Biologia Molecular Ciencias Biomedicas

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS
PROGRAMA DE BIOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS
BIOLOGA MOLECULAR
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

COMPILADORES:
Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega
Colaboradores:
Revisado por: Academia de Biologia 2011
Ciudad Jurez, Chihuahua

Universidad Autnoma de Ciudad Jurez
2011
p. 69
M. en C. Emilio Clarke Crespo

Coordinador de la Academia de Biologa
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biologa
Dr. Alejandro Martnez Martnez

Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas
M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomdicas
Aprobados por la Academia de Biologa, 2011
I NTRODUCCIN
La Biologa Molecular es una ciencia cuyo objetivo
fundamental es la comprensin de todos aquellos procesos
celulares, que contribuyen a que la informacin gentica se
transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en
los nuevos individuos.
Este conocimiento ha rebasado barreras naturales entre
especies y instalar genes de cualquier organismo, en un
organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de
herramientas genticas. Una de las consecuencias importantes
derivadas, fue la produccin de fragmentos de cidos
nuclecos a gran escala, abriendo las
puertas a la
secuenciacin de los cidos nuclecos, y por ende a nuevas
disciplinas como el diagnstico molecular, la terapia gnica o
la obtencin de organismos superiores recombinantes.
Cronolgicamente todos estos eventos inician en el ao 1866
cuando Mendel publica sus experimentos conducentes a los
principios de segregacin y clasificacin independiente de los
genes. En 1953 se marca la pauta que dio origen a la
revolucin gentica con la publicacin de Watson y Crick en
la cual describen la estructura del DNA como una doble hlice
complementaria que recuerda la estructura de una escalera
de caracol. A partir de entonces y de manera exponencial, se
ha llegado hasta la secuenciacin de los genomas y los
procesos de clonacin y mutagnesis.
El presente manual tiene como finalidad la transportacin al
maravilloso estudio de las macromolculas y su integracin
como herramientas moleculares para el estudio y
caracterizacin de estas. Es solo el inicio de un largo camino
por andar, esperando sea de inters para ustedes.
T ABLADE C ONTENIDO
Practica No. 1 ........................................................................................................ 4
Preparacin de soluciones de concentracin definida y soluciones
amortiguadoras ..................................................................................................... 4
Practica No. 2 ........................................................................................................ 9
Determinacin de protenas por la tcnica de Bradford .............................. 9
Practica No. 3 ...................................................................................................... 13
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida desnaturalizantes SDS-PAGE .... 13
Practica No. 4 ...................................................................................................... 20
Tincin de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue ............................. 20
Practica No. 5 ...................................................................................................... 22
Extraccin de DNA utilizando DNAZOL............................................................ 22
Practica No. 6 ...................................................................................................... 25
Extraccin de DNA utilizando Fenol Cloroformo Alcohol isoamlico .......... 25
Practica No. 7 ...................................................................................................... 28
Extraccin de RNA .............................................................................................. 28
Practica No. 8 ...................................................................................................... 31
Cuantificacin de RNA y DNA .......................................................................... 31
Practica No. 9 ...................................................................................................... 33
Electroforesis de DNA en geles de agarosa ................................................... 33
Practica No.10 ..................................................................................................... 35
Electroforesis de RNA en geles de agarosa-formaldehido .......................... 35
Practica No. 11 .................................................................................................... 38
Sntesis de cDNA .................................................................................................. 38
Practica No. 12 .................................................................................................... 41
Reaccin en cadena de la Polimerasa .......................................................... 41
Practica No. 13 .................................................................................................... 44
ManualdePrcticasdeLaboratorio
BiologaMolecular
Dra.FlorindaJimnezVega
Pag.2

Aislamiento de un fragmento de DNA a partir de un soporte solido ......... 44
Practica No. 14 .................................................................................................... 47
Ligacin de productos de PCR a un vector de clonacin .......................... 47
Practica No. 15 .................................................................................................... 50
Preparacin de clulas qumicamente competentes ................................. 50
Practica No. 16 ................................................................................................... 53
Transformacin bacteriana en E. coli .............................................................. 53
Practica No. 17 .................................................................................................... 57
Anlisis de colonias recombinantes por PCR ................................................. 57
Practica No. 18 .................................................................................................... 60
Aislamiento de DNA plasmdico ....................................................................... 60
Practica No. 19 .................................................................................................... 63
Digestin de DNA plasmdico con endonucleasas de restriccin ............. 63
Practica No. 20 .................................................................................................... 67
Introduccin a la Bioinformtica ...................................................................... 67
BiologaMolecular
Pag.3
P RACTICA N O . 1
P REPARACINDESOLUCIONESDE
CONCENTRACIN DEFINIDA Y
SOLUCIONESAMORTIGUADORAS
OBJETIVO
Que el
estudiante aprenda a preparar disoluciones en
concentraciones definidas en porciento, normalidad, molalidad
y molaridad.
INTRODUCCIN
La composicin de una solucin se debe medir en trminos de
volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la
cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de
disolvente, es decir su concentracin. Durante cualquier trabajo
experimental, el uso de soluciones se hace indispensable, por lo
que es necesario conocer los procedimientos para su
elaboracin. En la presente prctica se realizarn soluciones
utilizando como concentracin la molaridad, la normalidad y
las relaciones porcentuales.
La molalidad se define como el nmero de moles de soluto
disueltos en 1 kg de disolvente, esto es:
M =[( numero de moles de soluto )/( peso del disolvente en kg) ]
La unidad de porcentaje peso tiene la ventaja de que no se
necesita conocer la masa molar del soluto. Adems, el
porcentaje peso de una solucin es independiente a la
BiologaMolecular
Pag.4

temperatura, ya que se define en trminos de pesos, el termino
de fraccin molar no se emplea normalmente para expresar la
concentracin de soluciones. Sin embargo es de utilidad para
calcular las presiones parciales de los gases y en el estudio de
concentracin que se emplean con frecuencia, la ventaja del
empleo de la molaridad es que por lo general resulta ms
sencillo medir el volumen de una solucin utilizando matraces
volumtricos calibrados con precisin, que pesar al disolvente.
Su principal inconveniente es que depende de la temperatura,
ya que el volumen de una solucin suele aumentar con el
incremento de la temperatura. Otro inconveniente es que la
molaridad no especifica la cantidad de disolvente presente.
Por otra parte, la molalidad es independiente de la
temperatura, ya que se define como una relacin del nmero
de moles de soluto y el peso del disolvente. Por esta razn, la
molalidad es la unidad de concentracin de empleo
preferente en los estudios que involucran cambios de
temperatura, al igual que en aquellos de las propiedades
negativas de las soluciones.
Por su parte la Normalidad se define como el nmero de
equivalentes qumicos de sustancia disuelta por litro de
solucin.
# de equivalentes = peso molecular del soluto
As tambin dentro de las concentraciones porcentuales, el
%peso se define como el peso del componente entre el peso
de la solucin por 100 y el % mol es el numero de moles de
cada uno de los componentes entre el nmero total de moles
de solucin por 100.
MATERIALES
Cloruro de Sodio
Hidrxido de Sodio
cido clorhdrico
BiologaMolecular
Pag.5

Fosfato de Sodio
Probeta, pipetas, Balanza, Papel encerado, placa de
agitacin, magnetos, matraces volumtricos y vasos de
precipitado.
PROCEDIMIENTO
I. Disoluciones de concentracin en peso
Preparacin de 50 mL de una solucin de NaCl al 0.9% (p/v)
1. Pesar NaCl en la balanza
2. Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. 30 mL)
3. Colocar la disolucin de NaCl en un matraz volumtrico de
50 mL y aforar con agua destilada.
Preparacin de 50 mL de una disolucin de alcohol etlico al 70% (v/v)
1. Con base a la concentracin del alcohol etlico comercial
determinar el volumen necesario para tener 35 mL de alcohol
etlico.
2. Medir el alcohol en una probeta
3. Colocar el alcohol etlico en un matraz volumtrico de 50 mL
y aforar con agua destilada.
II. Disoluciones de concentracin molar

Preparacin de 200 mL una disolucin de NaOH 1 M
1. Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar
200 mL de NaOH 1M.
2. Pese el NaOH requerido y colocarlo en un vaso de
precipitado de 500 mL para su disolucin con agua destilada
(aprox. 150 mL).
3. Colocar la disolucin en un matraz volumtrico de 200 mL y
aforar con agua destilada.
BiologaMolecular
Pag.6

Nota: Los cidos y los lcalis son agentes corrosivos. Extreme
precauciones para su manejo, evite todo el contacto con la
piel y ojos.
Preparacin de 100 mL de una disolucin de NaOH 25 mM a partir de

la disolucin de NaOH 1M
Aplicar la frmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M
necesarios para preparar 100 mL de una disolucin de NaOH 25
mM
V1= (C2 x V2)/ C1
Donde: C1= Concentracin inicial

V1= Volumen inicial
C2= Concentracin final
V2= Volumen final
Medir el volumen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos

en un matraz volumtrico de 100 mL y aforar con agua
destilada.
III. Disoluciones de Concentracin Normal

