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1. PREPARACION DE LA MUESTRA
2. CARACTERES ORGANOLEPTICOS
3. INDICE DE COLOR A. B. T.
4. DENSIDAD
5. PRUEBA DEL FRIO
6. INDICE DE REFRACCION
7. PUNTO DE FUSION
8. HUMEDAD
9(a). HUMEDAD Y MATERIAS VOLATILES
9(B).2. MATERIAL Y APARATOS
10a. ACIDEZ INDICE DE ACIDEZ
10b. ACIDEZ INDICE DE ACIDEZ: potenciometra
11.a INDICE DE SAPONIFICACION
11(b). INDICE DE SAPONIFICACION(Mtodo potenciomtrico)
12. INDICE DE HIDROXILO
13. PREPARACION DE ACIDOS GRASOS INSOLUBLES
14. TITULO
15. INDICE DE ACIDOS VOLATILES SOLUBLES E INSOLUBLES
16(a). INDICE DE IODO
16(B). INDICE DE IODO
17. INDICE DE TIOCIANOGENO
18. INDICE DE POLIBROMUROS
19 INDICE DE DIENOS
20. ACIDOS OXIDADOS
21 INDICE DE PEROXIDOS
22 (a). INSAPONIFICABLE
22(B). INSAPONIFICABLE
23. INDICE DE ESCUALENO EN ACEITE DE OLIVA
24(a) DETERMINACION DE LA FRACCION DE ESTEROLES POR CROMATOGRAFIA EN
FASE GASEOSA
24(B). DETERMINACION CUANTITATIVA DE ESTEROLES
25. IMPUREZAS
26. CENIZAS
27. DETECCION DE COMPUESTOS CLORADOS
28(a).RECONOCIMIENTO DE AZUFRE (Benzoato de plata).
28(B). RECONOCIMIENTO DE AZUFRE (moneda de plata)
29 DETERMINACION DE JABON EN ACEITE DE OLIVA
30 RECONOCIMIENTO DE JABON EN ACEITE REFINADO
31. ABSORCION EXPECTROFOTOMETRICA ULTRAVIOLETA
32(a). INDICE DE BELLIER.
32(B). INDICE DE BELLIER
33. RECONOCIMIENTO DE ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA
34.DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LOS ACIDOS GRASOS
SITUADOS EN LA POSICION DE LOS TRIGLICERIDOS
35. RECONOCIMEINTO DEL ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA
36 TETRABROMUROS
37. MODIFICACION SYNODINOS-KONSTAS
38. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE ALGODON
39. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE SEMILLA DE TE EN ACEITE DE OLIVA
40 RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE SESAMO
41. DETERMINACION DE ACIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA
42. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA DE LOS ALPECHINES
43. RECONOCIMIENTO DE STERES NO GLICRIDOS EN GRASAS COMESTIBLES POR
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
44. TEMPERATURA DE INFLAMACIN.
45. RECONOCIMIENTO DE ANTIOXIDANTES.
46. ACIDOS GRASOS DE CADENA CORTA.
47. FSFORO.
48. GRASA NEUTRA.
49.-ACIDOS DOCOSENOICOS.
50 (a). ANILINA (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
50 (B). ANILINA (POR CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA).
50 (C). ANILINA COMO ACETANILIDA (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
50 (D). ANILINA COMO ACETANILIDA (POR HPLC).
51. ANILIDAS GRASAS (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
52. ANILIDAS GRASAS (POR HPLC).
53. COLORANTES ARTIFICIALES.
54. ACTIVIDAD DE ADSORBENTES PARA CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
55. CERAS EN ACEITES DE GIRASOL
56. TOCOFEROLES
57. ACEITE SEMISECANTE EN ACEITES DE OLIVA Y ORUJO
58. DETERMINACION DEL ERITRODIOL
59. DETERMINACIN DE CIDO ERCICO
APARTADO A
CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA DE LOS ESTERES METILICOS DE ACIDOS
GRASOS
APARTADO B
METODO DE PREPARACION DE LOS ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS QUE
TENGAN SEIS ATOMOS DE CARBONO Y MAS
2. MTODOS ALTERNATIVOS NO UTILIZANDO EL TRIFLUORURO DE BORO:
Llenar de aceite hasta las tres cuartas partes uno de los tubos; observar por
transparencia, mirando en direccin normal al eje del tubo, con cual de los colores de la
escala de patrones se idntica, colocando detrs de los tubos una hoja de papel blanco.
3.5. Expresin de resultados.
3.5.1. El ndice de color se expresara por un nmero, correspondiente a los ml del
patrn con el que se ha identificado la muestra.
4. Densidad
4.1. Principio.
Se determina la masa de la unidad de volumen, expresada en gramos por centmetro
cbico, a una temperatura dada. La densidad se representa por d.
La temperatura se ha de controlar exactamente ya que la densidad de las materias grasas
varia aproxidamente 0,00068 por grado.
La temperatura de la determinacin no diferir de la referencia en ms de 5gd.c.
4.2. Material y aparatos.
4.2.1. Picnmetro normal, o con termmetro acoplado de 50 ml aproximadamente.
4.3. Procedimiento.
4.3.1. Aceites y grasas liquidas. Para la determinacin de la densidad el picnmetro ha
de estar a la temperatura constante del medio ambiente. Llenar el picnmetro hasta el
borde superior del tubo capilar, introducir el termmetro, pesar y anotar la temperatura
de la determinacin.
4.3.2. Grasas slidas. Llenar el picnmetro hasta las tres cuartas partes,
aproximadamente, de su altura, con la grasa. Dejar 1 hora en estufa, a la temperatura de
fusin de la grasa, enfriar, pesar. Aadir agua, a la temperatura de referencia, hasta el
borde superior del picnmetro, dejar 1 hora en un bao a la temperatura de referencia,
secar el picnmetro y pesar.
4.4. Calculo.
Calcular la densidad expresada en g/cm3 y referida a una temperatura que generalmente
ser de 20 grd. C para los aceites y de 40 grd. , 60 grd. C, etc., para las grasas slidas.
4.4.1. Aceites y grasas liquidas.
(formula omitida)
4.4.2. Grasas slidas.
(formula omitida)
4.4.3. Correcciones.
El valor de la densidad calculado anteriormente puede corregirse del efecto del empuje
del aire por la formula
Densidad corregida = d + 0,0012 (1 - d)
D = densidad sin corregir.
4.5. Observaciones.
La temperatura de la determinacin y la temperatura de referencia se relacionan en la
siguiente forma:
D' = d + (t - t') 0,00068 si t > t
D' = d - (t' - t) 0,000068 si t < t'
D = densidad a la temperatura de la determinacin t.
D' = densidad a la temperatura de referencia t'
4.6. Referencias.
1. International union of pure and applied chemistry. Standard methods for the analysis
of oils, fats soaps. 1954.
2. Consejo oleicota internacional, 1967.
Tabla 4.i
Densidad del agua en funcin de la temperatura, tomando como unidad la masa de 1 ml
de agua a 4 grad. C
0 grad. 0,999868
11 grad. 0,999637
21 grad. 0,998019
1 grad. 0,999927
12 grad. 0,999525
22 grad. 0,997697
2 grad. 0,999968
13 grad. 0,999404
23 grad. 0,997565
3 grad. 0,999992
14 grad. 0,999271
24 grad. 0,997323
4 grad. 1,000000
15 grad. 0,999126
25 grad. 0,997071
5 grad. 0,999992
16 grad. 0,998970
26 grad. 0,996810
6 grad. 0,999968
17 grad. 0,998801
27 grad. 0,996539
7 grad. 0,999929
18 grad. 0,998622
28 grad. 0,996259
8 grad. 0,999876
19 grad. 0,998432
29 grad. 0,995971
9 grad. 0,999808
20 grad. 0,998230
30 grad. 0,995673
10 grad. 0,999728
Los valores dados son numricamente iguales a la densidad absoluta en g/ml.
5. Prueba del frio
5.1. Principio.
Este mtodo mide la resistencia de la muestra a la cristalizacin y se usa corrientemente
como un ndice de los procesos de desmargarizacion.
Es aplicable a todos los aceites vegetales y animales refinados y secos.
5.2. Material y aparatos.
5.2.1. Frascos de vidrio de unos 115 ml, limpios y secos.
5.2.2. Bao de agua y hielo troceado. Llenar un recipiente de 2 o 3 litros de capacidad
con hielo finamente machacado, y aadir agua fria en cantidad suficiente para que
quede cubierto el cierre del frasco que contenga la muestra.
5.3. Procedimiento.
Filtrar una cantidad suficiente de muestra (200 a 300 ml) a traves de papel de filtro.
Calentar el filtrado, agitandolo continuamente hasta que adquiera exactamente una
temperatura de 130 grad. C.
Llenar completamente un frasco con el aceite muestra filtrado y tapar suavemente con
un tapon de corcho. Llevar a 25 grad. C en un bao de agua y recubrir el nte tapon con
parafina.
Sumergir el frasco en el bao agua-hielo, de forma que quede cubierto el cierre de
aquel. Reponer hielo para mantener los 0 grad. C y el nivel primitivo.
Al cabo de cinco horas y media retirar el frasco del bao y examinarlo detenidamente
para ver si se han formado cristales o enturbamiento. No confundir las burbujas de aire
finamente dispersadas con los cristales de grasa. La muestra habra resistido la prueba si
se conserva clara, limpia y brillante.
5.4. Expresion de resultados.
Negtiva o positiva.
5.5. Observaciones.
El fin del calentamiento inicial es eliminar las trazas de humedad y destruir los nucleos
cristalinos que pueden existir. Ambos interferirian la prueba ocasionando enturbamiento
por cristalizacion prematura.
5.6. Referencias.
1. American oil chemists' society. Official and tentative methods. Cc 11-42.
2. Instituto de racionalizacion del trabajo. Una norma espaola 55.042.
6. Indice de refraccion
6.1. Principio.
El indice de refraccion de una sustancia dada es la razon de la velocidad de un rayo de
luz en el vacio a la velocidad de luz a traves de la sustancia. Por convenencia practica se
refiere a la relacion aire-sustancia.
Es igualmente la relacion del seno del angulo de incidencia al seno del angulo de
refraccion.
El indice de refraccion de una sustancia dada varia con la longitud de onda del rayo de
luz refractado y con la temperatura. Salvo indicacion contraria el indice de refraccion
viene referido a la longitud de onda correspondiente a la linea d 589,3 nm de la luz del
sodio. El indice de refraccion se indica con la notacion nt para t grad. C y longitud de
onda de la linea d del sodio. Para otra radiacion de distinta longitud de onda a t grad. C,
la notacion sera (simbolo omitido).
Ta longitud de onda a t grad. C, la notacion sera con los refractometros usuales la
observacion se hace en luz difusa, provistos de un dispositivo de acromatismo de la
radiacion d de la luz del sodio.
6.2. Material y aparatos.
6.2.1. Refractometro de precision, que permita apreciar como minimo las
diezmilesimas, con prismas calentados por circulacion de liquido termostatado, +- 0,1
grad. C. Puede usarse una luz blanca si el refractometro utilizado posee un dispositivo
de compensacion cromatica.
6.3. Procedimiento.
El aceite debe estar limpio y exento de agua. Filtrar sobre papel de filtro seco, con la
ayuda, si es necesario, de sulfato sodico anhidro. Llenar con la materia grasa el espacio
comprendido entre los dos prismas. Hacer la lectura despues de 5 minutos, al menos, de
contacto. La temperatura de lectura no debe sobrepasar en +- 2 grad. La temperatura de
referencia.
6.4. Calculo.
Calcular el indice de refraccion referido a la temperatura de 20 gd. Para las grasas
liquidas a esa temperatura, y referido a 40 grad., 60 grad., 80 grad. O temperaturas
superiores para las materias grasas solidas.
Nt = nt' + (t' - t) f si t' > t
Nt = nt' - (t - t') f si t' < t
Nt = indice de refraccion a la temperatura de referencia t grad. Nt' = indice de refraccion
a la temperatura de lectura t' grad.
F = factor de correccion por temperatura.
largo del termometro mediante un anillo de goma, de forma que su curvatura coincida
con el bulbo del termometro. Introducir termometro y tubo en el bao de agua; cuidar
que el nivel de esta sea inferior al de la rama mas corta.
Calentar lentamente, a razon de 0,1-0,2 gd. C por minuto, observando con una lupa lar
lentamente, a razon de 0,1-0,2 gd. C por minuto, observando con una columna de grasa,
bien iluminada sobre fondo oscuro. La temperatura inicial es aquella en que la columna
comienza a descender (se descuelga). La temperatura final corresponde a la
desaparicion de todo enturbiamiento y aspecto limpio.
En caso de duda del punto final se compara el tubo de ensayo con otro con grasa
netamente fundida.
7.4. Expresion de los resultados.
Para utilizacion tecnica de resultados puede ser suficiente la indicacion de la
temperatura del punto inicial.
Pero si se utiliza solo la expresion: "punto de fusion", se indicaran las dos temperaturas,
inicial y final.
Si la grasa se ha introducido en el tubo al estado solido se hara constar: "punto de
fusion" (sin fundir previamente la grasa).
7.5. Referencia.
1. American oil chemists' society. Official and tentative methods. Cc 1-25.
8. Humedad
(metodo del xilol)
8.1. Principio.
Este metodo determina la cantidad total de agua no combinada que se encuentra en la
materia grasa.
8.2. Material y aparatos.
8.2.1. Matraz de vidrio de cuello corto, de 300 a 500 ml de capacidad, sobre el cual se
adapta el aparato especial representado en la figura 8.1. Consta de un tubo cilindrico
graduado en ml, provisto de llave de descarga en el extremo inferior; en el superior se
adapta un refrigerante de reflujo. Entre este y la terminacion de la graduacion, lleva el
tubo cilindrico otro tubo comunicante y paralelo a el, a cuyo extremo se adapta el
matraz.
8.3. Reactivos.
8.3.1. Xileno.
8.4. Procedimiento.
Eliminar todo vestigio de grasa del tubo graduado y del tubo inferior del refrigerante,
lavando sucesivamente con mezcla cromica, agua destilada y acetona. Secar.
Pesar de 20 a 50 g de materia grasa, en el matraz seco, con una aproximacion de 0,1 g.
Agregar de 100 a 300 ml de xileno y algunos trozos de piedra pomez. Calentar
progresivamente hasta la ebullicion y mantenerla hasta que el xileno destilado resulte
limpio y no separe mas agua. Dejar en reposo hasta perfecta separacion de las capas de
xileno y agua. Leer el volumen de agua.
8.5. Calculo.
Calcular el contenido de agua expresado en porcentaje.
(formula omitida)
8.6. Observaciones.
Si las gotas de agua quedan adheridas a la pared del tubo, desprenderlas calentando con
precaucion con una llama pequea.
8.7. Referencias.
1. E. W. Dean. D. D. Stark. Ind. Eng. Chem. 1920. 12. 486.
2. American oil chemists' society. Official and tentative methods. Da. 2a-45.
3. Instituto de racionalizacion del trabajo. Una norma espaola 55.001.
(figura omitida)
9(a). Humedad y materias volatiles (metodo de la estufa de aire)
9(a).1. Principio.
Se establecen las condiciones adecuadas para la determinacin, en las materias grasas,
del agua y de las materias volatiles, operando en las condiciones del ensayo.
Es aplicable a las grasas animales y vegetales, con la excepcion de los aceites secantes o
semisecantes y los aceites del grupo del coco.
9(a).2. Material y aparatos.
9(a).2.1. Estufa de desecacion, con regulacion de temperatura, pudiendose calentar hasta
150 gd. C como minimo; la regulacion se efectuara entre unos limites de oscilacion de
+- 2 gd. C, siendo, ademas, la temperatura uniforme en todo el espacio interior,
tolerandose diferencias que no excedan de 1 gd. C en entre posiciones extremas.
Es aplicables a todos los aceites y grasas del comercio, incluyendo los aceites secantes y
semisecantes. No es aplicable a los aceites del grupo del coco, conteniendo un 1 por 100
o mas de acidos grasos libres, ni a grasas que hayan sido adicionadas de
monogliceridos.
9(b).2. Material y aparatos.
9(b).2.1. Estufa de vacio. Estufa en cuyo interior pueda hacerse el vacio, bien sea con
trompa de agua o con bomba de caracteristicas adecuadas, pudiendose mantener el
vacio con la estufa desocupadas, al limite maximo alcanzable con la trompa de agua o
1mm de hg como minimo, si se opera con bomba de aceite. En las operaciones de
desecacion es preferible operar con trompa de agua.
Ira provista de dispositivos de calefaccion y regulacion de temperatura, pudiendose
calentar hasta 110 grad. C como minimo, regulandose entre unos limites de oscilacion
de +- 2 grad. C; la temperatura sera, ademas, uniforme en todo el espacio interior, - 2
grad. C; la temperatura sera, ademas, uniforme en tolerandose diferencias que no
superen 1 grad. C entre posiciones extremas.
En la estufa ira provista de termometro, convenientemente calibrado, dispuesto de la
forma conveniente para que el operador pueda comprobar, durante su funcionamiento,
la temperatura que existe en el interior.
9(b).2.2. Capsulas de fondo plano, con dimensiones aproximadas de 80 mm de
diametro, de 20 mm de altura, de acero inoxidable, aluminio o porcelana.
9(b).2.3. Desecador, conteniendo como agente desecante sulfato calcico o gel de silice
de 6-20 mallas. Tambien puede ser utilizado el acido sulfurico monohidrato (d = 1,84),
aunque para asegurar una desecacion efectiva debera ser renovado con frecuencia.
9(b).3. Procedimiento.
9(b).3.1. Preparacion de la muestra.
La muestra debe ser previamente homogeneizada antes de pesar la cantidad con que se
vaya a operar. Esto se logra, con las grasas fluidas, agitando fuertemente el frasco que
las contiene y vertiendo rapidamente la cantidad aproximada que se vaya apesar en la
capsula en la que se efectue la desecacion. Si se tratase de grasas solidas o semisolidas a
la temperatura ambiente, calentar suavemente en bao de agua hasta conseguir el grado
de fluidez conveniente, cuidando de no llegar a fundir completamente y homogeneizar
con un mezclador adecuado o simplemente con una espatula si no se dispusiese de este
instrumento.
9(b).3.2. Tecnica operatoria.
En una capsula desecada previamente en estufa a 105 grad. C y enfriada en un
desecador, pesar, con exactitud de medio miligramo, una cantidad aproximada de 5 a 10
g de muestra, segun el contenido de humedad, preparada como se ha indicado en
9(b).3.1.
Colocar en la estufa y hacer el vacio debiendose alcanzar una presion interna que no sea
superior a 100 mm hg. Poner en marcha la calefaccion, regulandose a la temperatura en
relacion a la presion interna de la estufa. Las condiciones normales de trabajo deben ser
50 mm hg y 60 grad. C; para una presion de 100 mm hg, la temperatura sera de 75 grad.
