Ponies uae) Discos para Antibiogramas CONSIDERACIONES GENERALES Las pruebas in vitro de susceptibilidad de germenes a los agentes anti-microbianos es, hoy en dia, una practica corriente en el Labo- ratorio Clinico. Los fendmenos de transferencia genética y Ja mutacion en las bacterias, han dado lugar a la aparicion de cepas resistentes a uno 0 varios anti-mieroblanos, aunado a ello el uso indi criminado que se hace de los antimicroorganis- mos tanto por la poblacién en general como tambien hospitalario. Esto lleva a la necesidad de conocer el patron de susceptibilidad de las cepas aisladas en los casos clinicos frente a los anti-microbianos disponibles,teniendo en cuen- ta que tal patron varia ampliamente, depen- diendo del genero, la especie y atin el sitio donde se aisla el microorganismo. Debido a que no se hacen de rutina las pruebas de dilucion seriada, una alternativa es recurrir al uso de los Discos para obtener la Informacion necesaria que sirva como gula del tratamiento. Los microorganismos de crecimiento lento, anaerobios obligados y capnofilicos (que requie- ren de una atmésfera de CO2) no deben probarse por el método de difusion con Discos, que 3e describen para probar microorganismos aerobios o facultatives de crecimiento rapido, Si se desean pruebas de susceptbilidad para estos microorganismos, deben usarse los méto- dos de dilucion. Ahora los microorganisms que no re quieren de antibiograma son: S. pyrogenes, S.pneu-moniae, N.meningitides, N.gonorthoeae. C.diphteriae, A. israeli, H. influenzae, B.pertu: ssis, Bumelitensis y otros que tlenen un patron de susceptibilidad definido. FUNDAMENTO DE LA PRUEBA. Se basa en, colocar un Disco Impregnado con determinada cantidad de anti-microblano, sobre un medio sélido inoculado con bacterlas, el antl-microblano difundira, tomandose un gradiente de concentracién, el cual inhibiré 0 ermitiré el crecimiento de la bacteria. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA. A) Se recomlenda internacionalmente para la realizacion de esta prueba el agar de Mueller-Hinton, por reunir las _carac~ teristieas mas’ apropiadas, el pH final a temperatura ambiente deberd estar entre 7.2y 7.4, este medio favorece el crecimiento de cast todos los microorganismos. Colocar 25 ml. del medio en cajas de Petri (de plastico 0 de vidrio) de 90 mm. de diametro, de tal forma que la profundidad sea de 4mm. Las placas deberan guardarse en el refrigerador (2 a 8° C) en bolsas de plastico, para disminuir la pérdida de agua por evaporacion: antes de usarse, las placas se colocaran en una incubadora a 35°C por 30 minutos para eliminar la humedad exce- siva, Para mlcroorganismos exigentes puede agregarsele al medio, sangre de cordero, de caballo u otro animal desfibrinada al 5%. ©) Tomar con un asa 4 6 5 colonias aisladas del mismo tipo morfologico € inocular en 4 6 5 mi. del medio de cultivo, pudiendo ser aldo Mueller-Hinton 0 caldo Soya Tripticasa se incuba a 35°C hasta que aparece una turbidez ligera (generalmente entre 2 a 5 horas), Ia (urbidez se ajusta con solucion salina estéril 0 caldo estéril hasta tener una densidad comparable con un estandar de sulfato de barlo, El estandar se prepara mezclando 0.5 ml de BaCl2 0.048 M B) 49(1.175% peso/volumen de BaCl2.2H20) con 99.5 ml de H2S04 al 1% v/v (0.36N), que es la initad de Ia densidad del esténdar No. 1 de MacFarland, (se denomina a menudo estandar 0.5 de McFarland). La suspension ajustada del inéculo no debe permanecer mas de 15 a 20 minutos antes de proceder a sembrarla en la caja de Petri. D) Para