VENTAJA DEL MTODO DE ANALISIS

A travs de las pruebas de ADN se analiza el material gentico de un

individuo para determinar su identidad, su susceptibilidad a ciertas enfermedades
y otras informaciones importantes. El anlisis de ADN es cada vez una herramienta
ms comn en el campo de la medicina y en el de la justicia criminal, pero siguen
existiendo considerables inconvenientes que acompaan a sus beneficios.

Una de las mayores ventajas de las pruebas de ADN es su utilizacin para la

identificacin de los sospechosos en una investigacin criminal. Como el ADN de cada
individuo es nico, el margen de error es muy pequeo, por lo que se trata de una forma de
identificacin mejor que las huellas dactilares. Las muestras de ADN obtenidas de la
sangre, la piel y los cabellospueden compararse con el ADN de un sospechoso para obtener
informacin acerca de dnde ha estado ese individuo o con quin puede haber
tenido contacto. El anlisis de ADN es especialmente importante en casos de violacin, en
los que el personal mdico puede encontrar rastros de ADN del violador tras examinar a la
vctima. El ADN encontrado ser comparado luego con el de los sospechosos para
determinar quin es el culpable.
Otra ventaja importante del anlisis de ADN es la posibilidad de detectar ciertas
enfermedades genticas o factores de riesgo. Los futuros padres pueden someterse a un
anlisis para determinar si poseen los genes responsables de ciertas enfermedades que
puedan sufrir otros miembros de sus familias. Del resultado de las pruebas depender la
decisin de tener o no hijos. Las mujeres sometidas a tratamientos de fertilidad tambin
pueden obtener informacin sobre el embrin antes de su implantacin. Los anlisis
descartarn o confirmarn la existencia de ciertas enfermedades genticas, incrementando
as la probabilidad de tener un embarazo seguro y de que el nio nazca sano.

VENTAJA DEL MTODO DE ANALISIS

Una desventaja clave del anlisis de ADN es la posibilidad de que se produzca una
invasin de la privacidad. El ADN de una persona revela gran cantidad de informacin
sobre su estado fsico, por lo que se trata de una informacin delicada que debe ser
protegida con esmero. Es natural que cause preocupacin el hecho de que los empleadores
tengan acceso a informacin gentica sobre sus empleados y de que puedan utilizarla para
tomar decisiones de contratacin o para determinar los requisitos para acceder a la
asistencia sanitaria. La informacin sobre el origen tnico de una persona y parentesco
podra convertirse en causa de discriminacin.
Por ltimo, existe la preocupacin de que el uso generalizado de los anlisis de ADN
pueda llevar a la prctica de la eugenesia, es decir, la manipulacin por parte de los
mdicos o de otros individuos de la dotacin gentica para conseguir que nicamente las
caractersticas genticas deseables pasen a la siguiente generacin de nios. Este tipo de
procedimiento puede ser visto como una injerencia en el devenir natural y es posible que
vaya en contra de algunas creencias religiosas. Las cuestiones ticas relacionadas con la
modificacin gentica suelen estar en primera fila cuando se debate sobre cundo y cmo
deben ser realizadas las pruebas de ADN.