C; para valores intermedios, se calculara mediante interpolacion entre las cifras
indicadas.
Mantener la capsula en la estufa durante una hora. Secar y pasar a un desecador donde
se deja enfriar, pesando a continuacion. Repetir este tratamiento en operaciones
sucesivas, hasta que la diferencia entre dos pesadas consecutivas no exceda del 0,05 por
100.
9(b).4. Calculos.
(formula omitida)
9(b).5. Referencia.
1. Instituto racionalizacion del trabajo. Una norma espaola 55.082.
10. Acidez. Indice de acidez
10.1 principio.
La acidez que figura normalmente en los boletines de analisis es una expresion
convencional del contenido en tanto por ciento de los acidos grasos libres. Tambien se
denomina grado de acidez.
Indice de acidez, expresa el peso, en mg, de hidroxido potasico necesario para
neutralizar un gramo de materia grasa.
10.2. Reactivos.
10.2.1. Solucion etanolica de hidroxido potasico 0,5 n o 0,1 n.
10.2.2. Solucion al 1 por 100 de fenolftaleina en metanol de 95 por 100 v/v.
10.2.3. Mezcla etanol-eter etilico, 1:1, neutralizada exactamente con koh 0,1 n etanolica,
con fenolftaleina como indicador.
10.3. Procedimiento.
Pesar con una aproximacion de 0,01 g, 5 a 10 g. De grasa, en un erlenmeyer de 250 ml.
Disolverla en 50 ml de la mezcla etanol-eter etilico. Valorar, agitando continuamente,
con koh 0,5 n (o con 0,1 h para acideces inferiores a 2), hastao viraje del indicador.
0,5 n (o con 0,1 h para acideces inferiores a 2), hastao 10.4. Calculo.
11.5. Calculo.
Calcular El Indice De Saponificacion Expresado En Mg De Koh Por G De Grasa.
(Formula Omitida)
11.6. Observaciones.
Para Ciertas Materias Grasas Dificiles De Saponificar Es Necesario Calentar Durante
Mas De 60 Minutos.
11.7. Referencias.
1. Kottstorfer J. Zeitschrift F. Anal. Chemie. 1879. 18, 1990.
2. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods Por The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps 1964. Ii.D.2.
3. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.012.
4. Consejo Oleica Internacional, 1967.
11(b). INDICE DE SAPONIFICACION(Mtodo potenciomtrico)
11(b).1. Principio.-Se denomina ndice de saponificacin el peso en mg de hidrxido
potsico necesario para saponificar 1 g de materia grasa.
La determinacin se realiza saponificando la muestra con una disolucin previamente
valorada de hidrxido potsico, determinando por volumetra el exceso de hidrxido
potsico, utilizando indicador potenciomtrico. Este mtodo debe aplicarse cuando la
coloracin intensa de la solucin o turbidez dificulten la apreciacin del viraje del
indicador coloreado.
11(b).2. Material y aparatos.
11(b).2.1. Equipo de valoracin potenciomtrica equipado con electrodos de
vidrio/calomelano o wolframio/calomelano.
11(b).2.2. Agitador magntico.
11(b).2.3. Bureta de 25 ml. Dividida en dcimas de ml.
11(b).2.4. Pipeta aforada de 25 ml.
11(b).2.5. Matraz aforado de 1.000 ml.
11(b).2.6. Probeta graduada de 50 ml.
11(b).2.7. Matraces redondos de 100 ml. Provistos de tubo de reflujo, de un metro de
longitud, con ajuste normalizado 14/23.
11(b).2.8. Vasos de precipitado de 150 ml. Forma alta.
11(b).3. Reactivos.
11(b).3.1. Isopropanol.
11(b).3.2. Etilenglicol. Indice de refraccin a 20 C: 1,4274-1,4292.
11(b).3.3. Acido clorhdrico d = 1,18.
11(b).3.4. Hidrxido potsico.
11(b).3.5. Tris-(hidroxi-metil)-aminometano (CH2OH)3ONH4 de calidad utilizada para
la preparacin de soluciones patrn, peso equivalente 121,14.
13.3. Reactivos.
13.3.1. Solucion Etanolica De Hidroxido Potasico. Disolver 18 G De Koh En 20 Ml De
Agua Destilada, Y Diluir Con 50 Ml De Etanol De 95 Grad.
13.3.2. Acido Sulfurico Diluido. Diluir Un Volumen De Acido Concentrado (D = 1,84)
Con Cuatro Volumenes De Agua Destilada.
13.3.3. Solucion Acuosa De Clna Al 10 Por 100 P/V.
13.4. Procedimiento.
Pesar En La Capsula De 1.500 Ml Aproximadamente 50 G De Grasa Previamente
Homogeneizada. Fundir Lenta Y Progresivamente Calentando Hasta 115 - 118 Grad. C.
Agitando Y Frotando Constantemente Con Una Espatula Metalica Se Aade La
Solucionde Hidroxido Potasico Preparada. La Relacion De Grasa A Solucion Etanolica
De Hidroxido Potasico Debe Ser De 3 : 1.
Se Mueve Y Frota Constantemente La Masa Contenida En La Capsula, Que Se Sigue
Calentando A Fuego Lento Hasta Que El Jabon Obtenido Este Bastante Seco Para
Formar Fragmentos Que No Se Adhieran A La Espatula Por Simple Presion.
Verter Sobre El Jabon Un Litro De Agua Destilada Hirviente. Mantener La Ebullicion
De La Solucion Jabonosa Durante 45 Minutos De Manera Que Se Elimine El Alcohol Y
Se Obtenga Una Solucion Clara. Suprimir El Calentamiento. Reemplazar El Agua
Evaporada Con Agua Fria. Verter Con Precaucion 70 Ml De Acido Sulfurico Diluido.
Evitar Que Trazas De Jabon No Descompuesto Se Adhieran A Las Paredes O Al Borde
De La Capsula.
Llevar A Ebullicion Y Mantenerla Hasta Que Los Acidos Grasos Liberados Floten En
Forma De Capa Limpia (En El Caso Particular En Que La Materia Grasa Contenga
Gliceridos Del Acido Laurico, Esta Operacion Se Hara Sobre Bao De Agua Hirviente
Y No Con Ebullicion De La Capa Acuosa).
Lavar Los Acidos Dos Veces Con 500 Ml De Solucion De Clna Hirviente. Despues De
Cada Lavado Eliminar Tan Completamente Como Sea Posible La Capa Acuosa. Pasar
Los Acidos Grasos A Una Capsula, Adicionar Sulfato Sodico Anhidro Y Filtrar Sobre
Filtro Seco.
13.5. Observaciones.
Si La Preparacion De Los Acidos Grasos Tiene Por Objeto La Determinacion Del Peso
Molecular Medio, Asegurarse Que La Ultima Capa Acuosa Eliminada Es Neutral Al
Naranja De Metilo.
Si La Preparacion De Los Acidos Grasos Tiene Por Objeto La Determinacion Del
Titulo, Dejar Los Acidos Grasos Cristalizar En Un Desecados A La Temperatura Del
Laboratorio Durante 24 Horas Antes De La Determinacion.
13.6. Referencia.
15.2.1.5. Placa De Amianto O Similar, Para Proteger La Periferia Del Matraz Del
Contacto Directo De La Llama (E). Dimensiones: Diametro 120 Mm (+- 5 Mm).
Espesor, 6 Mm. Orificio Central Circular De 45 Mm De Diametro, Que Soporta El
Matraz Durante El Calentamiento.
15.2.2. Fuente De Calor, Que Permite Efectuar Sin Modificacion De Regimen La
Destilacion En El Tiempo Prescrito.
15.3. Reactivos.
15.3.1. Glicerina (D = 1,26), Correspondiente A 98 Por 100, P/P, De Glicerol Neutro A
La Fenolftaleina.
15.3.2. Solucion Acuosa De Hidroxido Sodico, 44 Por 100 P/P. Eventualmente Dejar
Calentar O Filtrar Al Abrigo Del Co2. La Solucion Empleada Debe Estar Perfectamente
Limpia Y Clara.
15.3.3. Agua Destilada, Exenta De Co2 Por Reciente Ebullicion.
15.3.4. Solucion De Acido Sulfurico N.
15.3.5. Solucion Acuosa De Hidroxido Sodico O Potasico, 0,1 N, De Normalidad
Conocida Exactamente.
15.3.6. Piedra Pomez En Granos. Tamao De Grano, Entre 1,5 Y 2 Mm.
15.4. Procedimiento.
Procedimiento.
15.4.1. Acidos Volatiles Solubles. Pesar Exactamente En El Matraz Tarado 5 G De
Materia Grasa A La 0,01 De Gramo. Agregar 20 G (Aproximadamente 16 Ml) De
Glicerol. Agregar 2 Ml De La Solucion De Hidroxido Sodico Al 44 Por 100 P/P,
Utilizando Una Bureta Protegida Contra El Co2, Descartando Las Primeras Gotas.
Calentar El Matraz Sobre Una Llama Libre, Agitando Continuamente Hasta Que La
Grasa Sea Completamente Saponificada, En Este Punto El Liquido No Formara Mas
Espuma, Y Su Aspecto Sera Limpio. Se Evitara Todo Sobrecalentamiento Durante La
Saponificacion.
Dejar Enfriar Hasta Aproximadamente 90 Grad. C. Agregar 93 Ml De Agua Destilada
Caliente. Homogeneizar Por Agitacion; El Liquido Estara Limpio. Agregar De 0,6 A
0,7 G De Piedra Pomez En Granos, Despues 50 Ml De La Solucion Acuosa De Acido
Sulfurico N. Montar El Matraz En El Aparato. Calentar Muy Moderadamente Hasta
Que Los Acidos Grasos Liberados Se Reunan En La Superficie, Formando Una Capa
Limpia. Establecer El Regimen De Calefaccion De Forma Que En 19 A 21 Minutos Se
Recojan 110 Ml De Destilado. El Destilado Se Recoge En El Matraz Aforado. La
Temperatura De Agua A La Salida Del Refrigerante Debe Estar Comprendida Entre 15
Grad. C Y 20 Grad. C. La Destilacion Comienza Cuando Se Forma La Primera Gota En
La Extremidad Del Tubo Acodado Unida Al Refrigerante.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. 1964.Ii.D.9.
2. American Oil Chemists' Society. Official And Tentative Methods Cd 5-40.
16(a). INDICE DE IODO
(Metodo De Wijs)
16(a).1. Principio.
El Indice De Iodo De Un Cuerpo Graso En Funcion De Su Grado De Insaturacion. Se
Determina Aadiendo A La Muestra Un Exceso De Reactivo Halogenado, Valorando El
Reactivo Que No Reacciona.
Se Expresa Convencionalmente Por El Peso De Iodo Absorbido Por Cien Partes En
Peso De La Materia Grasa.
16(a).2. Material Y Aparatos.
16(a).2.1. Navecillas De Vidrio De 2 A 3 Ml De Capacidad.
16(a).2.2. Matraces Erlenmeyer De Vidrio, De Boca Ancha, Con Tapon Esmerilado, De
Aproximadamente 300 Ml.
Todo El Material Debe Estar Perfectamente Limpio Y Seco.
16(a).3. Reactivos.
16(a).3.1. Solucion Acuosa De Ioduro Potasico Al 10 Por 100 P/V. Esta Solucion Debe
Estar Exenta De Iodo Y De Iodato Potasico.
16(a).3.2. Solucion Acuosa De Tiosulfato Sodico, 0,1 N.
16(a).3.3. Tetracloruro De Carbono Puro. Comprobar Que Esta Exento De Materias
Oxidables. Agitando 10 Ml Con 1 Ml De Solucion Acuosa Saturada De Dicromato
Potasico Y 2 Ml De Acido Sulfurico Concentrado, No Debe Aparacer Coloracion
Verde.
16(a).3.4. Engrudo De Almidon.
16(a).3.5. Reactivo De Wijs.
16(a).3.5.1. Con Tricloruro De Iodo.
Pesar 9 G De Tricloruro De Iodo Icl3 En Un Matraz De Vidrio Topacio De 1.500 Ml;
Disolver En Un Litro De Una Mezcla Compuesta De 700 Ml E Acido Acetico Y 300
Ml De Tetracloruro De Carbono.
(Formula Omitida)
16(a)6. Referencias.
1. Z. Angew Chem 1898, 11, 291.
2. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.013.
16(B). Indice De Iodo (Metodo De Hanus)
16(B).1. Principio.
Como 16(a).1.
16(B).2. Material Y Aparatos.
16(B).2.1. Frasco De Boca Ancha, De 200 A 220 Ml De Capacidad, Con Tapon
Esmerilado.
16(B).2.2. Buretas Graduadas De 0,1 De Ml, Comprobadas Y Contrastadas.
16(B).2.3. Buretas O Pipetas De 25 Ml De Salida Rapida.
16(B).3. Reactivos.
16(B).3.1. Tetracloruro De Carbono, Inerte A La Solucion De Hanus.
16(B).3.2. Solucion De Ioduro Potasico Al 10 Por 100, Exenta De Iodo Y De Iodatos.
16(B).3.3. Solucion De Tiosulfato Sodico 0,1 N.
16(B).3.4. Engrudo De Almidon.
16(B).3.5. Reactivo De Hanus: Disolver En Un Frasco De Color Amarillo, Con Tapon
Esmerilado, 10 G De Monobromuro De Iodo En 500 Ml. De Acido Acetico
Cristalizable (99-100 Por 100), Exento De Etanol.
16(B).4. Procedimiento.
Trabajar En Luz Difusa.
En El Frasco Limpio Y Seco, A Pesar De 0,25 A 0,30 G De Materia Grasa Limpia Y
Filtrada Sobre Papel (Tomar Una Cantidad De Grasa Tal Que, Una Vez Finalizada La
Reaccion, Debera Quedar Sin Absorber Una Cantidad De Iodo Igual, Por Lo Menos, Al
70 Por 100 De La Cantidad Total De Iodo Aadida.
Disolver La Materia Grasa En 10 Ml De Tetracloruro De Carbono. Aadir, Mediante
Bureta O Pipeta De Salida Rapida, 25 Milimetros Exactos Del Reactivo De Hanus.
Tapar El Frasco, Mezclar Por Agitacion Suave. Dejar Reposar Al Abrigo De La Luz
Durante Una Hora, A Una Temperatura De 20 Grad. +- 5 Grad. C.
Aadir 20 Ml De Solucion De Ioduro Potasico, Y 100 Ml De Agua Destilada. Mezclar.
Valorar Con La Solucion De Tiosulfato Sodico 0,1 N (Utilizando Engrudo De Almidon
Como Indicador), Agitando Constantemente. Aadir El Engrudo De Almidon Poco
Antes De Finalizar La Valoracion.
Realizar Una Prueba En Blanco En Identicas Condiciones.
16(B).5. Calculo.
(Formula Omitida)
16(B).6.Referencias.
1. Ztschr.Untersuch. Nahr. Und Genussm. 1901, 4, 913, 20.
2. Consejo Oleicola Internacional, 1967.
3. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.013.
17. INDICE DE TIOCIANOGENO
17.1. Principio.
Cianogeno
El Indice De Tiocianogeno De Una Materia Grasa Es Funcion De Su Grado De
Insaturacion. En La Practica Se Determina Por La Fijacion De Tiocianogeno, Y
Convencionalmente Se Expresa Por El Peso De Iodo Equivalente Al Tiocianogeno
Absorbido Por 100 Partes En Peso De La Grasa.
El Tiocianogeno (Scn)2 Se Fija Sobre Los Dobles Enlaces Como Los Halogenos. Es
Menos Reactivo Que Los Halogenos Y Su Fijacion Solo Es Cuantitativa Con El Acido
Oleico.
Se Considera Que Aproximadamente El (Scn)2 Se Fija Sobre Un Doble Enlace Del
Acido Linoleico Y Sobre Dos Dobles Enlaces Del Acido Linolenico.
17.2. Material Y Aparatos.
17.2.1. Navecillas De Vidrio De 2 A 3 Ml.
17.2.2. Matraces De Vidrio De Boca Esmerilada.
17.2.3. Embudo Buchner.
Todo El Material Debe Estar Perfectamente Lavado Y Seco.
17.3. Reactivos.
17.3.1. Acido Acetico Glacial Puro. Antes De Su Empleo Calentarle A Ebullicion Con
Refrigerante De Reflujo, Durante 3 Horas, Con 10 Por 100 V/V De Anhidrido Acetico.
Destilar Sobre Anhidrido Fosforico.
17.3.2. Tiocianato De Plomo. Disolver 250 G De Acetato De Plomo, Quimicamente
Puro (Ch3coo)2 Pb. 3 H2o En 500 Ml De Agua Destilada; Disolver 250 G De
Tiocianato Potasico En 500 Mililitros De Agua Destilada, Mezclar Las Dos Soluciones,
Filtrar El Tiocianato De Plomo Precipitado Sobre Embudo Buchner. Lavar Con Agua
Destilada, Despues Con Etanol De 95 Por 100 V/V, Y Por Ultimo Con Oxido De Etilo.
Secar El Precipitado Tan Completamente Como Sea Posible, Mediante Aspiracion Por
Vacio; Recoger El Precipitado En Una Capsula De Porcelana, Y Colocar Esta En Un
Desecador Con Anhidrido Fosforico, Durante Ocho A Diez Dias. El Tiocianato De
Plomo Asi Obtenido Debe Presentar Color Debilmente Amarillo Blanquecino O
Verduzco. Si Se Presenta Coloracion Mas Intensa, Volver A Someterle Al Mismo
Tratamiento. Guardando En Frasco Amarillo-Pardo, Al Abrigo De La Luz, Puede
Conservarse Hasta Dos Meses. Si Se Ha Coloreado Intensamente No Utilizarlo.
17.3.3. Bromo Puro, Previamente Desecado.
17.3.4. Tetracloruro De Carbono; Agitar Dos Veces El Tetracloruro De Carbono
Empleando Cada Vez El 5 Por 100 V/V De Acido Sulfurico Concentrado. Separa El
Tetracloruro De Carbono. Lavar Con Agua Destilada, Despues Con 5 Por 100 V/V De
Una Solucion Acuosa De Hidroxido Potasico Al 50 Por 100 P/V. Agitar Con Hidroxido
Potasico En Pastillas. Destilar Sobre Anhidrido Fosforico.
17.3.5. Ioduro Potasico Exento De Iodo Y Iodato.
17.3.6. Solucion Acuosa De Tiosulfato Sodico 0,1 N De Normalidad Conocida.
17.3.7. Solucion De Tiocianogeno Aproximadamente 0,2 N. Poner En Suspension 50 G.
De Tiocianato De Plomo En 500 Ml De Acido Acetico. Disolver, Por Separado, 5,1 Ml
De Bromo En 100 Ml De Acido Acetico. Verter Por Pequeas Porciones La Solucion
De Bromo En La Solucion De Tiocianato De Plomo, Agitando Vigorosamente Despues
De Cada Adicion Hasta Decoloracion Completa. Dejar Decantar. Filtrar Tan
Rapidamente Como Sea Posible Por Embudo Buchner, Previamente Secado,
Recogiendo El Filtrado En Un Matraz Seco.