Preparacin de HCL 1N
1. Conocer la concentracin del HCL concentrado comercial.
2. Calcular la cantidad de HCL conc. requerido para preparar 50 mL
de HCl 1N.
3. Colocar el agua destilada (aprox. 30 mL) en un vaso de precipitado.
4. Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado
requerido.
a. Nota: Siempre se agrega el cido al agua nunca el agua al cido.
5. Agitar en la placa de agitacin
6. Colocar la disolucin en un matraz volumtrico de 50 mL y aforar
con agua destilada.
BiologaMolecular
Pag.7
TEMASADEMOSTRAR
Clculos estequiomtricos
RESULTADOS
Desarrollar los clculos que realizaron para preparar las
soluciones.
Concluya la importancia de los diferentes procesos para
preparar soluciones.
BiologaMolecular
Pag.8
P RACTICA N O . 2
D ETERMINACINDE P ROTENAS
PORLA T CNICADE B RADFORD
OBJETIVO
Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de

elaborar una curva de calibracin para cuantificar la
concentracin de una protena.
INTRODUCCIN
Las molculas proteicas se organizan de manera caracterstica
en distintos niveles. El nivel primario es la secuencia de
aminocidos, dictada por el gen. Esta secuencia a su vez
determina el plegamiento local (estructura secundaria, el
plegamiento global (estructura terciaria) y la organizacin en
estructuras de mltiples subunidades (estructura cuaternaria).
Para la cuantificacin de estas molculas existen diversos
mtodos los cuales se basan en a) la propiedad intrnseca de
las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin
de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las
protenas de unir ciertos colorantes.
Dentro de la unin a colorantes especficos la cuantificacin
proteica por Bradford se basa en la unin del Coomassie Brillant
Blue G-250 a molculas de protena en pH cido produciendo
un cambio de color de rojo-caf a azul, que presenta un
mximo de absorbancia a 595 nm.
La interaccin del Coomassie se ha demostrado con residuos
de arginina y muy levemente con cistena, lisina, tirosina,
triptfano y residuos de fenilalanina. Debido a que la respuesta
BiologaMolecular
Pag.9

de color no es lineal en un amplio intervalo de concentracin,
es recomendable correr una curva estndar.
MATERIALES
Reactivo de Bradford
Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol
por agitacin con un magneto, cuando este perfectamente
disuelto adicionar 100 mL de ac.fosfrico 85% y aforar a un 1Lt
CUIDADO!!! (cido + agua)
Filtrar con papel (Listo para ser empleado).
Almacenar a temperatura ambiente.
Agua
Albmina
Celdas para luz visible
PROCEDIMIENTO
Elaboracin de curva patrn
1. A partir de una alcuota de protena de aproximadamente 4
mg/mL (C1), realizar las diluciones necesarias para tener
alcuotas de 500 uL con las siguientes concentraciones (0.05,
0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL)
Conc. mg/mL
C2
L apartir de L de agua
la alcuota de
4mg/mL
C1
V1
Volumen final
500 L
V2
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
BiologaMolecular
Pag.10
2. Para la cuantificacin, se realizara, cada determinacin por

duplicado.
3. Marcar para cada concentracin 2 tubos
Adicionar 100 L de la protena de cada una de las
concentraciones conocidas
4. Incluir un par de tubos sin muestra, intercambiar por agua
(ser el control)
5. Adicionar 1 mL de reactivo
6. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente
7. Determinar absorbancia a 595 nm
Informacin Adicional
Verificar
que
el
material
empleado
se
encuentre
perfectamente limpio ya que concentraciones muy bajas de
detergentes pueden interferir en la reaccin.
Sustancias compatibles
(NH4)2SO4, Etanol
con
Bradford
NaCl,
MgCl,
KCl,
Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M, Ac. Actico, 2Mercaptoetanol 1 M, Sacarosa 1 M, Glicerol 99 %, EDTA 0.1 M,
Triton X-100 0.1 %, SDS 1 %, Hemosol 0.1 %
TEMASADEMOSTRAR
Caracterizacin de macromolculas
RESULTADOS
Graficar la concentracin de protena (mg/mL) en el eje X y
lectura de absorbancia (595nm) eje Y.
Utilizando el programa Excel, realizar una regresin lineal de los
datos y determinar la curva estndar para cuantificar.
BiologaMolecular
Pag.11
BiologaMolecular
Pag.12
P RACTICA N O . 3
E LECTROFORESISEN G ELESDE
P OLIACRILAMIDA
DESNATURALIZANTES SDS
PAGE
OBJETIVO
Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis.
INTRODUCCIN
La electroforesis es una tcnica para la separacin de
molculas (protenas o cidos nuclecos) segn la movilidad de
estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la
cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga
elctrica, dependiendo de la tcnica que se use. Los cidos
nuclecos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los
dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan
con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas
negativas de una manera dependiente del peso molecular.
Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida
(fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de
molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y
debern ir pasando por la malla, por la que las pequeas se
movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas
avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de
partida.
Por lo general para caracterizar la molcula se determina la
velocidad a la que esta se mueve en un campo elctrico y se
utiliza para determinar el peso molecular en el caso de
BiologaMolecular
Pag.13

protenas o para detectar cambios de aminocidos y separar
cuantitativamente distintas especies moleculares.
MATERIALES
Soluciones proteicas
Marcadores de peso molecular
Fuente de poder
Cmara de electroforesis
Puntas de micropipeta
Papel absorbente
Soluc. Azul de Coomasie (tincin) (tabla anexa)
Soluc. PAGE-SDS (Tabla anexa)
PROCEDIMIENTO
Preparacin del gel de corrimiento (10%)
1. La preparacin del gel de separacin se efecta de acuerdo
a la tabla anexa
2. Una vez polimerizado en el portagel, lavarlo y eliminar el
exceso de agua usando tiras de papel Whatman.
3. Preparar el gel de concentracin (stacking gel) de acuerdo a
la tabla anexa.
4. Una vez llena la cmara, colocar el peine evitando la
formacin de burbujas.
5. Una vez polimerizado el gel, lavarlo con agua destilada y
llenarlo con buffer de corrimiento (running buffer).
BiologaMolecular
Pag.14

6. Resuspender la buffer muestra en proporcin 1:4 (si es
necesario agregar ms azul de bromofenol y glicerol).
7. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los
carriles correspondientes.
8. Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la
muestra al gel de separacin, una vez dentro, cambiar a 100120 V (2 h) y vigilar que las muestras no salgan del gel.
9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel.
10. Teir el gel utilizando Coomassie Blue, de acuerdo al
protocolo anexo.
11. Calcular el peso molecular de las protenas problema.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
1. Determinacin de la aparente masa molecular de las
protenas
2. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido
3. Mida la distancia del origen a cada uno de los estndares de
peso molecular
4. Mida la distancia de la protena desconocida (X)
5. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total, b /
total
6. Ejemplo a = 0.5cm, total = 4.9cm. 0.5/4.9 = 0.1
7. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estndar
BiologaMolecular
Pag.15

8. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de
los estndares
9. Localizar la movilidad relativa de la protena de la protena
desconocida, extrapolando el log PM correspondiente y
calcular el antiligaritmo.
LOG
MW
MOVILIDAD
BiologaMolecular
Pag.16
ANEXO
Preparacin del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles
de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli)
A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C)
Acrilamida
146.0 g
NN Bismetilenacrilamida
4.0 g
500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4C en la

obscuridad. Vida media 30 das.
B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

Tris base
54.45 g
Agua destilada
150 mL
Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua

destilada. Almacenar a 4 C
C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

Tris base
6.0 g
Agua destilada
60 mL
Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua

destilada y almacenar a 4C.
D) 10% (w/v) SDS

Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y
aforar a 100 mL
E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio
BiologaMolecular
Pag.17

100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua
destilada, preparar en el momento.
F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de

SDS, pH 8.3
Tris base
Glicina
SDS
45.0 g
216 .0 g
15.0 g
No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo

condiciones nativas (PAGE).
Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con acido o
base. Almacenar a 4C. Calentar a 37C antes de usar en caso
de precipitacin.
G) Buffer muestra
Agua destilada
4.4 mL
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
1.0 mL
Glicerol
0.8 mL
10 % SDS
1.6 mL
0.5 (w/v) azul de bromofenol en

agua
0.2 mL
Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer.

*Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantes y reductoras,
se deber adicionar 0.4 mL al buffer muestra de betamercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habr que
calentar las muestras a 95 C por 4 min.
*Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS,
BiologaMolecular
Pag.18

H) Preparacin de PAGE-SDS 10%
Volmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel
BioRad MR
Gel Separador (Separating) (10 mL)
Agua destilada
4.0 mL
2.5 mL
Acrilamida
3.3 mL
10 % SDS
0.1 mL
Persulfato de amonio 10%
0.1 mL
Temed
0.004 mL
Gel Concentrador (Stacking) (4mL)
Agua destilada
2.7 mL
0.5 mL
Acrilamida
0.67 mL
10 % SDS
0.04 mL
Persulfato de amonio
0.10 mL
Temed
0.004 mL
BiologaMolecular
Pag.19
P RACTICA N O . 4
T INCINDE G ELESDE
P OLIACRILAMIDAPOR
C OOMASSIE B LUE
OBJETIVO
El alumno evaluara el proceso para la deteccin de protenas

en gel.
INTRODUCCIN
Las protenas que se han separado en un gel de poliacrilamida
(o otros soportes) pueden ser detectadas por diferentes
mtodos, entre los que destacan los colorantes y la tincin con
plata.
La tincin de azul de coomassie permite detectar hasta o.2 a
0.6 g de protena y es cuantitativo (lineal) hasta 15 a 20 g. Se
utilizan principalmente solventes como metano y cido actico
para fijar las protenas.
Dentro de las diversidad de tcnicas que existen podemos
mencionar tambin la tincin con Plata que aunque es ms
sensible el proceso suele ser ms tardado y ms caro.
El uso de la tincin por Comassie tiene dentro de sus bondades
bajo costo y rapidez.
MATERIALES
Coomassie Blue-R250 al 0.1%
Disolver 0.1 g en solucin de desteido, dejar a temperatura
ambiente hasta el siguiente da, agregar el agua. Filtrar siempre
antes de su uso.
BiologaMolecular
Pag.20

Solucin A Solucin de fijado / desteido (Metanol 50%, Ac.
Actico 10%)
Recipientes plsticos o de vidrio
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir el gel por 10 minutos en solucin A.
2.
Teir con la solucin de Coomassie.
3.
Desteir con la solucin A hasta que se observen las

bandas.
4.
Enjuagar con agua destilada.
5.
Documente su gel fotograficamente
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Determine la pureza de sus muestras, as como el tamao de las
bandas proteicas obtenidas
Defina otras metodologas para tinciones electroforticas
mencionando el rango de sensibilidad as como bondades y
deficiencias en comparacin a la tincin con azul de comassie.
BiologaMolecular
Pag.21
P RACTICA N O . 5
E XTRACCINDE DNA
UTILIZANDO DNAZOL
OBJETIVO
extraer DNA, partiendo de tejido de tipo animal o vegetal, a
travs de esta prctica el alumno pondr en prctica los
conocimientos adquiridos en clase para el manejo y
almacenamiento del DNA.
INTRODUCCIN
La doble cadena de DNA est compuesta de potenciales
grupos reactivos que estn arreglados dentro de una hlice
central unida a travs de enlaces de puente de hidrgeno.
Estas pares de bases estn protegidas por azucares y fosfatos
los cuales estn unidos internamente por fuerzas superiores.
A pesar de su estabilidad qumica el DNA es fsicamente frgil,
para su extraccin a travs de clulas o tejidos es necesaria
Proteinasa K en presencia de EDTA y una solubilizacin de
membranas y desnaturalizacin de protenas con un
detergente como SDS. Los cidos nucleicos pueden ser
purificados a travs de extracciones con solventes orgnicos y
ser aplicados a una infinidad de tcnicas desde anlisis de
southern blot, como templado en reacciones en cadena de la
polimerasa y construccin de libreras genmicas entre otros.
MATERIALES
Material Biolgico
BiologaMolecular
Pag.22

DNAzol
Puntas, micropipetas, microtubos
PROCEDIMIENTO
1. Lisis celular adicionar 0.75-1mL de DNAzol
Clulas crecidas en monocapa 10cm 2 de cultivo
Suspensin celular 1-3 x 10 7
Tejidos 25-50 mg
2. Mezclar por homogenizacin, si se trata de tejidos, habr que
fragmentar en porciones pequeas, previo a la
homogenizacin.
3. Sedimentar el homogenizado por centrifugacin por 10 min a
10 000 x g a una temp. ambiente o 4 C. Transferir la fase
sobrenadante a un tubo nuevo.
4. Precipitacin.- Precipitar el DNA por adicin de 0.5 mL de
Etanol al 100% por mL de DNAzol. Mezclar por inversin y
mantener a temperatura ambiente por 1-3 min. El DNA
puede ser visible como una nube precipitante. Si es
probable, enroscar las hebras de DNA con la ayuda de la
punta de una pipeta (Si es que es visible) y transferir a un
tubo nuevo. Si tenemos pequeas cantidades, centrifugar a
4000 x g por 1-2 min a temp. ambiente o 4 C y retirar el
sobrenadante.
5. Lavado del DNA.- Lavar el DNA precipitado 2 veces con 0.81.0 mL de etanol al 75% por inversin del tubo 3-6 veces.
Mantener los tubos en posicin vertical por 1-2 min para
sedimentar el DNA y remover el etanol por pipeteo o
decantacin.
6. Resuspender el DNA en un pequeo volumen de agua
destilada.
7. Evaluar calidad y concentracin
BiologaMolecular
Pag.23

8. Almacenar el DNA a -20 C hasta su cuantificacin y
corrimiento electrofortico.
TEMASADEMOSTRAR
Caracterizacin de los cidos nuclecos
RESULTADOS
Determine como puede interferir la presencia de protenas en
la muestra.
Investigue en caso de tener protenas en la muestra de DNA
que proceso utilizara para poder purificarla?
Que caractersticas le da
absorbancia 260/280 = 1.9?
BiologaMolecular
si
obtiene
una
relacin
de
Pag.24
P RACTICA N O . 6
E XTRACCINDE DNA
UTILIZANDO F ENOL
C LOROFORMO A LCOHOL
ISOAMILICO
OBJETIVO
Evaluar el aislamiento de DNA a partir de extracciones con
solventes.
INTRODUCCIN
El DNA puede ser aislado de diferentes formas dependiendo si
es cromosomal o extracromosomal, para su purificacin se
requiere de debilitar la pared bacteriana por congelacin y
descongelacin o por tratamiento con lizosima y agentes
quelantes como EDTA.
La lisis celular tanto de procariotes como eucariotes, se realiza
con la adicin de detergentes, como el dodecil sulfato de
sodio (SDS). Despus de la lisis se degrada el RNA y las protenas
con ribonucleasa pancreatca y proteasa. Las protenas se
extraen con solventes orgnicos como fenol, debido a que este
solvente permite su desnaturalizacin y su concentracin en la
fase orgnica, en tanto que el DNA es recuperado de la fase
acuosa y precipitado con etanol.
MATERIALES
Material Biolgico
BiologaMolecular
Pag.25

Buffer de Lisis ( Tris 0.1M pH 8.0, EDTA 0.1M, NaCl 0.15 M, 2% mercaptoetanol, 4% L-Sarkosil)
Proteasa (10 mg/mL)
RNAsa (10mg/mL)
Fenol cloroformo alcohol isoamilico 24:25:1
Acetato de sodio 3M pH 5.4
Etanol absoluto
Etanol al 70%
Agua destilada estril
TE pH 8.0
PROCEDIMIENTO
1. Colocar una muestra de tejido finamente cortado
aproximadamente 10 mg de tejido en tubos eppendorf de
1.5 mL
2. Adicionar 500 L de Bufer de lisis y 3 L de proteinasa
3. Incubar durante 1 hr a 37C. Vortex cada 30 min
4. Adicionar 3 L de proteinasa e Incubar durante 1 hr a 37C.
Vortex cada 30 min
5. Adicionar 500 L de Fenol Cloroformo Alcohol Isoamilico
25:24:1
6. Mezclar por inversin
7. Centrifugar a 14 rpm durante 10 min a 4C
8. Colectar el sobrenadante y colocarlo em um tubo
eppendorf nuevo
9. Adicionar 2 volmenes de etanol absoluto previamente
enfriado a -20C.
BiologaMolecular
Pag.26

10. Mezclar por inversin, adicionar 1/10 del volumen de
acetato de sodio 3M
11. Incubar a -20 C durante 10 min.
12. Centrifugar a 14 000 rpm durante 20 min a 4C
13. Decantar el sobrenadante
14. Lavar el pellet con 250 L de alcohol al 70 % previamente
enfriado a -20
15. Dejar secar por inversin
16. Resuspender el pellet en 50 L de agua estril o buffer TE
TEMASADEMOSTRAR
Caracterizacin de cidos nuclecos
RESULTADOS
BiologaMolecular
Pag.27
P RACTICA N O . 7
E XTRACCINDE RNA
OBJETIVO

extraer RNA de tejido, y pondr en prctica los conocimientos
adquiridos en clase para su manejo y almacenamiento.
INTRODUCCIN
Una tpica clula de mamferos contiene aproximadamente 10
-5 g de RNA, 80-85% del cual es ribosomal. El remanente 1520% consiste de RNAs de bajo peso molecular (RNAs de
transferencia y pequeo nuclear). Estos RNAs abundantes han
sido determinados en tamao y secuencia, y pueden ser
aislados por electroforesis, centrifugacin a travs de
gradientes de densidad, o cromatografa de intercambio
inico.
En contraste con el RNA mensajero, el cual se
encuentra entre el 1 al 5 % del total del RNA celular.
La clave para poder extraer un RNA intacto es dada a travs
de la inactivacin del RNAsa, muchos mtodos, utilizan para la
purificacin fuertes agentes desnaturalizantes como tiocionato
de guanidina para disruptar las clulas,
solubilizar sus
componentes y desnaturalizar simultneamente RNAsas
endgenas.
La tcnica ms utilizada fue descrita por Chomczynski and
Sacchi en 1987, en la cual el tiocianato de guanidina es
extrado utilizando solventes como fenol cloroformo. Lo cual
genera una segunda fase orgnica en la cual el DNA y las
protenas son extrados liberando en RNA en la fase
sobrenadante. El RNA puede ser precipitado utilizando
BiologaMolecular
Pag.28