LABORATORIO DE GENTICA FORENSE

La identificacin de los restos cadavricos procedentes de los accidentes de
trfico, grandes catstrofes, personas desaparecidas, etc., constituye un tipo de
anlisis muy solicitado en gentica forense. Cuando se produce la aparicin de un
cadver o restos cadavricos cuya identidad se sospecha pero no se pueda
establecer con total seguridad por mtodos tradicionales (antropolgicos,
odontolgicos, etc.), se puede recurrir a un estudio gentico como complemento
como nica va posible de identificacin. Los cadveres de los que no haya
sospechas sobre quin se trata deben ser igualmente analizados y sus perfiles
genticos deben ser almacenados en una base de datos annima que permita su
comparacin con muestras de referencia de personas que tengan familiares
desaparecidos. Como consecuencia de la gran variedad de situaciones con las que
nos podemos encontrar, vamos a tratar de ordenar clasificar los casos que
pueden ser resueltos primero en funcin del tipo de muestra que debemos
analizar y segundo en funcin del tipo de caso.
Prueba de paternidad (ADN) forense: Se denomina prueba de paternidad
(ADN) forense cuando la muestra del padre alegado es una muestra cadavrica.
Tambin pueden darse casos donde el hijo/a estn fallecidos y deba recurrirse a
metodologas forenses de extraccin de ADN y de obtencin de perfiles de ADN.
Esta tecnologa tambin puede ser aplicada a pruebas de paternidad (ADN) en
casos que no involucran la justicia, pero que requieren proceso forense dada la
naturaleza de las muestras (uas, chicles, cepillos de dientes, dientes de leche,
etc. )
Validacin legal: Este tipo de pruebas legales requieren validacin de la
identidad y custodia de las muestras, segn legislacin de cada pas.
Estados de conservacin de muestras forenses:
El paso del tiempo es un factor adverso a la preservacin del ADN. Adems
de la metodologa de extraccin y tipificacin de ADN de muestras degradadas,
sin embargo, atendiendo al estado de conservacin de la muestra, los casos ms
tpicos en los que pueden presentarse las muestras cadavricas son:
Restos cadavricos en buen estado de conservacin. la recogida de
muestras se realiza inmediatamente despus de la muerte, las muestras ms
adecuadas son sangre y/o msculo. En los casos en los que se producen vctimas
carbonizadas, el ADN es muy estable a las altas temperaturas a las que se ve
sometido y en general es posible obtener ADN de alta calidad. Restos cadavricos
con un avanzado estado de putrefaccin esqueletizados. Se trata de restos en
los que la toma de muestras se realiza despus de un periodo de tiempo largo tras
la muerte, en este caso las muestras ms adecuadas son piezas dentales huesos
largos. Son los casos que entraan mayor dificultad en cuanto a la obtencin y el
anlisis del ADN. Restos cadavricos embalsamados. Normalmente son los casos
que entraan la mayor dificultad puesto que lo ms comn es que la conservacin
del cadver se realice mediante formol derivados y est demostrado que el
formol produce grandes modificaciones de los cidos nucleicos.
Restos cadavricos momificados. En ciertos cadveres se producen
fenmenos naturales de momificacin como consecuencia de la rpida
evaporacin del agua del cuerpo, con lo que se detiene el desarrollo de
microorganismos y por tanto la putrefaccin y por tanto el material gentico de los

tejidos blandos momificados se preserva en condiciones que permiten su anlisis,

que en condiciones habituales no sera posible debido a los procesos destructivos
del cadver

Extraccin
La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper
las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra
de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de
elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos crticos que
componen el anlisis de patgenos por PCR, la extraccin de ADN es quizs el ms
desconocido y sobre el que ms control podemos ejercer.
La extraccin del ADN de las clulas o virus donde se halla confinado es un
paso previo en muchos procedimientos analticos y diagnsticos.
Etapas en la extraccin de ADN Los pasos necesarios para una correcta
extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico son:
1.- Lisis de las clulas o virus. Las sales caotrpicas ayudan a romper la
estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos
nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el
SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.
Lisis: Destruccin de una clula, normalmente por rotura de la membrana
celular mediante un agente especfico o un proceso fsico.
Lisis de bacterias: Todas las clulas tienen una membrana hecha de
fosfolpidos con protenas embebidas. Las bacterias tienen adems una pared
celular externa. Los antibiticos del grupo de las penicilinas alteran o inhiben la
sntesis de protenas de la pared celular de las bacterias, causando su destruccin
o lisis.
2.- Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue
mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor
con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico.
3.- Purificacin. Consta de 3 fases:
Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede
precipitar etanol fro o isopropanol i recuperar mediante una centrifugacin. El
alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.
Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse
Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris
tras ser secado completamente.
EXTRACCIN DE ADN EN SUSPENSIONES BACTERIANAS.- De todas las
muestras biolgicas que podemos someter a un proceso de extraccin de ADN, las