inocular al agar se utiliza un hisopo esteril de algodén, el cual se humedece con la suspension, se quita el exceso de caldo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo, por arriba del nivel del caldo, se estria el medio en tres direc- ciones sobre la totalidad de la superficie del agar, para obtener un inéculo uniforme, se efectua un tltimo barrido del hisopo sobre el rebordle de la caja de Petri y el agar. Cuando el inéculo ha secado (3 a 5 Minutos} se procede a colocar los discos. E) Los discos se toman con pinza esteril y se colocan en el medio en un tiempo menor a 15 minutos después de haber incculado la placa, los discos deberin presionarse ligera- mente para asegurar un contacto con la superficie, debera prevenirse una sobrepo- sicién de las zonas de inhibicién con una distribucion adecuada de los discos y con tun limite no menor de 15 mm de los bordes dela placa. F) Luego de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petri e incubar a 95°C sin agregar CO2 el tempo de incu bacion es de 16 a 18 horas. En situaciones de urgencia clinica se podran efectuar lecturas preliminares a las 5 6 6 horas de incubacion pero debern ser reln- cubadas hasta completar las 18 horas. G) La medicion de los halos de Inhiblelén se efectua con compases de caltbracién, vernler, regla o plantilla disefhiada para este ropésito, por el fondo de la caja la cual se lumina con luz reflejada. Cuando se utiliza medio adiclonado con sangre, la lectura se efectiia sobre la super- ficie del agar. El punto final de todos los sistemas de lectura seri hasta la completa inhibicién del crecimiento determinada vi- sualmente, ignorando colonias tenues 0 muy Pequenias que pueden ser obervadas con minuclosidad, Las colonias grandes que aparecen entre la zona clara de inhibicion pueden ser va- Hlantes resistentes o bien un inéculo mezclado, por lo que se recomienda verificar la pureza de éste con un frote y tineion de Gram, o mejor con reidentificacién completa En el caso de las sulfas o mezcla de sulfatri- ‘metoprim, el mlcoorganismo puede crecer a través de varias generaciones antes de que ‘ocurra la inhibicion, en este caso, un ligero cerecimleto (90% de inhibicién) se descarta y se mide el margen de crecimiento abun- dante. El velo o swarming que produce Proteus spp también se descarta, INTERPRETACION DE RESULTADOS Las cepas se clasificaran en Resistentes (R), Intermedias (1) o Susceptibles (S). dependiendo del diametro del halo de inhibicién (incluyendo los 6 mm. del disco) SITUACIONES ESPECIALES a técnica de Kirby-Bauer, se disené para probar la sensibilidad anti-microbiana para microorganismos no exigentes y de crecimiento moderadamente rapido. algunos patdgenos co- munes no estan dentro de esta categoria, por lo cual el método debe modificarse y adaptarse a cada mieroorganismo. Estos microorganismos son:N.gonorthoeae,N.smeningitidis.H. influenzae, pneumoniae, Staphylococcus aureus metielina resistente. PRESENCIA DE MICRORGANISMOS PRO- DUCTORES DE BETA-LACTAMASA Con el objeto de que no se prueben inne- cesariamente las cepas B-lactamasa positiva de estafllococos se menciona a continuacién uno de los métodos para detectar la presencia de esta enzima, El método acidométrico consiste en permitir que el microorganismo sospechoso reaccione con una solucién de penicilina Ga un pH de 8.5; a este pH solucién de penicilina sera de color violeta cuando se use como indicador rojo fenol o purpura de bromocresol. La Blactamasa reaccionar4 con la peniel lina G para productr acido penictloice y el