Colocar El Embudo Buchner Sobre Un Segundo Matraz Y Filtrar De Nuevo; El Filtrado
Debe Ser Limpio E Incoloro. Conservarle En Un Frasco De Vidrio De Color Amarillo
O Pardo, De Tapon Esmerillado, Perfectamente Seco, Y En Lugar Fresco (Temperatura
Inferior A 20 Grad. C). De No Observar Estas Condiciones Se Altera Rapidamente.
Antes De Su Utilizacion, Comprobar Que Permanece Incoloro.
17.4. Procedimiento.
Pesar Con Una Precision De 1 Mg, En Una Navecilla De Vidrio, La Cantidad Necesaria
De Materia Grasa, Segun Las Indicaciones De La Tabla Siguiente (La Cantidad De
Solucion De Tiocianogeno Sera De Un 150 Por 100 En Exceso):
(Tabla Omitida)
Introducir La Navecilla Y Su Contenido En Un Matraz De Boca Esmerillada. Agregar
10 Ml De Tetracloruro De Carbono. Disolver. Agregar 25 O 50 Ml Exactamente
Medidos De La Solucion De Tiocianogeno. Tapar El Matraz. Mezclar Por Agitacion.
Dejar En La Oscuridad Durante 24 Horas, A Una Temperatura De Aproximadamente
20 Grad. C.
Agregar 2 G De Ioduro Potasico Pulverizado. Agitar Durante 3 Minutos. Agregar 30 Ml
De Agua Destilada. Valorar En Presencia De Engrudo De Almidon, Con La Solucion
De Tiosulfato Sodico 0,1 N, Hasta Desaparicion Del Color Azul Despues De Energica
Agitacion.
Realizar Un Ensayo Un Blanco, Sin Materia Grasa, En Las Mismas Condiciones.
Las Solucion De Tiocianogeno Debe Valorarse Antes De Iniciar Los Ensayos. Si La
Diferencia Entre Esta Valoracion Y La Del Ensayo En Blanco Es Superior 0,2 Ml,
Significa Que La Solucion Se Descompone Muy Rapidamente; Repetir Las
Operaciones Con Otra Solucion Mas Correcta.
Los Ensayos Sobre Materia Grasa Y En Blanco Se Realizaran Al Menos Por Duplicado.
Si Entre Ambos Ensayos, Sobre Materia Grasa Y En Blanco, Se Obtienen Diferencias
Superiores A 2 Unidades Del Indice De Tiocianogeno, Repetir La Determinacion.
17.5. Calculo.
(Formula Omitida)
17.6. Referencias.
1. H.P. Kaufmann, Chem. Ztg. 1925, 49, 768.
2. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps 1964. Ii.D.8.
18. INDICE DE POLIBROMUROS
18.1. Principio.
El Indice De Polibromuros De Una Sustancia Grasa Es El Peso En G De Polibromuros
Obtenidos, En Las Condiciones Descritas A Partir De 100 G De Grasa.
El Metodo Tiene Caracter Convencional, Por Lo Que Sus Prescripciones Han De Ser
Observadas Rigurosamente.
18.2. Material Y Aparatos.
18.2.1. Matraz De Saponifiacion, De Unos 200 Ml, Con Boca Esmerilada Adaptable A
Un Tubo Refrigerante De Reflujo De Aproximadamente 1 M De Largo.
18.2.2. Matraz Aforado De 100 Ml.
18.2.3. Matraz Erlenmeyer De Unos 100 Ml De Capacidad.
18.2.4. Ampollas De Decantacion De 500 Ml. 18.2.5. Crisol Con Placa Filtrante G3,
Con Dispositivo Para Refrigerar Y Kitasato Para Recoger El Filtrado.
18.3. Reactivos.
18.3.1. Disolucion Alcoholica De Hidroxido Potasico 1 N.
18.3.2. Disolucion De Acido Clorhidrico 1 N.
18.3.3. Disolucion Acuosa De Anaranjado De Metilo Al 0,1 Por 100.
18.3.4. Eter Etilico, Seco.
18.3.5. Solucion Acuosa Al 10 Por 100 De Cloruro Sodico.
18.3.6. Sulfato Sodico Anhidro.
18.3.7. Disolucion De Bromo. Agregar 4 Ml De Bromo Puro Y Seco, Enfriados A 0
Grad. C, A 100 Ml De Eter Etilico Seco, Previamente Enfriados A La Misma
Temperatura. Realizar La Adicion De Bromo Por Pequeas Porciones, Dejandolas
Resbalar Por Las Paredes Del Recipiente Y Agitando En Cada Adicion. Mantener A 0
Grad. Hasta El Momento De Su Utilizacion.
18.4. Procedimiento.
18.4.1. Preparacion De Los Acidos Grasos. Pesar Con Precision De 10 Mg, 5 G De
Grasa En El Matraz De Saponificacion. Agregar 25 Ml De Potasa Alcoholica 1 N.
Acoplar El Refrigerante Y Calentar A Ebullicion, Con Una Pequea Llama, Durante 30
Minutos.
Al Principio De La Calefacion Agitar El Matraz Por Rotacion Suave, Para
Homogeneizar Su Contenido, A Fin De Evitar El Sobrecalentamiento De La Grasa,
Terminada La Saponificacion, Separar El Refrigerante. Agregar 50 Ml De Agua
Destilada Y Pasar El Contenido Del Matraz A La Ampolla De Decantacion, Utilizando
En Varias Veces, 80 Ml De Agua En Total. Agregar 50 Ml De Eter Etilico Y Ligero
Exceso De Acido Clorhidrico 1 N, Calculado Mediante La Adicion De Dos Gotas De
Anaranjado De Metilo. Agitar Fuertemente La Ampolla Para Disolver Totalmente Los
Acidos Grsos Liberados. Dejar Reposar Hasta Que Se Separen Netamente Las Dos
Capas. Pasar La Disolucion Hidro-Alcoholica A Otra Ampolla De Decantacion Y
Extraer Nuevamente Con Otros 50 Ml De Eter Etilico, Repitiendo La Operacion
Anterior. Reunir Los Dos Extractos Etereos En Una Misma Ampolla Y Lavar Tres
Veces, Con 50 Ml Cada Una, Con La Disolucion De Cloruro Sodico. En Los Tres
Lavados Se Obtendra Una Buena Decantacion, Por Adecuada Separacion De Las Dos
Capas.
Pasar La Disolucion Eterea A Un Matraz Aforado De 100 Ml Y Completar Hasta El
Enrase Con Eter Etilico. Aadir Una Pequea Cantidad De Sulfato Sodico Anhidro (De
1 A 2 G) Para Asegurar La Deshidratacion. Tapar El Matraz Y Agitar Para
Homogeneizar.
En El Caso De Que La Bromacion No Vaya A Realizarse Inmediatamente, Llenar El
Matraz Con Co2 O Con N2 Tapar Y Conservar En Lugar Oscuro.
18.4.2. Bromuracion. Pesar El Matraz Erlnmeyer De 100 Milimetros, Previamente
Secado En Estufa Y Enfriado En Desecador. Agregar Una Cantidad De Polibromuros
Del Orden De 0,1 G, Obtenidos A Partir Del Mismo Aceite U Otro De Naturaleza
Analoga; Pesar Nuevamente El Matraz. Los Polibromuros Han De Estar Perfectamente
Divididos.
Agregar Al Matraz 20 Ml, Exactamente Medidos Con Pipeta, De La Disolucion Etera
De Los Acidos Grasos. Agitar Para Asegurar La Disolucion De Los Polibromuros.
Tapar El Matraz E Introducirlo En Hielo Fundente Durante 15 Minutos, Agitando De
Cuando En Cuando, Para Saturar El Liquido De Polibromuros.
Aadir 20 Ml De La Disolucion De Bromo, Poco A Poco Y Resbalando Por La Pared,
Agitar En Cada Adicion, Cuidando De Que La Temperatura No Exceda Nunca De + 2
Grad. C. Una Vez Que Se Han Agregado Los Dos Tercios Del Reactivo, Se Puede
Aadir El Resto Mas Rapidamente, Utilizando Las Ultimas Porciones Para Limpiar Las
Paredes Del Matraz. Tapar Y Dejar En Hielo Fundente Durante 3 Horas.
Realizar Un Ensayo En Blanco, En Las Mismas Condiciones.
18.4.3. Filtracion Y Lavados. Al Cabo De Las 3 Horas, Filtrar La Disolucion De Los
Acidos Grasos Por El Crisol De Placa Filtrante, Previamente Desecado En Estufa A 105
Grad. , Enfriado En Desecador Y Tarado. El Crisol Estara Rodeado De Hielo Fundente,
Facilitar La Filtracion Mediante Un Debil Vacio, Que Sera Eliminado Antes De Que Se
Consuma El Liquido Sobre La Placa Filtrante.
Lavar Cuatro Veces La Torta De Polibromuros Con Disolucion De Polibromuros En
Eter Etilico (0,06 G En 100 Ml), Enfriada A 0 Grad. C. En Los Dos Primeros Lavados
Utilizar 20 Ml Cada Vez, Y En Los Dos Ultimos, 10 Ml Cada Vez. Adicionar Estos
Volumenes De Eter Sucesivamente Al Matraz Donde Se Ha Efectuado La Precipitacion,
Cuidando De Lavar Bien Las Paredes Y Agitando Energicamente Para Desprender Las
Particulas Adheridas. Despues De Efectuar Estas Operaciones Conviene Introducir El
Matraz En Hielo Fundente, Y No Verter El Eter En El Crisol Hasta Segurarse De
Haberlo Enfriado A 0 Grad. C. Cuando Se Opera Con Aceite De Indica De
Polibromuros Bajo Pueden Reducirse Los Lavados A Tres Solamente, Utilizando En
Cada Uno Un Volumen De 10 Ml.
18.4.4. Desecacion Y Pesada. Colocar En Estufa Los Crisoles Y Erlenmeyer Que Se
Han Utilizado En La Precipitacion; Elevar Progresivamente La Temperatura Hasta
Ml De Eter Etilico Cada Vez, Y Despues Otras Tres Veces, Con 8 Ml De Agua
Destilada Cada Vez, Incorporando Todos Los Lavados Al Embudo De Separacion.
Agitar Y Dejar Reposar Hasta La Separacion De Las Dos Capas. Pasar La Capa Acuosa
Al Matraz Erelnmeyer De 300 Ml Repetir La Extraccion Del Extrato Etereo Contenido
En El Embudo De Separacion, Con 25 Ml Y Despues Con 10 Ml De Agua Destilada,
Incorporar La Capa Acuosa Al Matraz De 300 Ml.
Valorar Todos Los Extractos Acuosos Reunidos Con Disolucion De Hidroxido Sodico
N, Usando Fenolfttaleina Como Indicador.
Realizar Simultaneamente Un Ensayo En Blanco.
19.5. Calculo.
(Formula Omitida)
19.6. Observaciones. Es Conveniente Que El Agua Empleada Sea Destilada,
Recientemente Hervida Y Enfriada.
19.7. Referencias.
1. H. P. Kaufmann, J. Baltes. Fette Und Seifen 1936. 43, 93.
2. American Oil Chemists' Society. Official And Tentative Methods. Ka 12-55.
21 Indice De Peroxidos
20.1. Principio.
Este Metodo Determina Los Acidos Oxidados Contenidos En Las Grasa, Expresados En
Materia Grasa Insoluble En Eter De Petroleo.
Teniendo Caracter Empirico, Exige Observar Estrictamente Las Condicones Prescritas.
20.2. Material Y Aparatos
20.2.1. Matraz De 150 Ml, Adaptable A Refrigerante De Reflujo.
20.2.2. Ampollas De Decantacion De 500 Ml.
20.2.3. Estufa Estabilizada A 103 Grad. C (+- 2 Grad. C).
20.2.4. Crisol De Porcelana De 45 Mm De Altura Y 40 Mm De Diametro.
20.3. Reactivos.
20.3.1. Solucion Atanolica De Hidroxido Potasico, Aproximadamente 2 N. Disolver
112 G De Potasa En 500 Ml De Etanol De 96 Grad., Y Una Vez Fria La Solucion, R
Enrasar A 1.000 Ml Con Etanol De 96 Grad.
20.3.2. Eter De Petroleo (P.E. 40 Grad. -60 Grad. C) Bidestilado, Exento De Residuo.
Ter De Petroleo (P.E. 40 Grad. -60 Grad. C) Bidestilado, Exento De 20.3.3. Solucion
De Acido Clorhidrico N.
20.3.4. Eter Etilico (C2h5)2 O,D=0,712-0,714.
20.3.5. Etanol, 95 Grad. Exento De Acidez.
20.4. Procedimiento.
Tratar 5 G De Grasa Pesados Con Una Aproximacion De 10 Miligramos Como En
22(B).4, Hasta Agotamiento De La Disolucion Hidroalcocholica De Jabon Por El Eter
Y Los Dos Primeros Lavados.
Colocar La Disolucion Hidroalcholoca Y El Agua Procedente De Los Dos Primeros
Lavados Del Eter En Una Capsula De 500 Mililitros. Hervir Hasta Que Queden
Eliminadas Las Trazas De Eter Disuelto Y El Alcohol En Su Totalidad.
Trasvasar El Contendio De La Capsula A Una Ampolla De Decantacion De 500 Ml,
Lavando La Capsula Con Pequeas Cantidades De Agua, Procurando Que El Volumen
Total Del Liquido En La Ampolla Sea De 150 Ml Aproximadamente.
Aadir Solucion De Acido Clorhidrico N En Ligero Exceso (51 Ml Aproximadamente).
Agitar 2 Minutos. Despues De Agitado No Ha De Quedar Espuma; En Caso Contrario
Se Aade Un Poco Mas De Acido.
Agregar A La Ampolla 100 Ml De Eter De Petroleo. Agitar 1 Mimunto. Dejar Reposar
12 Horas. Decantar El Agua Acida. Filtrar La Solucion De Eter Sobre Un Filtro Lento
De 90 Mm De Diametro.
Los Acidos Oxidados Se Adhieren Generalmente A Las Paredes Del Tubo Y Aparecen
En Forma De Una Masa Roja Oscura.
Si Los Acidos Oxidados Son Abundantes, Hacer Salir El Eter De Petroleo Por La Parte
Superior De La Ampolla, Para Evitar Que Los Acidos Obturen Con 25 Ml De Eter De
Petroleo Y Filtrar. Lavar Tambien Con Eter De Petroleo El Tubo De Vaciado De La
Ampolla Y El Embudo, El Filtrado Y El Pico Del Embudo Con Porciones De 10, 10 Y
5 Ml Respectivamente. Seguidamente Desecar El Exterior Del Pico Del Embudo Y El
Del Tubo De Vaciado Del Embudo De Decantacion.
Disolver En Etanol De 95 Grad. Por 100 V/V Caliente, Los Acidos Oxidados
Contenidos En La Ampolla: Una Vez Con 25 Ml Caliente, Y Otra Con 50 Ml De Etanol
De Etanol Caliente. Pasar Sucesivamente Cada Porcion Caliente Por El Filtro. Nol
Lavar El Tubo De Vaciado De La Ampolla, El Filtro Y El Cono Del Embudo Con
Porciones Respectivas De 5 Ml De Etanol Caliente, Recoger Las Soluciones
Alcoholicas En Un Vaso De 400 Ml.
Evaporar El Etanol Hasta Un Volumen Muy Pequeo (Algunos Ml).
21.3. Reactivos.
21.3.1. Cloroformo, Para Analisis, Exento De Oxigeno Por Barboteo De Una Corriente
De Gas Inerte Puro Y Seco.
21.3.2. Acido Acetico Glacial Puro Exento De Oxigeno Como En 2.3.1.
21.3.3. Solucion Acuosa Saturada De Yoduro Potasico, Exento De Yodo Y Yodatos.
21.3.4. Soluciones Acuosas De Tiosulfato Sodico 0,01 N Y 0,002 N Exactamente
Valoradas.
21.3.5. Solucion Indicadora De Almidon Al 1 Por 100 En Agua Destilada.
21.4. Procedimiento.
Tomar Un Matraz Con Cierre Esmerilado, De Unos 25o Ml, Previamente Seco, Y
Llenar Con Un Gas Inerte, Puro Y Seco (Anhidrido Carbonico O Nitrogeno). Introducir
Tan Rapidamente Como Se Pueda La Muestra Del Aceite Que Se Desa Ensayar,
Definida En Funcion De Los Indices Presumidos (Ver 21.6.1.).
Agregar 10 Ml De Cloroformo, En El Caul Se Disuelve Rapidamente La Grasa Por
Agitacion, 150 Ml De Acido Acetico Glacial Y 1 Ml De Una Disolucion Acuosa De
Yoduro Potasico.
Cerrar El Matraz Y Mantener En Agitacion Durante Un Minuto, Imprimiendole Un
Suave Movimiento De Rotacion, Conservandolo Despues En La Oscuridad Durante 5
Minutos; Transcurrido Este Tiempo, Agregar 75 Ml De Agua, Agitar Vigorosamente Y
Valorar El Yodo Liberado Con Una Disolucion De Tiosulfato 0,002 N, Para Los
Aceites De Indices Inferiores O Iguales A 20 Y 0,01 N Para Los Indices Mas Elevados.
Paralelamente, Se Efectua Un Ensayo Testigo, Sin Aceite, Que Debe Dar Un Indice
Nulo.
21.5. Calculos.
El Indice De Peroxidos Se Expresa En Miliequivalentes De Oxigeno Por Kilogramo De
Muestra, Y Se Calculara Aplicando La Formula Siguiente:
(Formula Omitida)
21.6. Obsrvaciones.
21.6.1. Peso De La Muestra. La Toma De Las Muestras Para El Ensayo Se Efectuara
Tomando Una Cantidad De Grasa De Acuerdo Con El Indice De Peroxidos Que Se
Presupone Y Que Se Indica En El Cuadro Siguiente:
(Tabla Omitida)
21.6.2. Para La Expresion Del Indice De Peroxidos Se Han Propuesto Otras Unidades
Distintas A La Adoptada En Esta Norma Y Que Suelen Ser Utilizadas, En Algunos
Casos, Presentandose A Confusiones En La Interpretacion De Resultados. Para Evitar
Estos Errores Y Los Inconvenientes Que Pudieran Derivarse De Los Mismo, En Los
Informes Analiticos Debera Indicarse Siempre La Unidad En La Que Se Expresa El
Indice.