Isopropanol y purificado por cromatografa o utilizado como tal
para anlisis de hibridacin tipo Northen Blot, transcripcin
reversa o transcripcin reversa-PCR
MATERIALES
Tejido fresco
Estuche de diseccin, tubos eppendorf,
Trizol, Agua tratada con DEPC,
Homogenizadores
PROCEDIMIENTO
1. Cuidadosamente con ayuda de un equipo de diseccin,
extraer el tejido a utilizar no contaminar con otro tejido, y de
ser posible enjuagar con agua DEPC.
2. Fragmentar el tejido, pesar y colocar en un tubo
3. Mezclar 10 mg de tejido con 0.75 mL de trizol, homogenizar
la muestra e Incubar el homogenizado por 5 min a
temperatura ambiente (En este paso la muestra puede ser
almacenada a -80 C).
4. Adicionar 0.2 mL de cloroformo por cada 0.75 mL de Trizol,
mezclar vigorosamente con la mano por 15 seg e incubar a
temperatura ambiente por 2-15 min. Centrifugar la muestra
a no ms de 12,000 x g por 15 min a 4 C.
5. Transferir la fase acuosa a un tubo limpio, libre de RNAsas.
6. Precipitar el RNA por adicin de 0.5 mL de isopropanol por
cada 0.75 mL de Trizol, e incubar a 4 C por 10 min.
7. Centrifugar a no ms de 12,000 x g, por 10 min a 4 C. El RNA
precipitara formando una especie de gel, en la parte
inferior del tubo
8. Remover el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de EtOH
al 75%
BiologaMolecular
Pag.29

9. Centrifugar a no ms de 7500 x g por 5 min a 4 C
10. Secar el precipitado de RNA por 5 -10 min
11. Disolver el RNA en 50 L de agua libre de RNAsas, por
mezcla con la pipeta o incubando por 10 min a 55-60 C.
12. Almacenar el RNA a -80 C hasta su cuantificacin y
corrimiento electrofortico.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Determine la calidad y concentracin del cido nuclecos
Investigue que efecto tiene la solucin DEPC dentro del
proceso de aislamiento de RNA
Mencione que tipos de RNA existen en un tejido
BiologaMolecular
Pag.30
P RACTICA N O . 8
C UANTIFICACINDE RNA Y DNA
OBJETIVO
El alumno ser capaz de determinar la concentracin de DNA y
RNA por espectroscopia.
INTRODUCCIN
Medir la concentracin de cidos nucleicos de alto peso
molecular es difcil, cuando se trata realizar a travs de
mtodos estndares. Esto es debido a que la solucin de DNA
es usualmente viscosa, el problema se minimiza al realizar
diluciones de la muestra en buffer TE pH 8.0 y mezclando
vigorosamente. La absorbancia puede ser determinada a 260 y
280 nm.
Una solucin con una A260 de 1 contiene aproximadamente 50
g de DNA/mL en tanto que para DNA de simple cadena o
RNA A 260 equivale a un coeficiente de 38 g de RNA/mL.
MATERIALES
DNA, RNA
Buffer TE o agua
PROCEDIMIENTO
1. Colocar 1 L del cido nuclecos a cuantificar y diluir con 89
L de agua. Mezclar bien.
2. Ajustar a 0.0 la lectura del espectrofotmetro a 260 y 280 nm
con agua.
BiologaMolecular
Pag.31

3. Leer la absorbancia de la solucin a 260 y 280 nm.
4. Utilizar la relacin de 50 g/mL de DNA= 1 unidad de
absorbancia a 260 nm y calcular la concentracin y pureza
del DNA, en base a los principios estudiados en clase.
5. Utilizar la relacin de 40 g/mL de RNA= 1 unidad de
absorbancia a 260 nm y calcular la concentracin y pureza
del RNA, en base a los principios estudiados en clase.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Evalue los datos obtenidos y reporte
BiologaMolecular
Pag.32
P RACTICA N O . 9
E LECTROFORESISDE DNA EN
GELESDEAGAROSA
OBJETIVO
Analizar por electroforesis la calidad del DNA extrado.
INTRODUCCIN
Los cidos nuclecos pueden ser sujetos a tcnicas
electroforticas a travs de geles de agarosa que pueden ser
detectados por tincin y visualizacin por iluminacin con 300
nm de luz U.V. Los mtodos de tincin y visualizacin del DNA
ms utilizados son bromuro de etidio y SYBR Gold.
El bromuro de etidio fue sintetizado en los aos 50s en un
esfuerzo para desarrollar fenantridina como un efectivo agente
tipanocidal. Puede ser utilizado para la deteccin de cidos
nuclecos de simple y doble cadena.
MATERIALES
DNA
Buffer de corrida TAE Tris-Acetato EDTA (acetatos 0.04M, EDTA
0.01M, pH 8.0)
Agarosa
Buffer muestra
Estndares de Peso molecular 1 Kb ladder
Bromuro de etidio 1 mg/mL en agua
Cmara de electroforesis
BiologaMolecular
Pag.33

Transiluminador de UV
Cmara fotogrfica polaroid
PROCEDIMIENTO
1. Preparar una solucin de agarosa al 1% en buffer TAE.
Disolver por calentamiento cuidando que no ebulla
rpidamente y se derrame del matraz.
2. Una vez disuelta dejar que se enfri y vaciar en la placa de la
unidad de electroforesis. Esperar a que solidifique.
3. Colocar el gel en la unidad de electroforesis horizontal.
Agregar el buffer lentamente hasta cubrir el gel.
4. Cargar las muestras en los pozos del gel.
5. Conectar los electrodos a la fuente de poder.
6. Correr el gel en las condiciones indicadas; esto depende del
tamao del gel ya que alto voltaje puede ocasionar que la
agarosa se disuelva (en este caso 100 Volts constantes).
7. Fotografiar el gel utilizando pelcula instantnea y un
transiluminador de luz ultravioleta (usar lentes de seguridad).
8. Analizar los resultados del gel. Estime los tamaos de los
fragmentos de acuerdo a la migracin de los estndares y
las muestras.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
BiologaMolecular
Pag.34
P RACTICA N O .10
E LECTROFORESISDE RNA EN
GELESDEAGAROSA
FORMALDEHIDO
OBJETIVO
Determinar la calidad del RNA aislado anteriormente
INTRODUCCIN
Despus del aislamiento de la muestras de RNA, la calidad de
la preparacin aislada del RNA es evaluada por electroforesis
en gel de agarosa. Aunque los resultados son principalmente
cualitativos, se consigue informacin de la calidad del material.
Dicho anlisis deber de realizarse en condiciones
desnaturalizantes dado que el RNA tiende a formar
extensivamente estructuras secundarias, lo cual dificulta su
migracin.
Un RNA intacto en un gel desnaturalizante deber observarse
como un barrido donde encontraremos las bandas 28S y 18S
rRNA (en muestras eucariotas). La subunidad 28S rRNA puede
ser aproximadamente el doble de intensa que la 18S rRNA. Este
ratio 2:1 (28S:18S) es un indicativo que el RNA esta intacto.
MATERIALES
Buffer 10X MOPS/EDTA: MOPS 0.2 M, acetato de sodio 50 rnM,
EDTA 10
mM, pH 7.0 Yesterilizada en autoclave.
BiologaMolecular
Pag.35

Buffer muestra para RNA: 0.75 mI de formamida desionizada,
0.15 mI de MOPS lOX, 0.24 mI de forma1dehido,0.1 mI de agua
tratda con DEPC, 0.1 mI de glicerol, 0.08 mI de azul de
bromofenol al 10.% (p/v)
Agarosa
Estndares de tamaos conocidos
Cmara para electroforesis horizontal
Fuente de poder
Cmara fotogrfica polaroid
PROCEDIMIENTO
1. Preparar un gel al 1% de agarosa en buffer MOPS IX libre
deRNAsas. Para un volumen de 50 mI pesar 0.5 g de agarosa,
agregar 43.5 mI de agua tratada con DEPC y 5 mI de buffer
MOPS 10X en un matraz erlenmeyer libre de RNAsas.
2. Calentar en el microondas cuidando que no ebulla
rpidamente y se tire del matraz.
3. Enfriar la solucin hasta 55C y agregar 2.05 mI de
formaldehido al 37%, mezclar suavemente evitando la
formacin de burbujas y vaciar a la placa libre de RNAsas.
(Hacer este paso en la campana de humos, el formaldehido
es txico.
4. Esperar 1 h antes de usar el gel.
5. Preparacin de la muestra: Calcular el volumen necesario
para cargar 5-10 g de RNA en el gel. Aadir por lo menos 1
vol igual de buffer muestra. Lo ideal es tener 5 vol de buffer
muestra/vol de muestra. Calentar a 65C por 15 min y
colocar en el hielo.
6. Colocar buffer MOPS IX en la cmara de e1ectroforesis.El
nivel del buffer debe de cubrir ligeramente el gel.
BiologaMolecular
Pag.36

