eris Rewer, S.A, 2008. 8. Wikns MR, From presto proleomes: amascale prctan ident by tao-cmensoralelbctrophaests and ‘arin and raha. Bey Technoingy 006: 14, 61 5 4. Klose J, From 2-D electopresis to proteorics, Becrophcresis. 2009; 30, S142-43, 5. Ketiman JR, Coleclough C, Fey JA, Letkovits I. Clralpotserics: One gone —famiy of profes. Potsorics| 2002: 2, 624-8, 6. 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