Para Facilitar El Paso De Una Unidad A Otra, Se Indican A Continuacion, Los Factores
De Conversion Por Los Que Debera Multiplicarse, En Cada Caso, La Cifra Del Indice,
Expresado En Una Determinada Unidad, Para Obtener La Cifra Equivalente En La
Unidad Que Se Define En 21.1.
(Tabla Omitida)
21.7. Referencias.
1. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.023.
2. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps 1964.Ii.D.13.
22 (a). INSAPONIFICABLE
(Metodo Eter De Petroleo)
22(a).1. Principio.
Se Entiende Por Insaponificable El Peso En G De Sustancias No Saponificables,
Insolubles En Agua Y Solubles En El Disolvente Utilizando En La Determinacion,
Contenidas En 100 G De Grasa.
El Metodo Es Aplicable A Todas Las Materias Grasas, Su Exactitud Es Solo
Aproximada Para Aquellas Grasas Con Un Contenido De Insaponificable Muy Elevado.
22(a).2. Material Y Aparatos.
22(a).2.1. Matraz De Fondo Plano, De 200 Ml, Adaptable A Refrigerante De Reflujo.
22(a).2.2. Refrigerante De Reflujo.
22(a).2.3. Embudos De Separacion De 500 Ml.
22(a).2.4. Estufa Graduable A 103 Grad. (+- 2 Grad. C).
22(a).3. Reactivos.
22(a).3.1. Solucion De Hidroxido Potasico, Alcoholica, 2 N, En Etanol, De 95 Por 100
V/V.
22(a).3.2. Eter De Petroleo (P.E. 40 Grad. - 60 Grad.; Indice De Bromo, 1), Redestilado
Y Exento De Residuo.
22(a).3.3. Etanol Al 50 Por 100 En Volumen.
22(a).3.4. Agua Destilada.
22(a).3.5. Solucion De Heliantina Al 1 Por 100.
22(a).3.6. Solucion De Acido Clorhidrico 0,1 N.
Ss.(a).4. Procedimiento.
Eliminar El Agua De La Muestra Por Decantacion Y Filtracion Sobre Papel, Efectuadas
A Una Temperatura Ligeramente Superior Al Punto De Fusion De Determinados
Componentes Solidos Que Hubieran Podido Separarse De La Materia Grasa Fluida.
Pesar En El Matraz 5 G De Materia Grasa, Con Una Aproximacion De 0,01 G.
Aadir 50 Ml De Solucion Alcoholica De Potasa 2 N. Adaptar Refrigerante De Reflujo.
Calentar Una Hora Con Ligera Ebullicion. Separar La Fuente De Calor. Agregar Por La
Parte Superior Del Refrigerante 50 Ml De Agua Destilada Y Agitar. Dejar Enfriar.
Transvasar El Contenido Del Matraz A Un Embudo De Decantacion, Aclarar Y
Arrastrar Las Ultimas Prociones Lavando El Matraz Varias Veces Con 50 Ml De Eter
De Petroleo En Total.
Agitar Energicamente Durante Un Minuto. Dejar En Reposo Hasta La Completa
Separacion De Las Dos Fases. Pasar A Un Segundo Embudo De Decantacion La Fase
Jabonosa. Extraer Esta Con Otros 50 Ml De Eter De Petroleo; Decantarla De Nuevo Y
Voler A Extraer Con 50 Ml De Eter De Petroleo.
Reunir Las Tres Fracciones Etereas En Un Mismo Embudo De Separacion Y Lavarlas
Tres Veces Segudias, Utilizando Cada Vez 50 Ml De Etanol Al 50 Por 100 V/V.
Transvasar La Solucion De Eter De Petroleo A Un Pequeo Matraz De Cuello Corto,
Previamente Tarado Y Eliminar El Disolvente Por Destilacion En Bao De Agua
Hirviendo.
Secar Colocando El Matraz En Posicion Horizontal En Una Estufa Regulada A 103gd.
Durante 15 Minutos. Dejar Enfriar En Desecador Y Pesar. Repetir La Operacion Hasta
Que Las Perdidas Entre Dos Pesadas Consecutivas Sean Inferiores A 0,10 Por 100.
Incinerar Las Sustancias Insaponificables Obenitdas, Y Si Dejan Cenizas, Dosificar Su
Alcalinidad En Presencia De Heliantina Con Una Solucion De Acido Clorhidrico 0,1 N
(1 Ml De Esta Solucion Representa 0,032 G De Jabon De Potasa, Que Hay Que
Deducir).
22(a).5. Calculo.
Calcular El Insaponificable Expresado En Porcentaje.
De Agua Destilada Y Agitando, Con Una Varilla De Vidrio, Hasta Formar Una Pasta
Homogenea; 28 G De Gel De Silice Y 60 Ml De Agua Son Suficientes Para La
Preparacion De Dos Placas De 20 Por 5 Cm Y Cuatro Placas De 20 Por 20 Cm. Pasar
La Pasta Al Aplicador Y Extenderla Sobre Las Placas Con Un Espesor De 0,25 Mm.
Dejar Las Placas Al Aire Hasta Observar Que La Superficie Este Seca, Y A
Continuacion Mantener En Estufa De 105-110 Grad. C Durante Dos Horas. Guardar En
Desecador.
Preparacion De Los Esteroles.- En Un Matraz, Provisto De Un Refrigerante De Reflujo,
Se Pesan, Con Exactitud Del Miligramo, 5 G Del Cuerpo Graso Que Se Ha De Ensayar
Y Se Aaden 50 Ml De Disolucion Alcoholica De Potasa 2n, Hirviendo Durante Una
Hora. Aadir, Por La Parte Superior Del Refrigerante 50 Ml De Agua Destilada Y
Agitar. Dejar Enfriar Y Trasvasar El Contenido Del Matraz A Una Ampolla De
Extraccion Enjuagando El Matraz Con Eter De Petroleo, Operando Varias Veces Con
50 Ml En Total Y Se Transvasa A La Ampolla De Extraccion. Agitar Energicamente
Durante Un Minuto Para Asegurar Un Contacto Intimo Entre El Eter De Petroleo Y La
Disolucion Jabonosa. Dejar Reposar Y, Cuando Las Dos Fases Estan Completamente
Separadas, Trasvasar La Disolucion Jabonosa A Una Segunda Ampolla De Extraccion.
Tratar De Nuevo Con 50 Ml De Eter De Petroleo, Decantar Y Hacer Un Tercer
Tratamiento De La Disolucion Jabonosa Con Otros 50 Ml De Eter De Petroleo. Las
Emulsiones Que Excepcionalmente Se Presentan, Se Destruyen Aadiendo Pequeas
Cantidades De Alcohol O De Lejia De Potasa Concentrada. Las Tres Porciones De Eter
De Petroleo Se Reunen En Una Misma Ampolla, Se Las Lava, Tres Veces Seguidas,
Con Porciones De 50 Ml De Alcohol Etilico Al 50 Por 100 (En Volumen). Se Trasvasa
La Disolucion De Eter De Petroleo A Un Pequeo Matraz, Se Elimina El Disolvente
Por Destilacion Y Se Deseca En Estufa De Vacio A Una , Temperatura Que No
Sobrepase Los 50-60 Grad. C.
Disolver El Insaponficable Extraido En Diez Veces Su Peso De Cloroformo, Siendo,
Normalmente, Suficiente 0,5-1 Ml (Ver 5.3.). Depositar 16 Gotas De 3-4 Microl.
Contenido Aproximadamente 300-400 Microg. En Una Placa De 20 X 20 Cm, A
Distanciasaproximadamente 300-400 Microg. En Una Placa De 20 X 20 Cm, A De 1
Cm. Dejar Una Distancia De 2 Cm A Partir Del Borde Interior Y, Como Minimo, 2,5
Cm A Partir De Los Bordes Laterales. Depositar Como Referencia Una Cantidad
Aproximada De 35 Microg. De Colesterol Disuelto En Unas Diez Veces Su Peso De
Cloroformo, A Una Distancia De 1 Cm De Los Extremos Laterales.
Introducir En La Cubeta El Liquido De Desarrollo Necesario, Bien Sea Cloroformo O
Mezcla Hexano-Eter, Hasta Una Altura De 1 Cm; Se Tapa La Cubeta Y Se Deja En
Reposo Durante Unas Tres Horas, Con El Fin De Lograr El Equilibrio Liquido-Vapor
En El Interior De La Cubeta.
Introducir La Placa En La Cubeta; Poner La Tapa Y Esperar El Desarrollo Hasta Que El
Frente Liquido Se Haya Situado A Una Distancia De 0,5 A 1 Cm Del Limite Superior
De La Placa. Sacar La Placa De La Cubeta Y Dejar Que Se Evapore El Disolvente A La
Temperatura De La Habitacion. Pulverizar La Placa Con Un Reactivo De Revelado
(24(a).3.5.) Y Examinar El Cromatograma Bajo Una Lampara De Wood.
Localizar La Posicion De Los Esteroles Por Medio Del Colesterol De Referencia Y
Marcar Esta Marcha Con Una Aguja. Rascar La Silice Conteniendo La Mancha
Retirar Del Bao Uno De Los Tubos, Agregarle Aproximadamente 0,2 G De Benzoato
De Plata Y Agitar Inmediatamente. Observar El Aspecto Del Tubo, Comparandolo Con
El De Ensayo En Blanco. La Aparicion De Un Ennegrecimiento Indica La Presencia De
Azufre.
28(a).5. Referencia.
1. American Of Chemists Society. Official And Tentative Methods. Ca. 8b.35.
28(b). RECONOCIMIENTO DE AZUFRE
(Ensayo De La Moneda)
28(B).1. Principio.
Este Metodo Determina Cualitativamente La Presencia De Azufre.
Aplicable A La Deteccion De Azufre En El Sulfuro De Carbono Empleado En La
Extraccion Del Aceite De Oliva.
28(B).2. Material Y Aparatos.
28(B).2.1. Tubo De Ensayo O Vaso De Tamao Conveniente.
28(B).2.2. Varilla O Bolas De Vidrio Para Soportar La Moneda.
28(B).2.3. Una Moneda Pulida, Preferiblemente Nueva.
28(B).2.4. Bao De Aceite Capaz De Calentar La Muestra A 210 Grad. C En Unos 30
Minutos.
28(B).3. Procedimiento.
Colocar La Moneda En Un Tubo De Ensayo O Vaso, Soportada Por Bolas O Trozos De
Varilla De Vidrio. Agregar 20 Ml De La Muestra, Que Han De Cubrir La Moneda.
Colocar El Tubo De Ensayo O Vaso En El Bao De Aceite, Calentar De Forma Que La
Muestra Alcance 210 Grad. C En, Aproximadamente, 30 Minutos, Mantener A Esta
Temperatura Durante 10 Minutos Mas.
Enfriar Y Retirar La Moneda, Colocar Sobre Una Superficie Limpia Y Examinar
Cuidadosamente Si Presenta Despulido O Ennegrecimiento.
Si Este Es Evidente, La Presencia De Azufre Es Positiva.
28(B).4. Referencia.
1. American Oil Chemists' Society Official And Tentative Methods. Ca. 8a.35.
29 DETERMINACION DE JABON EN ACEITE DE OLIVA
29.1. Principio.
Este Metodo Tiene Por Objeto El Reconocimiento De Jabones Alcalinos, Magnesicos O
Calcicos, E Identificacion De Los Iones De Estos Ultimos Elementos En Aceites De
Oliva Que Hayan Sido Total O Parcialmente Neutralizados Con Compuestos Basicos
De Estos Metales Y Sometidos A Una Decantacion O Centrifugacion.
29.2. Material Y Aparatos.
29.2.1. Ampolla De Decantacion De 100 Ml, Con Tapon Esmerilado.
29.2.2. Probeta Graduada, De 10 Ml.
29.2.3. Embudo De Filtracion De 5 A 6 Cm De Diametro.
29.2.4. Capsulas De Vidrio Pyrex O Jena, Redondas O Fondo Plano, De 5 A 6 Cm De
Diametro.
29.2.5. Tubos De Ensayo, De 100 Mm De Longitud Y 10 Mm De Diametro.
29.2.6. Capsulas Redondas De Porcelana De 4 A 5 Cm De Diametro.
20.2.7. Vidrios De Reloj De 4 Cm De Diametro.
29.2.8. Papel De Filtro Sin Cenizas De 9 Cm De Diametros.
29.3. Reactivos.
20.3.1. Acido Clorhidrico, Reactivo Para Analisis, Al 10 Por 100.
29.3.2. Acido Nitrico, Reactivo Para Analisis, 2 N.
29.3.3. Hidroxido Sodico, Reactivo Para Analisis, 2 N.
29.3.4. Nitrato De Plata, Reactivo Para Analisis, Al 5 Por 100.
29.3.5. Quinalizarina, Reactivo Para Analisis, Disolucion Saturada En Etanol De 96
Grad., Recientemente Preparada.
29.3.6. Sal Sodica De La Osazona Del Acido Dihidroxitartarico.
29.4. Procedimiento.
29.4.1. Extraccion. Medir 10 Ml De Aceite Con La Probeta Graduada Y Verterlos En
La Ampolla De Decantacion, Previamente Mojada Con Agua. Aadir 10 Ml De
Disolucion De Acido Clorhidrico. Agitar Durante 15 O 20 Segundos. Dejar Reposar
Hasta Separacion De Las Dos Capas, Aproximadamente De 10 A 15 Minutos.
31.1. Principio.
Este Metodo Se Fundamenta En La Medida Espectrofotometrica Ultravioleta Del
Coeficiente De Extincion A Las Longitudes De Onda 232 Y 270mmicras Representados
Por K232 Y K270, Respectivamente.
Ambos Coeficientes Se Emplean Como Criterio De Calidad De Los Aceites.
31.2. Material Y Aparatos.
31.2.1. Espectrofotometro Ultravioleta. La Escala De Longitudes De Onda Permitira
Medir Entre 220 Y 350 Nm Con Precision De Un Nm.
31.2.2. Cubeta Prismatica De Cuarzo, De 1 Cm De Espesor O Paso Opticamente
Transparente Entre 220 Y 350 Nm. La Transmision A 220 Nm Sera, Como Minimo, De
Un 80 Por 100. Las Cubetas En Uso Tendran, Entre Si, Una Desviacion No Superior Al
2 Por 100 A 220 Ml.
31.2.3. Matraces Aforados Con Tapon De Vidrio Esmerillado De 10, 500 Y 1.000 Ml.
31.3. Reactivos.
31.3.1. Ciclohexano. Para Espectrofometria, Cuyos Valores Minutos De Transmision
Seran: 40 Por 100 A 220 Nm Y 95 Por 100 A 250 Nm.
31.3.2. Disolucion De Hidroxido Potasico, Para Analisis, 0,05 N.
31.3.3. Disolucion Patron De Cromato Potsico. Disolver 2.000 Miligramos De Cromato
Potasico, Para Analisis, En 1 Litro De Disolucion De Hidroxido Potasico 0,05 N. Tomar
25 Ml De Esta Solucion En Un Matraz Aforado De 500 Ml, Completando Hasta El
Enrase Con Disolucion De Hidroxido Potasico 0,05 N.
La Densidad Optica De Esta Ultima Disolucion A 275 Nm, Medida En Cubeta De 1
Cm, Tomando Como Referencia La Disolucion De Hidroxido Potasico 0,05 N, Debera
Ser De 0,200 +- 0,005.
31.4. Procedimiento.
Comprobar La Escala De Transmision A Absorbancia.
Si El Aceite No Esta Completamente Limpio Y Transparente Se Filtra A La
Temperatura Ambiente, A Traves De Papel De Filtro Adecuado.
Pesar Exactamente, En Un Matraz Aforado De 10 Ml, Aproximadamente, Las
Siguientes Cantidades De Muestra: 90 Mg De Aceite De Oliva Virgen, 60 Mg De
Aceite Refinado O Su Mezcla Con Virgenes, 40 Mg De Aceite De Orujo Bruto O
Refinado, 40 Miligramos De Aceite De Semilla; Disolver En Ciclohexano Y Completar
Hasta El Enrase.
32(a).1. Principio.
El Indice De Bellier De Un Aceite Es La Temperatura A La Que Se Produce La
Precipitacion De Lasa Sales De Los Acidos Grasos De Dicho Aceite Cuando Esta
Saponficado Y Disuelto Con Arreglo A Las Condiciones De Este Metodo.
34.6. Referencia.
1. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaol 55.079.
35. RECONOCIMEINTO DEL ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA
(Prueba De Vizern)
35.1. Principio.
Este Metodo Tiene Por Objeto La Identificacion Del Aceite Extraido Por Disolventes
De Los Orujos Grasos De Aceituna.
Se Aplica Para Determinar La Pureza De Los Aceites De Oliva Virgenes Y Refinados.
En Presencia De Otros Aceites, Su Aplicacion E Interpretacion De Resultados Debe Ser
Discrecional.
35.2. Materil Y Aparatos.
35.2. (1, 2, 3 Y 4). Como 22.2 (1, 2, 3 Y 4).
35.2.5. Matraz Erlenmeyer De 100 Ml, Con Boca Esmerilada, Provisto De Refrigerante
De Reflujo De Aire, Constituido Por Un Tubo De 80 A 100 Cm De Longitud
Aproximadamente.
35.2.6. Tubo De Ensayo De Paredes Gruesas, Con Dimensiones Aproximadas De 160
Mm De Altura Y 30 Mm De Diametro Interior.
35.2.7. Probeta De 10 Ml.
35.3. Reactivos.
35.3. (1, 2, 3, 4, 5 Y 6). Como 22.3 (1, 2, 3, 4, 5 Y 6).
35.3.7. Alcohol Etilico De 85 Por 100 En Volumen. Diluir 885 Mililitros De Etanol De
96 Grad. Hasta 1.000 Ml Con Agua Destilada. La Densidad Sera 0,8520. Comprobar
Con Un Alcohometro.
35.4. Procedimiento.
Extraer El Insaponificado De 5 G De Aceite Como En 22(a), Empleando Eter De
Petroleo.
La Totalidad Del Insaponificable Aislado Recogido En El Matraz De 100 Ml Se
Disuelve En 10 Ml De Etanol De 85 Grad., En Caliente Con Refrigerante De Reflujo.
En 10 Ml De Etanol De 85 Grad., En Caliente Con Refrigerante De La Disolucion
Alcoholica Se Transvasa Al Tubo De Ensayo 35.2.6 Y Se Enjuaga El Matraz Con Otros
10 Ml De Etanol De 85 Grad., Que Se Incorporan Tambien Al Tubo De Ensayo. Se
Homogeneiza La Mezcla Y Se Enfria A Unos 25 Grad. C; Dejandolo En Reposo
Durante Una Hora, A Temperatura Entre 20-25 Grad. C. Observar Al Cabo De La Hora.
40.1. Principio.
Este Metodo Tiene Por Objeto El Reconocimiento Del Aceite De Sesamo En Mezcla
Con Otros Aceites Y Grasas Comestibles.