7. Agregar 1-5 l de la solucin de bromuro de etidio (1.0
mg/mL) a cada muestra y cargar la muestra en el gel. Nota:
antes de cargar las muestras, lave los pozos con el buffer de
corrida.
8. Conectar a la fuente de poder. Nota: Este tipo de
electroforesis genera mucho calor y afecta el buffer de
corrida ocasionando cambios de pH y por lo tanto
migraciones anmalas. Si va correr geles geles grandes, se
recomienda recircular el buffer y utilizar un sistema de
enfriamiento.
9. Correr la electroforesis en las condiciones adecuadas de
acuerdo al tamao del gel. Seguir la migracin del azul de
bromofenol hasta aproximadamente 75% del gel.
10. Visualizar las bandas con luz UV y tomar la fotografa.
11. Determinar los tamaos de las bandas ms abundantes.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
BiologaMolecular
Pag.37
P RACTICA N O . 11
S NTESISDEC DNA
OBJETIVO
Por medio de esta prctica el alumno ser capaz de sintetizar in
vitro DNA complementario a partir de RNA.
INTRODUCCIN
La mezcla de RNAmensajero o bien RNA total se utiliza como
molde para sintetizar una cadena de DNA complementario
mediante una polimerasa dependiente de RNA, la transcriptasa
inversa. Para la reaccin se necesita de un cebador y se
aprovecha la presencia de la cola de Poli A en el lado 3del
mRNA eucariotico.
Tras la sntesis del cDNA se desnaturaliza el hibrido. El extremo
3forma una horquilla que sirve como cebador para la sntesis
de la segunda cadena, lo cual en este caso pueda darse por
medio de un fragmento de Klenow como en la transcriptasa
inversa.
MATERIALES
RNA problema
Oligo dt 50 mM
dNTPs 10 mM
Buffer RT 10X
MgCl2 25 mM
DTT 0.1 M
RNAse OUT 40U
BiologaMolecular
Pag.38

RNAsa H
SuperScript 200U
Microtubos
Incubadora
PROCEDIMIENTO
1.
Mezlcar los siguientes componentes

RNA
5 g
Oligo (dt) 50 M
1l
dNTPs 10 mM
1 l
Llevar con agua DEPC a 10 l

2.-Incubar a 65C por 5 min, y mantener en hielo por 1 min
3.-Preparar la siguiente mezcla, adicionando los componentes
en el orden indicado.
10X RT Buffer
2 l
25 mM MgCl2
4 l
0.1 M DTT
2 l
RNAse out(40U /l)
1 l
Super Script III RT (200U/ l)
1 l
4.-Adicionar 10 l de la mezcla de cDNA sntesis al tubo de

reaccin mezclar suavemente y colectar por centrifugacin.
5.-Incubar a 50 C por 50 min.
6. Terminar la reaccin por incubacin a 85 C por 5 min, y
mantener en hielo.
7. Colectar la reaccin por centrifugacin. Adicionar 1 L de
RNAsa H a cada tubo e incubar por 20 min a 37 C.
8. La sntesis puede ser almacenada a -20 C. o ser utilizado
inmediatamente para PCR.
BiologaMolecular
Pag.39
TEMASADEMOSTRAR
Transcripcin in vitro de RNA
RESULTADOS
Probar la sntesis de CDNA por PCR
Defina la importancia de realizar un ensayo de RT-PCR a un gen
problema?
Se requiere de esta tcnica para diagnostico molecular de
enfermedades como Dengue, o virus del nilo?
Porque?
BiologaMolecular
Pag.40
P RACTICA N O . 12
R EACCIN EN CADENA DE LA
P OLIMERASA
OBJETIVO
amplificar segmentos especficos de DNA mediante PCR
INTRODUCCIN
Es una de las tcnicas ms utilizadas en el campo de la biologa
molecular. Este mtodo fue propuesto a mediados de los aos
70s por Ghobind Khorana, sin embargo no su puso en marca
pues Polimerasas termoestables no haban sido descritas y la
sntesis de oligonucletidos era ms que un arte de la ciencia.
Sin embargo la tcnica fue puesta en prctica 15 aos ms
tarde por Kary Mullis, quien describi la amplificacin in Vitro de
una copia de genes de mamfero usando polimerasa Klenow.
PCR es una tcnica rpida y flexible, que permite la
amplificacin del DNA, este interactivo proceso requiere de tres
elementos como desnaturalizacin del templado por calor,
alineacin de los oligonucletidos a las secuencias blanco de
DNA y extensin de los primers alineados por una termoestable
DNA polimerasa.
MATERIALES
50 mM MgCl2
Taq Polimerasa 2U/L
10 mM dNTPs
BiologaMolecular
Pag.41

20 mM Primer Sentido y Antisentido
DNA
Agua estril
Termociclador
Tubos para PCR
Pipetas
PROCEDIMIENTO
1. En un microtubo de 0.2 mL para PCR, adicionar todos los
reactantes, mezclando con el agua perfectamente.
DNA10ng
X L
MgCl2 50 mM *
1.5 L
dNTPS 10 mM*
1.0 L
P. Sentido 20 mM
1.0 L
P. Antisentido 20 mM
1.0 L
Taq Polimerasa 2U/L*
1.0 L
Agua
Volumen final
X L
25 L
*Si se cuenta con master mix 2X Promega, estos reactivos pueden

sustituirse por 12.5 L de la muestras.
2. Colocar los tubos en la centrifuga y dar un pulso
3. Calentar los tubos a 95 C por dos minutos
4. Correr las reacciones bajo el siguiente programa:
5. 94C por 45 seg, T.M de los primers por 1 min y 68C por 2 min,
durante 30 ciclos, programar una extensin final a 68C durante 10
min y por ultimo mantener la reaccin a 4C.
6. Para estimar el producto de la reaccin examinar 5 L en un gel de
electroforesis de agarosa al 2%
BiologaMolecular
Pag.42

7. Fotografiar el gel con ayuda de un transilumnidar
8. Estimar el producto de la reaccin de PCR comparando la
intensidad de las bandas con el marcador de peso molecular
utilizado en la electroforesis.
TEMASADEMOSTRAR
Amplificacin del DNA
RESULTADOS
Determine los productos de amplificacin
Explique su gel de electroforesis
Calcule los tamaos de sus bandas
BiologaMolecular
Pag.43
P RACTICA N O . 13
A ISLAMIENTODEUNFRAGMENTO
DE DNA APARTIRDEUN
SOPORTESOLIDO
OBJETIVO
El alumno utilizara sus conocimientos y adiestramiento en
tcnicas de biologa molecular para recuperar un fragmento
de DNA partir de un gel electrofortico.
INTRODUCCIN
La purificacin de bandas requiere el uso nde agentes
caotropicos que desnaturalizan las protenas, disuelven la
agarosa y promueven la unin de DNA de doble cadena (100
bp a 48 kb)a una matriz de vidrio. Una vez que el DNA es
capturado, protenas y sales contaminantes son lavadas y el
DNA purificado es eluido en un buffer de baja fuerza inica (TE
o agua).
MATERIALES
Buffer de captura*, Buffer
purificacin de DNA*
de
lavado*, Columnas
para
Baos de agua, Incubadora, Pipetas, Microtubos

*Componentes del Kit Ilustra GFX PCR DNA and gel elute GE MR
cat 27-9602-01.
PROCEDIMIENTO
Pesar un microtubo limpio y estril.
BiologaMolecular
Pag.44

Exponer el gel, rpidamente en el transiluminador y cortar con
ayuda de una navaja limpia, la banda de inters, colocarla en
el tubo, limpio y volver a pesar. Por diferencia de pesos
determinar el peso real de la banda.
De acuerdo al peso estimado, adicionar 300 L de buffer de
captura por cada 300 mg de gel.
Cerrar el tubo, mezclar vigorosamente e incubar a 60 C por 515 min, hasta que la agarosa se haya disuelto.
Transferir la muestra a una columna de purificacin e incubar
por 1 min.
Centrifugar por 30 seg a 10000 rpm, descartar el buffer
centrifugado.
Adicionar a la columna 500 L de buffer de lavado, centrifugar
por 30 seg a 10000 rpm
Colocar la columna en un tubo limpio y adicionar agua estril
para la elusin 50 L, para eluir el DNA en forma concentrada,
disminuir el volumen de agua a no menos de 10 L
Incubar la muestra a temperatura ambiente por 1 min
Centrifugar por 30 seg a 10000 rpm para recuperar el DNA
purificado.
TEMASADEMOSTRAR
Aislamiento de DN A
RESULTADOS
Describa sus observaciones
Que caractersticas fsicas y qumicas tiene la agarosa que
permite purificar DNA?
Investigue el material y principio de las columnas que se utilizan
en estos procesos?
BiologaMolecular
Pag.45

