HIDRLISIS DE LA CELULOSA

Evaluar la capacidad hidroltica de un tipo de hidrolasa,

las Celulasas
usando un ensayo colorimtrico
con el cido 3,5-dinitrosaliclico (DNSA-reactivo).

 Las celulasas son una familia de enzimas, producidas principalmente por hongos,
bacterias y protozoos que pertenecen a la familia de las hidrolasas y que catalizan la
hidrlisis de enlaces 1,4--D-glucosidicos en celulosa, lichenina y -D-glucanos de

cereales.
Las celulasas catalizan la endo-hidrlisis de los enlaces glucosidicos.
La accin en la secuencia de estas enzimas lleva a la degradacin de este polisacrido
en subunidades simples de glucosa

 La celulosa es uno de los polisacridos ms importantes; se compone de un gran nmero de

molculas de glucosa (de aproximadamente 300 a 3000 unidades) unidas entre s por un enlace (1
4) glucosidico.
La celulosa es el ms abundante polisacrido natural, ya que es el componente de tejido fibroso de
las paredes celulares de las plantas (representa aproximadamente la mitad del carbono orgnico en la
biosfera).
Es un slido blanco, insoluble en agua.
La cadena del polmero no est ramificada.

Las cadenas estn dispuestas paralelas entre s y se unen por medio de enlaces de hidrgeno muy
fuertes, formando fibrillas, cadenas muy largas, difciles de disolver.

 Aproximadamente la mitad de las paredes celulares de las plantas est constituida por
celulosa, pero en el algodn, por ejemplo, la celulosa es casi es 100%.

La celulosa se hidroliza, en determinadas condiciones, a celobiosa, disacrido que

posteriormente se hidroliza a glucosa.

 En el intestino del hombre este proceso hidrolitico no se produce debido a una falta
de enzimas para romper los enlaces (1 4) glucosidicos.

En los estmagos de los rumiantes y en el ciego de los herbvoros monogastricos

(equinos), sin embargo, hay numerosas bacterias simbiticas y protozoos que
convierten el enlace en un enlace divisible por todos los animales.

Por ejemplo el almidn est compuesto de tipo orgnico de carbohidratos (polisacridos o

hidratos de carbono), comnmente contenido en alimentos como pan, pasta, arroz,
patatas, que tiene unidades de (+)-glucosa unidas entre s por vnculos -glucosidico a
diferencia de la celulosa.

En esta prctica se va a medir la capacidad de la celulasa de Aspergillus niger para

hidrolizar la celulosa a travs de un ensayo colorimtrico

Es el ensayo colorimtrico con cido 2,5-dinitrosaliclico (reactivo DNSA)

cido 2,5-dinitrosaliclico (reactivo DNSA)

El procedimiento se basa en el mtodo de Bailey et al. 199238 y permite la determinacin

espectrofotomtrica de azcares reductores liberados por la reaccin oxidativa.
La enzima Celulasa hidroliza la celulosa con la liberacin de monmeros de glucosa que reaccionan de

la siguiente manera con el cido 2,5-dinitrosaliclico:

cido 2,5-dinitrosaliclico
(Amarillo)

glucosa

cido gluconico

cido 3-amino-5-nitrosalicilico
(rojo-marrn)

reaccin redox entre la glucosa y el cido 3,5-dinitrosaliclico (amarillo) con la formacin de

cido gluconico y cido 3-amino-5-nitrosalicilico (rojo)

Principios bsicos de la colorimetra

1. Colorimetra es una tcnica utilizada para determinar la concentracin de sustancias en una

solucin colorida.

2. Es un mtodo rpido y no destructivo que ayuda a identificar y cuantificar un gran nmero de

sustancias para diagnstico e investigacin.

3. Es una forma de espectroscopia; en general, se mide la respuesta de los tomos y

molculas expuestos a la radiacin electromagntica de una cierta longitud de onda y, por lo

tanto, de una cierta energa.

4. Hace uso de longitudes de onda en la regin visible del espectro electromagntico y por lo
tanto es una tcnica de medicin bastante sencilla.

Anlisis :
1. La solucin de ensayo, inicialmente transparente, se colorea mediante la adicin de un
reactivo que reacciona con la sustancia buscada.
2. La coloracin es tanto ms intensa cuanto ms concentrada es la sustancia.
3. Un haz de luz de una determinada longitud de onda (llamado el rayo incidente) pasa a travs
de la solucin a analizar que est contenida en un recipiente de vidrio o de cuarzo dijo cubeta.
4. El haz de luz se absorbe de una manera proporcional a la saturacin del color (por ejemplo

una solucin de color amarilla absorbe la luz cerca de la azul).

5. La intensidad del haz que ha pasado a travs de la solucin (haz de luz transmitida) se mide

por un sistema fotodetector que transforma la energa del rayo transmitido en una corriente
proporcional a su intensidad elctrica.

Este anlisis se basa en la ley de Beer-Lambert que, en trminos simples, se correlaciona la

intensidad de color de una solucin con su concentracin. Ms precisamente, la ley dice que
como el absorbancia es proporcional c l,

A= c l
donde

es la absorcin especfica a esa sustancia (coeficiente de extincin molar tpico de cada

sustancia)

c es la concentracin de la sustancia

l es el camino ptico, es decir, el camino del haz de luz dentro de la celda

La determinacin cuantitativa de la sustancia se produce a travs de un instrumento llamado

espectrofotmetro

Este dispositivo es capaz de medir la cantidad de luz absorbida por la solucin:

fuente de luz (visible o ultravioleta)

que emite rayos de diversos longitudes de onda

un filtro, llamado un monocromador,

que permite seleccionar una longitud de
onda especfica til para el anlisis especfico
un sistema detector
representado por una fotoclula
la que produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de
luz

Ms compuestos a ser analizados no son de color.

Para superar este inconveniente se puede utilizar reacciones (qumicos o enzimticos) que
transforman una sustancia incolora en un compuesto coloreado: este ltimo se mide entonces

con el espectrofotmetro.

Se habla de mediciones indirectas como en el caso de este ensayo con el

cido 2,3-dinitrosaliclico cuyo pico de absorbancia a 540 nm

Sin embargo, dos aspectos fundamentales:

1) Hacer un blanco:
una parte de la absorbancia total es debido al disolvente, a la cubeta de vidrio y al mismo
espectrofotmetro: para corregir este efecto, adems de la muestra de ser hecho un blanco
que es la lectura espectrofotomtrica sin la muestra.

2) Construir una curva de calibracin (curva de calibracin):

usando soluciones estndar con concentraciones conocidas de analto.
A continuacin, la medicin de la absorbancia de la muestra desconocida y la interpolacin

con la lnea de calibracin permite determinar la concentracin de la muestra