Es Aplicable Aunque El Aceite De Sesamo Se Haya Sometido A Un Proceso De
Refinaion Alcalina, O Hidrogenacion Parcial Para La Preparacion De "Shortening" O
Margarinas.
40.2. Material Y Aparatos.
40.2.1. Tubo De Ensayo De 20 X 110 Mm De Diametro Interior Y Longitud,
Respectivament, Cont Apon Esmerilado Y Llave De Salida De Vidrio En Su Parte
Inferior, Debe Llevar Una Marca Indicando Los Volumenes De 10 Ml Y 15 Ml.
40.2.2. Soporte Para Mantener El Tubo Anterior En Posicion Vertical.
40.2.3. Capsula De Porcelanas, Fondo Plano, De Unos 60 Mm De Diametro.
40.3. Reactivos.
40.3.1. Acido Sulfurico Concentrado (D=1,84).
40.3.2. Disolucion De 0,35 Ml De Furfurol, Recientemente Destilado, En Un Litro De
Anhidrido Acetico. Esta Disolucion Debe Guardarse En Frascos Oscuros, De Tapon
Esmerilado, Preferiblemente Provistos De Capuchon Protector, Tambien Con Ajuste
Esmerilado. Manteniendo En Debidas Condiciones El Reactivo, Se Conserva Largo
Tiempo. No Es Necesario Que El Anhidrido Acetico Sea Rigurosamente Anhido,
Pudiendose Tolerar Hasta Un 5 Por 100 De Agua.
40.4 Procedimiento.
En El Tubo Graduado Se Vierten 10 Ml De La Muestra De Aceite, Y Seguidamente 5
Ml De Reactivo 40.3.2. Agitar Durante 1 Minuto Aproximadamente, Colocar El Tubo
En El Soporte Y Dejar Reposar Hasta Que Se Separen Las Dos Capas.
Verte De 1 A 2 Ml De La Capa Inferior A La Capsul De Porcelana. Agregar 5 O 6
Gotas De Acido Sulfurico Concentrado Y Mezclar Imprimiendo A La Capsula Un
Suave Movimiento De Rotacion.
Para Cantidades De Aceite De Sesamo Superiores Al 1 Por 100 Se Desarrolla
Inmediatamente Una Coloracion Azul De Prusia Oscura, Con Ligero Tinte Verdos. Para
Contenidos Menores, El Color Azul Va Siendo Mas Debil, Aumentando Al Mismo
Tiempo El Periodo Requerido Para El Desarrollo Completo Del Color. En Mezcla Con
Aceites De Oliva Y Soja, El Limite De Deteccion Es De 0,25 Por 100, Acusandose La
Presencia Por La Aparicion De Un Color Gris Azulado, Que Tarda En Desarrrollarse
De 5 A 10 Minutos.
40.5. Expresion De Resultados.
Positivo O Negativo.
40.6. Referencias.
1. Pavolini L. Olii Minerali, Grassi Saponi, Colori Vernici; 12, 41, 1934.
2. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.068.
41. DETERMINACION DE ACIDOS GRASOS POR
CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA
41.1. Principio.
El Metodo Esta Basado En La Separacion Y Determinacion Cromatografica De Los
Esteres Metilicos De Los Acidos Grasos.
Es Aplicable A Las Grasa Vegetales Y Animales Con Acidos Grasos De 12 A 24
Atomos De Carbono. No Es Aplicable Para La Determinacion De Acidos Grasos
Oxidados Y Epoxiacidos.
41.2. Material Y Aparatos.
41.2.1. Matraz Redondo, Fondo Plano, De 100 Ml, Boca Esmerilada.
41.2.2. Refrigerante De Reflujo, Adaptable Al Matraz Anterior.
41.2.3. Ampollas De Decantacion De 500 Ml.
41.2.4. Matraz Redondo, Fondo Plano, De 200 Ml.
41.2.5. Cromatografo Apto Para Separar Los Esteres Metilicos, Provisto De Horno Con
Regulacion De Temperatura Hasta 250 Grad. - 300 Grad. C, E Inyector Susceptible De
Ser Calentado Hasta 50 Grad. C Por Encima De La Temperatura Del Horno. Detector
Suficientemente Sensible Y Aparato Registrador Continuo.
41.2.6. Botella Con Nitrogeno A Presion; Riqueza Minima 99,8 Por 100.
41.2.7. Columna De Acero Inoxidable, Aluminio, Cobre O Vidrio De 3-6 Mm De
Diametro Interior, De 2 M De Longitud, Rellena Con Chromosorb P O W (60-80
Mallas) O Celite 545 (80-100 Mallas), Impregnada Con 5 Por 100 De Succionato De
Polietilenglicol.
41.2.8. Jeringa, De 5 A 10 De (Simbolo Omitido) De Capacidad.
41.3. Reactivos.
41.3.1. Metanol Absoluto, Reactivo Para Analisis.
41.3.2. Sodio Metalico, Reactivo Para Analisis.
Metilo Como Indicador. Secar La Disolucion Con Sulfato Sodico Anhidro. Eliminar El
Disolvente En Bao De Agua Bajo Corriente De Nitrogeno.
41.4.1.2. Aceites Y Grasas De Acidez No Superior Al 0,3 Por 100 En Acido Oleico.
Omitir La Metanolisis En Medio Acido. Realizar La Metanolisis Alcalina Segun
41.4.1.1. A) Y, Estando Aun Caliente El Matraz, Agregar Por La Parte Superior Del
Refrigerante Una Gota De Disolucion De Fenolftaleina Y Disolucion De Acido
Clorhidrico En Metanol En Cantidad Algo Superior A La Necesaria Para Neutralizar El
Metilado. Dejar Enfriar. Pasar La Disolucion A La Ampolla De Extraccion. Proceder A
La Extraccion De Los Esteres Metilicos Segun 41.4.1.1. C).
41.4.1.3. Aceites Y Grasa De Acidez Superior Al 80 Por 100 En Acido Oleico.
Omitir La Metanolisis Alcalina. Realizar La Metanolisis Acida, Pesando En El Matraz 2
G De Muestra, Previamente Filtrada Y Seca. Agregar 60 Ml De La Disolucion De
Acido Clorhidrico En Metanol. Proseguir Segun 41.4.1.1. B) Y 41.4.1.1. C).
41.4.1.4. Aceites Y Grasas Con Insaponificable Superior Al 2 Por 100.
Eliminar La Materia Insaponificable Segun El Metodo "Determinacion De La Materia
Insaponificable". La Solucion Hidroalcoholica De Jabones Resultantes Se Concentra En
Evaporador Rotario Hasta Unos 50 Ml. Pasar Estos A Una Ampolla De Extraccion.
Acidificar Con Acido Clorhidrico 2 N Hasta Reaccion Acida Al Rojo De Metilo.
Extraer Con Eter De Petroleo O Hexano. Proseguir Como En 41.4.1.3.
41.4.2. Preparacion De La Columna.
41.4.2.1. Soporte: En Un Vaso De 600 Ml Colocar 100 G De Chromosorb W O P, O
Celita 545, Preferentemente El Primero, Agregar Acido Clorhidrico Al 20 Por 100 En
Cantidad Suficiente Hasta Cubrir El Producto. Dejar En Reposo Durante 15 Horas.
Decantar El Acido. Agregar Agua Destilada, Agitando Fuertemente, Y Dejar Reposar 5
Minutos. Decantar El Agua Y Volver A Cubrir Con Acido Clorhidrico Al 20 Por 100 Y
Reposar Durante 2 Horas. Filtrar Sobre Embudo De Vidrio Y Lavar Con Agua
Destilada Hasta Neutralidad. Extender Seguidamente El Soporte En Capa Delgada En
Capsulas De Porcelana O Cubeta De Vidrio. Desecar En Estufa A 110 Grad. C Durante
2 Horas.
41.4.2.2. Fase Estacionaria: Succinato De Polietilenglicol Comercial.
41.4.2.3. Impregnacion Del Soporte: Disolver, En Capsula De Porcelana, 0,5 G De La
Fase Estacionaria O Fija De Unos 50 Ml De Acetona O Cloroformo. Aadir 9,5 G De
Soporte Tratado. Regular El Disolvente Para Obtener Una Papilla De Fluidez G
Adecuada Para Una Buena Homogeneizacion Por Agitacion. Eliminar El Disolvente G
Sobre Bao De Agua, Removiendo Con Espatula, Hasta Obtener El Producto En Forma
De Polvo Suelto. Extenderlo En Capa Delgada E Introducirlo En Estufa A 100 Orma
Grad. C Durante 2 Horas.
O En Capa Delgada E Introducirlo En Estufa A 100 Orma 41.4.2.4. Llenado De La
Columna: Introducir El Soporte Impregnado Con Fase Fija En La Columna, Haciendola
Vibrar Por Percusion O Con Un Vibrador Magnetico, Ja Hasta Su Llenado Total. Es
42.7. Referencia.
43. RECONOCIMIENTO DE STERES NO GLICRIDOS EN GRASAS
COMESTIBLES POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
43.1. Principio.-Disolucin de la muestra en hexano y posterior separacin de los
triglicridos por cromatografa en capa fina.
Es aplicable a todos los aceites vrgenes o refinados, utilizables directamente en la
alimentacin humana.
El mtodo ha sido estudiado con steres de cidos grasos y los alcoholes siguientes:
metanol, 1,2 y 1,3 propilenglicol y etilenglicol.
Los lmites detectados, segn ensayo colaborativo en el que han intervenido cinco
laboratorios, oscila entre 0,7% (p/p) y 1% (p/p).
43.2. Material y aparatos.
43.2.1. Equipo de cromatografa en capa fina, compuesto de placas de gel de slice G y
un espesor de capa de 0,25 mm. O de 0,40 mm. En caso de ser necesaria una mayor
resolucin.
43.2.2. Placa calefactora adecuada para quemar placas que permita alcanzar
temperaturas de 360 C.
43.2.3. Microjeringa de 101.
43.3. Reactivos.
43.3.1. Hexano para cromatografa (d20 C = 0,684).
43.3.2. Eter etlico (d20 C = 0,715).
43.3.3. Lquido de desarrollo.
Mezclar 92 volmenes de hexano y 8 volmenes de ter etlico.
43.3.4. Acido sulfrico al 50%.
43.4. Procedimiento.
Depositar con una jeringa 2 a 3 l de la disolucin de la muestra en hexano al 10%,
aproximadamente, sobre la placa de cromatografa, a una distancia aproximada de 1 cm.
Del borde inferior de la capa de slice.
Introducir en la cubeta contenida el lquido de desarrollo hexano-ter etlico, esperando
hasta que el frente del disolvente se site a unos 3 cm., aproximadamente, del borde
superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y dejar secar al aire, lo cual se consigue
en unos minutos. Con el fin de facilitar el reconocimiento de los steres ms
difcilmente separables, es recomendable y necesario en algunos casos efectuar dos o
tres desarrollos. Para ello, terminado el primer desarrollo y una vez seca la placa, volver
a introducir en la cubeta, mantenindola hasta que el frente del disolvente se haya
situado a la misma altura anterior. Repetir el proceso una vez ms si es necesario. En los
casos de duda sobre el resultado positivo de la prueba, deber repetirse la cromatografa,
sometiendo la placa a dos o tres desarrollos.
Pulverizar la placa seca con una disolucin de cido sulfrico al 50% y quemar sobre la
placa calefactora a unos 300 C.
43.5. Interpretacin de resultados.-A un tercio, aproximadamente, del borde inferior de
la placa aparece una mancha intensa correspondiente a los triglicridos. En aceites puros
no aparece por encima ninguna otra mancha prxima a la de los triglicridos, a
excepcin de algunos componentes del insaponificable que marchan con el frente del
disolvente. Una mancha, ms o menos intensa, situada por encima, prxima a la de los
triglicridos, acusa la presencia de steres extraos al glicerol. La distancia relativa
entre estas dos manchas depende, lgicamente, del alcohol de que se trate; los steres de
Para ello, la placa, una vez revelada y seca, se introduce en una cubeta saturada de
vapores de amonaco, mantenindola all hasta observar una intensificacin del color de
las manchas. Se adquieren coloraciones caractersticas en algunos casos.
Debe cuidarse no prolongar demasiado el contacto con el amonaco, en evitacin de que
se coloree el fondo de la placa, lo cual, en vez de beneficiar, podra dificultar el
reconocimiento de los antioxidantes.
45.6.3. A ttulo de orientacin, se dan a continuacin los valores Rf obtenidos con los
seis antioxidantes citados anteriormente:
Antioxidantes ..... NDHG ..... GP ..... GO ..... GD ..... BHA ..... BHT
Rf ..... 0,10 ..... 0,14 ..... 0,28 ..... 0,35 ..... 0,75 ..... 0,98
45.6.4. La aparicin de una mancha de BHT muy dbil, en comparacin con el patrn,
puede ser debido a una prdida del producto en el lavado con hexano saturado de
acetonitrilo. En este caso, proceder como sigue: Realizar la extraccin tal y como dice el
mtodo. Recoger por separados los lquidos procedentes de la extraccin con
acetonitrilo saturado de hexano y los que proceden del lavado con hexano saturado de
acetonitrilo. Evaporar los disolventes. Disolver ambos residuos con metanol (2 ml.).
Sobre la placa depositar unos 10l del extracto procedente de la extraccin con
acetonitrilo y 15l del que procede de los lavados con hexano. De esta forma, el BHT se
detecta en ambos desarrollos, pudindose considerar la cantidad presente en la muestra
por comparacin con el patrn como suma de las intensidades de ambas manchas.
45.7. Referencias.-1. Instituto de Racionalizacin del Trabajo. Una Norma Espaola
55.017.
46. ACIDOS GRASOS DE CADENA CORTA.
46.1. Principio.-Obtencin de los steres metlicos de los cidos grasos mediante
reaccin con una solucin de hidrxido potsico en metanol y subsiguiente inyeccin
directamente de la disolucin de steres metlicos en el cromatograma.
El mtodo es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan cidos grasos
de longitud de cadena inferior al C14 y siempre que el contenido de cidos libres no
exceda del 1% expresados en cido oleico.
46.2. Material y aparatos.
46.2.1. Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml. De capacidad.
46.2.2. Pipetas aforadas de 1 ml., 2 ml. Y 10 ml.
46.2.3. Matraces aforadas de 50 y 100 ml. De capacidad.
46.2.4. Probeta graduada de 10 ml.
46.2.5. Jeringa de caractersticas adecuadas para la inyeccin de la muestra, graduada en
dcimas de ml., con una capacidad total de 1 a 10 ml.
46.2.6. Cromatgrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser
calentado hasta 250-300 C y sistema de regulacin que permita controlar la
temperatura con un error de 1,0 C. Equipado con programador de temperatura capaz
de llevar la temperatura del horno de 60 C a una velocidad de 4 C/min. Provisto de
regulacin independiente de la temperatura del inyector, que podr ser calentado a una
temperatura superior, por lo menos, en 50 a la mxima alcanzable por el horno provisto
de un sistema de deteccin sensible, de ionizacin de llama de hidrgeno, que pueda ser
mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 C por encima del horno.
46.2.7. Registrador con una tensin de entrada adecuada a la salida del amplificador del
cromatgrafo, con una velocidad de respuesta mnima capaz de producir la deflexin
completa de la escala en un segundo y una velocidad de desplazamiento del papel de 5
presentes en una cuanta del 0,1% deben dar un pico, como mnimo, de 2 mm, siendo,
por tanto, perfectamente reconocibles.
B) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se
utilizar, en cada caso, la atenuacin de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el
pico de mayor intensidad no sea atenuado ms de ocho veces.
Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la
pluma la lnea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel
con el registro para la identificacin de los picos y/o clculos cuantitativos.
46.4.2.2. Identificacin de los picos.-Se seguirn los criterios establecidos en el mtodo
nmero 41 de los Mtodos Oficiales de Anlisis de Aceites y Grasas.
46.4.2.3. Determinaciones cuantitativas.-La determinacin cuantitativa se basa en el
principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son
proporcionales a las reas comprendidas dentro de los tringulos dibujados debajo de
cada pico. El rea de cada tringulo se obtiene trazando rectas tangentes a las lneas
dibujadas en el registro, prolongndolas hasta su interseccin con la lnea base y
multiplicando la altura del tringulo por la mitad de la base. En el caso de haber
trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirn todas las medidas a
una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de
atenuacin correspondiente en cada caso, y el valor de la altura as corregida por la
mitad de la base.
46.4.3. Determinacin del contenido de los cidos butrico y caproico en la materia
grasa.-Esta determinacin se realiza por el mtodo del patrn interno, siendo el patrn
elegido el pentanoato de metilo.
46.4.3.1. Preparacin de la mezcla de calibracin.-Con una exactitud de 0,1 mg. Y en
un matraz aforado de 50 ml., pesar unos 100 mg. De cada uno de los siguientes
patrones: butanoato de metilo, pentanoato de metilo y caproato de metilo. Se disuelve la
mezcla de heptano normal, y se diluye completando hasta el enrase.
Inyectar la cantidad necesaria de la solucin anterior, normalmente 0,2-0,4 l, para que,
trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los mximos de los
picos en una posicin del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los
tres picos debern registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluir la
solucin anterior con heptano normal en la relacin necesaria para poder ajustarse a las
prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que
no deben discrepar entre s ms del 1%.
46.4.4. Anlisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fraccin de cidos
grasos, comprendiendo del C4 al C20 y C18:3.
46.4.4.1. Preparacin de la mezcla de calibracin.-Determinar previamente el factor de
correccin para cada cido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos,
que se toma como patrn eligindose normalmente para este fin el cido palmtico, y
debiendo tener la mezcla de calibracin una composicin anloga a la de la mezcla
problema.
Para ello, si no se conoce previamente el orden de composicin del problema, se
realizar una determinacin cromatogrfica de orientacin, realizndose en el registro la
cuantificacin de los componentes suponiendo el mismo factor de respuesta para todos
ellos, efectuando un reparto proporcional entre las reas medidas.
En un matraz aforado de 50 ml., pesar, con una exactitud de 0,1 mg., cantidades de los
steres metlicos patrones que se indican a continuacin proporcionales a las cifras de
composicin encontradas en el anlisis de orientacin anteriormente aludido, o previstas
con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pesarse son los siguientes:
butanoato de metilo, hexanoato de metilo, octanoato de metilo, decanoato de metilo,
(fx * Ax) = suma de todas las reas corregidas correspondientes a los componentes de
la fraccin.
46.6. Referencias.-1. Instituto Nacional de Racionalizacin y Normalizacin del
Trabajo. Una Norma Espaola 55.118.
47. FSFORO.
47.1. Principio.-Incineracin de la muestra en presencia de xido de cinc, seguida de la
medida colorimtrica del fsforo como azul de molibdeno.
Aplicable a aceites vegetales brutos, desgomados y refinados.