suspensiones bacterianas, son quizs las que ofrecen menos problemas por la
homogeneidad y riqueza del material.
En particular, las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden
liberar cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden
ser una simple ebullicin, congelacin o una combinacin de ambas (frezze &
thaw).
El laboratorio de Microbiologa que decide incorporar la PCR a sus mtodos
de investigacin de bacterias patgenas en alimentos, lo hace buscando rapidez y
simplicidad. La purificacin del ADN tras el proceso de lisis y liberacin tiene como
ventaja la obtencin de un analito sin inhibidores a cambio de un sensible
aumento del tiempo de anlisis y de los pasos de manipulacin. Analizar
directamente un caldo de enriquecimiento tras un proceso de extraccin primaria
de ADN (lisis celular) suele producir resultados satisfactorios para la mayora de
matrices alimentarias por lo que un paso de purificacin no es estrictamente
necesario. Adems, los kits de anlisis de patgenos por PCR incorporan
detectores de inhibicin (controles internos de amplificacin). Solamente aquellas
matrices cuya presencia de inhibidores no pueda ser contrarrestada diluyendo el
extracto de ADN obligarn a plantear la adopcin de tcnicas de extraccin de
ADN que aseguren un extracto puro. Obtencin de ADN sin paso de purificacin.
Cada casa comercial acompaa a sus detectores con un mtodo de extraccin de
ADN. stos son fundamentalmente tres:
1. Chelex. El uso de una resina de slica ayuda a separar selectivamente el
ADN de la solucin. Es un mtodo rpido, pero muy poco eficacia en bacterias
grampositivas.
2. Ebullicin (combinado con congelacin). Algunos fabricantes incorporan
un paso de ebullicin de la muestra previo a la PCR como nica accin para
extraer el ADN de la muestra. Si bien esto puede ser usado en suspensiones con
nmeros elevados de bacterias gramnegativas, su baja eficiencia especialmente
con organismos grampositivos, reduce notablemente el nivel de deteccin del
mtodo.
3. DNAready (Microbial) Se trata de un tampn de lisis que incorpora los
elementos necesarios para buscar un equilibrio entre eficiencia y pureza que
adems est desarrollado para ser especialmente efectivo con bacterias
grampositivas.
CUANTIFICACION
Uno de los mtodos ms utilizados para la cuantificacin del ADN es el
anlisis de la absorcin UV, ya que los nucletidos poseen mximos de absorcin
alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm).

Este mtodo proporciona una estimacin simple y precisa de la

concentracin de una muestra, pero slo si sta se encuentra pura, sin
contaminacin significativa de protenas o solventes orgnicos que absorben a
longitudes de onda cercanas. Para evaluar la pureza de la muestra debe
determinarse la proporcin OD 260nm/OD 280nm. Si la relacin es mayor a 1,6
puede estimarse que la muestra es lo bastante pura para confiar en la
cuantificacin espectrofotomtrica.

La calidad de las molculas extradas se analiza por electroforesis en gel de

agarosa. La agarosa es un polisacrido altamente purificado derivado del agar. Se
utiliza para separar macromolculas tales como cidos nucleicos y grandes
complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolucin que la poliacrilamida
pero una gran rango de separacin, tal que pueden ser separadas molculas de
ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las
concentraciones de agarosa). El tamao del poro del gel puede ser
predeterminado ajustando su concentracin en el gel; entonces a mayor
concentracin menor tamao de poro. El rango de trabajo es aproximadamente
entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene una buena separacin
(resolucin) de grandes fragmentos de ADN (510kb) y con uno 2% se resuelven
mejor los fragmentos pequeos (0.21kb). Hay que tener en cuenta que los geles
de bajo porcentaje son muy frgiles y se pueden romper al intentar levantarlas, y
los de alto porcentaje suelen opacarse mucho, disminuyendo la visibilidad de las
bandas. En lineas generales, 1% es una concentracin estandar.
El ADN esta homogneamente cargada de forma negativa a pH neutro, por
lo que la relacin carga:masa es constante. Su velocidad de migracin del ADN en
la matriz de agarosa esta determinada por una serie de parmetros:
a).- Tamao del ADN
b).- Concentracin de agarosa
c).- Conformacin del ADN. Las distintas conformaciones de las molculas
de ADN circular del mismo peso molecular migran a distinta velocidad: de mayor a
menor velocidad, superenrollado circular, lineal y circular relajado.
Voltaje aplicado. A bajo voltaje la velocidad de migracin de un fragmento
lineal de ADN es proporcional al voltaje aplicado, as el rango efectivo de
separacin decrece a medida que el voltaje se incrementa.
Presencia de colorante intercalante. El Bromuro de Etidio o Sybr green
reduce la movilidad electrofortica del ADN lineal ya que el intercalante se
introduce entre las bases, extendiendo la longitud del ADN lineal o nicked
hacindolo mas rgido.
Para preparar un gel de agarosa, se pesa el polvo de agarosa y se disuelve
en el buffer
(TBE 0,5X) en un recipiente de vidrio. Para fundir la agarosa se necesita
calentar la mezcla, lo que generalmente se realiza con unos segundos en el
microondas. Es importante dejar enfriar un poco la preparacin (hasta que
podamos mantener el recipiente en la mano sin quemarnos!) antes de verterla en
la cuba ya que sta es de plstico, y si el lquido est muy caliente puede
romperla.
Finalmente se coloca el peine para generar las calles, y se deja enfriar
completamente.
AMPLIACIN
La tcnica de amplificacin de ADN mediante la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) es una tcnica que consiste en la amplificacin in vitro de un
fragmento de ADN especfico. Para llevar a cabo el experimento de amplificacin