Porque este tipo de tcnicas no pueden utilizarse para otras
molculas como protenas?
BiologaMolecular
Pag.46
P RACTICA N O . 14
L IGACINDEPRODUCTOSDE
PCR AUNVECTORDECLONACIN
OBJETIVO
Obtener un DNA recombinante mediante el proceso de
ligacin del material gentico a un vector de clonacin.
INTRODUCCIN
La tecnologa del DNA recombinante es un campo
relativamente extenso de la Biologa molecular que ha
permitido realizar grandes avances en el conocimiento de la
estructura y funcin del material hereditario. Comprende un
conjunto de tcnicas que permiten realizar el anlisis estructural
y fisiolgico de los elementos genticos. Destacamos los
diferentes pasos a seguir en un experimento de clonado de
DNA por medio de plsmidos bacterianos.
Un experimento de clonado de DNA consiste, esencialmente,
en extraer de un contexto gentico y celular complejo, grande
y poco conocido un fragmento de DNA de inters, y colocarlo
en un contexto sencillo y bien conocido. Desde el punto de
vista molecular, el DNA de inters se inserta en un vector., para
llevar a cabo este proceso se requiere de la Ligacin con DNA
ligasa de los DNAs productos de una amplificacin por PCR o
de la digestin de un DNA. stos se mezclan y se les aade
DNA ligasa. De este modo, se obtienen molculas
recombinantes integradas por el vector ms un inserto.
BiologaMolecular
Pag.47
MATERIALES
Incubadora
Microtubos
Micropipetas
pGEM-T Vector (50ng/L)*
Inserto (DNA ~4 ng/L)
T4 DNA ligasa100U *
Buffer de ligacin rpido 2X *
* Reactivos contenidos en el Kit pGEM-T Easy Vector System II Promega
A 1380.
PROCEDIMIENTO
1.-Centrifugar los tubos conteniendo el Vector rpidamente
para mantener el contenido de estos en el fondo.
2.-Mezclar el buffer de ligacin
3.- Realizar la mezcla de la siguiente forma:
Buffer de Ligacin 2X
5L
DNA ligasa 3U/L
1L
Vector pGEM 50 ng
1L
DNA
XL
___________
10 L
*Llevar a un volumen de 10L con agua desionizada

4.- Mezclar la reaccin por pipeteo e incubar por una hora a
temp amb, alternativamente si se requiere obtener un nmero
mayor de recombinantes incubar por toda la noche a 4C.
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante
RESULTADOSYCONCLUSIN
BiologaMolecular
Pag.48

Documentar sus observaciones
Describa porque es importante mantener control de la

temperatura, si la reaccin se lleva a cabo por toda la noche?
Describa el modo de accin de las T4 DNA ligasas
Uno de los ms estudiados y utilizados vectores para propsitos
generales ha sido el llamado pBR322, dibuje el mapa gentico
del vector e identifique los elementos con que cuenta y para
qu sirven.
BiologaMolecular
Pag.49
P RACTICA N O . 15
P REPARACINDECLULAS
QUMICAMENTECOMPETENTES
OBJETIVO
Elaborar clulas competentes utilizando CaCl2
INTRODUCCIN
Para los experimentos de DNA recombinante se requiere de la
insercin del DNA a una clula hospedera. En bacterias el
proceso de introducir DNA dentro de la clula es llamado
transformacin. Para E. coli uno de los mtodos de
transformacin requiere que las clulas sean tratadas con un
rgimen de alta temperatura y cloruro de calcio (CaCl2).
El mecanismo de accin del CaCl2 es asumido que la pared de
la clula bacteriana es fragmentado lo cual va a permitir que
el DN A entre al interior de la clula, por ello se dice que son
competentes. Para E. coli la competencia debe ser inducida,
en tanto que para otras bacterias esto ocurre naturalmente y
algunas veces puede ser inducido por el uso especfico de
medios de cultivo o condiciones de crecimiento. Para bacterias
que son resistentes a la competencia qumica o no son
naturalmente competentes, otros sistemas pueden ser
utilizados, como la competencia por pulsos elctricos
(electroporacin).
MATERIALES
Colonia de E. coli
Medio LB
BiologaMolecular
Pag.50

CaCl2
Tubos Falcon de 50 mL
Todos los materiales y reactivos deben de estar en condiciones
estriles.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular una colonia de E. coli en 50 mL de medio LB, crecer
durante toda la noche a 37C con agitacin moderada
(250rpm). Transferir la colonia en 100 mL de caldo LB o medio
SOC en un matraz de 1 L. Incubar el cultivo por 3 hrs a 37C
con vigorosa agitacin, monitoreando la densidad ptica
del cultivo a 600 nm. (Para una eficiente transformacin, es
esencial que el nmero de clulas viables no exceda de 10 8
cel/mL, lo cual en la mayora de las E. coli es equivalente a
una OD600 de 0.4.
2. Transferir las clulas a un tubo de 50 mL estril y frio. Enfriar los
cultivos a 0 C mantenindolos en hielo 10 min.
3. Recuperar las clulas por centrifugacin a 2700 g por 10 min
a 4C.
4. Decantar el medio del pellet celular. Mantener los tubos en
posicin invertida sobre una toalla de papel por un minuto
para evitar trazas del medio.
5. Resuspender el pellet en 30 mL de solucin (MgCl2 80 mM,
CaCl2 20 mM) fra.
6. Recuperar las clulas por centrifugacin a 2700 g por 10 min
a 4C.
7. Decantar el medio del pellet celular. Mantener los tubos en
posicin invertida sobre una toalla de papel por un minuto
para evitar trazas del medio.
8. Resuspender el pellet en 2 mL de solucin de CaCl2 0.1 mM
fra, por cada 50 mL del cultivo original.
BiologaMolecular
Pag.51

9. En este punto las clulas pueden ser utilizadas para
transformacin o bien almacenadas en alcuotas para su
almacenamiento a -70 C.
10. Adicionar 34 l de glicerol 100% v/v estril a las alcuotas de
166 l de la solucin de clulas competentes, dando una
concentracin final de 17% de glicerol.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOSYCONCLUSIN
Documentar sus observaciones
Mencione 5 de las principales cepas de E. coli que se utilizan

para los fines de transformacin.
Desarrolle brevemente el principio de la electroporacin y
cules son las condiciones que se requieren para llevar a cabo
dicho proceso.
Describa cuales son los puntos clave para que las clulas no
pierdan eficiencia.
BiologaMolecular
Pag.52
PRACTICANO.16
T RANSFORMACINBACTERIANA
EN E. COLI
OBJETIVO
El alumno evaluara el proceso de incorporar DNA extrao a
una clula de E. coli.
INTRODUCCIN
La transformacin es el proceso en el que las clulas
procariontes toman DNA exgeno del ambiente, alterando a su
fenotipo y el de sus descendientes. En general la entrada del
DNA a las clulas es independiente de la fuente del DNA (o de
sus secuencias), pero es muy dependiente del estado fsicoqumico del DNA (tamao, hebra simple o doble, lineal o
circular, relajado o superenrollado). La eficiencia con la que la
clula blanco tima el DNA exgeno vara ampliamente entre
especies procariticas y dentro una especie, de las cepas.
Algunas especies pueden ser manipuladas en el laboratorio
para incrementar la eficiencia con la que toman el DNA. Las
clulas pre-tratadas que toman el DNA ms eficientemente se
dice que son competentes.
El efecto que tiene el DNA al entrar en una clula blanco y en
los descendientes depende completamente de la secuencia
especfica del DNA exgeno. El DNA exgeno pasar a la
descendencia slo si este se integra en el material gentico de
la clula blanco o si el mismo tiene un origen de replicacin
(ori), que funcione en la clula blanco. Transformaremos clulas
de E. coli para demostrar la habilidad de este DNA para
modificar permanentemente la herencia gentica de las
clulas que lo adquieren. Se transformar con un plsmido que
BiologaMolecular
Pag.53

contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibitico. Las
clulas blanco que adquieran el plsmido se transformarn, de
un fenotipo sensible al antibitico, a otro, resistente al
antibitico. Despus de mezclase con el plsmido,
encontraremos a las clulas resistentes al antibitico
sembrando las clulas tratadas sobre cajas de agar que
contienen antibiticos. El antibitico matar cualquier clula
que no adquiero al plsmido.
MATERIALES
Medio LB
Reaccin de ligacin
Clulas competentes
Placas LB-agar
Antibitico
IPTG
X-Gal
PROCEDIMIENTO
Nota: Es necesario trabajar con mucho cuidado para mantener
la esterilidad y no contaminar las muestras.
1. Cada grupo tomar dos tubos con 200 l de clulas

competentes para la transformacin. Los tubos debern
conservarse sobre hielo.
2. Adicionar 2 l de la reaccin de ligacin slo a uno de los
tubos. Los dos tubos se incubarn 30 minutos sobre hielo. (El
tubo al que se le agreg el DNA es el experimento y al que
no se le agreg nada es el control negativo).
3. Colocar ambos tubos en un bao de agua a 42C por 90-120
segundos. Remover el tubo inmediatamente hacia el hielo e
BiologaMolecular
Pag.54