indi cador viraré a amarillo, RECOMENDACIONES 1) Los Sensidiscos producidos por nuestra firma (*REPYCOTEC) estan disenados segun el método de difusion de discos de papel filtro de Kirby-Bauer, con las modificaciones recomendadas por la Food an Drug Adminis: tration (FDA), el National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS) y modificaciones efectuadas por nuestro departamento de produccion de acuerdo a las caracteristicas proplas de nuestro medio, Se nos hace imperioso sefalar que la FDA recomienda las siguientes caracteristicas del Papel filtro: 1) Se debe utilizar discos de color blanco ‘con un diametro aproximado de 1/4 de pulgada (6.5 +/- 0.5 mm). 502) El peso del papel filtro blanco debe ser de 30 mg, +/-4 por centimetro cuadrado. 3) El papel no debe contener ningan mate- sal que inhiba o aumente la actividad de cualquier antl-mlcroblano, para lo cual se determina el pH que, no debe ser mayor de +0.3 unldades en relacion con el pH del agua destilada usada para determinarlo. 4) La capacidad de absorcion de agua dest! Tada debe ser de 2.5 a 3.0 veces su peso (NB = REPYCOTEC SE GUARDA LAS NORMAS ESTANDARIZADAS PARA NUESTRO MEDIO, EN SU PRODUC- clon) Ml, Se debe tener culdado en Ja Interpretacion de los resultados y en el reporte de los mismos, ya que se trata de pruebas basica- ‘mente cualitativas, que sirven de guia en la terapéutica, lo cual indica que no siguen una estricta correlacin :con la actividad de los antbisticos in vivo. POSIBLES FUENTES DE ERROR 1) Uso de otro medio que no sea el de Mueller- Hinton. 2) Preparacion inadecuada del Medio M-H, sobre todo falta de control de pH. 3) Conservacién inadecuada de las placas de Petri con el medio M-H. 4) Almacenamlento inadecuado de los discos ‘con antibioticos. 5) Inéeulo inadecuado por error en el reajuste de la densidad del microorganismo en el aldo. 6) No eliminar el exceso de liquido del hisopo antes de inocular las cajas. 7) Preparacion y almacenamiento no adecuado del estindar de referencia para turbidez. '8) Tempo no adecuado entre la preparacién del inéculo y la tnoculactén. 9) Tempo inadecuado en la aplicacién de los discos después de la inoculacion a la placa. 10)Tempo Inadecuado en la incubacién de la placa después de la colocacién de los discos. 11)Temperatura diferente de 35°C 0 el uso de almdsfera con C02 en la Incubacion. 12}Lectura de resultados antes de 16 a 18 horas. 13)No leer culdadosamente los limites de las ‘zonas de inhibietén, 14)Cultivos mbxtos. 15)Aplicacion del procedimiento a microorganis- ‘mos de crecimiento lento 0 anaerobios. 16)No utilizar cepas control © no anolar los resultados de la prueba control. I7)Eror en la trascripeion de resultados de pruebas individuales. DURACION ¥ ALMACENAMIENTO. La fecha de vencimiento para cada uno de Jos antibloticos se encuentra en la etiqueta de presentacion, la temperatura recomendada para la conservacion de los mismos es de 2 a ec, CONTROL DE CALIDAD Las cepas control utllizadas para medir la reproductibilidad de esta técnica son: Staphy- lococcus aureus (ATCC 25923) y Escherichia coll (ATCC 25922) que debera incluirse en la prueba daria, Entiendase tambien que la FDA recomlenda €1 uso de la cepa de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) susceptible a Gentamicina y Carbenicilina, NUESTRO PROGRAMA DE PRODUCCION EN "SENDIDISCOS": Envases color caramel con: 100, 200 y 300 unidades. ‘Ac. Nalidixico Ac. Pipemidico Amtkacina Amoxicilina Ampicilina —_Cefadroxil Cefalexina. Cefradina_—Cefoperazona Cefoiaxina Ceftriaxona_—Ceflizoxima