47.2. Material y aparatos.
47.2.1. Crisoles de porcelana de 50 ml. De capacidad.
47.2.2. Vidrios de reloj.
47.2.3. Placa de calefaccin elctrica, con regulador de temperatura.
47.2.4. Horno de mufla.
47.2.5. Embudo de vidrio de vstago corto de 50 mm. De dimetro.
47.2.6. Papel de filtro de 90 mm. De dimetro, Albet 242 o similar.
47.2.7. Frasco lavador de un litro de capacidad con cuello protegido del calor.
47.2.8. Matraces aforados de 50, 100, 250 y 500 ml. De capacidad provistos de tapones
de vidrio.
47.2.9. Pipetas de 2,5, 10 y 25 ml. De capacidad.
47.2.10. Pipetas de 10 ml. De capacidad, divididas en dcimas de mililitro.
47.2.11. Espectrofotmetro para medicin en el visible.
47.2.12. Cubetas espectrofotomtricas de 10 mm. De paso.
47.3. Reactivos.
47.3.1. Acido clorhdrico (d = 1,19).
47.3.2. Oxido de cinc.
47.3.3. Hidrxido potsico.
47.3.4. Acido sulfrico (d = 1,84).
47.3.5. Molibdato sdico.
47.3.6. Sulfato de hidracina.
47.3.7. Fosfato cido monopotsico, desecado a 103 2 C durante dos horas antes de
usarlo.
47.3.8. Disolucin de molibdato sdico.-Aadir con precaucin 140 ml. De cido
sulfrico a 300 ml. De agua destilada. Dejar enfriar la temperatura ambiente, aadir
12,5 gr. De molibdato sdico y disolver totalmente. Llevar a un matraz aforado de 500
ml., diluir con agua destilada hasta el enrase, homogeneizar y dejar reposar durante 24
horas, por lo menos, antes de usarla.
47.3.9. Disolucin de sulfato de hidracina al 0,015%.-Disolver en un matraz aforado
0,15 gr. De sulfato de hidracina en un litro de agua destilada.
47.3.10. Disolucin de hidrxido potsico al 50% (m/m). Disolver 50 gr. De hidrxido
potsico en 50 ml. De agua destilada.
47.3.11. Disolucin de fosfato cido monopotsico.-Disolver 1,0967 gr. De fosfato
monopotsico seco en agua destilada. Diluir a 250 ml. En un matraz aforado y agitar.
Esta disolucin contiene 1 mg. De fsforo por mililitro. A continuacin verter, con una
pipeta, 5 ml. De la disolucin anterior en un matraz aforado de 500 ml. Y enrasar con
agua destilada. Esta disolucin contiene 0,01 mg. De fsforo por mililitro.
47.4. Procedimiento.
47.4.1. Construccin de la curva patrn.-Tomar, mediante pipeta, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 ml.
De la disolucin 47.3.11, e introducir en matraces aforados de 50 ml. Completar el
volumen a 10 ml. Con agua destinada, utilizando la pipeta 47.2.10, continuando como
pesan, obtenindose por diferencia a 100 los cidos grasos libres e impurezas retenidas
en la columna.
No es aplicable con carcter general a los aceites de orujos.
48.2. Material y aparatos.
48.2.1. Equipo para cromatografa en columna, compuesto de:
48.2.1.1. Columna de vidrio, provista de una placa de vidrio porosa nmero 2,
correspondiente a un dimetro medio de poro de 40 a 90 (fig. 48.1).
48.2.1.2. Depsito de disolvente para la alimentacin de la columna (fig. 48.2).
48.2.1.3. Soporte para el manejo del frasco de pesada (figura 48.3).
48.2.1.4. Frasco de pesada de unos 20 ml. De capacidad (figura 48.4).
48.2.1.5. Tubo de prolongacin para el vaciado del frasco de pesada en la columna (fig.
48.5).
48.2.1.6. Matraz redondo, fondo plano, de vidrio Pyrex o similar, de 250 ml. De
capacidad y boca esmerilada normalizada 29/32.
48.2.2. Ampolla de decantacin de 125 ml. De capacidad, con llave de vidrio.
48.2.3. Frasco lavador de unos 125 ml. De capacidad.
48.2.4. Estufa de vaco que permita calentar hasta 110 C como mnimo y regulacin de
1 C. La temperatura ser adems uniforme en todo el espacio interior, tolerndose
diferencias que no superen 1 C entre posiciones extremas.
48.2.5. Horno de mufla capaz de alcanzar una temperatura de 800 C y regulacin de
5 C.
48.2.6. Desecador conteniendo un agente desecante apropiado.
48.2.7. Evaporador rotatorio.
48.2.8. Cpsulas de porcelana, fondo redondo de 50 mm. y 20 mm. De altura.
48.2.9. Pesa sustancias de vidrio, de 60 mm. interior y 40 de altura.
48.2.10. Tubo de cromatografa, de 10 cm. De longitud y 1,5 centmetros de dimetro
interior, provisto de llave esmerilada, con orificio de paso de 1,5 a 2 mm. Y placa
filtrante de vidrio porosidad nmero 2, correspondiente a un tamao medio de poro de
40 a 90 .
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1979, TOMO II, pgs. 2593 y 2594)
48.3. Reactivos.
48.3.1. Eter etlico.
48.3.2. Metanol anhidro.
48.3.3. Eter etlico-metanol.-Mezclar 975 ml. De 48.3.1. Y 25 ml. De 48.3.2.
48.3.4. Hexano, con un contenido mximo de 0,5% de aromticos.
48.3.5. Almina para cromatografa en columna de las siguientes caractersticas: ph en
suspensin acuosa al 5%; 7,0 0,5; actividad IV segn Brockmann (ver 48.6.1.).
Granulometra.-El anlisis granulomtrico del producto debe dar un contenido inferior
al 10% de partculas con un grosor igual o inferior a 63 micras e inferior al 0,1% de
partculas con un grosor mayor de 250 micras, con una medida estadstica para la
totalidad de 120 micras 5%.
48.3.6. P-amino-azo-benceno.
48.3.7. Rojo Sudan (Sudan II) (xileno-azo- naftol).
48.3.8. Amarillo Sudan (Sudan I) (benceno-azo -naftol).
48.3.9. Benceno pursimo, exento de tiofeno.
48.4. Procedimiento.
48.4.1. Preparacin de la columna de almina.
Pesar, con aproximacin de 0,5 gr., 20 gr. De almina e introducirlos en una ampolla de
extraccin de 125 ml., agregando despus 50 ml. Del disolvente 48.3.3, con el que se
Repetir este tratamiento en operaciones sucesivas, hasta conseguir peso constante, con
precisin del mg.
48.5. Clculos.
% aceite neutro = [(P - Po) / M] * 100
Siendo:
P = peso del matraz con el aceite.
Po = Peso del matraz vaco.
M = peso de la muestra en gramos.
% prdida cromatogrfica = 100 - % de aceite neutro.
48.6. Observaciones.
48.6.1. La determinacin de la actividad de la almina segn Brockmann se realiza en la
forma siguiente:
La almina que se ha de ensayar se introduce en la columna cromatogrfica 48.2.10,
procurando conseguir una distribucin homognea, formando una capa de 5 cm. De
altura y colocando en la parte superior un disco de papel de filtro. Preparar una
disolucin mezclando 2 ml. De benceno, 8 ml. De hexano, 2 mg. De rojo Sudan, 2 mg.
De p-amino-azobenceno y 2 mg. De amarillo Sudan. Verter la disolucin de colorantes
en la columna, abrir la llave y dejar pasar la disolucin hasta que el nivel lquido quede
justamente a la altura de la almina. Verter a continuacin el lquido de desarrollo
constituido por una mezcla de benceno-hexano en la proporcin 4:1 en volumen, del
que se hacen pasar por la columna 20 ml. La velocidad de salida se regula con la llave,
manteniendo un flujo de 0,5 a 1 ml. Por minuto, recogiendo el lquido en un matraz
cnico de boca estrecha.
Terminado el desarrollo, con una almina de grado IV que es la apropiada, el amarillo
Sudan habr sido eliminado totalmente de la columna, quedando retenidos los otros dos
que aparecern en dos bandas: Una inferior roja, correspondiente al rojo Sudan y otra
superior amarilla correspondiente al amino-azo-benceno. Una situacin distinta de estos
colorantes deber interpretarse como un grado de actividad mayor o menor del
producto, requiriendo el ajuste de su contenido en agua de la forma conveniente.
48.6.2. Preparacin de la almina.-Partiendo de una almina de actividad superior a IV,
se adicionarn cantidades crecientes de agua hasta conseguir en el ensayo de actividad,
realizado como se indica en el apartado 48.6.1, el grado IV necesario.
Efectuado esto, si se dispone de una partida relativamente importante de almina, es
conveniente determinar su humedad, siguiendo la metdica que se describe en 4.6.3,
conocido este dato, en operaciones sucesivas, bastar con determinar la humedad de la
almina, calculando la cantidad de agua que hay que aadir para obtener su producto de
actividad IV.
Para incorporar a la almina una determinada cantidad de agua, se proceder de la
forma siguiente: Introducir la almina pesada en un matraz o frasco con tapn
esmerilado con una capacidad aproximadamente el doble del volumen de almina.
Agregar el peso calculado de agua destilada, tapar el recipiente y agitar hasta conseguir
la homogeneizacin del producto. Mantener el frasco cerrado durante 48 horas como
mnimo, agitndolo durante este tiempo unas 10 12 veces por lo menos. Despus de
este tratamiento la almina debe estar lista para su utilizacin.
48.6.3. Determinacin de la humedad de la almina.-En una capsulita de porcelana
pesar, con precisin de 1 mg., 1 gr. De almina. Introducir en la mufla del horno y
mantenerla 2 horas a 600 C. Dejar enfriar parcialmente e introducir en un pesa
sustancias de dimensiones adecuadas; tapar y llevar a un desecador donde se mantiene
hasta adquirir la temperatura ambiente. Pesar la totalidad, sin destapar el pesasustancias.
La muestra utilizada deber estar seca y libre de sedimentos constituidos por materias
extraas. Si no fuese as, se filtrar previamente por un papel filtro, agregando, si fuese
necesario, una pequea cantidad de sulfato sdico anhidro, para retener la humedad. Si
los sedimentos estuviesen constituidos por materia grasa slida, se fundir, calentando
suavemente la muestra, agitando lo necesario para conseguir su homogeneizacin.
49.4.2.-Determinacin del factor de respuesta para el erucato de metilo en relacin al
lignocerato de metilo.
Tomar, exactamente medido, 1 ml. De solucin patrn de erucato de metilo (49.3.4.),
depositar en un matraz cnico de 25 ml, agregando 3 ml de la solucin patrn de
lignocerato de metilo (49.3.5.). Agregar 4 ml de heptano y agitar suavemente para
homogenizar la mezcla.
Preparar otras dos soluciones tomando, respectivamente 2 y 3 ml de la solucin de
lignocerato, completando con heptano hasta un volumen total de 8 ml.
El factor de respuesta se obtiene aplicando la siguiente frmula:
Ra = (Ag * Pe) / (Ae * Pg).
Siendo:
Ra = Factor de respuesta.
Ag = Respuesta del cido lignocrico.
Ae = Respuesta del cido ercico, expresada en las mismas unidades del cido
lignocrico.
Pe = Peso, en mg. Del erucato.
Pg = Peso, en mg. Del lignocerato.
49.4.3.-Preparacin de los steres metlicos.
En un matraz de metilacin seco, pesar, con precisin de 0,1 mg, 50 mg de la muestra
convenientemente preparada, agregando 3 ml de la solucin patrn de lignocerato de
metilo (Ver 49.6.1) y 10 ml de la solucin de metilato sdico. Agregar 2 3 trocitos de
plato poroso, colocar el refrigerante, calentar hasta ebullicin suave, que se mantiene
durante una hora. Al cabo de este tiempo y sin interrumpir la ebullicin, agregar, por la
boca superior del refrigerante, 10 ml de la solucin metanlica de clorhdrico,
continuando la ebullicin durante 15 minutos (Ver 49.6.2.).
Al cabo de este tiempo, dejar enfriar el matraz y una vez fro quitar el refrigerante,
adicionando 5 ml de heptano; taponar el matraz, agitando fuertemente durante un
minuto. Adicionar solucin acuosa saturada de cloruro sdico hasta situar la capa de
heptano en el cuello del matraz.
50 (b).1. Principio.
Dilucin con hexano, extraccin con cido clorhdrico y metanol y posterior
determinacin por cromatografa de lquidos de alta eficacia.
50 (b).2. Material y aparatos.
50 (b).2.1. Cromatgrafo de lquidos de alta eficacia.
50 (b).2.2. Columna RP-18.
50 (b).2.3. Solvente acetonitrilo/metanol (70/30).
50 (b).2.4. Longitud de onda: 254 nm.
50 (b).2.5. Flujo 1 ml/min.
50 (b).3. Reactivos.
50 (b).3.1. Hexano.
50 (b).3.2. Acido clorhdrico 2N.
50 (b).3.3. Hidrxido sdico 2N.
50 (b).3.4. Metanol.
50 (b).3.5. Acetonitrilo.
50 (b).3.6. Sulfato sdico anhidro.
50 (b).3.7. Anilina.
50 (b).3.8. Cloruro de metileno.
50 (b).4. Procedimiento.
Tomar 25 ml de aceite y aadir 25 ml de hexano, extraer dos veces con 10 ml. Cada
vez de cido clorhdrico 2N. Alcalinizar la solucin clorhdrica con hidrxido sdico 2N
a Ph = 8 y extraer dos veces con 10 ml. De cloruro de metileno cada vez en embudo de
decantacin, haciendo pasar las dos extracciones por un embudo con sulfato sdico
anhidro. Se evapora a sequedad y se recoge con 25 ml de metanol. Inyectar
seguidamente en el cromatgrafo.
50 (b).5. Expresin de los resultados.
Los resultados se expresan en mg/l por comparacin con los obtenidos en un aceite
al que se ha aadido cantidades conocidas de anilina. La concentracin de la muestra y
parmetros cromatogrficos y atenuaciones se combinarn para obtener un lmite de
deteccin de 0,5 mg/l.
50 (b).6. Observaciones.
50 (b).6.1. Para concentraciones < 0,5 mg/l se repartir el mtodo partiendo de
mayores cantidades de muestra.
50 (C). ANILINA COMO ACETANILIDA POR CROMATOGRAFA DE GASES
50 (c).1. Principio.
Dilucin con hexano, extraccin con cido clorhdrico, neutralizacin con hidrxido
sdico, extraccin de la anilina libre con cloruro de metileno, derivacin a acetanilida,
concentracin y posterior determinacin por cromatografa de gases.
50 (c).2. Material y aparatos.
50 (c).2.1. Cromatgrafo de gases con detector especfico de nitrgeno.
50 (c).2.2. Condiciones cromatogrficas:
Flujo de N2: 60 ml.
Temperatura de la columna: 230 C.
Temperatura del inyeccin: 300 C.
Temperatura del detector: 300 C.
Columna carbowax 20 M 6 por 100 sobre G.C.Q. 60/80 3 m * 1/4".
50 (c).3. Reactivos.
50 (c).3.1. Hexano.
50 (c).3.2. Acido clorhdrico 2,5M.
50 (c).3.3. Hidrxido sdico 2,5M.
50 (c).3.4. Cloruro de metileno.
50 (c).3.5. Sulfato sdico anhidro.
50 (c).3.6. Anhdrido actico.
50 (c).3.7. Acetona.
50 (c).3.8. Anilina.
50 (c).3.9. Acetalida.
50 (c).4. Procedimiento.
Diluir 25 ml de aceite con 25 ml de hexano. Proceder a extraer dos veces con 20 ml.
De la disolucin de cido clorhdrico en embudo de decantacin. Recogidas las
fracciones cidas se neutralizan con la disolucin de hidrxido sdico, aadiendo en
exceso de sta para que quede alcalina. Seguidamente extraer la anilina libre con
cloruro de metileno (30 * 20 * 20 ml) en embudo de decantacin, haciendo pasar las
tres extracciones a travs de un embudo con sulfato sdico anhidro. A continuacin
derivar la anilina a acetanilida con anhdrido actico (0,2 ml), procediendo a evaporar
a sequedad en rotavapor (50 C). Recoger la acetanilida con acetona hasta completar
20 ml., pasndolos seguidamente a una probeta, y concentrar a un volumen de 5 ml.;
la muestra as preparada se inyecta en el cromatgrafo de gases con detector especfico
de nitrgeno.
50 (c).5. Expresin de los resultados.
Los resultados se expresan en mg/l por comparacin con los obtenidos en un aceite
al que se ha aadido cantidades conocidas de anilina. La concentracin de la muestra y
parmetros cromatogrficos y atenuaciones se combinarn para obtener un lmite de
deteccin de 0,5 mg/l.
50 (c).6. Observaciones.
50 (c).6.1. Para concentraciones < 0,5 mg/l se repetir el mtodo partiendo de
mayores cantidades de muestra.
50 (c).6.2. En las muestras que una vez inyectadas se obtengan picos con tiempo de
retencin que no coincidan exactamente con el de la acetanilida, hay que repetir el
50 (d).1. Principio.
Dilucin con hexano, extraccin con cido clorhdrico, neutralizacin con hidrxido
sdico, extraccin de la anilina libre con cloruro de metileno, derivacin a acetanilida,
exaporacin y posterior determinacin por cromatografa de lquidos de alta eficacia.
50 (d).2. Materiales y aparatos.
50 (d).2.1. Cromatgrafo de lquidos.
50 (d).2.2. Columna RP-8.
50 (d).2.3. Solvente (metanol/agua cido actico (60/39/1).
50 (d).2.4. Flujo un ml/minuto.
50 (d).3. Reactivos.
50 (d).3.1. Hexano.
50 (d).3.2. Acido clorhdrico 2,5M.
50 (d).3.3. Hidrxido sdico al 2,5M.
50 (d).3.4. Cloruro de metileno.
50 (d).3.5. Sulfato sdico anhidro.
50 (d).3.6. Anhdrido actico.
50 (d).3.7. Metanol.
50 (d).3.8. Anilina.
50 (d).3.9. Acetanilida.
50 (d).4. Procedimiento.
Diluir 25 ml. De aceite con 25 ml. De hexano. Extraer dos veces con 20 ml. De cido
clorhdrico 2,5M en embudo de decantacin. Recogidas las fracciones cidas se
neutralizan con hidrxido sdico 2,5M, aadiendo en exceso para que quede alcalina.
Seguidamente extraer la anilina libre con cloruro de metileno (30 * 20 * 20 ml.) En
embudo de decantacin, haciendo pasar las tres extracciones a travs de un embudo
con sulfato sdico anhidro. A continuacin derivar la anilina a acetanilida con
anhdrido actico (0,2 ml.), procediendo a evaporar a sequedad en rotavapor (50 C).
Recoger el residuo con 10 ml. De metanol e inyectar 10 l. En el cromatgrafo.