es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a

amplificar (un gen, una parte de un gen, una regin no codificadora,).
Bsicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y,
para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las clulas in vivo para replicar su
ADN.
As, se trata de disponer en un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto
de estudio. Adems debemos aadir en dicho tubo un par de oligonucletidos que
acten como cebadores para la ADN polimerasa. La eleccin de estos
oligonucletidos (cebadores o primers) es crucial dado que han de delimitar la
regin a amplificar. En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los
extremos 3 de la regin a amplificar:
Adems del ADN y de los primers, es necesario aadir al tubo de reaccin
los 4 tipos de desoxirribonucletidos trifosfatos (dNTPs) que componen el ADN
(dATP, dGTP, dTTP y dCTP, en una mezcla equimolar de cada uno de ellos). Por
supuesto, aadiremos por ltimo tambin la ADN polimerasa que, en este caso, ha
de ser una polimerasa especial capaz de resistir las elevadas temperaturas a la
que vamos a someter a nuestro tubo de reaccin. Dicha ADN polimerasa es la
llamada Taq-polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus.

Una vez tenemos todos los componentes en nuestro tubo de reaccin (Figura 1),
tenemos que favorecer de alguna forma que ocurra la sntesis de ADN. Para ello, lo
primero que debemos hacer es facilitar la desnaturalizacin del ADN. A
continuacin, permitir el alineamiento de los primers (apareamiento con su regin
complementaria) y, por ltimo, facilitar que la polimerasa lleve a cabo la sntesis
de ADN utilizando como cebadores los extremos 3 de los primers utilizados. As,
nuestra reaccin constara de 3 pasos:
1. Desnaturalizacin. Se conseguira elevando la temperatura del tubo de
reaccin hasta 94oC, durante, por ejemplo, un minuto (este tiempo puede variar
entre minuto y 2 minutos)
2. Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura que
puede oscilar entre 40 oC y 60 oC (dependiendo de diversos parmetros como la
secuencia de los primers, su especificidad,...). La duracin de este paso puede
oscilar entre minuto y 2 minutos.
3. Extensin. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72 oC y se deja
actuar a la Taq polimerasa durante 1 2 minutos.
Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40
veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de
amplificacin, millones de copias del fragmento de inters.
Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada. Para ello, los
tubos de reaccin se introducen en un termociclador que de forma automtica
realiza los 40 ciclos de amplificacin.
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la
movilidad de stas en un campo elctrico. La electroforesis se usa en una gran

mayora en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga
que poseen los polipptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de
las variaciones del experimento del ADN recombinante.
Las molculas que forman las protenas reciben el nombre de polipptidos.
Se trata de pptidos compuestos por, al menos, diez aminocidos (una clase de
molcula de tipo orgnico).
La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de
cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de
poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa,
que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con
sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una
manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de
molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando
por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las
pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn
ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.
La mayora de las biomolecular poseen una carga elctrica, cuya magnitud
depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se
desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se denomina
electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en
disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica
fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines
preparativos. Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando
rpidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza
del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento)
impuesta por el medio en el que se desplaza.