incubarlo otros 5 minutos (Al finalizar este paso el DNA
presente debi entrar en algunas clulas).
4. Adicionar 900 l de LB
o medio SOC a cada tubo
resupendiendo suavemente las clulas. Incubar 30-60 min,
esto permitir a las clulas recobrarse del trauma del
tratamiento de competencia y empezar la expresin de los
genes funcionales recin introducidos.
5. Despus de la incubacin, resuspender las clulas de ambos
tubos y sembrar por separado 100 l de cada uno en cajas
con LB, conteniendo el antibitico al que confiera resistencia
el plsmido (generalmente 50g/ml) y suplementadas con
100 L de 100mM IPTG y 20 L de 50 mg/mL y esparcir
uniformemente sobre el agar con una varilla de vidrio
doblada como bastn de hockey esterilizada mediante
flameo con alcohol.
6. Pipetear 1.98 ml de medio LB en cuatro tubos estriles y
arreglar en dos hileras de tubos.
7. Agitar en vortex el tubo con el cultivo tratado con el
plsmido e inmediatamente pipetear 20 l en el primer tubo
de la primera serie y agite vigorosamente. Este tubo
contendr la dilucin 1 a 100. Cambiar la punta de la pipeta
e inmediatamente pipetear 20 ml de esta dilucin 1:100 al
segundo tubo y agitar vigorosamente. Se realizaron dos
diluciones seriales 1:100. Cul es la dilucin final en el
segundo tubo? Ahora repita las diluciones con el tubo del
control negativo.
8. Agitar la dilucin final y pipetear 100 l de clulas diluidas en
cajas con LB mrquelas como transformadas. Untarlas en la
superficie de la placa con la varilla de vidrio esterilizada.
Repetir el procedimiento para la dilucin final del tubo del
control negativo y marcar.
BiologaMolecular
Pag.55

9. Incubar las placas a 35-37 C toda la noche y revisar si hay
crecimiento al otro da. Contar el nmero de colonias en las
cajas con LB-antibitico.
TEMASADEMOSTRAR
RESULTADOS
Cuente el nmero de colonias en las dos cajas con LB.
Debera ser el nmero de colonias en estas dos cajas similar?
Cuntos ml requieren agar y de esos cuntos ampicilina?
Llene la siguiente tabla
Control
#
colonias
Factor de
dilucin
Clulas
suspendidas
(cels/ml)
Transformadas
#
colonias
Factor de
dilucin
Clulas
suspendidas
(cels/ml)
Calcular la proporcin del control de clulas transformadas

(#clulas no transformadas / total de clulas = ________
Calcule la proporcin de clulas transformadas (#clulas
transformadas / total de clulas = ________
Porque se tiene la presencia de colonias blanca y azules?
BiologaMolecular
Pag.56
P RACTICA N O . 17
A NLISISDECOLONIAS
RECOMBINANTESPOR PCR
OBJETIVO
El alumno ser capaz de analizar la presencia de inserto

producto de un proceso de clonacin.
INTRODUCCIN
La tecnologa de DNA recombinante requiere de una batera
de procedimientos experimentales usados para aislar piezas de
DNA que contienen especficos genes.
En este caso el aislamiento de la colonia por el toque a travs
de un palillo, es de los mtodos ms sencillos para poder
evaluar la presencia de un recombinante presente en ese DNA,
no requiere de cultivo previo, la tcnica acoplada a PCR
utilizando oligonucletidos especficos contenidos en el vector
permite el anlisis del inserto correspondiente.
MATERIALES
Colonias en placa
Palillos estriles
Placas LB + antibitico
Agua estril
Tubos de PCR
Master Mix 2X (Contiene Taq Polimerasa 2U, Buffer PCR 10X,
dNTPs 10 mM)
Primers 20 mM
PROCEDIMIENTO
BiologaMolecular
Pag.57

1. Tomar parte de la colonia con un palillo estril
2. Transferir el material a un tubo conteniendo 35 L de agua
estril en un tubo
3. Realizar una siembra en un sector de la placa utilizando el
material restante en el palillo
4. Preparar la reaccin utilizando las siguientes condiciones:
Master mix
10.5 L
Primer FW
1.0 L
Primer RV
1.0 L
Agua inoculada con la colonia
12.5 L
5. Amplificar utilizando las siguientes condiciones de corrida

35 ciclos a 1 min 95 C, 2 min a 50 C ( o a la tm de los primers
-5 C), 2 min.
6.
Analizar 10 L de la reaccin de PCR en gel de agarosa
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante_Clonacin
RESULTADOS
Determine la presencia de insertos
Explique su gel electrofortico
Describa porque es importante crecer la colonia en
medio de cultivo una vez diluida en agua para el mtodo
de PCR.
Que otra tcnica puede utilizar para analizar la presencia
de un recombinate?
Cual considera
metodologa?
BiologaMolecular
ud
que
son
los
riesgos
de
esta
Pag.58
BiologaMolecular
Pag.59
P RACTICA N O . 18
A ISLAMIENTODE DNA
PLASMDICO
OBJETIVO
Aislar DNA plasmidico a partir de un cultivo lquido de E. coli
transformada.
INTRODUCCIN
Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico circular
y generalmente de tamao pequeo que se localiza en
bacterias y que puede ser replicado independientemente.
Tiene un inters peculiar dado que son producidos mediante
ingeniera gentica como producto de una clonacin.
El proceso de aislamiento es conocido como Mini Preps, debido
a que es preparado de pequeas proporciones de cultivo de
bacterias las cuales contienen el plsmido. La bacterias debe
ser lisada con una solucin conteniendo dodecil sulfato de
sodio e hidrxido de sodio, lo cual desnaturaliza protenas y
DNA cromosomal. La mezcla es neutralizada con acetato de
sodio, la mayora del DNA cromosomal y protenas son
precipitadas y removidas por centrifugacin, por lo cual el DNA
plasmdico es recuperado en la fase sobrenadante y
precipitado con etanol, para su posterior anlisis.
MATERIALES
Plsmido
Solucin I (Glucosa 50mM, Tris-HCL pH 8.0 25 mM, EDTA 10mM)
Solucin II (NaOH 0.2 N, SDS 1%)
Solucin III (Acetato de Potasio 5M)
Etanol, Isopropanol
BiologaMolecular
Pag.60

Caldo LB
Ampicilina
PROCEDIMIENTO
1. Inocular 5 mL de caldo LB estril conteniendo ampicilina 100
ug/mL, con 10 ml de muestra. Incubar en agitacin hasta
obtener un cultivo en fase estacionaria por lo menos 8 hrs.
2. Centrifugar 1.5 mL de cultivo en un microtubo a 10,000 rpm x
3 min, retirar el sobrenadante y colocar ah mismo otros 1,5
mL de cultivo, repetir este proceso, hasta haber
centrifugado todo el material.
3. Resuspender las clulas en 250 L de solucin 1, mezclando
bien
4. Adicionar 250 L de Solucin 2, esperando 5-10 min hasta
que este transparente.
5. Adicionar 250 L de solucin III (fra) y mantener en hielo por
10-15 min.
6. Centrifugar a temperatura ambiente por 10 000 rpm x 10
min
7. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio (700 L)
8. Adicional 500 L de Isopropanol a temp. Ambiente, agitar,
suavemente
9. Centrifugar 30 min a 10,000 rpm
10. Remover el sobrenadante y lavar el pellet con 500 L de
etanol fri al 70%
11. Centrifugar por 5 min y remover el etanol
12. Decantar y dejar secar, colocando el tubo, boca abajo y
dejarlo por 5 min a temp. amb.
13. Resuspender en 50 L de agua estril.
14. Evaluar el DNA mediante gel, PCR o digestin enzimtica.
BiologaMolecular
Pag.61
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante_Caracterizacin de
plasmidos
RESULTADOS
Evaluar la calidad del material nucleco por espectrofotometra
y anlisis en gel.
BiologaMolecular
Pag.62
P RACTICA N O . 19
D IGESTINDE DNA PLASMDICO
CONENDONUCLEASASDE
RESTRICCIN
OBJETIVOS
Digerir DNA plasmdico con diferentes enzimas de restriccin.
INTRODUCCIN
Muchos de los cambios que se han llevado a cabo en las
ciencias biolgicas pueden ser atribuidos a la habilidad para
manipular el DNA. La herramienta ms importante para la
ingeniera gentica son las enzimas que catalizan especficas
reacciones en el DNA.
Primeramente el corte se da en sitios limitando a obtener un
mapa fsico de DNA. Segundo, la habilidad para producir
especficamente fragmentos de DNA haciendo posible purificar
estos fragmentos por clonacin molecular.
Existen dos tipos de enzimas de restriccin. Las del tipo I son
complejos enzimticos grandes con capacidad de modificar
mutilar y colar el DNA. Probablemente sirven para proteger las
clulas de la invasin de DNA extrao. Las endonucleasas de
restriccin del tipo II reconocen secuencia cortas de DNA y
rompen el DNA en sitios especficos dentro o adyacente a
secuencias
de
reconocimiento,
las
secuencias
son
generalmente, pero no siempre 4 a 6 nucletidos en longitud y
son usualmente caracterizados por una simetra. El corte puede
producir diferentes tipos de extremos en la molcula
produciendo extremos parejos o disparejos produciendo
extremos cohesivos.
BiologaMolecular
Pag.63