Ciprofloxacino Clindamicina_Cloranfentcol Cloxacilina —-Enoxacina—_Eritromicina Espectinomicina Fosfomicina Gentamicina Kanamicina —Lincomicina__Metronidazol Neomicina _Nitrofurantoina Norfloxacino Oxacilina Penicilina —_-Rifampleina Streptomicina Sulfadiazina S+T Tetraciclina Trimetoprim —_Vancomicina ‘Ac. Oxolinico Flucloxacilina Doxicilina DISCOS PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS OxIDASA. Discos embebidos en solucién de (etrafenit: p-fenilendiamina, para determinar la presen. la de Ja enzima oxidasa, producida por los distintos géneros bacterianos como por ejemplo: Moraxella, Pseudomonas, aereomo: nas, Alcaligenes, Neisserias, etc La enzina citrocromo oxidasa cataliza la Feaccion entre el oxigeno molecular y un sustrato artificial. dando lugar aun producto final coloreado. ONPG, Discos embebidos en una solucién de 0- nitrofenil D-galactosino, para detectar la presencia o ausencia de la enzima B. Balactosidasa: con ello se consigue diferen: iar los microorganismos con una accion retardada a la lactosa, de los lactosa negati La Bgalactosidasa hidroliza_al_reactivo ONPG (incolore), Itberando o-nitrofenel, que en medio alcalino produce una coloracion amarilla, 51OPTOgUINA Discos embebidos en solucién acuosa de clorhidrato de etilhidrocupreina, para la diferenciacion presuntiva de estreptococos alfa hemoliticos, de los neumococes. El clorhidrato de etilhidrocupreina provoca la ruptura de la membrana celular sel neumococo, mientras que los estreptococos son resistentes. BACITRACINA Discos embebidos en una solucion de bac tracina, para la diferenciacién presuntiva del estreptococo beta hemolitice grupo A y né grupo A. El desarrollo del estreptococo beta _hemo- ico grupo A (Streptococcus pyrogenes) es Inhibido por la bacitracina, por lo general no ‘ocurre lo mismo con los otros estreptococos beta hemoliticos, NOVOBIOCINA Discos embebidos en una solucion de novo- biocina, para la Identificacton del Strepto- coceus epidermidis. NUESTRO PROGRAMA DE PRODUCCION Ofrecemos Sensidiscos Diagnésticos en frascos color caramelo por 50 y 100 unidades Optoquina ‘npc Bacitracina Oxidasa Novobiocina BIBLIOGRAFIA Barry, Al, Thornsberry, C., Sucepiibly test Dittu- sion test procedures. En: E. Lennette (ED). Manual of Clinical Microbiology. 4th ed. amet ‘can Society for Micro-biology. Washington. DC. + Giono Cerezo Siva: Prusba de Kirby-Baver para sensibildad a los antibisticos. Infectologia IIL UAM 1989, Raphael Stanley S. Lynch's Medical Laboratory Technology ed. W.B, Saunders. USA 1983. + Richard E, Resse, D.E. Sontochnik, AG. Dou- las, J, RLF. Betts, Handbook of Antibiotic. Little Brown and Co. of Boston, 1988. Roservados todos los derechos. Reproduccién autorizada para la Revista del Colegio de Farmacia y Bloquimica * REPYCOTEC ‘A. Chirvaches 2028 Fono: 96-1585 /39.2425, Fax: 591 -2- 392425 La Paz - Bolivia SOCOMAN, S.A. SOCIEDAD COMERCIAL ANDINA S.A. Calle Colon 282, 6to. piso - Casilla 2196 Teléfonos, SECCION VENTAS: 350670 - 322409 - 951174 DISTRIBUIDORES EXCLUSIVOS DE: LABORATORIOS ABBOTT LABORATORIOS ALCON LABORATORIOS ATRAL_ LABORATORIOS DALMER (ATEROMIXOL - P.P. 6.5.) LABORATORIOS PARKE DAVIS * LABORATORIOS PFIZER LABORATORIOS PRO (cepillos dentales) LABORATORIOS SILESIA LABORATORIOS SQUIBB LABORATORIOS WARNER CHILLCOT LABORATORIOS WHITEHALL ‘TAMPAX INCORPORATED CO - DISTRIBUIDORES DE: + LABORATORIOS AYERST LABORATORIOS CIBA - GEIGY LABORATORIOS UPJOHN LABORATORIOS WYETH LABORATORIOS ZYMA AGENCIAS EN TODO EL PAIS SALUDA AL DISTINGUIDO CUERPO FARMACEUTICO NACIONAL 52.