50 (d).5. Expresin de los resultados.
Los resultados se expresan en mg/l. Por comparacin con los obtenidos en un
aceite al que se ha aadido cantidades conocidas de anilina. La concentracin de la
muestra y parmetros cromatogrficos y atenuaciones se combinarn para obtener un
lmite de deteccin de 0,5 mg/l.
50 (d).6. Observaciones.
50 (d).6.1. Para concentraciones < 0,5 mg/l. Se repetir el mtodo partiendo de
mayores cantidades de muestra.
51. ANILIDAS GRASAS (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
51.1. Principio.
Extraccin con metanol, transesterificacin con hidrxido potsico en metanol y
hexano y posterior determinacin cromatogrfica por cromatografa de gases.
51.2. Materiales y aparatos.
51.2.1. Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de llama.
51.2.2. Columna cromatogrfica 2 m. * 1/8' en acero inoxidable de SE-30 al 5 por
100 sobre Chromosorb AW-DMCS 80-100 mesh.
51.2.3. Condiciones cromatogrficas indicativas:
Temperatura del horno 280 C.
Flujo gas portador (nitrgeno), 20 ml. Por minuto.
51.3. Reactivos.
51.3.1. Metanol.
51.3.2. Hidrxido potsico 2M en metanol.
51.3.3. Hexano.
51.4. Procedimiento.
Extraer 750 ml. De aceite con dos porciones de 75 ml. De metanol. Se renen
ambos extractos, concentrndose a sequedad. La totalidad del residuo se
transesterifica con 0,5 ml. De hidrxido potsico 2M en metanol y 5 ml. De hexano,
agitando a temperatura ambiente durante treinta segundos. Esperar veinte minutos
antes de inyectar 2l. En el cromatgrafo.
Tiempo de retencin aproximado de la oleilanilida... Seis-ocho minutos.
51.5. Expresin de los resultados.
Los resultados se expresarn en mg/l. Por comparacin con los obtenidos con un
aceite al que se ha aadido cantidades conocidas de oleilanilida. La concentracin de la
muestra, parmetros cromatogrficos o atenuantes se combinarn para obtener un
lmite de deteccin de 10 mg/l.
51.6. Observaciones.
51.6.1. Preparacin del patrn de oleilanilida.
Calentar a ebullicin durante tres horas en matraz con refrigerante unos 50 g. De
anilina e igual cantidad de cido oleico. Enfriar y disolver en unos 100 ml. De ter
etlico. Lavar tres veces con 50 ml. De hidrxido de sdico 2M para eliminacin del
cido oleico libre y a continuacin con otras tres porciones de 80 ml. De cido
clorhdrico 2M para quitar la anilina libre. El exceso de cido clorhdrico se elimina
lavando con agua hasta Ph neutro. Secar la fase etrea con SO4Na2 anhidro y evaporar
a sequedad.
52. Anilidas grasas (por cromatografa de lquidos de alta eficacia)
52.1. Principio.
Extraccin con metanol, concentracin del extracto, disolucin del residuo y
posterior determinacin por cromatografa de lquidos de alta eficacia.
52.2. Material y aparatos.
52.2.1. Cromatgrafo de lquidos.
52.2.2. Columna RP-8.
52.2.3. Condiciones cromatogrficas:
Columna: RP-8.
Longitud de onda: 254 nm.
Solvente: Metanol.
Flujo: 1 ml/minuto.
52.3. Reactivos.
52.3.1. Metanol.
52.3.2. Agua destilada.
52.3.3. Acido actico.
52.4. Procedimiento.
Extraer 100 ml. De aceite en dos porciones de 50 ml. De metanol. Reunir ambos
extractos concentrndose a sequedad. Disolver la totalidad del residuo en 10 ml. De
metanol e inyectar 10 l. En el cromatgrafo.
52.5. Expresin de los resultados.
Como en 51.5.
53. COLORANTES ARTIFICIALES
53.1. Principio.
Dilucin con ciclohexano, extraccin por columna de almina, lavado con alcohol
etlico, concentracin y posterior determinacin por cromatografa en capa fina.
53.2. Material y aparatos.
53.2.1. Espectrodensitmetro.
53.2.2. Columnas de vidrio para cromatografa de 20 cm. De longitud y 2 cm. De
dimetro interno.
53.2.3. Placas de gel de slice comerciales de 0,25 mm. De espesor.
53.2.4. Cubetas de desarrollo para cromatografa.
53.3. Reactivos.
53.3.1. Ciclohexano.
53.3.2. Eter de petrleo.
53.3.3. Alcohol etlico.
53.3.4. Benceno.
53.3.5. Tetracloruro de carbono.
53.3.6. Almina neutra. Actividad 1.
53.4. Procedimiento.
Tomar 20 ml. De aceite y diluir con 20 ml. De ciclohexano. Hacer pasar la mezcla
lentamente por columna cromatogrfica de almina previamente embebida con
ciclohexano. Una vez que ha pasado todo el aceite por la columna, lavar varias veces
con ter de petrleo hasta que ste salga incoloro. A continuacin pasar por la columna
25 ml. De alcohol etlico que se recogen en un matraz. Concentrar hasta casi sequedad
y colocar en placa de silicagel manchas de 3 l. Frente a patrones. Introducir la placa
en una cubeta de cromatografa previamente saturada con eluyente (bencenotetracloruro de carbono) 50/50.
53.5. Interpretacin de los resultados.
Los colorantes desarrollados en la placa se identifican inicialmente por su Rf.,
confirmndose por espectrodensitometra (en caso de no disponer de este aparato,
ser necesario raspar la placa y realizar un barrido en espectro U. V.).
55.6.2 Los valores que se sealan en el apartado 55.3.3, para el grosor de las partculas
de la almina que se recomienda utilizar, se corresponden con las aberturas de mallas de
los tamices que se indican a continuacin:
Luz de malla/mm ..... Numeracin
0,063 ..... Tamiz 0,063
0,25 ..... Tamiz 0,25
55.6.3 Dado el carcter txico del benceno, debe evitarse la respiracin de sus vapores,
efectundose todas las operaciones en vitrina con un buen tiro, manteniendo la
compuerta de cierre lo ms baja posible.
55.6.4 Si se dispone de evaporador rotatorio, la concentracin de la disolucin puede
hacerse con ms rapidez y comodidad en el mismo erlenmeyer, sin tener que trasvasar a
la cpsula.
55.6.5 Las ceras, una vez desecadas, deben tener un color blanco limpio. Una coloracin
generalmente amarillenta o ambarina indica haberse realizado una purificacin
incompleta, falseando los resultados.
55.6.6 Es la mxima importancia la calidad de la acetona, cuyo contenido de agua es
crtico para la marcha normal del proceso de insolubilizacin. Por este motivo, es
conveniente someter la acetona anhidra comercial, calidad relativo anlisis, a un
proceso previo de deshidratacin, habiendo dado buen resultado el tratamiento con
cloruro clcico escoriforme, que se deja en contacto con la acetona durante cuatro o
cinco horas como mnimo, destilando la cantidad necesaria inmediatamente antes de su
utilizacin, empleando una columna Vigreux de 30 cm.
55.7 Referencias bibliogrficas.
1. Instituto Espaol de Normalizacin. UNE 55.115.
2. Instituto Espaol de Normalizacin. UNE 55.129.
56. TOCOFEROLES
56.1 Principio.
1. Extraccin de la materia insaponificable de la grasa.
2. Aislamiento de la fraccin de tocoferoles por cromatografa en capa fina.
3. Separacin y cuantificacin de los componentes de la fraccin de tocoferoles por
colorimetra o cromatografa gaseosa.
56.2 Material y aparatos.
56.2.1 Matraces de fondo redondo de 50 ml y 100 ml.
56.2.2 Matraces en forma de corazn de 15 ml.
56.2.3 Tubos de reflujo de 1 ml para adaptar a los matraces (56.2.1) o refrigerante de
reflujo.
56.2.4 Ampollas de decantacin de 125 ml.
56.2.5 Microjeringuillas de 100 l.
56.2.6 Placas de vidrio para cromatografa en capa fina de 20 cm * 20 cm, con capa de
gel de slice de 0,25 mm de espesor.
56.2.7 Contraplacas de 20 cm * 16 cm.
56.2.8 Cubeta de desarrollo en vidrio para cromatografa en capa fina, con tapa de
vidrio.
56.2.9 Pulverizador para lquidos de revelado.
56.2.10 Columna de eluccin, de vidrio, dimetro interior 6 mm, con un tubo superior
de 16 mm de dimetro y 95 mm de longitud, con un tubo capilar inferior de 40 mm de
longitud (figura 1).
56.2.11 Evaporador rotatorio o bao de agua hirviendo.
56.2.12 Estufa regulada a 110 2 C.
Llevar la columna sobre un matraz en forma de corazn. Pasar 5-6 ml del disolvente de
elucin (56.3.7). Evaporar los disolventes al vaco y proceder inmediatamente a la
evacuacin de los tocoferoles en el residuo, por uno de los mtodos de cuantificacin.
56.4.3 Colorimetra.-Todas las operaciones siguientes debern efectuarse en cmara y
con luz roja.
En cada matraz conteniendo la fraccin tocoferlica obtenida en 56.4.2, aadir
exactamente 3,6 ml de etanol, 0,2 ml de la solucin de cloruro de hierro III (56.3.10).
Mezclar por ligera rotacin del matraz y dejar reposar durante diez minutos.
Efectuar un ensayo en blanco en las mismas condiciones.
Trasvasar las soluciones a las cubetas (56.2.15) y medir las absorbancias a 520 nm de
las muestras y del ensayo blanco, con relacin al etanol. El ensayo en blanco debe tener
una absorbancia inferior a 0, 05.
Este mtodo es aplicable a todos los aceites, incluidos los de oliva virgen y no se
permite la separacin del y tocoferol, ni de los tocotrienios correspondientes.
56.4.4 Cromatografa gaseosa.
56.4.4.1 Preparacin de los sililteres.
En un matraz (56.2.16) aadir 0,5 ml de piridina (56.3.15), 0,45 ml de
hexamerildisilazano (56.5.16) y 0,3 ml de dimetilclorosilano.
Tapar y dejar reposar quince minutos hasta la completa decantacin del precipitado
blanco.
Del lquido superior claro, tomar 100 l con microjeringa e introducirlo en un matraz
que contiene la fraccin de tocoferoles en 56.4.2. La mezcla de la solucin se facilita
inclinando el matraz y haciendo girar sobre s mismo. Esperar cinco minutos antes de
proceder a la cromatografa gaseosa.
56.4.4.2 Condiciones de trabajo.
Para las columnas dadas en 56.2.19 sern:
Temperatura de la columna: 240 C.
Temperatura del inyector: 250 C.
Temperatura del detector: 250 C.
Flujo del gas portador: 0,8 atmsferas.
Inyectar 0,5-1 l de la solucin silanizada que, segn la respuesta cromatogrfica puede
ser concentrada por evaporacin en corriente de nitrgeno.
En estas condiciones y utilizando la columna (SE 30), los tiempos de retencin relativos
al -tocoferol son:
-tocoferol 1,00
+ tocoferol 0,71
-tocoferol 0,55
56.4.4.3 Para columnas capilares (56.2.20), las condiciones cromatogrficas sern:
Temperatura de la columna: 240 C.
Temperatura del inyector: 250 C.
Temperatura del detector: 250 C.
Gas portador caudal de entrada: 2 ml/min; caudal de columna: 60 ml/min.
Evaporar los relativos en corriente de nitrgeno de los sililteres obtenidos segn
56.4.1. Disolver el residuo en 1 ml de ter etlico e inyectar en el cromatgrafo 1 litro.
En estas condiciones, los tiempos de retencin reducidos para el -tocoferol sern los
siguientes:
..... OV-17 ..... SE-30
-tocoferol ..... 1,00 ..... 1,00
-tocoferol ..... 0,64 ..... 0,68
-tocoferol ..... 0,66 ..... 0,70
agotar el contenido del tubo de ensayo. En esta operacin, los tubos de ensayo se deben
coger por el cuello esmerilado, cuidndose no sacarlos del recinto del arcn.
Una vez se da por terminada la filtracin se retiran los embudos de los matraces antes de
sacarlos del arcn, se recogen los matraces y se evapora el disolvente en evaporador
rotatorio al vaco.
57.4.3 Purificacin del extracto.-Disolver el residuo en 0,25 ml de hexano y depositarlo
en forma de banda en una placa de CCF con gel de slice, de 20 * 20 cm y un espesor de
capa de 0,25 mm previamente activada por calentamiento en estufa a 105 C durante
unos quince minutos.
El desarrollo se realiza en cubeta cromatogrfica, con una mezcla hexano-ter etlico
8:2 (v/v), recientemente preparada, hasta que el frente del disolvente quede a unos 4 cm
del extremo superior de la placa.
Concluido el desarrollo, tomar una placa cromatogrfica limpia, sin recubrimiento de
slice, y se la coloca encima de la placa desarrollada, dejando al descubierto una banda
lateral de unos 3 cm de ancho, fijando el conjunto con una pinza.
Se introduce el conjunto de las dos placas en una cubeta saturada de vapores de iodo,
debiendo aparecer una banda ancha correspondiente a los triglicridos, claramente
separada de otros componentes minoritarios que pueden interferir.
57.4.4 Metilacin de los cidos grasos.-Raspar la banda de los triglicridos
recogindose el raspado en un papel satinado, pasando el polvo al matraz de metilacin
(57.2.13).
Agregar al matraz 10 ml de disolucin de metilato de sodio y hervir en bao Mara a
reflujo, durante cinco minutos.
Retirar el matraz del bao, agregar una gota de solucin de fenolftalena y a
continuacin disolucin metanlica de clorhdrico, hasta reaccin cida y un volumen
igual al consumido para neutralizar, como exceso, hirviendo de nuevo diez minutos.
Enfriar la disolucin con los steres metlicos, agregados seguidamente al matraz 0,25
ml de hexano y 15 ml de solucin acuosa saturada de cloruro de sodio. Agitar
fuertemente, adicionando a continuacin, la cantidad necesaria de la misma solucin
salina, para que la capa de hexano se site en el cuello del matraz.
Dejar reposar unos minutos para que la capa de hexano se separe limpia en el cuello del
matraz, pasndose seguidamente a efectuar el anlisis de los cidos grasos por
cromatografa gaseosa.
Se realiza tambin la metilacin de la muestra de aceites originales utilizado para el
fraccionamiento, siguiendo el mtodo oficial nmero 41.
57.4.5 Acidos grasos por cromatografa gaseosa.-Segn mtodo oficial nmero 41.
57.5 Expresin de los resultados.
Sea x el contenido en cido linoleico de la muestra original encontrado por anlisis gascromatogrfico; e y el contenido en cido linoleico de la fraccin ms insaturada.
En la tabla I se entiende para cada valor de x el valor previsible para y, en el supuesto de
que se trate de un aceite genuino, teniendo en cuenta la dispersin real de resultados,
calculado con un nivel de probabilidad de 0, 99.
Para valores de x intermedios, no incluidos en la tabla, se calcular el valor previsible
de y por interpolacin entre los dos valores ms prximos.
Si el valor encontrado para el cido linoleico en la fraccin ms insaturada es superior a
la cifra deducida de la tabla se puede considerar a la muestra adulterada; para valores
inferiores o iguales hay que considerarla como genuina (57.6.3 y 57.6.4).
TABLA I
58.5.2 En los casos de aceites de oliva y de orujo de aceituna, en los que el contenido de
eritrodiol en relacin al -sitosterol vaya a utilizarse como criterio de diferenciacin,
debe tomarse el denominador -sitosterol aparente, dado por la suma del -sitosterol
e Incremento 5-avenasterol. Para este fin, es recomendable la utilizacin como fase
estacionaria del SE-30, ya que, con esta fase, estos dos esteroles se registran en un solo
pico.
58.5.3 La utilizacin de este tubo no es imprescindible, pudiendo ser sustituido por una
varilla hueca de 7-8 mm de dimetro interior, y una longitud aproximada de 250 mm,
con una estrangulacin en el extremo para un tapn de lana de vidrio de 20-30 mm.
58.5.4 Tanto la fase fija como los soportes que se sealan, se hace slo a ttulo
orientativo, por haberse experimentado con resultados satisfactorios. Sin embargo,
pueden ser sustituidos por otros rellenos que podrn dar resultados anlogos, o incluso,
mejores, siempre que la columna satisfaga los criterios de eficacia que se dan en el
apartado (58.5.3).
Con columnas de OV-17 o SE-30 puede producirse el solapamiento del eritrodiol con el
Incremento 5-avenasterol que, en determinados casos, puede estar presente en
cantidades significativas. Estos esteroles pueden separarse perfectamente con columna
capilar de OV-17 (58.5.2).
58.5.5 Antes de su utilizacin para la purificacin del insaponificable, la resina deber
ser sometida al tratamiento siguiente:
6-7 g de resina se introduce en una columna cromatogrfica (58.2.1), agregndose 100
ml de metanol anhidro que se hacen pasar a una velocidad aproximada de una gota por
segundo. Una vez pasada la totalidad del metano, se hace pasar por la columna una
corriente de aire con el fin de eliminar los restos de metanol. La resina as desecada
puede conservarse en un frasco hermticamente cerrado.
La resina se hidrata con mucha facilidad, reteniendo grandes cantidades de agua. Por lo
tanto, en algunos casos, la cantidad indicada de metanol puede ser insuficiente para
lograr la deshidratacin total de la resina, siendo necesario un lavado ms prolongado,
utilizando mayor cantidad de metanol.
Inmediatamente antes de su utilizacin, la cantidad necesaria de resina (6 g), se pone en
suspensin en 10-15 ml de xido dietlico, mantenindola as unos quince minutos,
agitando suavemente de vez en cuando.
58.5.6 En lugar de la mezcla hexano-xido dietlico para el desarrollo de la placa,
pueden utilizarse otros disolventes con resultados anlogos, y siempre que se consiga
una separacin clara de los esteroles y los dialcoholes triterpnicos que permita su
localizacin en la placa, para su raspado y recuperacin cuantitativa. Se han
recomendado por algunos experimentadores el cloroformo; benceno-acetona (95:5);
heptano normal-acetona (85:15); etctera.
58.5.7 En el caso de que la solucin etrea del insaponificable contuviese mucha agua,
lo cual es lo ms frecuente, es conveniente proceder a una desecacin con sulfato
sdico. Para ello, se adiciona a la solucin contenida en la ampolla de extraccin 8-10 g
de sulfato sdico anhidro, agitndose y dejando en reposo durante treinta-cuarenta y
cinco minutos. Seguidamente, se filtra la solucin, que se recoge en el matraz en el que
se vaya a efectuar la destilacin. La ampolla y el filtro se lavan con tres porciones de
xido dietlico de 5 ml cada una.