Algunos factores que deben de tomarse en cuenta para una
digestin son pureza del DNA, grado de mutilacin y
condiciones de buffer.
MATERIALES
Buffer de reaccin (10X) para las digestiones
Buffer muestra 6X para terminacin de reaccin y de carga
paraelectroforesis6X:0.25% azul de bromofenol, 0.25%
xilencianolFF 30%
Glicerol
DNA plasmdico
Agua destilada estril
Enzimas de restriccin
Nota: Para la mayora de las enzimas de restriccin comerciales,
una unidad de actividad se define como la cantidad de
enzima requerida para digerir completamente 1 g de pBR322
o de DNA del bacterifago lambda) en una hora bajo las
condiciones apropiadas de reaccin y generalmente a 37C.
La digestin del DNA es afectada por la pureza del DNA y el
nmero de sitios de restriccin presentes en el mismo. En
ocasiones es necesario extraer la solucin de DNA otra vez (y a
veces ms) con fenol y cloroformo para eliminar las protenas,
seguido por precipitacin con etanol para remover los
solventes orgnicos, las sales y finalmente precipitar el DNA.
Bao de agua o incubadora a 37C.
PRECAUCIONES:
Siempre use puntas nuevas y estriles para tomar cada una de
las enzimas. Evite la contaminacin de las soluciones, del DNA y
BiologaMolecular
Pag.64

de las enzimas usando una punta nueva para la toma de cada
componente.
PROCEDIMIENTO
1. Utilizar micropipeta y microtubos de 1.5 mL estriles para
hacer las siguientes digestiones. Todas las soluciones y los
tubos de reaccin se mantienen en hielo hasta el momento
de iniciar la digestin. Agregar los componentes de la
reaccin en forma ordenada como se indica. Mezclar los
componentes de las reacciones por agitacin suave del
microtubo con la punta de los dedos. Incluir un control sin
digerir para cada una de las reacciones, para este paso,
agregar todos los componentes en el mismo orden, excepto
la enzima, mezclar como lo hizo anteriormente y parar la
reaccin inmediatamente despus con buffer muestra para
electroforesis. Evitar introducir burbujas de aire por agitacin
demasiado vigorosa.
Cada reaccin deber de tener los siguientes componentes.

Agua bidestilada estril
____L
Buffer 10X
____L
Enzima de restriccin
____L
DNA a digerir -
____L
Volume total
_50_L
2. Colocar los tubos a digerir a 37C e incubar por 1.5 hr.

Mantener los tubos control (sin digerir) a -20C o en hielo.
BiologaMolecular
Pag.65

3. Transferir una alcuota de 0.5 g del DNA plasmdico a otro
tubo, agregar buffer de carga para analizar por electroforesis
en geles de agarosa.
4. Guardar los tubos conteniendo el resto de DNA a -20C.
TEMASADEMOSTRAR
Tecnologa del DNA recombinante _ Mapas de restriccin
RESULTADOS
Defina el mapa de restriccin del proceso utilizado.

Describa 5 enzimas que presenten sitios rasurados y 5 con sitios
cohesivos.
Mencione 5 factores que interfieran en la digestin enzimtica
de un DNA y explique porque interfieren.
BiologaMolecular
Pag.66
P RACTICA N O . 20
I NTRODUCCINALA
B IOINFORMTICA
OBJETIVO
Aplicacin del uso de las herramientas bioinformticas

accesibles en el Internet para el estudio de protenas y los
genes que las codifican.
INTRODUCCIN
La biologa computacional est creciendo rpidamente y el
nmero y variedad de mtodos computacionales utilizados
para el anlisis de secuencias de DNA y protenas aumenta
cada da. El conocimiento de los algoritmos y su aplicacin
tienen alto valor para las compaas biotecnolgicas y para los
investigadores.
Por ello, se hace necesario conocer las principales herramientas
de la Bioinformtica y aprender a utilizarlas en la resolucin de
problemas biolgicos. Nuevas tcnicas y demostraciones de su
uso, son presentadas para mantener al alumno en el estado del
arte de esta disciplina.
MATERIALES
Secuencias:
NP_035564
AAS65790,
NP_003113,
Q39837,
BAA99079,
PROCEDIMIENTO
1. Conocer la pgina NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
2. Explorar y PUBMED, BLAST, Books y all bases.
3. Elija 3 secuencias de las proporcionadas
BiologaMolecular
Pag.67

4. Busque la secuencia que le fue asignada a travs de su
nmero de acceso del banco de datos NCBI.
5. Asigne identidad a la secuencia.
6. Determine mediante esta pgina http://ca.expasy.org/
i.Peso molecular
ii.Punto isoelctrico
iii.Contenido de aminocidos
iv.Mencione en que ORF se localiza
v.Describa que tipo de estructura secundaria presenta
7. Determine el sitio de corte del pptido seal (si es que se
presenta). http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
8. Explore la liga de Human genome resuorce
9. Conozca las herramientas para el diseo de primers
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
10. Conozca las herramientas para poder estudiar filogenia
11. http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.ht
ml
TEMASADEMOSTRAR
Anlisis Bioinformticos
RESULTADOS
Para su reporte explore una liga de las bases analizadas y
arme un ejercicio con forme a lo aprendido en esta seccin.
Describa en media cuartilla la importancia que tienen la
bioinformtica en relacin con el estudios de los genomas.
BiologaMolecular
Pag.68
BIBLIOGRAFA
Ausbel F., Brent R., Kingston R.E., Moore D., Seidman J.,
Smith J.A., Struhl, K. 1995. Current Protocols in Molecualr
Biology. John Wiley & Sons, Inc.
Devlin T. 2000. Bioquimica:Libro de texto con aplicaciones
clnicas. 3 Edicin. Revert. Madrid, Espaa.
Glick B. y Pasternak J. 2003. Molecular Biotechnology,
Principles and Applications of Recombinant DNA.
American Society for Microbiology. Washington D.C.
Harlow Ed. 1988. Antibodies a Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor, New York.
Ruvinsky A., Marshall, J. 2005. Mammalian Genomics. CABI
Pub, Cambridge, MA, USA.
Sambrook J. y Rusell D. 2001. Molecular Cloning a
Laboratory Manual. 3a Edicin. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
BiologaMolecular
Pag.69

Biologia Molecular Ciencias Biomedicas

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

MANUAL DE PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

Ciudad Jurez, Chihuahua

M. en C. Emilio Clarke Crespo

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Dr. Alejandro Martnez Martnez

M.C. Hugo Staines Orozco

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

II. Disoluciones de concentracin molar

Preparacin de 100 mL de una disolucin de NaOH 25 mM a partir de

Donde: C1= Concentracin inicial

Medir el volumen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos

III. Disoluciones de Concentracin Normal

Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de

2. Para la cuantificacin, se realizara, cada determinacin por

500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4C en la

B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua

C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua

D) 10% (w/v) SDS

E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio

F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de

No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo

0.5 M Tris-HCl pH 6.8

0.5 (w/v) azul de bromofenol en

Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer.

Gel Separador (Separating) (10 mL)

1.5 M Tris-HCl pH 8.8

Persulfato de amonio 10%

Gel Concentrador (Stacking) (4mL)

0.5 M Tris-HCl pH 6.8

El alumno evaluara el proceso para la deteccin de protenas

Teir con la solucin de Coomassie.

Desteir con la solucin A hasta que se observen las

Enjuagar con agua destilada.

Documente su gel fotograficamente

Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de

Evalue los datos obtenidos y reporte

Mezlcar los siguientes componentes

Llevar con agua DEPC a 10 l

RNAse out(40U /l)

Super Script III RT (200U/ l)

4.-Adicionar 10 l de la mezcla de cDNA sntesis al tubo de

Taq Polimerasa 2U/L*

*Si se cuenta con master mix 2X Promega, estos reactivos pueden

Baos de agua, Incubadora, Pipetas, Microtubos

DNA ligasa 3U/L

*Llevar a un volumen de 10L con agua desionizada

Describa porque es importante mantener control de la

Mencione 5 de las principales cepas de E. coli que se utilizan

1. Cada grupo tomar dos tubos con 200 l de clulas

Calcular la proporcin del control de clulas transformadas

El alumno ser capaz de analizar la presencia de inserto

Agua inoculada con la colonia

5. Amplificar utilizando las siguientes condiciones de corrida

Analizar 10 L de la reaccin de PCR en gel de agarosa

Bao de agua o incubadora a 37C.

Cada reaccin deber de tener los siguientes componentes.

2. Colocar los tubos a digerir a 37C e incubar por 1.5 hr.

Defina el mapa de restriccin del proceso utilizado.

Aplicacin del uso de las herramientas bioinformticas

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