58.5.8 Todas estas operaciones de evaporacin se pueden realizar con mayor rapidez y
comodidad utilizando un evaporador rotatorio de vaco. En cualquier caso, la disolucin
del insaponificable no deber ser calentada por encima de los 40 C.
DISPOSICION DEROGATORIA
Quedan derogadas cuantas disposiciones de igual o inferior rango se opongan a lo
establecido en la presente Orden.
ANEJO
59. ACIDO ERUCICO
59.1. Principio.-Separacin de los steres metlicos de los cidos grasos por
cromatografa en la capa fina con nitrato de plata y determinacin cuantitativa de los
steres as separados por cromatografa en fase gaseosa.
Este mtodo permite determinar el contenido en cido ercico de:
A) Los aceites y grasas que contengan cido cetoleico (ismero cis del cido
docosenoico, que se encuentra en los aceites de pescado).
B) Los aceites y grasas hidrogenadas que contengan ismeros cis y trans del cido
docosenoico.
59.2 Material y aparatos:
59.2.1 Balanza analtica con una precisin de 0,1 miligramos.
59.2.2 Equipo de cromatografa en capa fina que incluya:
59.2.2.1 Cubetas de desarrollo.
59.2.2.2 Placas de vidrio de 20 x 20 centmetros.
59.2.2.3 Aplicador para depositar las soluciones en forma de banda estrecha o de lnea
sobre placas TLC.
59.2.3 Unidad de congelacin capaz de mantener la cubeta de desarrollo y su contenido
a una temperatura entre -20 C y -25 C.
59.2.4 Lmpara de rayos U.V.
59.2.5 Columnas de vidrio de 200 milmetros de largo y 10 milmetros de dimetro
interno, provistas de filtros de lana de vidrio o vidrio calcinado, o bien pequeos
embudos provistos de filtros de vidrio calcinado.
59.2.6 Aparato de cromatografa de gases acoplado a un integrador electrnico, tal
como se describe en el punto 2 del apartado A.
59.3 Reactivos:
59.3.1 Agua destilada o desmineralizada de pureza equivalente.
utilizar. Antes de hacer uso de ellas, trazar surcos a travs del subtrato a 10 milmetros
de los lados y de la parte superior de cada placa, a fin de disminuir los efectos
marginales durante el desarrollo (ver nota 2).
59.4.3.2 Aplicacin de los steres metlicos. Con ayuda del aplicador (59.2.2.3)
depositar 50 l de la solucin de steres metlicos preparada a partir de la muestra,
sobre una fina lnea de unos 50 milmetros de largo, a 40 milmetros como mnimo de
los lados y a 10 milmetros de la parte inferior de la placa. Aplicar de la misma manera
100 l de una solucin que contenga volmenes iguales de la solucin de steres
metlicos y de la solucin de erucato de metilo (59.3.7). Tras la aplicacin de los steres
metlicos (ver nota 3), colocar la placa en una cubeta con ter dietlico hasta que suba el
frente de desarrollo a unos 5 milmetros por encima de la zona de aplicacin. Dicha
operacin concentrar los steres metlicos en una banda estrecha.
59.4.3.3 Desarrollo de las placas. Colocar la cubeta conteniendo el lquido (59.3.9) en la
unidad de congelacin (59.2.3) que se halla a -25 C aproximadamente (podr resultar
til proteger la cubeta de la luz con algn tipo de revestimiento). Transcurridas dos
horas, colocar la placa en la cubeta con precaucin y dejar subir el disolvente hasta que
alcance una zona situada entre la mitad y los dos tercios de la altura de la placa. Retirar
sta y evaporar lentamente el disolvente con ayuda de una corriente de nitrgeno.
Volver a colocar la placa en la cubeta y dejar que el disolvente alcance la parte superior
de la placa. Retirar sta y secarla de nuevo con la corriente de nitrgeno, revelndola a
continuacin con la solucin de 2, 7-diclorofluorescena (59.3.10) y examinar a la luz
U.V. Se podr localizar la banda de erucato de metilo presente en la muestra por
referencia a la banda ms intensa de la muestra a la cual se ha aadido el erucato de
metilo (ver figura).
59.4.3.4 Separacin de las fracciones de steres metlicos. Raspar cuantitativamente la
banda de erucato de metilo procedente de la muestra y pasarla a un recipiente de 59
mililitros de capacidad (ver nota 7 y figura). Raspar cuantitativamente las bandas que se
encuentran por encima y la que se encuentra inmediatamente por debajo de la banda de
erucato de metilo y que contienen las dems fracciones de steres metlicos de cidos
grasos y pasarlas a otro recipiente de 50 mililitros. En cada uno de los dos recipientes
verter 1,0 mililitros de la solucin patrn de tetracasaonato de metilo (59.3.8) y 10
mililitros de ter dietlico (59.3.2). Agitar y transferir separadamente el contenido de los
recipientes a las correspondientes columnas o embudos (59.2.5), que contendrn
aproximadamente 1 gramo de gel de slice (59.3.5). A continuacin extraer 3 4 veces
los steres con ayuda de 10 mililitros de ter dietlico. Recoger el producto eluido o
filtrado si es con embudo, en pequeos matraces. Tras haber evaporado una parte del
disolvente con corriente de nitrgeno, transferir los steres metlicos a matraces en
forma de corazn. Evaporar el resto del disolvente con corriente de nitrgeno, de
manera que los steres metlicos se concentren en el fondo. Disolver los steres
metlicos en 25 a 50 l de n-Hexano (59.3.3).
59.4.4 Cromatografa gas-lquido:
59.4.4.1 Seguir la metdica descrita en el apartado I e inyectar de 1 a 2 l de las
soluciones de steres metlicos obtenidos a partir de: a) La fraccin que contiene el
erucato de metilo, y b) las fracciones que contienen el resto de los steres metlicos.
59.4.4.2 Las reas de los picos suministrados al integrador electrnico son las
siguientes:
A) A partir del cromatograma de la fraccin que contiene el erucato de metilo:
1) Erucato de metilo (E).
2) Patrn interno (L1).
3) Areas totales de los picos de los steres metlicos, exceptuando el patrn interno
(EF).
B) A partir del cromatograma de la fraccin que contiene el resto de los steres
metlicos:
1) Areas totales de los picos, exceptuando el patrn interno (RF).
2) Patrn interno (L2).
59.5 Expresin de resultados:
59.5.1 Frmula y mtodo de clculo:
59.5.1.1 El contenido en cido ercico de la muestra, expresado en porcentaje de ster
metlico de los steres metlicos totales, viene dado por la frmula siguiente:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 735)
En donde E, EF, RF, L1 y L2 son las reas de los picos definidos en (59.4.4.2),
corregidas, si fuera necesario, por factores de calibracin. El contenido de erucato de
metilo obtenido mediante esta frmula es equivalente al contenido de cido ercico
expresado en porcentaje del contenido total en cidos grasos.
59.5.1.2 Si el rea de los picos est expresada en tanto por ciento, calcular como sigue
los valores EF y RF:
EF = 100 - L1.
RF = 100 - L2.
59.5.1.3 El modo de clculo (59.5.1.1) supone que el contenido de cido tetracosanoico
de la muestra es despreciable; cuando esto no sea as, el valor del contenido del cido
tetracosanoico (L.) Obtenido del cromatograma de las fracciones que contienen los otros
steres metlicos, se puede reducir a:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 735)
En donde:
T2: Area del pico del ster metlico del cido tetracosanoico proveniente de la muestra,
que constituye una parte de la superficie del pico atribuido al patrn interno del
cromatograma de la fraccin restante de steres metlicos.
P2: Area del pico del ster metlico del cido palmtico obtenido del cromatograma de la
fraccin restante.
T0: Area del pico del ster metlico del cido tetracosanoico obtenido del cromatograma
de los steres metlicos de los cidos grasos totales, determinados segn el mtodo
descrito en el apartado A.
P0: Area del pico del ster metlico del cido palmtico obtenido del cromatograma de
los steres metlicos de los cidos grasos totales, determinada segn el mtodo descrito
en el apartado A.
59.5.1.4 Origen de la frmula: El contenido en cido graso de la fraccin que contenga
el erucato de metilo, expresado en porcentaje del contenido total de cidos grasos en la
muestra, vendr dada por:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 735)
El contenido en cido ercico de la fraccin que contenga el erucato de metilo vendr
dada por:
E / EF
De donde resulta que el contenido en cido ercico de la muestra, expresado en
porcentaje del contenido total de cidos grasos, vendr dado por:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 736)
59.5.1.5 Repetibilidad: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones
paralelas efectuadas simultneamente en las mismas condiciones por el mismo analista
sobre la misma muestra no deber superar, en valor relativo, el 10 por 100 del resultado
obtenido y, en valor absoluto, 0,5 gramos por 100 gramos de muestra tomando el valor
ms elevado (ver notas 4, 5 y 6).
Notas:
1. El peso de la muestra presentada al laboratorio para su anlisis deber ser
normalmente de 50 gramos, a menos que sea necesaria una cantidad mayor.
En general, los siguientes valores sern los que den los resultados deseados, a saber,
nmero de platos tericos para el estearato de metilo al menos igual a 2.000 y elucin
de ste en aproximadamente quince minutos:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 737)
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 738)
Cuando el aparato lo permita, estar el inyector a una temperatura cercana a los 200 C
y el detector a una temperatura igual o superior a la de la columna.
El caudal de hidrgeno del detector de ionizacin de llama es, en general, de cerca de la
mitad del gas portador y el de oxgeno es de 5 a 10 veces el del hidrgeno.
4.1.2 Determinacin de la eficacia y de la resolucin:
Efectuar el anlisis de una mezcla de estearato y de oleato de metilo en proporciones
sensiblemente equivalentes (por ejemplo, steres metlicos de manteca de cacao). La
importancia de la concentracin de muestra, la temperatura de la columna y el caudal
del gas portador se escogern de manera que el mximo del pico de estearato de metilo
se registre alrededor de quince minutos despus del pico del disolvente y que dicho pico
corresponda aproximadamente a los tres cuartos de la escala total.
Calcular el nmero de platos tericos n (eficacia) mediante la frmula:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 738)
Donde:
Dr1 es la distancia de retencin en milmetros medida a partir de la introduccin hasta el
mximo relativo del pico de estearato de metilo.
W1 y w2 son las anchuras en milmetros de los picos del estearato y del oleato de metilo
medidas entre los puntos de inflexin de la curva.
/FONTD es la distancia entre los mximos relativos de los picos del estearato y del
oleato de metilo.
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 738)
Las condiciones de operacin que se tomarn en consideracin sern las que den un
nmero de platos tericos para el estearato de metilo al menos igual a 2.000 y una
resolucin de al menos 1,25. Debern, adems, ser tales que el cido linolnico (C18:3)
sea separado de los cidos arquico (C20:0) y gacoleico (C20:1)
4.2 Anlisis: El volumen de muestra ser de 0,1 a 2 l de la solucin heptnica de los
steres metlicos obtenida en el apartado B. En los casos de steres exentos de
disolventes, hacer una solucin al 10 por 100 aproximadamente en heptano e inyectar de
0,1 a 1 l de sta.
Para la bsqueda de componentes presentes en trazas, esta toma de muestras podr
aumentarse hasta 10 veces; en los casos habituales, las condiciones de operacin sern
las determinadas en el punto 4.1.1. Sin embargo, ser posible operar con una
temperatura de columna ms baja en el caso en que sea necesario dosificar cidos grasos
inferiores a C,2, o ms elevada en el caso en que fuera necesario dosificar cidos grasos
superiores a C20
En su caso, es posible operar a una temperatura programada en los dos casos
precedentes. Por ejemplo, si la muestra contuviera steres metlicos de cidos grasos de
menos de 12 tomos de carbono, inyectar la muestra a 100 C (o a 50-60 C si el cido
butrico estuviera presente) y programar inmediatamente a 48 C/minuto hasta la
temperatura ptima.
En determinados casos, podrn combinarse los dos procedimientos: Despus del
perodo de programacin de temperatura, continuar la elucin a temperatura constante
hasta la elucin de todos los constituyentes. Si el aparato no pudiera trabajar a
temperatura programada, operar a dos temperaturas fijadas entre 100 y 195 C.
Si fuera necesario, se recomienda hacer un anlisis sobre dos fases fijas de polaridades
diferentes para comprobar la ausencia de picos ocultos, por ejemplo para los aceites de
pescado o en el caso de la presencia simultnea de C18:3 y C20 y de C18:3 y de C18:2
conjugados.
5. Expresin de los resultados:
5.1 Anlisis cualitativo: En condiciones de operacin idnticas a las del ensayo, analizar
la mezcla testigo, de composicin conocida, y determinar las distancias de retencin (o
los tiempos de retencin) para los cidos grasos constitutivos. Trazar las curvas que den
el logaritmo de la distancia de retencin (o del tiempo de retencin) en funcin del
nmero de tomos de carbono; en condiciones isotermas y para los steres de cadena
recta y un ndice de insaturacin fijado, dichas curvas trazadas sobre papel
semilogartmico debern ser rectas notablemente paralelas.
Para la prueba, identificar los picos remitindose a dichas rectas, si fuera necesario
interpolando.
Debern evitarse las condiciones operativas en las que existan picos ocultos, o sea,
que dos constituyentes no puedan distinguirse como consecuencia de una resolucin
insuficiente.
5.2 Anlisis cuantitativo:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 739)
Ci= rea del pico correspondiente al compuesto i,
ci=suma e las reas de la totalidad de los picos.
De donde:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 739)
Habitualmente, los factores de correccin se refieren al K16 = 1 y se obtienen los
factores relativos:
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 739)
Para la muestra, el contenido en cada constituyente est dado por porcentaje (m/m) del
compuesto i expresado en steres metlicos
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 739)
5.2.1.3 Empleo de un patrn interno: En determinados casos (en especial cuantificacin
de los cidos C4 y C6 y cuantificacin de los cidos en caso de que todos los cidos
grasos no estn eluidos) proceder utilizar un patrn interno (respectivamente C5 y C15
C17) y, a continuacin, determinar el factor de correccin del mismo.
Porcentaje (m/m) del compuesto i expresado en steres metlicos=
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1989, TOMO I, pg. 739)
Ms=peso del patrn interno en mg,
M=peso de la muestra en mg,
Ks=factor de correccin del patrn interno,
As=rea del pico correspondiente al patrn interno,
Az=rea del pico correspondiente al compuesto i.
5.5.2 Expresin de los resultados: Dar el resultado con:
Quitar la fuente de calor del matraz y despus el refrigerante. Aadir algunos mililitros
de la solucin saturada de cloruro de sodio y agitar suavemente el matraz varias veces
por rotacin.
Continuar aadiendo solucin saturada de cloruro de sodio para llevar el nivel del
lquido al cuello del matraz. Trasladar alrededor de 1 mililitro de la capa superior
(solucin heptnica) a un tubo de ensayo esmerilado y aadir la cantidad de sulfato de
sodio anhidro necesaria para eliminar los restos de agua. En el caso de una muestra de
350 miligramos, la solucin obtenida contendr alrededor del 5 al 10 por 100 de steres
metlicos y podr inyectarse directamente en la columna de cromatografa en fase
gaseosa. En los otros casos diluir la solucin heptnica para obtener una concentracin
del 5 al 10 por 100 en steres metlicos (nota 6).
Para obtener la totalidad de los steres secos, trasladar la solucin y la fase heptnica a
una ampolla de decantacin de 250 mililitros. Decantar. Extraer la solucin salina con
50 mililitros de ter de petrleo (Eb 40-50 C) o de hexano.
Repetir una segunda vez esta extraccin. Reunir la fase heptnica y los dos extractos y
lavarlos con porciones de 20 mililitros de agua hasta la desaparicin de la acidez
(indicador: Rojo de metilo). Secar con sulfato de sodio anhidro y evaporar el disolvente
al bao mara bajo corriente de nitrgeno (nota 6 y nota 7). Para muestras inferiores a
500 miligramos, es preferible reducir proporcionalmente los volmenes de disolvente y
de agua.
1.4.2 Para cidos grasos:
Si la muestra est constituida nicamente por cidos grasos no se efecta la
saponificacin.
Introducir la cantidad deseada de cidos grasos preparados en el matraz. Aadir la
cantidad indicada de la solucin metanlica de trifluoruro de boro. Llevar a ebullicin
durante dos minutos. Proceder a continuacin como se indica en el punto 1.4.4 a partir
de: Aadir a la mezcla hirviendo....
2. MTODOS ALTERNATIVOS NO UTILIZANDO EL TRIFLUORURO DE
BORO:
2.1 Para los cuerpos grasos neutros (IA < 2):
2.1.1 Principio: Metanlisis de los glicridos en medio alcalino.
2.1.2 Material:
Agitador que permita una agitacin rpida y dispositivo de calentamiento apropiado
(por ejemplo, agitador magntico-calentador).
Erlenmeyer o matraz de 100 mililitros de cuello esmerilado.
Tubo para burbujeo de nitrgeno.
Para los cuerpos grasos cidos, neutralizacin de los cidos grasos libres, metanlisis
alcalina de los glicridos y esterificacin posterior de los cidos grasos en medio cido.
Para los cidos grasos, esterificacin en medio cido.
2.2.2 Material:
Agitador que permita una agitacin rpida y dispositivo de calentamiento apropiado
(por ejemplo, agitador magntico- calentador).
Erlenmeyer o matraz de 250 mililitros de cuello esmerilado.
Tubo para burbujeo de nitrgeno.
Refrigerante que se adapte al erlenmeyer o al matraz.
Regularizador de ebullicin, exento de grasa.
Ampollas de decantacin de 250 mililitros.
Erlenmeyer de boca estrecha, de 100 mililitros.
2.2.3 Reactivos:
Solucin de metilato de sodio obtenida disolviendo 1 gramo de sodio en 100 mililitros
de metanol que no contenga ms del 0,5 por 100 (m/m) de agua.
Solucin metanlica de cido clorhdrico de alrededor de 1 N (ver observaciones 2.2.6,
a) y b).
Heptano para cromatografa (nota 2, nota 4).
Sulfato de sodio anhidro.
Nitrato que contenga menos de 5 miligramos de oxgeno por kilogramo.
2.2.4 Mtodo operatorio para los cuerpos grasos cidos (IA > 2):
En presencia de aceites que contengan cidos de ms de 2 dobles enlaces es
recomendable eliminar el aire contenido en el metanol y en el matraz mediante burbujeo
de nitrgeno durante algunos minutos.
En un erlenmeyer o un matraz de 250 mililitros introducir alrededor de 4 gramos (nota
5) de cuerpo graso preparado.
Aadir 40 mililitros de la solucin de metilato de sodio (ver observacin 2.2.6, c). Poner
bajo refrigerante a reflujo, agitar y llevar a ebullicin. La solucin debe hacerse lmpida,
lo que se produce generalmente al cabo de una decena de minutos. La reaccin estar
prcticamente finalizada despus de quince minutos.